Floresan-Akış durdu ve Etiketli Nükleotidlerinin Kullanım kinesinlerin ATP Ciro Döngüsü Analiz için

Bu prosedürün genel amacı, bir kinesinin A TP devir döngüsü sırasında nükleotid bağlanma ve ayrışma kinetiğini ölçmektir. Bu, ilk önce nükleotid içermeyen veya floresan etiketli nükleotid ile yüklenmiş kinesin proteininin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Daha sonra, hazırlanan kinesin, durdurulmuş bir akış florimetresi kullanılarak nükleotid ile karıştırılır ve floresan etiketli nükleotidin bağlanması veya ayrışması ile ilişkili floresanstaki değişiklik gözlenir.

Daha sonra floresandaki değişiklik, bir hız sabiti elde etmek için üstel bir fonksiyona uydurulur. Son olarak, ölçülen oran sabitleri devredilir ve oran sabitleri, A TP devir döngüsünün belirli geçişlerine atfedilir. Sonuç olarak, floresan etiketli nükleotid ve durdurulmuş akış floresan kombinasyonu, nükleotid bağlanma ve ayrışma kinetiğini ölçmek için kullanılır.

CIN Prosedürü gösteren Jennifer Patel postdoc ve laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olan Hannah Belch olacak. Metin protokolünde belirtildiği gibi insan etiketli nükleotidin bir milimolar EDTA ve bir milimolar DTT'de magnezyum içermeyen tampon içinde 20'ye kadar mikromolar kinesin çözeltisine bağlanması üzerine kinesinin floresan yoğunluğunu belirledikten sonra, çözeltiyi 25 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin, bir yerçekimi akışı G 25 SX jel filtrasyon kolonu kurun ve en az üç kolon hacmi ile dengeleyin magnezyum içermez arabellek. Ardından, serbest nükleotidleri ve EDTA'yı kinesinden ayırmak için essin çözeltisini kolona yükleyin.

Boş tüpe 100 milimolar magnezyum klorür çözeltisi hacmi ekleyerek bir toplama tüpünü onarın, böylece nihai magnezyum klorür konsantrasyonu bir milimolar olur. Kinesin çözeltisinin toplanmasından sonra, uygun bir magnezyum içermeyen tampon kullanarak kinesini hızlı bir şekilde elüte edin. Toplama tüpünde magnezyum klorürün bulunması, Ian'ın kolondan hemen sonra kinesinin stabilize edilmesine yardımcı olur, kinesini buz üzerinde saklar ve bir ila iki saat içinde kullanır.

Bu arada, bir adama bir TP konsantrasyon serisi hazırlayın. Mevcut kinesin konsantrasyonuna göre konsantrasyon aralığını seçin. Her mant konsantrasyonu için bir TP, insan etiketli nükleotid, kinesin nükleotid bağlanma bölgeleri üzerinde beş ila on kat molar fazlalıkta olacak şekilde uygun bir kinesin konsantrasyonu hazırlar.

Durdurulmuş akış florimetresindeki uyarma dalga boyunu 365 nanometre ve emisyon dalga boyunu uzun geçiren bir filtre ile 400 nanometrenin üzerine ayarlayın. Ardından, en düşük Manta TP konsantrasyonundan başlayarak, manta TP ve nükleotid içermeyen kinesini bire bir hacim / hacim oranında karıştırmak için durdurulmuş akış florimetresini kullanın. Aşağıdaki formülü kullanarak, mant A TP konsantrasyonunu üstel bir fonksiyona öğretmek için floresan yoğunluk ölçümündeki değişikliği ve ayrıca mant grubunun fotoağartılmasını hesaba katmak için sabit bir negatif eğim çizgisini uygun hale getirin.

Bu uyumlardan, her mant konsantrasyonunda bir hız sabiti belirleyin. Bir TP daha sonra kopları mant konsantrasyonuna karşı diş ipi ile değiştirerek ilişkilendirme ve ayrışma oranlarını devreder. Bir TP Daha sonra gradyan ve y ekseni kesişimini elde etmek için bu verileri doğrusal bir fonksiyona sığdırın.

Gradyan, saniyede molar başına birimlerle bir TP ilişkisi olan adam için hız sabitini temsil eder. Kesişme noktası, saniyedeki birimlerle ayrışma hızı sabitini temsil eder. Ayrışma hızı sabitini ölçmek için, bir DP'yi 50'de uygun bir tamponda iki mikromolar kinesin çözeltisine fermente edin.

Mikromolar, 30 dakika boyunca 25 santigrat derece bir DP inkübatörü anlamına geliyordu. Kinesinden fre mant, A DP'yi çıkarmak için bir G 25 Sedex sütunu kullandıktan sonra, mant A DP ile yüklendikten ve bu videoda daha önce açıklandığı gibi durdurma akışı olukunu ayarladıktan sonra, mant A DP Kinine kompleksini 50 kat veya daha büyük molar fazla etiketsiz A TP ile bire bir hacim / hacim oranı uyumunda karıştırmak için durdurulan akışı kullanın. Zaman içinde tek bir üstel fonksiyona gözlemlenen floresan yoğunluğundaki azalma ve ayrıca grubun foto-ağartılmasına izin vermek için sabit bir negatif eğim çizgisi.

Bu uyumdan belirlenen kops, mant A DP'nin saniyedeki birimlerle ayrışması için hız sabitidir. Manto ağacı nükleotidinin bağlanması veya ayrışması üzerine sinyal değişikliğinin büyüklüğü, belirli kinesine bağlıdır. Bu nedenle, bir floresan yoğunluk değişikliğinin hem varlığını hem de büyüklüğünü doğrulamak için önce denge ölçümleri yapmak yararlıdır.

Floresan spektrumlar bir TP'yi fermente eder ve kinesin M CAC'nin hem çözeltisinde hem de kompleksinde bir DP anlamına gelir. Bu şekil, insanın bir TP'sini nükleotid içermeyen kinesin ile karıştırması üzerine meydana gelen reaksiyonu göstermektedir. İnsan A TP'nin M CAC'ye bağlanması üzerine meydana gelen floresan yoğunluğundaki artış, adama karşı hız sabitine uygun olarak burada gösterilmiştir.

Burada görüldüğü gibi doğrusal bir fonksiyona bir TP konsantrasyonu, kops'a katkıda bulunan hız sabitinin evrişimine izin verir ve birleşme ve ayrışma hızı duruş duruşu fermenti A TP'yi sağlar. Bu şekil, burada gösterildiği gibi M CEC'den ayrışma üzerine ferment A DP'de gözlemlenen floresan yoğunluğu düşüşünü göstermektedir. Mant A DP'nin Kinesin'den ayrışması için hız sabiti, bu verinin üstel bir fonksiyona uydurulmasıyla belirlenir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu protokollerin her biri üç saatten daha kısa sürede tamamlanabilir.

Bu yöntem kinesin hakkında bilgi sağlayabilse de, miyozin ve G proteinleri gibi diğer nükleotid bağlayıcı proteinlere de uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, bir kinesin için nükleotid bağlanma ve ayrışma kinetiğini ölçmek için floresan etiketli nükleotidlerin ve bir durdurma akış ölçerin nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.