Floresan Bazlı Astar Uzatma Tekniği Transkripsiyonal Başlangıç ​​Noktalarını ve RNases yarılması Siteleri belirleme In Vivo

Bu prosedürün genel amacı, bir floresan primer uzatma reaksiyonu kullanarak bakterilerden in vivo olarak transkripsiyonel başlangıç noktalarını ve RNA'ların bölünme bölgelerini tanımlamaktır. Bu, önce e coli veya S aria gibi bakterilerin büyümesi ve RNA moleküllerinin izole edilmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra, RNA, spesifik floresan primerler ve ters transkriptaz kullanılarak ters kopyalanır ve bu da CD NA fragmanları ile sonuçlanır.

Daha sonra DNA veya plazmitler bakteri hücrelerinden izole edilir ve bir dizileme kiti kullanılarak DNA şablonundan bir floresan Sanger dizileme merdiveni oluşturulur. Son olarak, CDNA fragmanları ve sıralama merdivenleri ayrılır ve otomatik bir jel sıralayıcı kullanılarak bir poli akrilamid jel üzerinde aynı anda tespit edilir ve birbirleriyle karşılaştırılır. Sonuç olarak, floresan primer uzantısı, RNA moleküllerinin beş asal ucunu bir baz çözünürlüğe kadar haritalamak için kullanılır.

Bu tekniğin, ırk veya radyoaktiviteye dayalı birincil uzatma gibi diğer yöntemlere göre ana avantajı, elektroforez sırasında algılama aynı anda gerçekleştiğinden, RNA moleküllerinin uçlarından beşinin hızlı bir şekilde tanımlanmasıdır. Duyarlılık, kırmızı aktiviteye dayalı birincil uzantılara benzer, ancak laboratuvar personelinin hız aktivitesi radyasyon güvenliği eğitimine ihtiyaç duymadan bu yöntemi kullanmasını sağlar. Toksin antitoksin sistemlerinin RNA bileşenlerini araştırmak için bu floresan birincil uzatma tekniğini başarıyla kullandık.

Prosedürü gösteren stafilokok, laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olan Christopher Schuster olacak. Yüksek verimde bir RNA hazırladıktan ve metin protokolüne göre primerler tasarladıktan sonra, önce termodöngüleyiciyi 95 santigrat dereceye kadar ön ısıtarak primer uzatma reaksiyonunu gerçekleştirin. Her RNA numunesi için aşağıdaki bileşikleri bir PCR tüpünde karıştırın, numuneleri 95 santigrat derecede bir dakika boyunca denatüre edin.

Ardından, primerleri ve RNA'yı hibritleştirmek için tüpleri beş dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin. Ardından, PCR makinesini 47 santigrat dereceye ayarlayın. Ardından, burada açıklandığı gibi ters transkripsiyon ana karışımını hazırlayın.

Her hibritleştirilmiş RNA örneğine dört mikrolitre, bir ters transkripsiyon ana karışımı ekleyin ve tüpleri 47 santigrat derecede bir saat inkübe edin. Reaksiyonu durdurmak için numuneleri iki dakika boyunca 95 santigrat dereceye ısıtın. Daha sonra altı mikrolitre form amid yükleme boyası ekleyin ve gece boyunca veya karanlıkta eksi 20 santigrat derecede iki haftaya kadar saklayın.

Genomik DNA veya plazmitleri hazırladıktan sonra, metin protokolüne göre, 12 mikrolitre yaklaşık 10 ila 15 mikrogram genomik DNA veya 100 ila 500 nanogram plazmit DNA'yı bir mikrolitre floresan etiketli primer ve bir mikrolitre DMSO pipeti ile karıştırarak Sanger dizileme reaksiyonunu birleştirin. Her dizilimin bir mikrolitresi, önceden etiketlenmiş ayrı PCR tüplerine karıştırılır. Daha sonra her tüpe üç mikrolitre D-N-A-D-M-S-O astar karışımı ekleyin.

PCR makinesini aşağıdaki programa ayarlayın ve numuneleri makineye yerleştirdikten sonra çalıştırın. Çalışmadan sonra, numunelere ve ardından buzun üzerine altı mikrolitre yükleme boyası ekleyin. Hemen veya eksi 20 santigrat derecede temiz, tozsuz 25 santimetre plakalar kullanarak uzun süreli kullanıyorsanız, arka cam plakaya 0.25 milimetre ara parçalar yerleştirin ve çentikli cam plakayı, cam plakaların çentikli ucu ve ray giriş pilotlarının her ikisi de yukarı bakacak şekilde üste indirin.

Jel raylarını cam plakaların her iki tarafına takın ve jeli dökmek için düğmeleri hafifçe sıkın. Burada listelenen bileşikleri bir beherde bir karıştırma çubuğu ile birleştirin ve manyetik bir karıştırma plakasına yerleştirin. Bir PS ekledikten ve bir araya geldikten hemen sonra, akrilamid çözeltisini almak için 50 mililitrelik bir şırınga kullanın ve uca 0.45 nanometrelik bir filtre yerleştirin.

Sandviç plakaları 10 ila 20 derecelik bir açıyla yerleştirin ve şırınga ucunu sürekli olarak bir taraftan diğerine hareket ettirirken jel çözeltisini cam plakalar arasına yavaşça dağıtın. Jel solüsyonunu cam plakaların alt ucuyla buluştuğunda dağıtmayı bırakın. Bir baloncuk kancası kullanarak, oluşmuş olabilecek baloncukları çıkarın.

Daha sonra jel cep ara parçasını çentikli uçtaki cam plakalar arasına kaydırın, jel çözeltisine batırın ve döküm plakasını takarak sabitleyin, üst ray vidalarını hafifçe sıkın ve jelin bir ila iki saat sertleşmesine izin verin. Döküm plakasını ve cep ara parçasını çıkarmadan önce, jeli çalıştırmak için tuz ve jel kalıntılarını temizlemek için damıtılmış deiyonize su kullanın. Tampon tankı tutucusunu ön cam plakalardaki jel raylarına kaydırın ve düğmeleri sıkın.

Jeli, otomatik jel görüntüleyicinin alt jel tankına ısıtma plakasına doğru yerleştirin ve ray giriş pilotunu aparat braketlerine kaydırarak sabitleyin. Üst ve alt jel tampon bölmelerini doldurmak için bir XTBE tamponu kullanın. Ardından alt tampon bölmesini kapatın ve üst tampon bölmesini güce bağlamak için güç kablosunu kullanın.

Jel cebinde tuz varsa, temizlemek için cebe tekrar tekrar pipetlemek için tampon kullanın. Ardından, üst tampon tankı haznesini kapatmak için üst tampon kapağını kullanın. Görüntüleyiciyi ve bilgisayarı açtıktan ve temel görüntü IR veri toplama yazılımını metin protokolüne göre başlattıktan sonra, tarayıcı kontrolünü ayarlamak için burada listelenen ayarları kullanın.

Ardından, voltajı seçerek ve enter tuşuna basarak boş jeli 20 dakika önceden çalıştırın. Bu arada, bir PCR makinesi kullanarak, sıralama merdivenini ve astar uzatma ürünlerini iki dakika boyunca 90 santigrat dereceye ısıtın Buz üzerinde soğutmadan önce elektroforezi durdurun, otomatik jel sıralayıcıyı açın ve üst tampon tankı kapağını çıkarın. Ardından köpekbalığı dişi tarağını cam plakaların arasına ve köpekbalığı dişleriyle birlikte yerleştirin.

Jel pipetini, astar uzatma ürünlerinden bir ila iki mikrolitre veya sıralama merdiveni reaksiyonlarını her bir jel cebine hafifçe delin. Boş cepler için. Tutarsız çalışma davranışını önlemek için doldurmak için yükleme boyası kullanın, tampon tankını ve jel sıralayıcının kapısını kapatın.

Ardından, lazer için voltaj açık'ı seçerek elektroforezi başlatın, tarama durumunu seçin ve enter tuşuna basın. İlgilenilen bölge lazeri geçtikten sonra, burada gösterildiği gibi elektroforezi durdurun. Bir primer uzatma reaksiyonu, ilgilenilen transkriptlerin transkripsiyonel başlangıç noktalarını veya TSP'sini belirlemek için kullanılabilir ve promotör bölgelerin çıkarılmasına yardımcı olabilir.

Bu örnekte, MPE mRNA'nın TSP'si, daha önce yayınlanmış verilerle tutarlı olarak G olarak tanımlanmıştır. Eksi 35 ve eksi 10 promotör elemanların T-T-G-T-A-A ve T-A-G-A-C-T olduğu çıkarıldı ve bu motifler, mRNA bölünme ürünlerini tanımlamak için primer uzantısı kullanan konsensüs dizilerinin her birinden yalnızca bazlara farklılık gösterir. RNA Ybi SEC iki tarafından START co-on'a yakın bölünmenin RNA haritalaması, RNA'lar mevcut olmadığında veya inaktif olduğunda, RNA'ların aktivitesinin bir sonucu olarak başlangıç ko-on'a yakın hiçbir primer uzatma ürünü oluşmadığında burada gösterilir.

Bununla birlikte, başlangıç katının hemen aşağısında görünen iki güçlü bant, bu şekilde, tek tek bantların tanımlanmasını önleyen ters transkripsiyon reaksiyonundaki fazla RNA nedeniyle başarısız bir primer uzatma deneyini göstermektedir. Bu, toplam şablon RNA miktarının, ilgilenilen RNA'nın bolluğuna göre ayarlanması gerektiğini gösterir. Bu videoyu izledikten sonra, floresan primerler ve biraz pratikle otomatik bir jel sıralayıcı kullanarak in vivo olarak transkripsiyonel başlangıç noktalarının ve RNA'ların bölünme bölgelerinin nasıl açıklanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Bu yöntemin gerçekleştirilmesi hızlı ve kolaydır. Deneylerinizde iyi şanslar.