Name: Floresan Bazlı Astar Uzatma Tekniği Transkripsiyonal Başlangıç Noktalarını ve RNases yarılması Siteleri belirleme In Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Öğrenin, bakteri transkriptlerinde transkripsiyonel başlangıç noktalarını ve RNA yarılma bölgelerini belirlemek için floresan bazlı astar uzatma yöntemini. Bu teknik otomatik jel sekanslayıcı kullanarak yüksek çözünürlüklü haritalama sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Laboratuvardaki yardımı için Anne Wochele'ye ve otomatik jel dizileyici konusundaki yardımı için Vera Augsburger'e teşekkür ederiz. Deutsche Forschungsgemeinschaft'a, SPP1316 ve SPP1617'deki "öncelikli programlar" kapsamında BE4038/2 ve BE4038/5 hibeleri ile finanse edildiği için teşekkür ederiz.

<ol><li>Simpson, C. G., Brown, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer+extension+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Primer extension assay.</a> Methods Mol. Biol. 49, 249-256 (1995).</li>
<li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequencing+with+chain-terminating+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 74, 5463-5467 (1977).</li>
<li>Fekete, R. A., Miller, M. J., Chattoraj, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescently+labeled+oligonucleotide+extension%3A+a+rapid+and+quantitative+protocol+for+primer+extension%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Fluorescently labeled oligonucleotide extension: a rapid and quantitative protocol for primer extension.</a> Biotechniques. 35, 90-94 (2003).</li>
<li>Schuster, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+mazEF+Toxin-Antitoxin+Homologue+from+Staphylococcus+equorum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Characterization of a mazEF Toxin-Antitoxin Homologue from Staphylococcus equorum.</a> J. Bacteriol. 195, 115-125 (2013).</li>
<li>Nolle, N., Schuster, C. F., Bertram, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+paralogous+yefM-yoeB+loci+from+Staphylococcus+equorum+encode+functional+toxin-antitoxin+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Two paralogous yefM-yoeB loci from Staphylococcus equorum encode functional toxin-antitoxin systems.</a> Microbiology. 159, 1575-1585 (2013).</li>
<li>Yamaguchi, Y., Park, J. H., Inouye, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxin-antitoxin+systems+in+bacteria+and+archaea%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Toxin-antitoxin systems in bacteria and archaea.</a> Annu. Rev. Genet. 45, 61-79 (2011).</li>
<li>Schuster, C. F., Bertram, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxin-antitoxin+systems+are+ubiquitous+and+versatile+modulators+of+prokaryotic+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Toxin-antitoxin systems are ubiquitous and versatile modulators of prokaryotic cell fate.</a> FEMS Microbiol. Lett. 340, 73-85 (2013).</li>
<li>Goeders, N., Van Melderen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxin-antitoxin+systems+as+multilevel+interaction+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins%22%5BJournal%5D)">Toxin-antitoxin systems as multilevel interaction systems.</a> Toxins. 6, 304-324 (2014).</li>
<li>Yamaguchi, Y., Inouye, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+interferases%2C+sequence-specific+endoribonucleases+from+the+toxin-antitoxin+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+molecular+biology+and+translational+science%22%5BJournal%5D)">mRNA interferases, sequence-specific endoribonucleases from the toxin-antitoxin systems.</a> Progress in molecular biology and translational science. 85, 467-500 (2009).</li>
<li>Park, J. H., Yamaguchi, Y., Inouye, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacillus+subtilis+MazF-bs+%28EndoA%29+is+a+UACAU-specific+mRNA+interferase%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Bacillus subtilis MazF-bs (EndoA) is a UACAU-specific mRNA interferase.</a> FEBS Lett. 585, 2526-2532 (2011).</li>
<li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.Staphylococcus+aureus+MazF+specifically+cleaves+a+pentad+sequence%2C+UACAU%2C+which+is+unusually+abundant+in+the+mRNA+for+pathogenic+adhesive+factor+SraP%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">et al.Staphylococcus aureus MazF specifically cleaves a pentad sequence, UACAU, which is unusually abundant in the mRNA for pathogenic adhesive factor SraP.</a> J. Bacteriol. 191, 3248-3255 (2009).</li>
<li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mRNA+interferases%2C+MazF-mt3+and+MazF-mt7+from+Mycobacterium+tuberculosis+target+unique+pentad+sequences+in+single-stranded+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The mRNA interferases, MazF-mt3 and MazF-mt7 from Mycobacterium tuberculosis target unique pentad sequences in single-stranded RNA.</a> Mol. Microbiol. 69, 559-569 (2008).</li>
<li>Fu, Z., Donegan, N. P., Memmi, G., Cheung, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+MazFSa%2C+an+endoribonuclease+from+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Characterization of MazFSa, an endoribonuclease from Staphylococcus aureus.</a> J. Bacteriol. 189, 8871-8879 (2007).</li>
<li>Marmur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+procedure+for+the+isolation+of+deoxyribonucleic+acid+from+micro-organisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from micro-organisms.</a> J. Mol. Biol. 3, 208-218 (1961).</li>
<li>Emory, S. A., Belasco, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ompA+5%27+untranslated+RNA+segment+functions+in+Escherichia+coli+as+a+growth-rate-regulated+mRNA+stabilizer+whose+activity+is+unrelated+to+translational+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The ompA 5' untranslated RNA segment functions in Escherichia coli as a growth-rate-regulated mRNA stabilizer whose activity is unrelated to translational efficiency.</a> J. Bacteriol. 172, 4472-4481 (1990).</li>
<li>Cole, S. T., Bremer, E., Hindennach, I., Henning, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+the+promoters+for+the+ompA+gene+which+encodes+a+major+outer+membrane+protein+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Gen.+Genet%22%5BJournal%5D)">Characterisation of the promoters for the ompA gene which encodes a major outer membrane protein of Escherichia coli.</a> Mol. Gen. Genet. 188, 472-479 (1982).</li>
<li>Schleifer, K. H., Kilpper-Bälz, R., Devriese, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+arlettae+sp.+nov.%2C+S.+equorum+sp.+nov.+and+S.+kloosii+sp.+nov.%3A+Three+New+Coagulase-Negative%2C+Novobiocin-Resistant+Species+from+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22Syst.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus arlettae sp. nov., S. equorum sp. nov. and S. kloosii sp. nov.: Three New Coagulase-Negative, Novobiocin-Resistant Species from Animals.</a> Syst. Appl. Microbiol. 5, 501-509 Forthcoming.</li>
<li>Yu, H., Goodman, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+HIV-1+and+avian+myeloblastosis+virus+reverse+transcriptase+fidelity+on+RNA+and+DNA+templates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Comparison of HIV-1 and avian myeloblastosis virus reverse transcriptase fidelity on RNA and DNA templates.</a> J. Biol. Chem. 267, 10888-10896 (1992).</li>
<li>Ying, B. W., Fourmy, D., Yoshizawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substitution+of+the+use+of+radioactivity+by+fluorescence+for+biochemical+studies+of+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Substitution of the use of radioactivity by fluorescence for biochemical studies of RNA.</a> RNA. 13, 2042-2050 (2007).</li>
</ol>

Yazarların çıkar çatışması oluşturacak açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Floresan primer uzatma TSP- veya ikincil bir RNA işleme tanımlanması için iki, RNA&#39;ların 5 &#39;uçlarını belirlemek için basit ve hızlı bir yöntemdir. Dolayı floresan primerlerin kullanımı ile reaksiyonlar, ayarlanabilir ve (radyoaktif olarak etiketlenmiş primerler aksine olarak) ilave güvenlik önlemleri olmadan çalışabilir. Numuneler floresan ile tespit edilir elektroforez X-ışını filmleri yaygın olarak kullanılan radyoaktif yöntemlerle karşılaştırıldığında hızlı bir analizine izin verir işlemi sırasında, bunlar gö...

Primer uzatma 1 bir taban çözünürlüğe kadar özel bir RNA moleküllerinin 5 'ucunun saptanması için moleküler bir yöntemdir. 5'-RACE (cDNA uçlarının hızlı yükseltilmesi) gibi diğer yöntemlerin bir avantajı, hızlı bir geri dönüş süresi ve kolay bir RNA moleküllerinin farklı uzunluklarının bir karışımı analiz yeteneğidir. Bu yöntem, RNA molekülleri, belirli uzunluktaki cDNA fragmanlarının üretilmesi, özel bir flüoresan primerler kullanılarak transkripsiyon reaksiyonlarını ters tabi tutarak çalışır. Bu cDNA molekülleri denatüre edici poliakrilamid jelleri üzerinde geleneksel Sanger dizileme reaksiyonlarının 2 yanına uygulanır ve bağlı floresan etiketli primerlerin kullanımı ile fluoresansları ile tespit edilebilir. CDNA fragmanlarının uzunlukları 5 'RNA uçlarının eşleşmesini sağlayan bir sıralama merdiven karşılaştırılarak değerlendirilir. Geleneksel olarak, primer uzatma reaksiyonları bağlantılı olarak kullanılanradyoaktif izotoplar X-ray filmlerde cDNA molekülleri tespit etmek. Onların duyarlılığı biraz daha düşük de olsa dolayı sağlık tehlikeleri, atık bertaraf sorunları ve kullanım kolaylığı, yeni protokoller, otomatik dizicilerle ile primer uzatma tespiti için floresan kullanmaktadır. Floresan primerler (bizim elimizde bir yıldan daha fazla), uzun bir süre için kararlı olduğu gibi, floresanla işaretlenmiş primerler kullanılarak, tekrar eden radyo-etiketleme prosedürü, ihmal edilebilir. Burada açıklandığı gibi bir yöntem otomatik bir jel sekanslayıcı kullanır, ancak küçük değişiklikler yapılarak, kapillerli da cDNA ayrılması ve keşfi 3 için kullanılabilir. Jel analizi paralel yapısı mümkün RNA bölünme ve işlem daha az miktarda tespit edilebilir. Diğer bir avantajı tespit edilebilir terminali bölünme ya da bir bazın işleme gibi, bu yöntemin yüksek çözünürlüktür. RNA bölünme ya da işlem, t tespiti ile ilgili olarakprimer uzantıları ypically iki farklı tür ayırt edilir. Diğer bir durumda, işlem, in vivo olarak yapılması ve sonuçta elde edilen RNA saflaştırılmıştır ise Bir durumda, olan enzimatik işlem, saflaştırılmış RNA ve arıtılmış enzim kullanılarak in vitro olarak yapılır. Bir primer uzatma in vitro olarak, her iki durumda da RNA RNA kaynağına bağlı olarak, ancak, tabi tutulur, bu yöntem, bir in vitro veya in vivo olarak, primer genişlemesini, adlandırılır ya. Burada mevcut protokol, bunların kullanım kolaylığı (herhangi bir saflaştırılmış protein için) ve aynı zamanda kopyalama başlangıç ​​noktaları ve belirlemek için olasılığı, sadece, in vivo bir primer uzatma odaklanır. Bununla birlikte in vitro primer uzantıları ile aynı şekilde ayarlanır, prensip olarak ve bu protokol, bir başlangıç ​​noktası olarak görev yapabilir. Burada gösterilen yöntem sürece yüksek giriş oranlı gibi pek çok bakteri türleri uygulanabilirNükleik asitlerin saflığı ve yüksek verimli hazırlanması. Laboratuarımızda araştırma toksin antitoksin (TA-) sistemler 4,5, primer uzatma yöntemi yaygın olarak kullanıldığı bir alanın düzenleme kapsamında odaklanmaktadır. TA-sistemleri istikrarlı ve endojen aktif toksik protein ve toksisite 6,7 zıt bir çoğunlukla kararsız protein ya da RNA antitoksin oluşmaktadır prokaryotik genomları mevcut küçük genetik unsurlardır. Toksin aktivitesi bazen RNaz etkinliğinin 8,9 En sık replikasyonu, hücre çeperi sentezi veya başka mekanizmalar inhibisyonu tarafından uygulanan, ancak. Tipik haliyle, RNaz özgüllük primer uzatma yöntemdir biri farklı testler, iletken ile belirlenir. Parçalanır ve tam uzunlukta parçalarının bir karışımı, aynı zamanda, 5 'ucunun saptanması için analiz edilebilir Primer uzatma reaksiyonları, bu uygulama için uygundur. In vitro ve in vivo primeri uzantılarında bir karışımını kullanarak,spesifik toksin RNaz ayrılma, örneğin, sekans özgüllük 10-13 belirlenebilir. <img alt="Primer uzama, RNA izolasyonu, cDNA sentezi, Sanger dizileme, jel elektroforez diyagramı." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52134/52134fig1highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Şekil 1,"> . Primer uzatma prosedürünün 1. Genel Bakış Şekil Bakteriyel kültürler deneysel ihtiyaçlarına göre kuluçkaya ve tedavi edilir. Toplam RNA, hücre cDNA elde edildi hedefe özgü floresan DNA primerler kullanılarak bir ters transkripsiyon reaksiyonu, DNA izlerini ortadan kaldırmak için DNase I ile işleme tabi tutuldu ve tabi elde edilir. Genomik DNA ya da plazmidler ekstre edilmiş ve daha sonra cDNA fragmanları ile boyut karşılaştırma için floresan Sanger dizileme reaksiyonları için kullanılır. Primer uzatma ürünleri denatüre üre poliakrilamid jel üzerinde Sanger dizileme ürünlerin yanında çalıştırmak ve otomatik lazer ve mikroskop ile analiz edilir. La cDNA bandı ile çizgiler kadar olan sıralama bazSt olarak 5 'cDNA ucu (mavi ok) tabanı. Fekete daha fazla bilgi, vd. 3 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52134/52134fig1highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Bütün primer uzatma işlemi ile ilgili bilgi, Şekil 1 'de bulunabilir. Kısaca, bakteri hücreleri, hasat edilir, kültürlenir, hücre topağı eritilir ve RNA ekstre edildi. Arındırılmış RNA daha sonra ters transkriptaz için şablon olarak hareket edebilir DNA moleküllerinin izlerini ortadan kaldırmak için DNase I ile işleme tabi tutulur. Özel flüoresan primerler ilgi bölgeye hibridize ve daha sonra tek sarmallı Tamamlayıcı DNA (cDNA) 'de elde edilen, ters transkribe edilmiş RNA ilave edilir. Bir sıralama merdiven floresan primer kullanılarak, geleneksel Sanger dizileme ile oluşturulan ve primer uzatma cDNA parçaları ile birlikte bir denatüre edici poliakrilamid jeli üzerinde ayrılır. Elde edilenJel ilgi 5 'uçlarının tanımlanmasına izin veren, floresan bantları karşılaştırılarak analiz edilir. Transkripsiyonal başlangıç ​​noktaları ve işleme siteleri daha sonra sırası karşılaştırmaları tek tek değerlendirilir.

<table><tbody><tr><td>AMV Ters Transkriptaz (20-25 U/&mikro; l)</td><td>NEB / Roche</td><td>NEB: M0277-T / Roche: 10109118001</td><td></td></tr><tr><td>DNase I (RNaz içermez)</td><td>Ambion (yaşam teknolojileri)</td><td>AM2222</td><td></td></tr><tr><td>FastPrep-24 Cihazı&nbsp;</td><td>MPBio</td><td>116004500</td><td></td></tr><tr><td>Floresan etiketli primerler</td><td>Biomers</td><td>n/a</td><td>5' DY-681 modifikasyonu " sıradan" DNA oligonükleotidleri. LICOR IRDye 700/800 gibi uyumlu boyalar, IDTdna gibi diğer tedarikçilerden de temin edilebilir.</td></tr><tr><td>Li-Cor 4200 Sequencer, ImagIR dahil, Veri toplama yazılımı</td><td>Li-Cor</td><td></td><td>Ürün üretimi durduruldu</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo Scientific Nükleaz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>içermeyen su</td><td>Ambion (yaşam teknolojileri)</td><td>AM9915G</td><td></td></tr><tr><td>Plazmid mini hazırlama kiti</td><td>QIAGEN</td><td>12125</td><td></td></tr><tr><td>RapidGel-XL-%40 Konsantre</td><td>USB</td><td>US75863</td><td></td></tr><tr><td>RNA DEPOLAMA TAMPONU</td><td>Ambion (yaşam teknolojileri)</td><td>AM7000</td><td></td></tr><tr><td>Roti-Aqua-P/C/I</td><td>Carl Roth</td><td>X985.3</td><td>Alternatif: " Asit-Fenol: Kloroform, pH 4.5 (IAA ile, 125: 24: 1)" itibaren Ambion (AM9720)</td></tr> <tr><td>SUPERase & boğa; RNase İnhibitörü</td><td>Ambion'da (yaşam teknolojileri)</td><td>AM2696</td><td></td></tr><tr><td>Termo Sekel, floresan etiketli, 7-deaza-dGTP'li primer döngü dizileme kiti</td>, <td>GE Healthcare</td><td>RPN2538</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol reaktifi</td><td>yaşam teknolojileri</td>, <td>15596-026</td><td></td></tr>, <tr><td>Zirkonya/Silika Boncuklar, 0,1 mm</td>, <td>BioSpec</td>, <td>11079101z</td><td></td></tr></tbody></table>

floresan bazlı astar uzatma tekniği transkripsiyonal başlangıç ​​noktalarını ve rnases yarılması siteleri belirleme in vivo

Fluorescence Based Primer Extension Technique to Determine Transcriptional Starting Points and Cleavage Sites of RNases In Vivo

Flüoresan göre primer uzatma (FPE) transkripsiyonel başlangıç ​​noktalarının ya da RNA moleküllerinin işlenmesi bölgelerini belirlemek için moleküler bir yöntemdir. Bu özel floresanla işaretlenmiş primerler ve poliakrilamid jel elektroforezi ile denaturasyon ile elde edilen cDNA parçaları daha sonra analizi kullanılarak, ilgi konusu RNA&#39;nın ters transkripsiyonu ile elde edilir. Aynı zamanda, geleneksel bir Sanger dizileme Reaksiyon bunların tam karşılık gelen tabanlarına cDNA fragmanlarının uçları eşlemek için jel üzerinde çalıştırılır. Ürün klonlanmış olması ve çok sayıda aday dizilenmiştir 5&#39;-RACE (cDNA uçlarının hızlı büyütülmesi), aksine, primer uzama yolu ile üretilen bir cDNA fragmanlarının toplu eşzamanlı olarak bir jel vadede tespit edilebilir. Buna ek olarak, (sonuçların son analizde, ters transkripsiyon ile ilgili) bütün işlem bir iş günü içinde tamamlanabilir. Floresanla işaretlenmiş primerler kullanılarak, tehlikeli radyoaktif izotop kullanımı reaktifler etiketliönlenebilir ve ürünler elektroforez işlemi sırasında tespit edilebilir işlem süreleri azaltılır. Aşağıdaki protokol, güvenilir ve hızlı S. (örneğin, toksin antitoksin sistem bileşenleri ile) bir başlangıç ​​noktası ve RNA işleme the transkripsiyonel anlamak için RNA&#39;ların 5 &#39;uçlarını tespit etmek için, bir in vivo floresan primer uzatma yöntemi tarif S. aureus, E. E. coli ve diğer bakteriler.

Şekil 6'da gösterildiği gibi, bir primer uzatma reaksiyonu ilgi transkript transkripsiyonel başlangıç ​​noktalarını belirlemek için kullanılabilir ve (tipik olarak -10 ila -35 elemanlar tarafından tanımlanan) hızlandırıcı bölgeler anlamak için yardımcı olabilir. En üstteki (uzun) cDNA parçası, mRNA 5 'ucunu temsil eder ve bu sıralama merdiven göre kolayca eşlenebilir. <img alt="ompA transkripsiyon başlangıcı, mRNA bölünmesi; Jel elektroforezi, genetik ekspresyon analiz diyagr...

Burada, bakteri transkriptlerinden transkripsiyonel başlangıç noktalarını belirlemek ve otomatik bir jel dizileyici kullanarak in vivo RNA işlemeyi belirlemek için floresan bazlı bir primer uzatma yöntemini açıklıyoruz.

Floresan Bazlı Astar Uzatma Tekniği Transkripsiyonal Başlangıç ​​Noktalarını ve RNases yarılması Siteleri belirleme In Vivo

Fluorescence based primer extension (FPE) is a molecular method to determine transcriptional starting points or processing sites of RNA molecules. This is ...

Bu prosedürün genel amacı, bir floresan primer uzatma reaksiyonu kullanarak bakterilerden in vivo olarak transkripsiyonel başlangıç noktalarını ve RNA'ların bölünme bölgelerini tanımlamaktır. Bu, önce e coli veya S aria gibi bakterilerin büyümesi ve RNA moleküllerinin izole edilmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra, RNA, spesifik floresan primerler ve ters transkriptaz kullanılarak ters kopyalanır ve bu da CD NA fragmanları ile sonuçlanır.Daha sonra DNA veya plazmitler bakteri hücrelerinden izole edilir ve bir dizileme kiti kullanılarak DNA şablonundan bir floresan Sanger dizileme merdiveni oluşturulur. Son olarak, CDNA fragmanları ve sıralama merdivenleri ayrılır ve otomatik bir jel sıralayıcı kullanılarak bir poli akrilamid jel üzerinde aynı anda tespit edilir ve birbirleriyle karşılaştırılır. Sonuç olarak, floresan primer uzantısı, RNA moleküllerinin beş asal ucunu bir baz çözünürlüğe kadar haritalamak için kullanılır.Bu tekniğin, ırk veya radyoaktiviteye dayalı birincil uzatma gibi diğer yöntemlere göre ana avantajı, elektroforez sırasında algılama aynı anda gerçekleştiğinden, RNA moleküllerinin uçlarından beşinin hızlı bir şekilde tanımlanmasıdır. Duyarlılık, kırmızı aktiviteye dayalı birincil uzantılara benzer, ancak laboratuvar personelinin hız aktivitesi radyasyon güvenliği eğitimine ihtiyaç duymadan bu yöntemi kullanmasını sağlar. Toksin antitoksin sistemlerinin RNA bileşenlerini araştırmak için bu floresan birincil uzatma tekniğini başarıyla kullandık.Prosedürü gösteren stafilokok, laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olan Christopher Schuster olacak. Yüksek verimde bir RNA hazırladıktan ve metin protokolüne göre primerler tasarladıktan sonra, önce termodöngüleyiciyi 95 santigrat dereceye kadar ön ısıtarak primer uzatma reaksiyonunu gerçekleştirin. Her RNA numunesi için aşağıdaki bileşikleri bir PCR tüpünde karıştırın, numuneleri 95 santigrat derecede bir dakika boyunca denatüre edin.Ardından, primerleri ve RNA'yı hibritleştirmek için tüpleri beş dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin. Ardından, PCR makinesini 47 santigrat dereceye ayarlayın. Ardından, burada açıklandığı gibi ters transkripsiyon ana karışımını hazırlayın.Her hibritleştirilmiş RNA örneğine dört mikrolitre, bir ters transkripsiyon ana karışımı ekleyin ve tüpleri 47 santigrat derecede bir saat inkübe edin. Reaksiyonu durdurmak için numuneleri iki dakika boyunca 95 santigrat dereceye ısıtın. Daha sonra altı mikrolitre form amid yükleme boyası ekleyin ve gece boyunca veya karanlıkta eksi 20 santigrat derecede iki haftaya kadar saklayın.Genomik DNA veya plazmitleri hazırladıktan sonra, metin protokolüne göre, 12 mikrolitre yaklaşık 10 ila 15 mikrogram genomik DNA veya 100 ila 500 nanogram plazmit DNA'yı bir mikrolitre floresan etiketli primer ve bir mikrolitre DMSO pipeti ile karıştırarak Sanger dizileme reaksiyonunu birleştirin. Her dizilimin bir mikrolitresi, önceden etiketlenmiş ayrı PCR tüplerine karıştırılır. Daha sonra her tüpe üç mikrolitre D-N-A-D-M-S-O astar karışımı ekleyin.PCR makinesini aşağıdaki programa ayarlayın ve numuneleri makineye yerleştirdikten sonra çalıştırın. Çalışmadan sonra, numunelere ve ardından buzun üzerine altı mikrolitre yükleme boyası ekleyin. Hemen veya eksi 20 santigrat derecede temiz, tozsuz 25 santimetre plakalar kullanarak uzun süreli kullanıyorsanız, arka cam plakaya 0.25 milimetre ara parçalar yerleştirin ve çentikli cam plakayı, cam plakaların çentikli ucu ve ray giriş pilotlarının her ikisi de yukarı bakacak şekilde üste indirin.Jel raylarını cam plakaların her iki tarafına takın ve jeli dökmek için düğmeleri hafifçe sıkın. Burada listelenen bileşikleri bir beherde bir karıştırma çubuğu ile birleştirin ve manyetik bir karıştırma plakasına yerleştirin. Bir PS ekledikten ve bir araya geldikten hemen sonra, akrilamid çözeltisini almak için 50 mililitrelik bir şırınga kullanın ve uca 0.45 nanometrelik bir filtre yerleştirin.Sandviç plakaları 10 ila 20 derecelik bir açıyla yerleştirin ve şırınga ucunu sürekli olarak bir taraftan diğerine hareket ettirirken jel çözeltisini cam plakalar arasına yavaşça dağıtın. Jel solüsyonunu cam plakaların alt ucuyla buluştuğunda dağıtmayı bırakın. Bir baloncuk kancası kullanarak, oluşmuş olabilecek baloncukları çıkarın.Daha sonra jel cep ara parçasını çentikli uçtaki cam plakalar arasına kaydırın, jel çözeltisine batırın ve döküm plakasını takarak sabitleyin, üst ray vidalarını hafifçe sıkın ve jelin bir ila iki saat sertleşmesine izin verin. Döküm plakasını ve cep ara parçasını çıkarmadan önce, jeli çalıştırmak için tuz ve jel kalıntılarını temizlemek için damıtılmış deiyonize su kullanın. Tampon tankı tutucusunu ön cam plakalardaki jel raylarına kaydırın ve düğmeleri sıkın.Jeli, otomatik jel görüntüleyicinin alt jel tankına ısıtma plakasına doğru yerleştirin ve ray giriş pilotunu aparat braketlerine kaydırarak sabitleyin. Üst ve alt jel tampon bölmelerini doldurmak için bir XTBE tamponu kullanın. Ardından alt tampon bölmesini kapatın ve üst tampon bölmesini güce bağlamak için güç kablosunu kullanın.Jel cebinde tuz varsa, temizlemek için cebe tekrar tekrar pipetlemek için tampon kullanın. Ardından, üst tampon tankı haznesini kapatmak için üst tampon kapağını kullanın. Görüntüleyiciyi ve bilgisayarı açtıktan ve temel görüntü IR veri toplama yazılımını metin protokolüne göre başlattıktan sonra, tarayıcı kontrolünü ayarlamak için burada listelenen ayarları kullanın.Ardından, voltajı seçerek ve enter tuşuna basarak boş jeli 20 dakika önceden çalıştırın. Bu arada, bir PCR makinesi kullanarak, sıralama merdivenini ve astar uzatma ürünlerini iki dakika boyunca 90 santigrat dereceye ısıtın Buz üzerinde soğutmadan önce elektroforezi durdurun, otomatik jel sıralayıcıyı açın ve üst tampon tankı kapağını çıkarın. Ardından köpekbalığı dişi tarağını cam plakaların arasına ve köpekbalığı dişleriyle birlikte yerleştirin.Jel pipetini, astar uzatma ürünlerinden bir ila iki mikrolitre veya sıralama merdiveni reaksiyonlarını her bir jel cebine hafifçe delin. Boş cepler için. Tutarsız çalışma davranışını önlemek için doldurmak için yükleme boyası kullanın, tampon tankını ve jel sıralayıcının kapısını kapatın.Ardından, lazer için voltaj açık'ı seçerek elektroforezi başlatın, tarama durumunu seçin ve enter tuşuna basın. İlgilenilen bölge lazeri geçtikten sonra, burada gösterildiği gibi elektroforezi durdurun. Bir primer uzatma reaksiyonu, ilgilenilen transkriptlerin transkripsiyonel başlangıç noktalarını veya TSP'sini belirlemek için kullanılabilir ve promotör bölgelerin çıkarılmasına yardımcı olabilir.Bu örnekte, MPE mRNA'nın TSP'si, daha önce yayınlanmış verilerle tutarlı olarak G olarak tanımlanmıştır. Eksi 35 ve eksi 10 promotör elemanların T-T-G-T-A-A ve T-A-G-A-C-T olduğu çıkarıldı ve bu motifler, mRNA bölünme ürünlerini tanımlamak için primer uzantısı kullanan konsensüs dizilerinin her birinden yalnızca bazlara farklılık gösterir. RNA Ybi SEC iki tarafından START co-on'a yakın bölünmenin RNA haritalaması, RNA'lar mevcut olmadığında veya inaktif olduğunda, RNA'ların aktivitesinin bir sonucu olarak başlangıç ko-on'a yakın hiçbir primer uzatma ürünü oluşmadığında burada gösterilir.Bununla birlikte, başlangıç katının hemen aşağısında görünen iki güçlü bant, bu şekilde, tek tek bantların tanımlanmasını önleyen ters transkripsiyon reaksiyonundaki fazla RNA nedeniyle başarısız bir primer uzatma deneyini göstermektedir. Bu, toplam şablon RNA miktarının, ilgilenilen RNA'nın bolluğuna göre ayarlanması gerektiğini gösterir. Bu videoyu izledikten sonra, floresan primerler ve biraz pratikle otomatik bir jel sıralayıcı kullanarak in vivo olarak transkripsiyonel başlangıç noktalarının ve RNA'ların bölünme bölgelerinin nasıl açıklanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.Bu yöntemin gerçekleştirilmesi hızlı ve kolaydır. Deneylerinizde iyi şanslar.

fluorescence-based-primer-extension-technique-to-determine

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz Photobleaching sonra Floresan Kurtarma (sıkı bağlamak) ve embriyonik kök hücreleri (ES) kromatin protein dinamiklerini izlemek için (FLIP) Photobleaching Floresan kaybı da dahil olmak üzere photobleaching yöntemleri açıklanmaktadır. Kromatin plastisite çalışma araçlarının biri olarak kabul edilir Kromatin protein dinamiği, pluripotent hücreler geliştirilmiş.

Embriyonik Kök Hücreler Yaşayan Kromatin Protein Dynamics Tedbir Tahliller (sıkı bağlamak ve FLIP) Photobleaching

Biz son zamanlarda basit bir bakteriyel tespiti için floresan assay "mix-ve-okuma" kurmak için uygulanabilir Flourogenik DNAzyme probları üretmek için yeni bir yaklaşım bildirdin. Bu özel DNA sondaları böylece floresans sinyali kuşağa bakteriyel algılama çevirme belirli bakteri tarafından üretilen ham hücre dışı karışımı (CEM) varlığında, bir kromofor-değiştirilmiş-DNA RNA kimerik substratın bölünme katalize. Bu yazıda, "RFD-EC1" ifade belirli bir DNAzyme prob modeli bakterinin tespiti için...

Flourogenik DNAzymes kullanarak Bakterilerin Tespiti

Eksonükleazlar, genom stabilitesinin sağlanmasında kritik roller oynar. WRN eksonükleaz fonksiyonunun kaybı erken yaşlanmaya neden olur. Nükleazın substratlarını ve diğer gereksinimlerini in vitro olarak incelemek, in vivo rolünü aydınlatmaya yardımcı olabilir. Burada, nükleaz aktivitesini ölçmek için hızlı ve tekrarlanabilir floresan bazlı bir test gösteriyoruz.

İnsan Progeroid WRN Eksonükleazının Ortologu DmWRNexo'yu Karakterize Etmek için Floresan Bazlı Bir Eksonükleaz Testi ve Diğer Nükleazlara Uygulanması

Rasyometrik bimoleküler işaretleri (RBMBs) canlı hücreler görüntü tek bir mühendislik RNA transkriptleri için kullanılabilir. Burada, RBMBs, mikroporasyonu ve gerçek zamanlı olarak tek RNA transkriptlerinin floresan görüntüleme hücrelere RBMBs teslimat hazırlanmasını ve saflaştırılmasını tanımlarlar.

Oranlı metrik Bimoleküler Fenerleri kullanma Yaşam Hücrelerde Tek Engineered RNA Transkriptlerinin Gerçek zamanlı Görüntüleme

Bu çalışmada, aktif geliştiricilerin nasıl tanımlanabileceğine ve deneysel olarak doğrulanabileceğine dair deneysel bir iş akışı sağlıyoruz.

Tahmin ve Gen Düzenleme Elementlerin Doğrulama Retinoik Asit Kaynaklı Embriyonik sırasında Aktif Hücre Farklılaşma Kök

Burada, sadece kısa sentetik DNA ve RNA oligonükleotides ve arıtılmış pol II gerektiren RNA polimeraz II (pol II) uzama kompleklerinin montajını tarif ediyoruz. Bu kompleksleri, Pol II uzama kompleksi ile ilişkili transkriptlerin Co-transcriptional işleme temel mekanizmaları eğitim için yararlıdır.

Diseksiyon eş transkripsiyon RNA Işleme etkinlikleri için suni RNA polimeraz II uzama kompleksler

Tek moleküllü RNA floresan in situ hibridizasyon (smFISH), belirli RNA'ların seviyelerini ve lokalizasyonunu tek hücre düzeyinde doğru bir şekilde ölçmek için bir yöntemdir. Burada, belirli RNA'ların tek hücreli nicelleştirilmesi için ıslak tezgah işleme, görüntüleme ve görüntü analizi için onaylanmış laboratuvar protokollerimizi rapor ediyoruz.

Transkripsiyonel Aktif Alellerin Tek Molekül FISH ile Tek Hücre Analizi

DNA metiltransferazlar potansiyel kanser ilaç hedefleridir. Burada, DNA metiltransferaz inhibisyonu için küçük molekülleri değerlendirmek için bir protokol sunulmaktadır. Bu tahlil, DNA metilasyonunu floresan üretimine bağlamak için bir endonükleaz kullanır ve enzim aktivitesinin gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlar.

DNA Metiltransferaz İnhibitörlerini Taramak için Sürekli Floresan Bazlı Endonükleaz Bağlantılı DNA Metilasyon Testi

Bu çalışma, DNaz aktivitesinin tespiti ve kantitatif değerlendirmesi için basit, kullanıcı dostu bir oransal FRET testi sunar ve zayıf bir nükleazın analizinde uygulamasını gösterir.

DNaz Aktivitesinin Oransal Floresan Rezonans Enerji Transferi ile Değerlendirilmesi

Bu protokol, fare embriyonik kök hücrelerinde intergenik ve intragenik güçlendirici RNA'ların kararlılığını ve yarı ömrünü Aktinomisin D tedavisi, RT-qPCR ve doğrusal olmayan regresyon analiziyle nicel olarak ölçer. Konuma özgü normalleştirme stratejileri, eRNA bozunma dinamiklerini bağlama bağlı olarak doğru şekilde modellemek için dahil edilir.

Fare embriyonik kök hücrelerinde Enhancer RNA Stabilitesinin Optimize Edilebilir Nicel Değerlendirmesi

Öğrenin, bakteri transkriptlerinde transkripsiyonel başlangıç noktalarını ve RNA yarılma bölgelerini belirlemek için floresan bazlı astar uzatma yöntemini. Bu teknik otomatik jel sekanslayıcı kullanarak yüksek çözünürlüklü haritalama sağlar.

Floresan Bazlı Astar Uzatma Tekniği Transkripsiyonal Başlangıç ​​Noktalarını ve RNases yarılması Siteleri belirleme In Vivo

Daha fazla video keşfet

Floresan Bazlı Astar Uzatma Tekniği Transkripsiyonal Başlangıç Noktalarını ve RNases yarılması Siteleri belirleme In Vivo