Omurilik Yaralanması Deneysel Kontuzif Modelinde Sinir Kök Hücre Nakli

Bu prosedürün genel amacı, farelerde omurilik yaralanmasının bir kontüzyon modelini ve ardından nöral kök hücrelerin naklini ayrıntılı olarak tanımlamaktır. Bu, ilk olarak postmortem, nöral öncü hücreler veya PM NPC'lerin hayati izleyici PKH 26 ile etiketlenmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra, fare üzerinde bir dorsal kesi yapılır ve omurilik ortaya çıkarılır.

Daha sonra omurilik üzerinde bir lezyon oluşturmak için sonsuz ufuk veya IH çarpma cihazı kullanılır. Son olarak, PKH 26 etiketli PM ve PC'ler farenin kuyruk damarına enjekte edilir. Sonuç olarak, lezyon bölgesindeki engrafte PKH 20 18:00 ve PC'lerin kaderi takip edilir.

Yaralanma modeli, omurilik yaralanması olan adamı kopyalar. Primer mekanik yaralanmayı, hücresel ve farmakolojik tedavinin çalışıldığı ilerleyici sekonder dejenerasyon takip eder. Açıklanan uygulamalar, inanç hakkında daha fazla bilgi edinmek için metodolojik bir temel sağlayabilir.

Dejenerasyon ve enflamatuar olaylar meydana gelirken omuriliğe nakledilen kök hücrelerin indüksiyonu. Lezyonu gösteren laboratuvarda doktora öğrencisi Dr.Tony Laja Longo olacak. Kuyruk enjeksiyonu, laboratuvarda doktora sonrası araştırmacı olan Dr.Ache tarafından gerçekleştirilecek olsa da, metin protokolünde açıklanan kriterleri karşılayan nöral kök hücrelerle başlayarak.

Resus, hücreleri 150 mikrolitre başına 10 ila altı hücre arasında bir konsantrasyona kadar askıya alır. Pipeti yüklemek için yeterli hücreye sahip olmak için fare başına en az 1,2 kez 10 ila altı hücre hazırlayın. Nöral kök hücre ortamı ile, hücreleri 10 mililitrelik konik bir şişede üç kez yıkayın, hücreleri peletlemek için oda sıcaklığında beş dakika boyunca 500 kez G'de döndürün.

Her yıkamadan sonra, son sıkma sayımından önce, hücreler daha sonra döndükten sonra, süpernatanı aspire eder ve herhangi bir hücrenin aspire edilmesini önlemek için yaklaşık 25 mikrolitre sıvı bırakır. Ardından, hücre damağına bir mililitre seyreltici C ekleyerek iki X süspansiyonu hazırlayın ve hemen yeniden süspanse etmek için hafif pipetleme kullanın. Boyamadan önce, bir tüpte bir mililitre seyreltici C'ye dört mikrolitre PKH 26 etanol D çözeltisi ekleyerek seyreltici C'de iki x boya çözeltisi hazırlayın ve iyice karıştırın.

Hızlı bir şekilde dağıtmak için, bir mililitre iki x hücreli süspansiyonu bir mililitre iki XD çözeltisine ekleyin ve numuneyi hemen pipetleyerek karıştırın. Hücre kalıbı süspansiyonunu bir ila beş dakika inkübe ettikten sonra, HBSS'ye eşit hacimde% 1 BSA çözeltisi ekleyerek boyamayı durdurun ve bir dakika inkübe edin. Daha sonra hücreleri 10 dakika boyunca 500 kez G'de santrifüjleyin ve süpernatanı dikkatlice çıkarın.

Hücre geri kazanımının, hücre canlılığının ve floresan yoğunluğunun değerlendirilmesi için hücre peletini yeniden süspanse etmek için 10 mililitre tam ortam kullanın. Hücreleri santrifüjleyin, süpernatanı atın ve hücre peletine 10 mililitre HBSS ekleyin. HBSS ile iki kez yıkayın ve hücreleri steril bir fizyolojik çözelti içinde yeniden süspanse edin.

Cerrahi alanı ve bir fareyi metin protokolüne göre hazırladıktan sonra, ameliyat sırasında hipotermiyi önlemek için bir neşter ile hayvanın sırt tarafı yukarı bakacak şekilde bir slayt ısıtıcısına yerleştirin, forseps kullanarak T yediden T 12'ye kadar olan ilgili bölge üzerinde dikey bir kesi yapın. Beşinci ve altıncı torasik süreçler arasındaki boşluk arasında bulunan cildi ve yüzeysel yağ yastığını stereo mikroskop altında tutun. Kan damarı altındaki işlemi T altı olarak sayın, ardından T yediye geçin.

Ardından, omurganın eğriliğini artırmak için farenin ventral tarafının altına küçük bir yatak yerleştirin ve omurgayı hareketsiz hale getirmek için grof forseps kullanın. Daha sonra, laminanın sırt yüzeyi neşter ucuna temas edene kadar vertebral seviyede vertebral seviyede T yediden T 10'a kadar olan vertebral kasların parasını iki taraflı olarak kesmek için bir neşter kullanın. Ardından, laminanın dorsal yüzeyi neşter ucuna temas edene kadar vertebral seviyede T yediden T 10'a kadar olan bağlantıyı işaretlemek için bir neşter kullanın, T sekiz ve T dokuz minik çıkıntılar arasındaki boşlukta durun.

Daha sonra dokuyu T sekiz ile T dokuz ve T dokuz ile T 10 arasında kesmek için mikro makas kullanın. Şimdi T dokuz işlemini kaldırmak için rongeur'u kullanın. Kas tabakasını dikkatlice kazımak için mikro makas kullanarak kavşağı ortaya çıkarın.

Kemik açığa çıkana kadar devam edin. Kasları laminadan çıkarmak ve omurlar arasında küçük bir boşluk açmak için forseps kullanın. Ardından mikro makası nazikçe kemiğin altına sokun.

Laminayı her iki taraftan kesin ve çıkarmak için forsepsleri kullanarak kordonu açığa çıkarın. Geride kalan serbest veya pürüzlü kemik parçalarını çıkarmak için ron jour'u kullanın. Ardından T dokuz dorsal işleminin üst yarısını çıkarın.

IH çarpma cihazı protokolünü takip ettikten sonra, metindeki yönergelere göre, önce çıkarılan lamina bölgesinde açıkta kalan omuriliği kaplayarak insizyonu kapatmak için dört oh emilebilir sütür kullanın. Altta yatan kasları sıkıştırmamaya dikkat edin. Cildi kapatmak için iki veya üç refleks klipsi kullanın.

Deri altından alt sırta iki mililitre salin enjekte edin ve fareyi kurtarmak için bir ısıtma yastığı üzerindeki ön ısıtma kafesine yerleştirin. Hücrelerin kuyruk damarı enjeksiyonunu gerçekleştirmek için. Test tüpündeki hücreleri yeniden askıya alın ve 75 mikrolitreyi 0.3 mililitrelik bir şırıngaya yükleyin, böylece hücre süspansiyonunda kabarcık bulunmadığından emin olun.

Hücre sedimantasyonunu önlemek için şırıngayı yatay konumda tutun. Kuyruk damarlarını genişletmek için fareyi ısı lambasının altına yerleştirin. Ardından, dar mavi bir çizgi olarak görünen yanal kuyruk damarını görselleştirmek için fareyi yavaşça sınırlayıcının içine çekin.

Kuyruğu temizlemek için alkollü bir bez kullanın ve damar görüntülendikten sonra, kuyruk damarını orta parmak ile sol elin başparmağı arasında tutun. Bu videoda gösterilen T dokuz kontüzyonu, yaralanmadan 30 dakika, altı saat ve 18 saat sonra gerçekleştirilen üç enjeksiyonda arka bacak fonksiyonunun üç kez 10 ila beşinci hücrelere geçici kaybına neden oldu veya PBS kuyruk damarına enjekte edildi. Burada gösterildiği gibi, iki ila üç hafta içinde, PBS yaralıları tedavi etti, fareler iyileşti ve arka bacak fonksiyonu üç nokta bazal fare ölçeğine ulaştı veya PM.NPC'lerle tedavi edilen BMS fareleri, ancak daha yüksek bir iyileşme gösterdi ve burada görüldüğü gibi 4.5 BMS puanına ulaştı, çoğu aşılanmış pm NPC'leri PKH 26 ile etiketlenmiş, lezyonun kenarlarında biriken kümeler oluşturur.

Uygulamadan kısa bir süre sonra, nakledilen hücreler lezyon kenarları boyunca ve nöronlara farklılaştıkları daha dağınık bir şekilde göç etti. Lezyon ve transplantasyondan 30 gün sonra, pm NPC'lerin hücre gövdesi boyut olarak artmış ve çoğu hücrede, dendritik benzeri süreçler belirgindi, haritalanacak spesifik antikorlar tarafından tamamen immün leke Bu pro prosedürü elde ederken, daha yüksek kuvvetlerin daha ciddi yaralanmalar nedeniyle hayvanda mortaliteyi artırabileceğini hatırlamak önemlidir. Bu nedenle, daha tekrarlanabilir bir iyileşme süreci tarafından takip edilen lezyon paradigmamızı kullanmayı öneriyoruz.

Bu videoyu izledikten sonra, sonsuz ufuk çarpma tertibatını kullanarak farede travmatik omurilik yaralanmasının tekrarlanabilir deneysel bir modelinin nasıl elde edileceğini iyi anlamış olmalısınız.