Bir Flow Koşullarında lökosit-endotel Etkileşimleri değerlendirilmesi Ex vivo Autoperfused Microflow Odası Deneyi

Bu prosedürün genel amacı, fizyolojik akış koşulları altında endotelyal adezyon molekülleri ile lökosit etkileşimlerini değerlendirmek için ex vivo arteriyovenöz bir kapalı devre oluşturmaktır. Bu, önce ince bir cam haznenin ilgilenilen endotelyal adezyon molekülü ile kaplanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adımda, polietilen ve silikon boru hazneye ve daha sonra cerrahi olarak fareye bağlanır.

Daha sonra karotis arterden gelen kanın borudan akmasına izin verilir. Ve doğal lökositlerin kaplanmış cam haznesi ile müteakip etkileşimleri gerçek zamanlı olarak kaydedilir. Sonuç olarak, çeşitli tedavilerin, hareketsizleştirilmiş adezyon molekülleri ile etkileşime girerken lökositlerin yer değiştirmesi ve yuvarlanma hızı üzerindeki etkileri zaman içinde hesaplanabilir.

Bu tekniğin pro sitometri analizi gibi mevcut tekniğe göre en büyük avantajı, bu teknikle endotel molekülleri ile lökosit etkileşiminin fizyolojik akış koşulları altında değerlendirilmesidir. Deneyden bir gün önce, bir santimetre PE 10 polietilen boruyu altı santimetrelik bir silikon boruya, ardından beş santimetre polietilen boruya bağlayın. Hayvanın şah damarı tarafı için boru kurulumunu karotis tarafı için hazırlamak için, boruyu bir santimetre polietilen borudan yaklaşık 1,5 santimetre uzakta, altı santimetre silikon boru içine bir TTU ilavesiyle gösterildiği gibi bağlayın.

Ardından, 10 santimetrelik bir silikon boru parçasının bir ucunu basınç dönüştürücüsüne bağlayın ve karotis tarafı T tüpünün T ucunu diğer uca yerleştirin. Bağlantı yerlerinin sıkı ve sızıntısız olduğundan emin olun. Daha sonra, her bir mikro akış odasını yeni hazırlanmış endotelyal yüzey kaplama proteini ile infüze etmek için 25 gauge iğneye bağlı bir mililitrelik şırınga kullanın ve kaplanmış odaları ertesi gün gece boyunca dört santigrat derecede 15 mililitrelik bir tüpte saklayın.

Juguler ve karotis boruyu mikro akış odasına bağlamak için, odanın her iki tarafına bir santimetre silikon boru bağlayın ve ardından bağlantıları, boru hazneyle buluşacak şekilde gerilmiş küçük bir dikdörtgen param parçasıyla kapatın. Hazneyi ve tüpü %0.1 sığır serum albümini ile doldurmak için bir şırınga kullanın. Daha sonra sızıntı olup olmadığını kontrol ettikten sonra, 45 dakika boyunca hazneye inkübe edin.

İnkübasyonun sonuna yakın oda sıcaklığında, mikro akış odasını her çentikte küçük bir damla silikon ile Petri kabına bir çentik üzerinde stabilize edin. Ardından juguler ve karotis borularını odanın her iki tarafına bağlayın. Daha sonra silikon kururken, heparin ile doldurulmuş 60 millik bir kilitleme şırıngasını basınç dönüştürücüsüne bağlayın ve hava kabarcığı kalmayana kadar boru ve hazneden 100 USP dereceli heparin geçirin.

Fareyi mikro akış odasına bağlamadan önce bilgisayarı, mikroskobu ve uygun basınç kayıt cihazını açın. Yazılım kurulduktan sonra, 10 ila 12 haftalık bir fareyi emniyete alın. Ventral pozisyonda, boyun bölgesinde makasla bir kesi yapın ve ardından trakea ve damarları ortaya çıkarmak için tiroid bezini inceleyin.

Karotis arteri tamamen açığa çıkana kadar temizleyin. Vagus sinirine zarar vermemeye özen göstermek. Daha sonra katlanmış bir dikiş parçasının kıvrımını karotis arterin altından geçirin ve bükümde dikişi kesin.

Yani atardamarın altında iki parça dikiş var. Her bir dikişi sıkmadan düğümler halinde geçirin ve ardından sol şah damarı için dikişleri aynı şekilde yerleştirin. Juguler dikişler yerine oturduğunda, fare ipine bir mililitre heparin enjekte edin.

Enjeksiyondan sonra, karotis arter üzerindeki üst sütürü sıkın ve arterin açıkta kalan kısmına gidebildiği kadar alçak bir damar klempi yerleştirin. Arteri üst dikişten tutmak için forseps kullanın ve ardından üst dikişe yakın arter çevresinin yaklaşık sekizde biri kadar küçük bir kesi yapmak için ince mikro makas kullanın. Şimdi karotis arter tüpünü bir tüp tutucu kullanarak arterde yapılan kesiden yerleştirin ve alt dikişten aşağı geçirin.

Daha sonra alt dikişi ve ardından üst dikişi bağlayın. Böylece arter, borunun etrafına kapatılır ve sıkı bir sızdırmazlık sağlamak için birkaç düğüm yapılır. Juguler tüp için aynı prosedürü tekrarladıktan sonra, damar kelepçesi hariç, akışı test etmek için karotis arter borusundaki damar kelepçesini geçici olarak açın.

Sızıntı yoksa, fareyi mikroskoba hareket ettirin ve lökositlerin mikro akış odasından yuvarlanma hızını kaydetmek için karotis ve juguler damar borusunu mikro akış odası borusuna bağlayın. Hazneyi doldurmak için karotis kelepçesini tamamen serbest bırakın. Kanın üç ila beş dakika dolaşmasına izin verin, böylece akış koşulları stabilize olur.

Bu arada, mikroskop aşamasını, hazne mikroskop objektifi ile aynı hizada olacak ve kenarı ekrandaki video kayıt penceresine paralel olacak şekilde ayarlayın. Daha sonra, oda sıcaklığında su ile bir Petri kabı oluşturun ve ardından 10 x suya daldırma hedefini tabağa indirin, böylece odadan akan hücreler görünür olur, orta fizyolojik akış basıncını simüle etmek için ışık yoğunluğunu uygun şekilde ayarlayın, boru üzerindeki kelepçeyi ayarlayın, böylece dönüştürücü sabit bir 30 milimetre cıva okur. Ardından, hem lökosit kaçakçılığının hem de basıncın kaydını başlatmak için başlat düğmesine basın, ilk zaman atlaması odanın juguler ucuna yakın ve tamamlanana kadar karotis ucuna doğru akışa karşı hareket eder.

Kayıt bittiğinde, kan akışını durdurmak için giriş bölgesindeki valfi kapatın ve istenirse odayı farklı bir yapışma molekülü ile kaplanmış yeni bir odayla değiştirin. Her kayıt sırasında, oda içinde sadece etkileşen lökositler belirgindir. Örneğin, bu görüntülerin her birinde, beyaz ok uçları, ilgilenilen adezyon molekülü tarafından yakalanan ve diğer serbest akışlı hücreler arasında oda boyunca yuvarlanan bireysel lökositleri gösterir.

Kan akışı içinde, tüm görüntülerdeki büyük karanlık kürelerle odanın dışındaki ortak bir artefakt görülebilir ve bu da izleyicinin sabit bir noktaya göre lökosit hareketini takdir etmesine yardımcı olabilir. Grafik, verilerin son çizimini gösterir. İlk deneysel tedavinin, sola kayma olarak belirgin olan yuvarlanma hızını azalttığı gözlendi ve ikinci deneysel işlemin, bu prosedürle kombinasyon halinde kontrol yuvarlanma hızına kıyasla sağa kayma olarak görünen hızı arttırdığı gözlendi.

Lökosit ve vivo x Viva'yı etiketlemek gibi diğer yöntemler, belirli lökosit alt tipi hastalık ilerlemesinin katkısı gibi diğer soruları daha fazla yanıtlamak için kullanılabilir.