Name: Kemokin Sinyalizasyonu Bağlı Hücresel ve Moleküler Polarizasyon Hızlı ve Sağlam Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Öğrenin, görüntüleme akış sitometrisi kullanarak T hücrelerinde kemokin uyarımı sonrası hücre morfolojisi ve protein lokalizasyonu değişikliklerini hızlı ve güvenilir şekilde nicelendirmeyi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar ölçüde Pierre BOURDONCLE, Thomas Guilbert ve Cochin Görüntüleme Tesisi Louise Rimbault kabul. Bu çalışma Inserm, CNRS ve Ligue Nationale contre le Kanser (Equipe labellisée) tarafından desteklenmiştir.

T Lemfositleri hazırlanması 1. <ol><li> 10,11 tarif edildiği gibi primer, fare veya insan T hücrelerini hazırlamak. </li><li> 3 x 10 6 hücre / mL - 2 arasında bir yoğunlukta% 10 insan serumu AB ile tam RPMI ortamı içinde insan T hücrelerini yetiştirmek. Not: kültürde insan T hücrelerinin büyük bir kısmını kendiliğinden polarizasyon ortaya fetal sığır serumu (FCS) yerine, insan serumu kullanılması. Bu dönemde herhangi bir zamanda 5 gün ve daha fazla işlem onları - 4 kültürde bu hücreleri tutun. </li><li> Benzer bir hücre yoğunluğunda,% 10 FCS ile desteklenmiş tam RPMI ortamı içinde fare T hücrelerini koruyun. 10 ng / ml IL7 mevcudiyetinde 37 ° C &#39;de hemen ya da ertesi gün, bir O / N kültürden sonra kullanın. </li><li> Tam RPMI,% 10 FCS ile takviye edilmiş CEM insan T hücre soyu geliştirin. </li></ol> 2. Kemokin Uyarım <ol><li> 10 mM HIPE ile desteklenmiş sıcak HBSS ortamında deneysel koşul başına 5 x 10 5 hücre yıkayıns. Bazı deneyler için, 2 ug pmaxGFP ve 8 ug pcDNA3.1 + (boş vektör kontrol), ölü yer PKCζ kinaz ya da N-ucu Par6 plazmidler ile bir gün önce, primer insan T hücrelerinin ko-transfekte. </li><li> Sıcak HBSS-hepes ortamında hücre pelletini (deneysel koşullar 0.3 ml x numarasını kullanın). </li><li> 1.5 ml mikrosantrifüj tüplerine hücreleri dağıtın. NOT: Bu nedenle, tek bir deneysel koşuluna karşılık gelen bir boru, 0.3 ml HBSS-HEPES ortamında 5 x 10 5 hücre içerir. Bazı deneyler için, 500 nM Latrunculin A veya aracı (DMSO) ilave ediniz ve kemokin uyarılmadan önce 30 dakika için kuluçkalayın. </li><li> Her bir tüp içinde 10 ng / ml CCL19 veya CXCL12 kemokin 500 ekleyin. NOT: Biz genellikle 10 kullanın - İnsan T hücreleri için 200 ng / ml kemokini. CEM hücreleri CCL19 bağlayan CCR7 reseptörü ifade yoktur. Bu nedenle, CEM hücreleri sadece bir CXCL12 uyarısına cevap mümkün olacak. 500 N - Ayrıca, daha yüksek bir kemokin konsantrasyonları (300 kullanımıg / ml) fare T hücrelerini kutuplaşmaya. </li><li> Tüpler birkaç kez ters çevirin ve sırasıyla, birincil T hücrelerinin veya CEM 8 ya da 10 dakika boyunca 37 ° C su banyosu içinde inkübe. </li><li> Her bir tüpe,% 2 paraformaldehit (PFA) ile PBS içinde 10 mM Hepes ihtiva eden ılık bir çözeltiye, 0.3 ml ilave etmek suretiyle polarizasyon işlemi durdurun. Tüpler ters çevirin ve 5 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe. </li></ol> 3. Renklendirmeler <ol><li> Tüpler akış sitometri mikrosantrifüj tüpleri hücreleri aktarın. </li><li> % 1 sığır serum albümini (BSA), 0.5 mM EDTA ve PBS içinde 10 mM Hepes ihtiva eden bir RT çözeltisi ile tam olarak tüpler doldurun. </li><li> 4 dakika için 460 xg&#39;de tüpler santrifüj. </li><li> Süpernatant atılır ve PBS içinde% 5 FCS ihtiva eden bir RT çözeltisi 100 ul süspansiyon hücrelerin. </li><li> Işıktan uzakta, girdap onları, her bir tüp içinde FITC-anti-HLA-ABC 5 ul ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe. </li><li> PBS,% 5 FCS ihtiva eden bir kez hücreler yıkayınSadece bir kez PBS ile nd. </li><li> Oda sıcaklığında: daha sonra% 1 BSA, 0.5 mM EDTA ve PBS içinde 10 mM HEPES içeren bir solüsyon ile yıkama hücreleri, 10 dakika süre ile inkübe edilir, 500 ul% 1 PFA ekleyin. </li><li> Süpernatant atılır, PBS,% 0.2 BSA,% 0.1 saponin, 0.5 mM EDTA ve 10 mM Hepes (permeabilizasyon tamponu) ihtiva eden bir çözelti ile tamamen tüpleri doldurun. </li><li> Bu ortam içinde hücreler iki kez yıkayın. </li><li> Orta kaldırmak ve hücre pelet ayırmak için onları vorteks tüpleri çevirin. </li><li> Her bir tüpe, anti-P-KRY antikorun 100 seyrelti, girdap onları ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir: ve / veya 1 ila 0.25 ug / ml TRITC-falloidin ekleyin. </li><li> Permeabilizasyon tampon maddesi ile hücreleri yıkayın. Bir fluorescent sekonder antikor gerektiğinde kuluçkalayın. </li><li> 200 ul PBS hücrelerin tekrar ve mikrosantrifüj tüpler aktarabilirsiniz. NOT: Hücreler edinimi için hazırız. Tüp başına 200 ul maksimum toplam hacmi korurken, alternatif olarak, bir son% 1 konsantre PFA eklemekHücreler daha fazla işlem için aynı gün kullanılmak üzere takdirde için yoğunlaştırma lekelenmelerinin korumak için. </li></ol> 4. Görüntüler Toplama ve Analiz <ol><li> Aparat (Belirli Reaktifler / Ekipman Tabloya bakınız) açın ve üreticinin talimatlarına göre kendisini kalibre edelim. NOT: INSPIRE yazılımı 40X objektif (0.75 NA) ile kullanılmıştır. FİKİRLER 3.0 yazılımı tüm bildirilen sayımsal için kullanılmıştır. </li><li> Gelecek deneyler için bir şablona kaydedilebilir satın alma pencereleri bir dizi hazırlayın. RMS degrade değerlerini ölçmek histogramlar çizin. RMS degrade histogram seçilen &quot;Focus&quot; nüfus itibaren, Alan histogram &quot;Tek hücreli&quot; nüfus sınırlandırmak. Mikrosantrifüj tüpü makinesinde yerleştirildikten sonra, tek tek hücreler ile bir kapı lazer gücünün ayarlanması ve 5000 T lenfositleri kazanır. </li><li> Yumuşak Fikirlerware, satın alma dosyasını açın ve her hücre için elde edilen parlak bir alan görüntüler için degrade RMS değerini gösteren bir histogram (Kanal 1) oluşturun. 57 Yukarıda RMS degrade değeri sergileyen hücreler gördüğü RMS degrade histogram üzerinde bir kapı çizin. NOT: RMS degrade analizinde odak düzleminde sadece T lenfositler dikkate alarak sağlar. Bu 57 um&#39;nin RMS gradyan değeri gösteren tek tek hücreler odak düzlem içindedir ve doğru olarak kabul edilebilir ampirik olarak tespit edilmiştir. </li><li> Analiz / Maskeler menüsünde, 2 piksel aşınmış aydınlık görüntüler M01, üzerinde morfoloji maskesinden (M01,2) Erode denilen, yeni bir maske oluşturmak. Ardından, Analiz / Erode (M01,2) maske hesaplanan Area, yeni bir özellik oluşturmak, menü bulunmaktadır. Bir önceki kapısı seçilen hücrelerden, bu yeni oluşturulan maske kullanarak hücrelerin Alan gösteren bir histogram açın. NOT: ulaşırsınız morfoloji maskeleriVarsayılan hücrenin gerçek boyutundan daha büyüktür. Böylece, 2 piksel o kadar aşındırmak için daha hassas. </li><li> Kalibrasyon boncuk ve enkaz (küçük Alan) ve çiftler (büyük Area) hariç, bireysel T hücreleri üzerinde bir kapı çizin. Her satın alma bu kapıyı ayarlayın. NOT: Hücre boyutu varyasyonlar kapısı konumunu etkileyecektir. Fare T hücrelerinin kendilerini CEM hücreleri daha küçük olan insan T hücrelerinin daha küçük olduğu için, her hücre tipi alan büyüklüğü ile orantılı olacaktır. </li><li> Önceki adımlarda Geçitli edildi tek odakta hücreleri göz önüne alındığında, Phalloidin Raw Max Pixel bir fonksiyonu olarak HLA-ABC boyama Raw Max Pixel (Kanal 2, x ekseni) oluşan bir nokta arsa açmak boyama (Kanal 4, y ekseni). Lekesiz veya doymuş floresan olayları dışlamak için bir kapı oluşturun. Ham Max HLA-ABC için Pixel (Kanal 2) ve Phalloidin (Kanal 4) lekelenmelerinin gösteren Aç iki histogramlar. </li><li> Analiz / Maskeler menüsünde, creat içinde2 piksel aşınmış HLA-ABC boyanmış hücreler (Kanal 2), morfolojisi maskesinden (M02,2) Erode denilen adet yeni maske. Ardından, Analiz / Erode (M02,2) üzerinden hesaplanan Circularity parametresi oluşan yeni bir özellik oluşturmak, menü bulunmaktadır. NOT: Bu parametre, bir daire hücre şeklinin sapmasını ölçer. Bu nedenle, mükemmel yuvarlak T hücresi düşük dairesellik endeksi sergileyecek uzatılmış polarize hücreler ise yüksek bir yuvarlaklık değerine sahip olacaktır. </li><li> Daha sonra, daha önce kapı hücrelerden Circularity özelliği değerlerini rapor başka bir histogram yaratmak. Doğrudan her bir hücre için daireselliğe değerine göre bir birey, odakta hücre popülasyonu dağılımının çizmek için bu histogram kullanın. </li><li> Uyarılmamış hücrelere için histogram şeklinde bakıldığında, dairesellik sınır değerine kadar düşük dairesellik değerden başlayarak polarize hücreler için bir kapı çizmek burada Uyarılmamış hücrelere ençizilmiştir. Kapılı nüfus arasında polarize hücrelerin yüzdesi istatistikleri ekrana bak (% Geçitli). NOT: Biz 13 altında Circularity indeks değerleri için bu kapıyı belirledik. </li><li> Hücrelerde aktin boyama kutuplaşma bakmak için, HLA-ABC boyama (Kanal 2) ve falloidin boyama karşılaştırarak, Parlak Detay Benzerlik R3 değeri için histogram arsa (Kanal 4). NOT: Bu özellik büyük değeri, en fazla iki Renklendirmeler vardır bindirilmiş. </li><li> Daha önce olduğu gibi aynı yolluk strateji kullanarak, polarize aktin boyama ile hücrelerin yüzdesini gösterir ayrılmış boyama için, uyarılmamış hücreler ile bir kapı çizilir. </li><li> Tamamlandığında, MHC Sınıf I ve falloidin boyamalar, birlikte SD ± bütün hücrelerin Circularity ve Benzerlik indeksleri ortalama değerleri ile polarize hücrelerin yüzdesi dağılımında bir ayrımı sergileyen hücrelerin yüzdesi Nominal değerden uygun olarak gösterilmektedironding istatistik paneller. </li></ol>

<ol><li>Rossi, D., Zlotnik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+chemokines+and+their+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The biology of chemokines and their receptors.</a> Annu Rev Immunol. 18, 217-242 (2000).</li>
<li>Thelen, M., Stein, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+chemokines+invite+leukocytes+to+dance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">How chemokines invite leukocytes to dance.</a> Nat Immunol. 9 (9), 953-959 (2008).</li>
<li>Rougerie, P., Rho Delon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTPases%3A+masters+of+T+lymphocyte+migration+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Lett%22%5BJournal%5D)">GTPases: masters of T lymphocyte migration and activation.</a> Immunol Lett. 142 (1-2), 1-13 (2012).</li>
<li>Sanchez-Madrid, F., del Pozo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+polarization+in+cell+migration+and+immune+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Leukocyte polarization in cell migration and immune interactions.</a> Embo J. 18 (3), 501-511 (1999).</li>
<li>Adams, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte+growth+factor+and+macrophage+inflammatory+protein+1+beta%3A+structurally+distinct+cytokines+that+induce+rapid+cytoskeletal+changes+and+subset-preferential+migration+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte growth factor and macrophage inflammatory protein 1 beta: structurally distinct cytokines that induce rapid cytoskeletal changes and subset-preferential migration in T cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (15), 7144-7148 (1994).</li>
<li>Rougerie, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fam65b+is+a+new+transcriptional+target+of+FOXO1+that+regulates+RhoA+signaling+for+T+lymphocyte+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fam65b is a new transcriptional target of FOXO1 that regulates RhoA signaling for T lymphocyte migration.</a> J Immunol. 190 (2), 748-7455 (2013).</li>
<li>Real, E., Faure, S., Donnadieu, E., Delon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+Atypical+PKCs+regulate+T+lymphocyte+polarity+and+scanning+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: Atypical PKCs regulate T lymphocyte polarity and scanning behavior.</a> J Immunol. 179 (9), 5649-5652 (2007).</li>
<li>Negulescu, P. A., Krasieva, T. B., Khan, A., Kerschbaum, H. H., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarity+of+T+cell+shape%2C+motility%2C+and+sensitivity+to+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Polarity of T cell shape, motility, and sensitivity to antigen.</a> Immunity. 4 (5), 421-430 (1996).</li>
<li>Zuba-Surma, E. K., Kucia, M., Abdel-Latif, A., Lillard, J. W., Ratajczak, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ImageStream+System%3A+a+key+step+to+a+new+era+in+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Histochem+Cytobiol%22%5BJournal%5D)">The ImageStream System: a key step to a new era in imaging.</a> Folia Histochem Cytobiol. 45 (4), 279-290 (2007).</li>
<li>Matheu, M. P., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+CD4%2B+T+cells+from+mouse+lymph+nodes+using+Miltenyi+MACS+purification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification.</a> J Vis Exp. (9), 409(2007).</li>
<li>James, E. A., LaFond, R., Durinovic-Bello, I., Kwok, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+antigen+specific+CD4%2B+T+cells+using+MHC+class+II+tetramers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualizing antigen specific CD4+ T cells using MHC class II tetramers.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li>
<li>Wabnitz, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-plastin+phosphorylation%3A+a+novel+target+for+the+immunosuppressive+drug+dexamethasone+in+primary+human+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">L-plastin phosphorylation: a novel target for the immunosuppressive drug dexamethasone in primary human T cells.</a> Eur J Immunol. 41 (11), 3157-3169 (2011).</li>
<li>Freeley, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-plastin+regulates+polarization+and+migration+in+chemokine-stimulated+human+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">L-plastin regulates polarization and migration in chemokine-stimulated human T lymphocytes.</a> J Immunol. 188 (12), 6357-6370 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını olduğunu beyan ederim.

Sitometri, hızlı ve bilgilendirici yolluk strateji kemokin uyarımı ile uyarılan hücresel ve moleküler olayları analiz etmek görüntüleme akışının son teknolojiyi kullanarak sunulmuştur. Kemokin uyarılması ve polarizasyon sürecinde farklı proteinlerin hücre içi dağılımı ile oluşturulan hücre morfolojisi değişiklikleri: Tek bir deney itibaren, bir iki ana bilgi edinebilirsiniz. İlginç bir şekilde, kanıtlar da istatistiksel sağlamlık ve bütün hücre nüfusun küçük bir fraksiyonu ilgili analizine izin verir hücrelerin geniş bi...

Kemokinler özel yerlere 1 hücreleri çekmek küçük çözünebilir proteinlerdir. Bu nedenle, bu dokularda hücre doğru konumlandırılması, geliştirme ve fizyolojisi çok önemli bir işlevine katılırlar. Bu, etkili bir bağışıklık karşılığının ortaya çıkarılması için birlikte hareket birçok farklı hücre tiplerinin hareketlerine dayanır, bağışıklık sistemi, bu kurala istisna değildir. Yabancı antijenler tespit ve nötralize edilebilir önce belirli bir durumda bir bağışıklık hücre tipi özel konumunu kontrol ederek, kemokinler önceden gerekli bulunmaktadır. Özellikle T lenfositleri kemokinler T hücresi hareketliliği 2,3 tercih geçişi üzerine, hücreiçi sinyal ortaya, özel yüzey reseptörleri (kalsiyum yükselişi ERK fosforilasyonu, Rho GTPazlar aktivasyonu, integrinler afinite ve sitoskeletal değişimler artış) bağlanır. Hücresel düzeyde, bir kemokin stimülasyon üzerine ortaya morfolojik değişiklikler gözlemleyebilirsiniz.Hücre şekilleri bu değişiklikler T hücrelerinin özellikle dramatik: kanda seyahat ederken dinlenme T hücreleri, bir boncuk gibi yuvarlak morfoloji var. Ön bir ön kenarı: Bununla birlikte, iltihabik bölgelerde veya lenfoid organların yakınlık kemokinlerin varlığı algılama hemen iki kutuplu bir formundan oluşan tipik bir &quot;el ayna&quot; morfolojisi kabul T hücrelerinin şeklinin değiştirilmesi için gidiyor ve arka 4 bir arka kenar veya uropod. Buna ek olarak, hücre içi bileşenleri göç sürdürmek için polarize T hücresinin bu iki zıt bölgeye ayırmak olabilir. Örneğin kemokin uyarımı 5 ve polimerize aktin üzerine aktin filamentler polimerizasyon artar kutuplaşmış T hücresinin 2 ön birikir. Öte yandan, bu tür kortikal F-aktin hücre iskeleti, plazma membranı bağlantı Ezrin-Radixin-moesin (ERM); ailesinin fosforile proteinler gibi bazı proteinler, kutuplaşmış uropod yeniden lokalizeT hücreleri, 6. İlginç bir şekilde, ve diğerleri, bu kutuplaşma süreci T hücre göçü için gerekli olduğunu göstermiştir. Nitekim, polarizasyon müdahale herhangi bir tedavi hücresel hareketliliğini engeller. Örneğin, atipik protein üyelerinin etkinliğinin engellenmesi, C (PKC), aile, PKCζ ve PKCι blok T hücresi polarizasyon ve dendritik hücrelerin 7 için göç tarama işlemini kinaz. T hücre kutuplaşma da Rho GTPases tarafından düzenlenir. Son zamanlarda tarif edildiği Fam65b proteini ile RhoA aktivitesinin modüle bir Transwell tahlilinde 6 geçirilecek T hücre morfolojisindeki değişikliklerle ve kapasiteyi etkiler göstermiştir. Polarizasyon hücre motilitesi için bir ön adım olarak, kemokin tepkilerin ana okuma olarak ölçmek mümkün böylece önemlidir. Hücre şekli değişiklikleri önceden elle 8 ölçüldü. Ancak, miktar bu tür çok zaman tüketen olduğunu, genellikle sadece birkaç yüzdenhücre on dikkate alınmaktadır. Burada, yeni bir yöntem hızlı uyarımı kemokin maruz bırakılan T lenfositlerinin şekil değişiklikleri derecesini ölçmek için sunulmuştur. Teknoloji sitometri bir görüntüleme akış kemokin stimülasyon farklı koşullarda verimli polarize hücrelerin miktarını ölçmek için bir akış sitometresinde ve bir mikroskop 9 avantajlarını birleştiren, kullanılan (Belirli Reaktifler / Ekipman Tablo). Bir bu teknoloji ile sağlam ölçebilen morfolojik değişimlerin değerlendirilmesiyle ek olarak, bu kemokin sinyali üzerine, bazı proteinlerin hücre altı lokalizasyonda değişiklikleri değerlendirmek için de mümkündür.

<table><tbody><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>İnsan serumu AB</td><td>PAA</td><td>C11-021</td><td>Tamamlayıcıyı etkisiz hale getirmek için önceden ısıtın.</td></tr><tr><td>Fetal buzağı serumu</td><td>PAN Biotech</td><td>P30-3300</td><td>Tamamlayıcıyı inaktive etmek için önceden ısıtın.</td></tr><tr><td>İnsan T hücresi nükleofaktör kiti</td><td>Lonza</td><td>VCA-1002</td><td></td></tr><tr><td>Murin IL7</td><td>Peprotech</td><td>217-17</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025-050</td><td>37 ° C'de sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu.</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>Murine CCL19</td><td>Peprotech</td><td>250-27B</td><td>Aliquots, kemokin hücrelere eklenmeden önce buz üzerinde çözülür.</td></tr><tr><td>İnsan CCL19</td><td>Peprotech</td><td>300-29B</td><td>Alikotları, kemokin hücrelere eklenmeden önce buz üzerinde çözülür.</td></tr><tr><td>İnsan CXCL12</td><td>Peprotech</td><td>300-28A</td><td>Alikotları, kemokin hücrelere eklenmeden önce buz üzerinde çözülür. Bu kemokin, fare T hücrelerinde de kullanılabilir.</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>157-8-100</td><td>Bu, suda% 8'lik bir PFA çözeltisidir. PBS'de %2'lük bir PFA çözeltisi elde etmek için 4x PBS ile hacmi hacimle karıştırın.</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Fluka</td><td>84510</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A12381</td><td></td></tr><tr><td>FITC-anti-anti-HLA-ABC antikoru</td><td>Beckman Coulter</td><td>IM1838</td><td>klonu B9.12.1</td></tr><tr><td>Anti-P-ERM antikoru</td><td>Hücre Sinyal Teknolojisi</td><td>3149P</td><td></td></tr><tr><td>ImageStreamx Mark II</td><td>Amnis</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

kemokin sinyalizasyonu bağlı hücresel ve moleküler polarizasyon hızlı ve sağlam analizi

Rapid and Robust Analysis of Cellular and Molecular Polarization Induced by Chemokine Signaling

Hücreler, bir süreç olarak adlandırılan kutuplaşma onların yuvarlak kaybederek ve birçok proteinlerin hücre içi lokalizasyonu değiştirerek uyarılmasını kemokin cevap. Klasik görüntüleme teknikleri bu olguları incelemek için kullanılmıştır. Bununla birlikte, morfolojisi ve hücre onlarca boyama eş-lokalizasyonu zaman alıcı miktarının ardından birçok hücrede elle toplama gerektiriyordu. Burada, hızlı ve güçlü bir yöntem, bir sitometresinde kişilerce mikroskop avantajlarını bir araya teknolojisi sitometri bir görüntüleme akışı kullanılarak hücrelerin birkaç bin oluşan numuneler üzerinde, bu olayları incelemek için tarif edilmektedir. MHC sınıf I molekülleri ve filamentli aktin için CCL19 ve boyama ile uyarılmış T lenfositleri kullanılarak bir yolluk stratejisi aynı zamanda şekil değişikliklerinin derecesi ve CCL19 sinyal etkilenen belirteçlerin eş-lokalizasyonu derecesini ölçmek için sunulmuştur. Üstelik, bu yolluk strateji gözlemleme için bize izine CXCL12 uyarıldıktan sonra polarize T hücrelerinde (ön) ipliksi aktin ve (arkada) fosforile Ezrin-Radixin-moesin (fosfo-ERM) proteinlerin ayrımı. Par6 / atipik PKC sinyal yolunun mutantlar bir farmakolojik inhibitörü ve ifade ile aktin polimerizasyonu inhibe: Bu teknik aynı zamanda iki farklı unsurların kutuplaşma engelleme etkisini gözlemlemek için yararlı oldu. Böylece, kanıtlar bu tekniğin morfolojik değişiklikler ve protein yeniden dağıtımı esnasında hem de analiz etmek yararlı olduğu gösterilmiştir.

Burada seçilen ilk örnek CCL19 ile uyarılmış insan primer T lenfositlerinin kullanımı ile ilgilidir. Bununla birlikte, aynı strateji primer fare T hücreleri, T hücre çizgileri ya da kemokin stimülasyona yanıt veren herhangi bir başka hücre tipi ile kullanılabilir. Burada sunulan yolluk strateji odaklı olaylar, ardından tek hücreleri seçin pencerelerin bir dizi içerir. (Şekil 1) veya CCL19-uyarılmış (Şekil 2), T lenfositleri istirahat için MHC Sınıf I HLA-ABC ve ipliksi aktin: Nihayet fl...

Kemokin sinyali, hücresel morfolojide belirgin değişiklikler ve hücre içi proteinlerin bazı önemli yeniden dağılımlarını ortaya çıkarır. Burada, bu olayları incelemek için hızlı ve ayrıntılı bir protokol sağlanmaktadır.

Kemokin Sinyalizasyonu Bağlı Hücresel ve Moleküler Polarizasyon Hızlı ve Sağlam Analizi

Cells respond to chemokine stimulation by losing their round shape in a process called polarization, and by altering the subcellular localization of many ...

Aşağıdaki prosedürün amacı, belirli bir uyarana yanıt olarak hücre morfolojisindeki değişiklikleri ve çok sayıda hücrede ilgilenilen spesifik proteinlerin hücre altı lokalizasyonunu hızlı ve otomatik olarak ölçmektir. Bu, ilk olarak T hücrelerinin kemoterapi türleri ile uyarılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adımda, hücreler floresan olarak etiketlenir ve daha sonra görüntüleme akış sitometrisi ile analiz edilir.Son adımda, morfolojik olarak polarize lenfositlerin sayısı ve floresan belirteçlerin ayrılma miktarı, seçilen maskeye bağlı olarak her boyama için piksellerin konumuna ve yoğunluğuna göre değerlendirilebilir. Sonuç olarak, bu görüntüleme akışı sitometrisi teknolojisi, kemokin stimülasyonundan sonra lenfositlerin morfolojik değişikliklerini ve ayrıca polarize hücreler içindeki ilgilenilen spesifik proteinlerin konumunu hızlı ve sağlam bir şekilde ölçmek için kullanılabilir. Bu tekniğin mikroskopi gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, çok sayıda hücrenin tekrar tekrar işlenebilmesi ve otomatik olarak analiz edilebilmesi, morfolojik değişikliklerin ve protein dağılımının istatistiksel olarak güçlü bir şekilde analiz edilmesini sağlamasıdır.Kemokin ile uyarılmış T lenfositlerde, T hücrelerinin Boche tipi stimülasyonu, oda sıcaklığında 340 kez beş dakika boyunca 10 milimolar HEP santrifüjü ile desteklenmiş ılık HBSS'G.At de deney koşulu başına beş hücreyi beş kez merkezleyerek başlar, supinatı çıkarın ve peletleri tüp başına 0.3 mililitre ılık HBSS he parçasında yeniden süspanse edin. Daha sonra hücre süspansiyonlarını ayrı ayrı 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüplerine aktarın. Her tüpe mililitre kemokin başına 10 ila 500 nanogram ekleyin ve ardından karıştırmak için tüpleri birkaç kez çevirin.Hücreleri 37 santigrat derece su banyosunda inkübe edin. Sekiz ila 10 dakika sonra, 10 milimolar ile desteklenmiş 0,3 mililitre ılık,% 2 paraldehit ile polarizasyonu durdurun. O bezelye.Daha sonra tüpleri daha fazla çevirme ile karıştırın ve immünofloresan analizi için hücreleri boyamak için 37 santigrat derecede beş dakika daha inkübe edin. Daha sonra, uyarılmış T hücrelerini karşılık gelen akış sitometri tüplerine aktarın. Tüpleri tamamen boyama tamponu ile doldurun.Daha sonra hücreleri döndürün ve peletleri PBS'de 100 mikrolitre% 5 fetal buzağı serumunda yeniden süspanse edin. Şimdi her tüpe beş mikrolitre ZI N-T-H-L-A-A-B-C ekleyin. Onları vorteksleyin ve inkübasyonun sonunda hücreleri karanlıkta 30 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.Hücreleri iki kez yıkayın ve ardından 500 mikrolitre% 1 para formaldehit içinde inkübe edin. 10 dakika sonra, hücreleri daha fazla boyama tamponunda yıkayın ve ardından tüpleri tamamen geçirgenlik tamponu ile doldurun. Hücreleri geçirgenlik tamponunda iki kez yıkadıktan sonra, supinatı çıkarmak için tüpleri terk edin ve daha sonra hücre peletlerini ayırmak için bunları girdaplayın.Şimdi numuneleri mililitre başına sıfır noktası 25 mikrogram, bel için trixi ile boyayın, girdaplayın ve karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Daha sonra inkübasyon süresinin sonunda, hücreleri geçirgenlik tamponunda yıkayın. Yine, resus.Peletleri 200 mikrolitre PBS'de askıya alın ve daha sonra kemokin stimülasyonundan sonra polarize T hücrelerinin yüzdesini belirlemek için hücreleri ayrı mikro santrifüj tüplerine aktarın. Önce görüntüleme akış sitometresini açın ve üreticinin talimatlarına göre kendini kalibre etmesine izin verin. RMS gradyanında seçilen odak içi popülasyondan RMS gradyan değerlerini ölçen histogramlar çizin.Histogram, mikro santrifüj tüpü makineye yerleştirildikten sonra alanın histogramında tek hücre popülasyonunu tanımlar, tek tek hücreler üzerinde lazer güç yürüyüşünü ayarlar ve 5.000 T lenfosit elde eder. Fikir analizi yazılımında. Alınan dosyaları açın, ardından her bir hücre için elde edilen parlak alan görüntüleri için gradyan RMS değerini gösteren bir histogram oluşturun, hücrelerin üzerine bir geçit çizin ve 57'nin üzerinde bir RMS gradyan değeri sergileyin.Analiz menüsünde, iki pikselden aşınmış parlak alan görüntülerindeki morfoloji maskesinden M1 ikisini aşındırmak adlı yeni bir maske oluşturun. Daha sonra analiz özellikleri menüsünde, önceki kapıda oluşturulan hücrelerden erode M1 iki maskesi üzerinde hesaplanan alanın yeni bir özelliğini oluşturun. Hücrelerin alanını gösteren bir histogram açın Bu yeni oluşturulan maskeyi kullanarak, küçük alandaki kalibrasyon boncukları ve kalıntıların yanı sıra geniş alandaki çiftler hariç, tek tek T hücrelerinin üzerine bir kapı çizin.Daha sonra a. botu açın. H-L-A-A-B-C boyamasındaki ham maksimum pikselin bir fonksiyonu olarak Phin boyamasındaki ham maksimum pikselin bir fonksiyonu olarak analiz maskeleri menüsünde yeni maskeye geri aşındırma adı verilen yeni maskeye iki tane H-L-A-A-B-C boyama hücrelerinin morfoloji maskesinden iki pikselden aşınmış. Daha sonra analiz özellikleri menüsünde, erode M iki iki üzerinde hesaplanan dairesellik parametresinden oluşan yeni bir özellik oluşturun.Ardından, daha önce kapılı hücrelerden dairesellik özelliğinin değerlerini raporlamak için başka bir histogram oluşturun. Daha sonra, uyarılmamış hücreler için histogramın şekline bakıldığında, polarize hücreler için RO akik, en düşük dairesellik değerinden başlayarak, uyarılmamış hücrelerin çoğunun hücreler içindeki aktin lekelenmesinin polarizasyonunu değerlendirmek için çizildiği dairesellik sınır değerine kadar. Ayrıca parlak detay benzerliği için bir histogram, H-L-A-A-B-C ve boyamadaki foid'i karşılaştırmak için R üç değeri.Daha sonra, az önce gösterildiği gibi aynı geçit stratejisini, ayrıca kolokalize olmayan ayrılmış boyama için uyarılmamış hücreler üzerinde bir GA kullanarak. İstatistik paneli, burada polarize aktin boyaması olan T hücrelerinin yüzdesini gösterir. Polarize olmayan veya polarize hücrelerin kapısına düşen CCL 19 ile uyarılmış T lenfositlerinin örnekleri gösterilmiştir.Her iki alt popülasyon arasındaki morfolojideki farklılıklar açıkça gözlemlenebilir. Az önce gösterilen geçit stratejisi, CCL 19'un yokluğunda polarize kapıya düşen hücrelerin yüzdesini çizmek için de kullanılabilir. Beklendiği gibi, kemokin stimülasyonunun polarize T hücrelerinin yüzdesini arttırdığı açıktır.Her iki koşul altında elde edilen tüm hücre popülasyonunun ortalama dairesellik indeksi de çizilebilir. Gerçekten de, CCL 19 stimülasyonu bu endekste bir düşüşe neden olur. Bununla birlikte, hücrelerin sadece yarısı polarize olduğundan, CCL 19 stimülasyonu üzerine gözlenen ortalama dairesellik indeksindeki değişiklik küçüktür.Bu deneyde, T hücreleri, par altı polarite kompleksinin baskın negatif mutantlarını kodlayan plazmitlerle birlikte GFP ile kesildi. PKC zeta. Transfekte edilmemiş hücreler için histogram, ilgili GFP pozitif T hücreleri için spesifik geçitlemeye izin verdi ve tüm hücre popülasyonunun küçük bir kısmının transfekte edildiğini gösterdi.Bu transfekte edilmiş hücrelerin morfolojik polarizasyon derecesi daha sonra sadece GFP pozitif hücrelerin dairesellik indeksi ve T hücreleri için ek bir yürüyüş ölçülerek ölçüldü. Alınan her koşul altında polarize hücrelerin yüzdesini tahmin etmek için düşük dairesellik değerleri sergilemek oluşturuldu. Birlikte, bu veriler, par altı PK CZ'nin sinyal yoluna fonksiyonunun bozulmasının, hem CCL 19 hem de c Xcl 12 kemokinleri tarafından indüklenen T hücresi polarizasyonunu inhibe ettiğini göstermektedir.Önceki bulgularla uyumlu olarak. Bu prosedürü denerken, lenfositlerin güçlü ve güvenilir morfolojik polarizasyonunu sağlamak için insolution akraba stimülasyon adımı ve takip eden fiksasyon boyunca her zaman 37 santigrat derecede çalışmak çok önemlidir.

rapid-robust-analysis-cellular-molecular-polarization-induced

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Burada, kemotaksis soruşturma için ayrıntılı canlı hücre görüntüleme yöntemleri açıklanmaktadır. Biz göç eden hücreleri olayları sinyal Spatiotemporal dinamiklerini izlemek için floresan mikroskobik yöntemler sunuyoruz. Ölçüm sinyal olayların bir GPCR sinyal ağı daha chemoattractants ve kontroller ökaryotik hücrelerin yönlü göç algılama degrade nasıl elde ettiğini anlamak için bize izin verir.

Görüntüleme G-protein Coupled Reseptör (GPCR) aracılı Sinyal Olaylar Kontrolü Kemotaksis Diktiyostelyum diskodeyum</em

Bu video, hepsi çip üzerinde bir yöntem kullanılarak nötrofil kemotaksisi testini göstermektedir. Yöntem, immünomanyetik negatif seçim ve ardından bir mikroakışkan çip üzerinde kemotaksis testi ile nötrofillerin tam kandan doğrudan izolasyonuna izin verir.

Tam Kan Kullanılarak Hızlı Nötrofil Kemotaksisi Analizi için Mikroakışkan Çip Tabanlı Bir Yöntem

Beyin inflamatuar yanıtının karmaşıklığı hakkında yeni bilgiler edinmenin bir yolu sunulmaktadır. İmmünofloresan tabanlı protokolleri ve ardından fokal iskeminin bir fare modelinde mikroglia/makrofaj fenotip belirteçlerinin birlikte ekspresyon modelini araştırmak için üç boyutlu konfokal analizi tanımladık.

Deneysel Beyin Hasarında Polarizasyonun Mikroglia/Makrofaj Belirteçlerinin Üç Boyutlu Konfokal Analizi

Hücre altı düzeyde, sinyal olayları gelişimsel ve çevresel ipuçları tarafından dinamik olarak modüle edilir. Burada, dinamik protein-protein etkileşimini izlemek ve bitki hücrelerinde sinyal iletiminin uzamsal organizasyonunu açıklamak için tütün geçici ekspresyon sistemini kullanan bir protokolü açıklıyoruz.

Tütün Geçici İfade Sisteminin Kullanılması bir MAPK sinyal yolu Mekansal Reorganizasyon Görüntüleme

Görsel kemotaksis deneyleri kemoatraktan aracılı yönlü hücre göçü nasıl kontrol ökaryotik hücreler daha iyi anlaşılması için gereklidir. 1) Gerçek zamanlı, çoklu kemotaksis deneyleri yüksek çözünürlüklü izleme ve 2) aynı anda kemoatraktan degrade görselleştirmek ve nötrofil gibi HL60 hücrelerinde sinyal olaylarının zamanmekansal dinamiği: Burada ayrıntılı yöntemler açıklanmaktadır.

Görüntüleme G Nötrofil gibi HL60 Hücreleri Kemotaksis ve Sinyal Olaylar Reseptör aracılı Protein-çiftli

Bu makale, tam kandan alınan çipte nötrofil izolasyonunu ve kemotaks testini tek bir mikroakışkan yonga üzerine entegre ederek hızlı bir nötrofıl kemotaksis tahlilini gerçekleştirmek için ayrıntılı bir yöntem sunmaktadır.

Hızla Nötrofil Kemotaksis Analizinde Doğrudan Bir Damla Kan Alınacak Bütünleşik Çip Yöntemi

Lenfosit kemotaksis ve geçiş kantitatif değerlendirilmesi için protokolleri İmmünoloji araştırma için önemli araçlardır. Burada, bir vitro Protokolü izni gerçek zamanlı, hücre göç değerlendirilmesi yanı sıra bir tamamlayıcı vivo içinde teknik etkinleştirme izlemeyle yerli hücreleri dalak multiplexed açıklanmıştır.

İnsan monosit kemotaksisi Vitro ve In Vivo kaçakçılığı fare lenfosit miktarının

Burada akut mekanik stimülasyon hücresel yanıt değerlendirmek için yöntemleri açıklanmaktadır. Mikroskopi tabanlı tahlil fluorescently etiketli biyosensörler kesme akışı ile kısa stimülasyon takip yerelleştirilmesini inceleyin. Ayrıca akut mekanik stimülasyon karşılık olarak ilgi çeşitli proteinlerin aktivasyonu biyokimyasal olarak test ediyoruz.

Dictyostelium discoideum yanıt-e doğru akut mekanik stimülasyon değerlendirilmesi

Biz insan makrofajlar proteomik imzaları elde edilir ve bu düşük oksijen çevre makrofaj polarizasyon üzerindeki etkisinin belirlenmesi için geçerli bir iletişim kuralı mevcut.

Düşük oksijen ortamı altında insan makrofaj polarizasyon proteomik analizi

Biz 3D kültür ve hücreler ve çok hücreli organoids ile deney için cihazlar oluşturmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu cihaz, tanımlanan kemoçekici degradeler ile 3D mikro ortamlarda çözünür sinyallere hücresel tepkiler analizi sağlar. Organoids zayıf gürültülü girişleri tespiti tek hücrelerden daha iyidir.

Chemoattractant degradelere Multi-hücresel tepkiler 3D Analizi

Bir kemokinin in vivo makrofaj alımı üzerindeki etkisini test etmek için, yerinde hibridizasyondaki tüm montaj, kemokinin ektopik ekspresyonunu saptamak için kullanıldı ve makrofajları etiketlemek için immünboyama kullanıldı. Makrofaj göçünün gerçek zamanlı gözlemi için canlı görüntüleme kullanıldı.

Vivo Makrofaj İşe Test için Bir Ektopik Kemokin İfade Modeli

Öğrenin, görüntüleme akış sitometrisi kullanarak T hücrelerinde kemokin uyarımı sonrası hücre morfolojisi ve protein lokalizasyonu değişikliklerini hızlı ve güvenilir şekilde nicelendirmeyi.

Kemokin Sinyalizasyonu Bağlı Hücresel ve Moleküler Polarizasyon Hızlı ve Sağlam Analizi

Daha fazla video keşfet