Name: Floresan-Akış durdu ve Etiketli Nükleotidlerinin Kullanım kinesinlerin ATP Ciro Döngüsü Analiz için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Öğrenin, kinesin ATP devir döngüsünde nükleotid bağlanma ve ayrışma kinetiğini floresan etiketli nükleotidler ve durdurulmuş akış floresansı kullanarak nasıl ölçülür. Bu yöntem motor protein fonksiyonlarını anlamak için temel bilgiler sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Biyoteknoloji ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi (BBSRC), Royal Society ve Nottingham Üniversitesi tarafından desteklenmektedir.

Mant olarak işaretlenmiş nükleotid bağlanması üzerine floresans yoğunluğunu değiştirmek 1. belirlenmesi. <ol><li> Uygun bir reaksiyon tampon maddesi içinde 1 uM kinesin (nihai konsantrasyonlar) için 1 uM mant-etiketli bir nükleotit ekleyin. Tipik mikrotübül büyüme ve istikrarı faydaları bir tampon (tartışma) kullanılır. Yaygın olarak kullanılan bir tampon 80 mM piperazin-bis-2-etansülfonik asit (PIPES) içeren pH6.9, 1 mM MgCI2 ve 1 mM etilen glikol-bis-2, iminoeter-tetraasetik asit (EGTA). Not: Tüm protokolde belirtilen kinesin konsantrasyonu, nükleotid bağlama bölgeleri (örneğin, motorlu etki) konsantrasyonu anlamına gelir. Farklı kinesinler monomerler, dimerler veya tetramerler olarak bulunur ve her bir molekül için birden fazla nükleotid bağlanma bölgesini içerebilir. </li><li> Bir kuluçka dönemine (1-3 dakika) ve standart bir florimetre kullanılarak sonra, MANT-işaretlenmiş nükleotid-kinesin kompleksi için emisyon spektrumunu ölçmek. 365nm bir eksitasyon dalga boyu ve kullanmaölçmek 1nm artışlarla 400-500 nm arasında ışığı yaydığı. </li><li> Aşama 1.1 &#39;de kullanılan aynı reaksiyon tampon maddesi içinde 1 mM bir çözeltisi mant olarak işaretlenmiş nükleotid olun. </li><li> Daha önce açıklandığı gibi, tek bir nükleotid, MANT numune için emisyon spektrumunu ölçülür (bakınız Aşama 1.2). </li><li> Bu değer ile bölünerek (kinesin kullanılmadan doğrudan) çözelti içinde mant nükleotid spektrumunda tepe floresan yoğunluğunun dalga boyunda sinyaline normalize spektrumları. </li><li> (Örneğin, Şekil 2B) mantATP-bağlanmış ve / veya çözelti içinde mantADP bağlı kinesin ve mant nükleotid arasındaki floresans yoğunluğu farkları gözlemlemek için normalize spektrumları çizilir. </li></ol> MantATP için birleşme ve ayrılma oranı Katsayıların 2. Ölçüm <ol><li> -ücretsiz Tamponu 2 + herhangi bir uygun Mg en fazla 20 uM kinesin (tartışma) içindeki bir çözeltisine, (örneğin, 80 mM PIPES pH6.9, 1 mM EGTA,% 0.1 Tween 20) içinde, 1 ekleyinmM (son konsantrasyon) etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ve 1 mM (son konsantrasyon) ditiyotreitol (DTT). Not: azaldıkça tampon Tween®20 ilavesi tavsiye edilir / tampon değişimi için kullanılan sütun üzerinde kinesin protein kaybını önler (Adımlar 2.3 ve 3.3) </li><li> 15 dakika boyunca 25 ° C&#39;da, çözelti inkübe edin. </li><li> (Malzemelerin listesine bakınız) kullanılarak üreticinin talimatlarına göre bir yerçekimi akışlı, G-25 Sephadex jel filtrasyon kolonu kullanılarak kinesin ayırın ihtiva etmeyen nükleotid ve EDTA ihtiva eder. <ol><li> Uygun bir Mg +2 tamponu -ücretsiz en az 3 sütun hacmi ile sütun dengeye (Basamak 2.1). Kolona kinesin-içeren çözelti yükleyin. Magnezyum klorürün son konsantrasyonu kinesin çözeltisi toplanmasından sonra 1 mM olacak şekilde, boş tüp, 100 mM, magnezyum klorür çözeltisinin uygun bir hacmi ilave bir toplama tüpü hazırlayın. Magnezyum klorürün ilavesi anında yardımcı olur dayanıklılıknükleotid içermeyen kinesin se. </li><li> Uygun bir Mg 2 + -ücretsiz tampon kullanarak kinesin Zehir. Hızlı çalışmak için zaman önemlidir bu yüzden nükleotid ücretsiz Kinesinler kararsızdır. Buz üzerinde nükleotid-serbest Kinezin&#39;e saklayın ve 1-2 saat içinde kullanın. </li></ol></li><li> Sırasında ya da öncesinde nükleotid içermeyen kinesin hazırlanmasına nükleotid içermeyen kinesin nihai çözelti ile aynı tampon maddesi içinde bir reaksiyon mantATP konsantrasyon geliştirilmesidir. 0.1 ila 50 uM (adım 2.5 ve tartışmaya bakınız) arasında değişen tipik bir dizi kinesin mevcut konsantrasyonuna göre gerekli mantATP konsantrasyonlarının aralığı belirler. </li><li> Nükleotid-serbest kinesin&#39;in bir konsantrasyon dizi hazırlayın. MantATP her bir konsantrasyonu (2.4 adım) için, nükleotid içermeyen kinesin bir konsantrasyon, MANT-işaretlenmiş nükleotid kinesin nükleotid bağlayıcı siteler üzerinde 5-10 kat molar fazla olacak şekilde hazırlanmalıdır. </li><li> Durdu-flo üzerinde dalgaboyu ayarlayın365 nm florimetrede w ve uzun geçişli filtre kullanılarak&gt; 400 nm ışık yaydığı toplamak. </li><li> Durdurulan bir akış florimetresi (Şekil 3A ve 3B Ankastre) kullanılarak 1 hacim / hacim oranı: mantATP en düşük konsantrasyonu ile başlayarak, 1 nükleotid içermeyen kinesin uygun bir konsantrasyonu ile mantATP karıştırın. Not: Reaksiyona giren maddeler karıştırma üzerine% 50 oranında seyreltilir. Karışıklığı önlemek için nükleotid konsantrasyon öncesi ve sonrası karıştırma (örneğin, 3.0 / 1.5 mM) not edin. </li><li> MANT grup, ışıkla hesaba üstel fonksiyon ayrıca sürekli olumsuz bir eğim hattına mantATP her konsantrasyonunda ölçülen floresan yoğunluğundaki değişim monte (örneğin, floresan, bir 0 .exp (atıl .T k) + (M =. T + 0 genliği, c) k gözlenen hız sabitidir ve T,) Şekil 3B ve açıklamalara bakın zamandır. Bu krizleri bir tespitmantATP her konsantrasyonunda sabiti (k, obs) oranı. Her bir K atıl bir birleşme ve ayrılma oranı sabiti (Şekil 1, k, 1 ve k-1) olan bir evrişim. </li><li> (Örneğin, Şekil 3C) mantATP konsantrasyonuna karşı taslak haline getirilmesi suretiyle k, atıl, birleşme ve ayrılma oranı sabitleri Deconvolve. Degrade ve y-ekseni kesişim elde etmek için doğrusal bir fonksiyonu (yani, k obs = k 1 [mantATP] + k -1) bu verileri uygun. Gradyan birimlerinin M-1 s-1 ile ilişkili mantATP (Şekil 1, k, 1) için oran sabiti temsil eder. Kesişim s-1 (tartışmaya bakınız) birimleri ile ayrılma oranı sabitesinin (Şekil 1, k-1) temsil etmektedir. Bu yaklaşım, aynı zamanda, ADP, birleşme ve ayrılma belirlemek için uygulanabilir: Notnükleotid olarak mantADP kullanılarak oran sabitleri (Şekil 1, k, k -4 4). </li></ol> MantADP için ayrışma oranı 3. Sabit ölçüm <ol><li> Uygun bir reaksiyon tampon maddesi içinde 2 uM kinesin eden bir çözeltiye, (örneğin, 80 mM PIPES pH6.9, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA,% 0.1 Tween 20), 50 uM mantADP (nihai konsantrasyon) ilave edilir. </li><li> 30 dakika boyunca 25 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> G-25 Sephadex kolonu kullanılarak, seçilen reaksiyon tampon maddesi içine kinesin alışverişi tamponu ile aşırı mantADP ve diğer serbest nükleotid kaldır, üreticinin talimatlarına uygun olarak (malzemelerin listesine bakınız). Kinesin Motor alanı şimdi mantADP yüklü olmalıdır. </li><li> 365 nm durdu akış florimetrede dalgaboyu ayarlayın ve uzun geçişli filtre kullanılarak&gt; 400 nm ışık yaydığı toplamak. </li><li> 50 katı veya daha büyük olan Mola mantADP.kinesin kompleksi (~ 1 uM) karıştırındurdurulan bir akış florimetre (Şekil 4A ve 4B, Ankastre) kullanılarak 1 h / h oranında bir 1 etiketlenmemiş ATP r fazla. </li><li> Tek bir üstel fonksiyon artı MANT grubunun ışıkla ağartma açıklamak için sürekli negatif bir eğim hattı zamanla gözlenen floresan yoğunluğundaki azalma monte (örneğin, floresan, bir 0 .exp (atıl .T k) + (m.t + = Bir 0 genliği, burada c), k gözlenen hızı sabittir ve t, zamandır,) Şekil 4B ve tartışmaya bakınız. Bu uyum tespit K atıl s-1 (tartışmaya bakınız) birimleriyle ADP (Şekil 1, k 4) ayrılması için oranı sabitidir. </li></ol>

<ol><li>Marx, A., Hoenger, A., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+kinesin+motor+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Structures of kinesin motor proteins.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 66, 958-966 (2009).</li>
<li>Hirokawa, N., Noda, Y., Tanaka, Y., Niwa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin+superfamily+motor+proteins+and+intracellular+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Kinesin superfamily motor proteins and intracellular transport.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 682-696 (2009).</li>
<li>Friel, C. T., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+of+kinesin+ATP+turnover+to+translocation+and+microtubule+regulation%3A+one+engine%2C+many+machines%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Muscle+Res.+Cell+Motil%22%5BJournal%5D)">Coupling of kinesin ATP turnover to translocation and microtubule regulation: one engine, many machines.</a> J. Muscle Res. Cell Motil. 33, 377-383 (2012).</li>
<li>Yun, M., Zhang, X., Park, C. G., Park, H. W., Endow, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+structural+pathway+for+activation+of+the+kinesin+motor+ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">A structural pathway for activation of the kinesin motor ATPase.</a> EMBO J. 20, 2611-2618 (2001).</li>
<li>Hirose, K., Akimaru, E., Akiba, T., Endow, S. A., Amos, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+conformational+changes+in+a+kinesin+motor+catalyzed+by+interaction+with+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Large conformational changes in a kinesin motor catalyzed by interaction with microtubules.</a> Mol. Cell. 23, 913-923 (2006).</li>
<li>Kikkawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switch-based+mechanism+of+kinesin+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Switch-based mechanism of kinesin motors.</a> Nature. 411, 439-445 (2001).</li>
<li>Friel, C. T., Bagshaw, C. R., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysing+the+ATP+turnover+cycle+of+microtubule+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysing the ATP turnover cycle of microtubule motors.</a> Methods Mol. Biol. 777, 177-192 (2011).</li>
<li>Bagshaw, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+analogues+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">ATP analogues at a glance.</a> J. Cell Sci. 114, 459-460 (2001).</li>
<li>Friel, C. T., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinesin-13+MCAK+has+an+unconventional+ATPase+cycle+adapted+for+microtubule+depolymerization%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The kinesin-13 MCAK has an unconventional ATPase cycle adapted for microtubule depolymerization.</a> EMBO J. 30, 3928-3939 (2011).</li>
<li>Gilbert, S. P., Webb, M. R., Brune, M., Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathway+of+processive+ATP+hydrolysis+by+kinesin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pathway of processive ATP hydrolysis by kinesin.</a> Nature. 373, 671-676 (1995).</li>
<li>Sadhu, A., Taylor, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+kinetic+study+of+the+kinesin+ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A kinetic study of the kinesin ATPase.</a> J. Biol. Chem. 267, 11352-11359 (1992).</li>
<li>Woodward, S. K., Eccleston, J. F., Geeves, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+the+interaction+of+2%27%283%27%29-O-%28N-methylanthraniloyl%29-ATP+with+myosin+subfragment+1+and+actomyosin+subfragment+1%3A+characterization+of+two+acto-S1-ADP+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Kinetics of the interaction of 2'(3')-O-(N-methylanthraniloyl)-ATP with myosin subfragment 1 and actomyosin subfragment 1: characterization of two acto-S1-ADP complexes.</a> Biochemistry. 30, 422-430 (1991).</li>
<li>Hackney, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathway+of+ADP-stimulated+ADP+release+and+dissociation+of+tethered+kinesin+from+microtubules.+Implications+for+the+extent+of+processivity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Pathway of ADP-stimulated ADP release and dissociation of tethered kinesin from microtubules. Implications for the extent of processivity.</a> Biochemistry. 41, 4437-4446 (2002).</li>
<li>Lockhart, A., Cross, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+and+motility+of+the+Eg5+microtubule+motor%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Kinetics and motility of the Eg5 microtubule motor.</a> Biochemistry. 35, 2365-2373 (1996).</li>
<li>Chen, C. J., Porche, K., Rayment, I., Gilbert, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ATPase+pathway+that+drives+the+kinesin-14+Kar3Vik1+powerstroke%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The ATPase pathway that drives the kinesin-14 Kar3Vik1 powerstroke.</a> J. Biol. Chem. 287, 36673-36682 (2012).</li>
<li>Moyer, M. L., Gilbert, S. P., Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathway+of+ATP+hydrolysis+by+monomeric+and+dimeric+kinesin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Pathway of ATP hydrolysis by monomeric and dimeric kinesin.</a> Biochemistry. 37, 800-813 (1998).</li>
<li>Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E., Direct Webb, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((real-time+measurement+of+rapid+inorganic+phosphate+release+using+a+novel+fluorescent+probe+and+its+application+to+actomyosin+subfragment+1+ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">real-time measurement of rapid inorganic phosphate release using a novel fluorescent probe and its application to actomyosin subfragment 1 ATPase.</a> Biochemistry. 33, 8262-8271 (1994).</li>
<li>Goodrich, J. A., Kugel, J. F. Chapter 4. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGoodrich%2C+JA+%22Binding+and+Kinetics+for+Molecular+Biologists%22">Binding and Kinetics for Molecular Biologists</a>. 4, Cold Spring Harbour Laboratory Press. Cold Spring, NY. 69-97 (2006).</li>
<li>Gell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+dynamics+reconstituted+in+vitro+and+imaged+by+single-molecule+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule dynamics reconstituted in vitro and imaged by single-molecule fluorescence microscopy.</a> Methods Cell Biol. 95, 221-245 (2010).</li>
<li>Olmsted, J. B., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionic+and+nucleotide+requirements+for+microtubule+polymerization+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Ionic and nucleotide requirements for microtubule polymerization in vitro.</a> Biochemistry. 14, 2996-3005 (1975).</li>
<li>Brinkley, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubules%3A+a+brief+historical+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubules: a brief historical perspective.</a> J. Struct Biol. 118, 84-86 (1997).</li>
<li>Ostap, E. M., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+kinetic+characterization+of+the+Acanthamoeba+myosin-I+ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Biochemical kinetic characterization of the Acanthamoeba myosin-I ATPase.</a> J. Cell Biol. 132, 1053-1060 (1996).</li>
<li>Eccleston, J. F., Moore, K. J., Brownbridge, G. G., Webb, M. R., Lowe, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+approaches+to+the+study+of+the+p21ras+GTPase+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Soc.+Trans%22%5BJournal%5D)">Fluorescence approaches to the study of the p21ras GTPase mechanism.</a> Biochem. Soc. Trans. 19, 432-437 (1991).</li>
<li>Ahmadian, M. R., Wittinghofer, A., Herrmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+methods+in+the+study+of+small+GTP-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence methods in the study of small GTP-binding proteins.</a> Methods Mol. Biol. 189, 45-63 (2002).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Burada, bir kinesin&#39;in için nükleotid devletler arasındaki geçişlerin kinetik gözlem ve analiz için protokolleri sunuyoruz. Bu protokoller, floresanla işaretlenmiş nükleotidlerin ile bağlantılı olarak hızlı karıştırma yöntemi durdu akışı kullanmaktadır. Bu tip yöntem kinesinlerin 9-11,13-16 çeşitli nükleotid bağlanma ve ayrılma incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Fosfat serbest (Şekil 1, Aşama 3) gözlenmesini izin vermez açıklanan yöntemler. Bununla birlikte, durdurmalı akış bir floresan yoğunluğu değişim 17 bağlanması için fosfat üretimini fosfat algılama proteini kullanarak, bu geçiş gözlemlemek için kullanılabilir. Proteine ​​bağlanan genel olarak, flüoresans yoğunluğunda bir artış sergiler küçük flüorofor methylanthraniloyl (mant) kullanımı ile etiketlenmiş nükleotitler, sunulan yöntemler. Ayrıca, MANT florofor zaman R 2 &#39;veya 3&#39; pozisyon ya da konjügeibose, genellikle 9-12 nükleotid bağlanma, çözünme veya hidroliz üzerine çok az veya hiç etkisi yoktur. Mant-etiketli nükleotidler ticari kaynaklardan (malzemelerin listesine bakınız) kolayca elde edilebilir ve tek bir izomer 8 için saflaştınrken hızla yeniden dengeye olarak, 2 &#39;ve 3&#39; konjügat karışımları olarak sağlanmıştır. Mant-etiketli nükleotidler nükleotid bağlama ve ayrışma kinetikleri görülebildiği ile mükemmel bir bildirici molekül oluşturmak. , Floresanla işaretlenmiş nükleotidlerin kullanılması tarif edilen deneyler üzerinden flüoresans yoğunluğunda bir gerçek zaman değişikliği okumak olduğu anlamına gelir. Bu reaktifler, hızlı karıştırma ve daha sonraki reaksiyon ile bağlantılı floresan değişikliklerin gerçek zamanlı gözlem sağlar durdurmalı akış floresan, bu deneyler, ideal hale getirir. Saptama yöntemi olarak karıştırma tekniği ve floresan gibi durdu akışı araya gelmesi göreceli olarak örnek EF bir sistem üretirficient. Örneğin, 0.8 gerektirir Şekil 3C&#39;de gösterilen veri elde etmek için - saflaştırılmış kinesin-13 1.0 mg, MCAK ve Şekil 4B&#39;de gösterilen veri elde etmek için, saflaştırılmış ~ kinesin-13, 0.3 mg MCAK gerektirir. Bir florofor olarak mant kullanımının bir dezavantajı, ışıkla eğilimli olmasıdır. Bu durdu-akış, kinesin yokluğunda, reaksiyon tampon maddesi ile mant olarak işaretlenmiş nükleotid ihtiva eden bir çözelti karıştırma ile reaksiyon kinetiği kinesin ayrı olarak görülmektedir. MANT grubu ağartılmış olduğunda, flüoresans yoğunluğunda bir yavaş azalması gözlenmektedir. MANT grubunun photobleaching tarif edilen protokollere kullanılan çizelgesinin aralığı üzerinde iyi bir doğrusal fonksiyonu ile tarif edilmektedir. Bu yüzden, ışıkla ağartma için veri düzeltmek için, basit bir şekilde tek bir parametre ile tarif edilen bir doğrusal fonksiyonu (örneğin, mt + c) &#39;yerine daha sık yassı bir temel hat ile tarif edilen bir taban içeren bir üstel fonksiyon için uygun etmektir. mantATP bağlama MantATP arasında Birleşme ve ayrışmaya ilişkin oran sabitleri mikrotübül yokluğunda kinesin nükleotid bağlanma yeri ile bağlantılı olarak kalır (Kısım 2) ADP ölçülürken, çıkarılmalıdır. Bu mantATP, birleşme ve ayrılma (Şekil 1, aşama 1) ADP ayrışma ayrı olarak görülmektedir sağlar. Bu kinesin nükleotid bağlanma sitelerinin (2.1 adım) üzerinden EDTA en az 50-kat fazlası ile inkübe edilir elde etmek. EDTA Mg 2 + iyonları nükleotid 11 salınımına neden nükleotid-bağlayıcı cebinden, uzaklaşmak için Mg 2 + neden tecrit. Yürütülmesi 2.1 adım Bu nedenle, - 2.3, bu Mg +2 ücretsiz tampon kullanmak hayati önem taşımaktadır. Nükleotid-serbest kinesin protein tampon ücretsiz nükleotid gelen ve EDTA hem ayırmak için alışverişinde olduğunu. Bu ayrılık, bir tek yerçekimi akışı ge gerçekleştirmek içinl filtrasyon kolon yeterlidir basit ve (malzemelerin listesini görmek) kullanmak için hızlıdır. Nükleotid serbest kinesin ile mantATP etkileşimi, birleşme ve ayrılma oranı sabiti (2.8 aşamasının) kıvrım giderme sağlamak için mantATP konsantrasyonda (Basamak 2.4) aralığında gerçekleştirilir. Bu tip deney arkasındaki teori, ayrıca tek mantATP en düşük konsantrasyonu ile başlar, bu deneyler içinde referans 18&#39;de açıklanmaktadır. Bu, farklı konsantrasyonları arasında yıkama aşamasına olan ihtiyacı ortadan kaldırır. Büyük olasılıkla mantATP konsantrasyonu arttıkça durdu akış florimetrede hassasiyetini ayarlamak için gerekli olacaktır. MantATP konsantrasyonu her zaman sözde birinci dereceden koşulları sağlamak için kinesin nükleotid bağlanma sitelerinin konsantrasyonuna göre en az 5 kat fazla olmalıdır. MantATP konsantrasyonu artar Bununla birlikte, sinyal değişimi düşüşler kinesin bağlanan nükleotid fraksiyonu olarak gömülmek hale gelir. Therefo, kinesin konsantrasyonu da mantATP her yeni konsantrasyonu artırılır, bu tür yeniden mantATP konsantrasyonu, nükleotid bağlanma sitelerinin (2.6 adım) fazla 10 kat molar fazlalık daha asla daha fazladır. mantADP Ayrılma MantADP için birleşme ve ayrılma oranı sabitleri mantATP (Kısım 2) için tarif edilen aynı yöntemle belirlenebilir açabilir. Bir kinesin ADP ayrışması doğrudan mantADP.kinesin kompleks, etiketlenmemiş ATP (adım 3.5) fazlası ile karıştırılır mantADP (Aşama 3.1-3.3) nükleotid bağlanma sitesi önyüklemeyle gözlenebilir. Fazla etiketsiz ATP kinesin&#39;in için mantADP yeniden bağlanmasının önler ve böylece mantADP örgütlenme ayrı olarak uyulması gereken ayrışma reaksiyonu (Şekil 1, k 4) verir. Bu tahlilde, etiketlenmemiş ATP konsantrasyonu nuc en azından bir 50 kat fazla mol olmalıdırbağlanma yeri oligonükleotid. Bu deneyde arkasındaki teori de bu doğrudan yöntem, Aşama 2.8 &#39;de tarif edilen Y-eksenine göre sabit bir ekstrapolasyon ayrışma hızı için daha doğru bir değer verir referans 18&#39;de açıklanmaktadır. Mikrotübüller İçerme Açıklanan yöntemler aynı zamanda mikrotübül mevcudiyetinde nükleotid bağlama ve ayrışma kinetiklerini belirlemek için kullanılabilir. Mikrotübüller önce durdu-akış karıştırma nükleotid ihtiva eden bir şırıngaya konur: Şekil 3B ve 4B alt şırınga (Insets). Bu mikrotübülleri, uygun olarak, bu yapılandırmada, kinesin aynı zamanda nükleotid karşılayacaktır. Stabilize mikrotübüller tübülin polimerin ömrü, stabilize edici kimyasal ya kullanımı ile uzatılmış olduğu, kullanılan örneğin &#39;guanosin-5 gibi taksol veya nonhydrolysable GTP analoğu gibi - [(α, β) -methyleno] trifosfat (GMPCPP, malzeme listesine bakınız). Bu sıvı azot 9,19 birçok ay boyunca saklanabilir mikrotübülleri yapmak GMPCPP sahip tübülin polimerizasyonu iki çevrim kullanmak mümkündür. Önceden hazırlanmış mikrotübül kullanılması nedeniyle, bu tahliller yapmak için pratik güçlüklerle azaltır. Tahlillerinde mikrotübül dahil etmek için, bir mikrotübül stabilite için uygun olan bir reaksiyon tamponu kullanılması önemlidir. Tercih tamponu (BRB80 olarak da bilinir), 80 mM PIPES pH 6.9, 1 mM MgCI2, 1 mM EGTA 20,21 ihtiva eden en yaygın olarak kullanılan tampon madde ile, borularla vardır. Açıklanan yöntemler kinesinlerin ile kullanımı sınırlı değildir, ancak uyarlanmış herhangi bir nükleotid bağlayıcı proteine ​​uygulanabilir. Örneğin, benzer yöntemlerin moleküler motorlar 12,22 arasında miyozin ailesi ve mant etiketli guanozin nükleotitlerin kullanılması daha uzun ve üyelerinin ATP devir döngüsü uygulanmıştırBu tip yöntemler, proteinleri, GTP ye hidrolize 23,24.

Kinesinler yüksek oranda korunan bir motor fonksiyonun 1 ile karakterize edilen bir protein süper-familyası vardır. Kinesin motor fonksiyonun bir nükleotid bağımlı bir şekilde mikrotübül ile etkileşime girer. Kinesin aile üyeleri mikrotübül dinamiklerini 2,3 düzenleyen olmayan translocating mikrotübül son bağlayıcı kinesinlerin Mikrotübüllerin boyunca yönlendirilmiş bir şekilde yük taşımak translocating kinesinlerin, fonksiyonları bir dizi görüntüler. Kinesinler, 4-6 iskeleti mikrotübül ile etkileşimlerini düzenleyen adensosine-5'-trifosfat (ATP) ciro kullanın. ATP, ADP ADP.Pi ya da nükleotid bağlı olabilir (Şekil 1) için mikrotübül kinesin motor fonksiyonun ve dolayısıyla afinite konformasyonu, nükleotid durumuna göre değişir. Bir kinesin'in moleküler mekanizmasını anlamak için, ATP ciro ve mikrotübül etkileşim arasındaki ilişkinin bir anlayış gereklidir.refore, kinesin alanda önemli bir amacı, farklı nükleotid durumlarının fonksiyonel özellikleri ve mikrotübüllerin varlığında ve yokluğunda her ikisinin arasındaki geçişlere kinetiklerini nitelendirilmesidir. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="2in" width="200" src="/files/ftp_upload/52142/52142fig1highres.jpg"> Bir kinesin'in için basit ATP ciro döngüsü Şekil 1. Dört olası durumlar oluşur:. Nükleotid-free (Φ) dört geçişler her bir ileri ve bir ile karakterize, ADP.P i-bağlı, ATP bağlı ve ADP-bağlı Geriye hız sabiti (k x ve sırasıyla -x k). ATP ciro kimyasal çevrim mikrotübül etkileşim mekanik döngüsüne bağlanmış anlamak için, bir kuru microtub yokluğunda sınırlayıcı ATP ciro döngüsünde hangi aşamasını belirlemek gerekirModüller, ve sonra çevrim mikrotübül varlığı ile değiştirilmektedir biçimini belirler. En basit ATP çevirme süresi dört ayrı kimyasal adımlardan oluşur: (1) ATP boş yere bağlanabilen (Φ ve boş, yani nükleotid içermeyen kinesin temsil eder); (2) ATP bölünmesi; (3) ayrışma fosfat ve (4) ADP ayrılma (Şekil 1). Oran-sınırlayıcı aşama tamamlandıktan ATP devir döngüsü için hız sabitini belirler. Bu nedenle, tek tek geçişler her ölçülmüş ve tam devir için hız sabiti ile karşılaştırılır sınırlayıcı oran olan adım belirlemek için. Yöntem burada açıklanmayan genel ATP çevirme süresi hızı sabitini ölçmek için değil Burada referans 7'de bulunabilir, tek tek kimyasal aşamalar için oran sabitleri belirlenebilir edildiği metotları da tarif eder. Bir nükleotid hidroliz proteinin çevirme süresi bireysel geçişleri çalışma mevcut yöntemler vardır. Burada sunulan yöntemler sunar advantagflorofor ile işaretlenmiş nükleotidlerin methylanthraniloyl özelliklerinin e 8 genellikle protein bağlanması üzerine, flüoresans yoğunluğunda bir değişme sergilemekte mant, olarak adlandırılır. Küçük boyutlu riboz (Şekil 2A) ile birleştirildiğinde, genellikle nükleotid bağlayıcı ya da hidroliz 9-12 kinetikleri üzerinde çok az ya da hiçbir etkisi yoktur, anlamına gelir, çünkü MANT grubu kullanılır. Burada, bir kinesin ATP ciro döngüsünde nükleotid bağlama ve ayrışma gözlenmesine imkan vermek için durdurmalı akış floresan ile bağlantılı olarak mant-işaretlenmiş nükleotidlerin kullanımını anlatan protokolleri sunuyoruz.

<table><tbody><tr><td>2'/3'-(N-metilantraniloil) adenozin-5' trifosfat&nbsp;</td><td>Jena Biosciences</td><td># NU-202</td><td>mantATP</td></tr><tr><td>2'/3'-(N-metilantraniloil) adenosin-5'-difosfat&nbsp;</td><td>Jena Biosciences#</td> <td>NU-201</td><td>mantADP</td></tr><tr><td>Mg-ATP Roche</td><td></td> <td># 10519979001</td><td>ATP'nin disodyum tuzu 100 & nbsp; 100&nbsp'de mM; mM MgCl<alt>2</alt>. Konsantrasyon 260&nbsp'de absorpsiyon ile doğrulanmalıdır; nm (e = 15,400&nbsp; M-1cm-1). -20&nbsp'de alikotlarda saklanan çözelti; oC.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik asit (EDTA)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>BP120-500</td><td>0.5&nbsp; Sudaki M stok çözeltisi, pH 8.0. TEHLİKE: Solunması halinde zararlı toz.</td></tr><tr><td>Ditiyotreitol (DTT)</td><td>Melford</td><td>MB1015</td><td>1&nbsp; Aynı gün kullanılmak üzere taze hale getirilmiş suda M stok çözeltisi. TEHLİKE: Solunması veya cilt ile temas etmesi halinde zararlı pudra.</td></tr><tr><td>NAP-5 sütunu</td><td>GE Sağlık</td> <td># 17-0853</td><td>G-25 sephadex reçine yerçekimi akışlı jel filtrasyon sütunu</td></tr><tr><td>GMPCPP</td><td>Jena Biosciences</td> <td># NU-405</td><td>GTP'nin hidrolize edilemeyen analogu</td></tr><tr><td>Durdurulmuş akışlı florimetre&nbsp;</td><td>Uygulamalı Fotofizik</td><td>SX20</td><td>Reaktiflerin gözlem küvetinde hızlı bir şekilde karıştırılmasını sağlayan, bazı sıhhi tesisat takılı bir florimetre. Böylece ~0.1&nbsp;-&nbsp; zaman ölçeklerinde reaksiyonların kinetiğine izin verilir; 100&nbsp; SEC izlenecek.</td></tr></tbody></table>

floresan-akış durdu ve etiketli nükleotidlerinin kullanım kinesinlerin atp ciro döngüsü analiz için

Use of Stopped-Flow Fluorescence and Labeled Nucleotides to Analyze the ATP Turnover Cycle of Kinesins

Mikrotübül ilişkili motor proteinlerinin kinesin süperailesi hem ATP hidrolizler ve mikrotübülleri bağlayan bir karakteristik motorlu etki alanını paylaşır. Kinesinler ATP ciro ve mikrotübül etkileşim hem süperailesinin genelinde farklılıklar gösterebilir. Bu farklılıkların, kargo taşımacılığı, Mikrotubullerin sürgülü, mikrotübül depolimerizasyona ve mikrotübül stabilizasyonu gibi çeşitli fonksiyonları belirli kinesinlerin terzi. Bir kinesin&#39;in etki mekanizmasını anlamak için ATP ciro kimyasal çevrim mikrotübül etkileşimin mekanik döngüsü birleştiğinde nasıl anlamak önemlidir. ATP çevirme süresi incelemek için, bir yaklaşım; çevriminde tek tek adımları görselleştirmek için, floresanla işaretlenmiş nükleotidlerin kullanılmasıdır. ATP ciro döngüsündeki her bir nükleotid geçiş kinetiklerini belirlemek tam döngüsü tespit edilmesi için oran-sınırlayıcı aşama ya da aşamalara sağlar. Bir kinesin için, içerisinde, hız kesici aşama bilmek önemlidirkinesin mikrotübüller ile etkileşime girdiğinde mikrotübül yokluğu, bu adım, genel olarak birkaç bin kat olarak hızlanır. Mikrotübüllerin yokluğunda Bu daha sonra tamamen kinesin ATP çevirme süresi anlama mikrotübül mevcudiyetinde ile karşılaştırılır. Tek tek nükleotid geçişler kinetiği genellikle elle özellikle mikrotübül varlığında, reaktifleri, gözlenmek için çok hızlıdır. Hızlı bir karıştırma cihazının, kinetik bir kaç milisaniye gibi kısa bir zaman ölçeği içinde gözlemlenen sağlayan bir durdurmalı akış florimetresi olarak, bu tür geçiş izlemek için de kullanılabilir. Burada, durdu akışı ile hızlı karıştırma reaktiflerin bir kinesin ATP çevirme süresi incelemek için, floresanla işaretlenmiş nükleotidlerin ile bağlantılı olarak kullanıldığı protokolleri açıklar.

MANT grubunun, flüoresans yoğunluğunda bir artış tipik olarak kinesin için mant olarak işaretlenmiş nükleotid bağlanması üzerine gözlenmiştir. Bununla birlikte, böyle bir sinyal değişikliğin büyüklüğü, söz konusu olan kinesin bağlıdır. Bu nedenle, bu kinetik deneyler için ilerlemeden önce bir flüoresan yoğunluğu değişim varlığını ve büyüklüğünü hem de teyit etmek için denge ölçümlerini gerçekleştirmek için yararlıdır. MantATP ve mantADP için tipik floresan spektroskopisi, ve kinesin-13, MCAK ile kompleks hem de Şekil 2B'de gösterilmiştir. Bu veriler MCAK bağlanması üzerine mantATP ve mantADP her ikisi tarafından gösterilen floresan yoğunluğu artışı vurgulamaktadır. Bir kinesin'in için mant nükleotid bağlanması üzerine floresan yoğunluğundaki değişim dernek ve ATP ve ADP hem dissosiasyonuna bildirmek için kullanılır (Bölüm 2 ve 3). MCAK durumunda, bir flüoresan yoğunluğu bir fark mantATP.kinesin ve mantADP.kinesin arasında görülmektedir <sus> Şekil 3 A, nükleotid içermeyen kinesin ile mantATP karıştırma üzerine cereyan eden, reaksiyon göstermektedir. Kinesin-13'e mantATP bağlanması * ile oluşan floresan yoğunluğundaki artışı gösteren Örnek bilgileri, MCAK Şekil 3B'de gösterilmiştir. Şekil 3B'de gösterilen tipte veri mantATP bir konsantrasyon aralığında toplanır. MantATP konsantrasyonuna karşı belirlenen hız sabitleri (K gözlenen) bir grafiği Şekil 3C 'de gösterilmiştir. Bir doğrusal bir fonksiyonu bu verileri takılması (yani, k obs = k 1 [mantATP] + k -1) atıl (2.8 Adım) k katkıda hız sabitleri dekonvulasyon sağlar. Bu nedenle, esas ve mantATP için ayrışma oranı sabiti hem belirlenmesini sağlayan (Şekil 1, k, 1 ve k, -1 sırasıyla). Şekil 4A, etiketlenmemiş ATP fazlası ile mantADP.kinesin karıştırma üzerine cereyan eden, reaksiyon göstermektedir. Şekil 4B'de veriler kinesin-13, MCAK ayrıldıktan sonra mantADP için gözlenen floresan yoğunluğu azalmayı göstermektedir. MantADP ayrılması için (adım 3.6), bir üstel fonksiyon için hız sabitini bu verileri uydurularak doğrudan belirlenir. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/52142/52142fig2highres.jpg"> Fluorofor methylanthraniloyl (mant) ile etiketlenmiş nükleotidler Şekil 2. ATP çevirme süresi bireysel adımları izole etmek için kullanılır. Riboz üzerindeki yerine 2 'veya 3' ya da konjüge MANT fluorofor konumunu gösteren mantATP (A) yapısı. (B) çözeltisi (mAXP) olarak mantATP ve mantADP Normalize floresan spektrumu ve bir mantATPkinesin'in MCAK (MATP + MCAK ve mADP + MCAK) ile kompleksi d mantADP. MantATP spektrumu çözelti içinde mantADP için azami floresan normalize çözelti içinde mantATP için azami floresans ve mantADP spektrumları için normalize edilir bulunmaktadır. MCAK ile karıştırılmış, MANT nükleotidlerin spektrumları 1 dakika karıştırma sonrası toplanır. Olarak protokolde açıklanan reaktifler ve florimetrenin ayarları konsantrasyonu 1.1 ve 1.2 adımları. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52142/52142fig3highres.jpg"> MantATP arasında, bağlantı oranı sabitinin Şekil 3. ölçümü. (A) durdu-akış ile yer mesaja karıştırma alır tepkiyi gösteren şematik: mantATP (MATP) nükleotid-free Kinezin'e bağlanır. Proteinine bağlanması üzerine, MANT grubu artar floresans yoğunluğu. (B) 'Flüoresan sinyali, değişiklik (siyah) MCAK ile mantATP (25 M) (5 M nu karıştırma üzerine gözlenencleotide içermeyen). Bu veri (tartışma) mant floroforun ışıkla hesapları tek bir üstel fonksiyonu artı sabit negatif eğim bir çizgi, sığdırma (kesik kırmızı) Ankastre:. Önce durdu akış florimetrede karıştırma şırınga içeriği. nükleotid içermeyen MCAK ile mantATP reaksiyonu için hesaplanmış bir (C) hız sabitleri (K atıl) mantATP konsantrasyonu ile karşılaştırıldı. Bu grafik, M-1 s birimleri ile, bağlantı oranı sabitinin (Şekil 1, k, 1) olan gradyanı -1 ve y-dinleme ayrılma oranı sabit kalır (Şekil 1, k-1) ile olan bir doğrusal bölgesine sahip olacaktır s birimleri -1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52142/52142fig3large.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> . MantADP ile yüklenmiş kinesin etiketlenmemiş ATP fazla bir katma seyreltilir: mantADP için ayrışma oranı sabiti Şekil 4 ölçümü (A) şematik akış durduruldu-sonrası karıştırma yer alan reaksiyon görünümüdür. Böylece ayrıştırma mantADP mantADP Birliği (tartışmaya bakınız) arka reaksiyonunu önlemek, etiketlenmemiş ATP ile değiştirilir. MANT grubunun flüoresan yoğunluğu, proteinin ayrıldıktan sonra azalmaktadır. Kinesin MCAK gelen mantADP dissosiye üzerine gözlenen (B) Floresans bir azalma. Floresan sinyali (siyah) (tartışma) mant grubun ışıkla hesabını tek bir üstel artı sürekli olumsuz bir eğim çizgisine uygun (kesikli kırmızı) 'dir. Belirlenen hız sabiti mantADP (Şekil 1, k ayrılması için hız sabitidir4) Ankastre:.. Durdurulmuş akış florimetrede karıştırma önce şırınga içeriği <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52142/52142fig4highres.jpg" target="_blank">bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> </sus>

Kinesinler mikrotübüllerle nükleotid-bağımlı etkileşimi ile karakterize edilir: mikrotübül bir etkileşim döngüsü birleştiğinde ATP ciro bir döngü. Burada, floresanla işaretlenmiş nükleotidlerin ve durdurmalı akış floresan kullanılarak kinesin ATP çevirme süresi bireysel nükleotid geçişler kinetiği analiz protokolleri açıklar.

Floresan-Akış durdu ve Etiketli Nükleotidlerinin Kullanım kinesinlerin ATP Ciro Döngüsü Analiz için

The kinesin superfamily of microtubule associated motor proteins share a characteristic motor domain which both hydrolyses ATP and binds microtubules. ...

Bu prosedürün genel amacı, bir kinesinin A TP devir döngüsü sırasında nükleotid bağlanma ve ayrışma kinetiğini ölçmektir. Bu, ilk önce nükleotid içermeyen veya floresan etiketli nükleotid ile yüklenmiş kinesin proteininin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Daha sonra, hazırlanan kinesin, durdurulmuş bir akış florimetresi kullanılarak nükleotid ile karıştırılır ve floresan etiketli nükleotidin bağlanması veya ayrışması ile ilişkili floresanstaki değişiklik gözlenir.Daha sonra floresandaki değişiklik, bir hız sabiti elde etmek için üstel bir fonksiyona uydurulur. Son olarak, ölçülen oran sabitleri devredilir ve oran sabitleri, A TP devir döngüsünün belirli geçişlerine atfedilir. Sonuç olarak, floresan etiketli nükleotid ve durdurulmuş akış floresan kombinasyonu, nükleotid bağlanma ve ayrışma kinetiğini ölçmek için kullanılır.CIN Prosedürü gösteren Jennifer Patel postdoc ve laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olan Hannah Belch olacak. Metin protokolünde belirtildiği gibi insan etiketli nükleotidin bir milimolar EDTA ve bir milimolar DTT'de magnezyum içermeyen tampon içinde 20'ye kadar mikromolar kinesin çözeltisine bağlanması üzerine kinesinin floresan yoğunluğunu belirledikten sonra, çözeltiyi 25 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin, bir yerçekimi akışı G 25 SX jel filtrasyon kolonu kurun ve en az üç kolon hacmi ile dengeleyin magnezyum içermez arabellek. Ardından, serbest nükleotidleri ve EDTA'yı kinesinden ayırmak için essin çözeltisini kolona yükleyin.Boş tüpe 100 milimolar magnezyum klorür çözeltisi hacmi ekleyerek bir toplama tüpünü onarın, böylece nihai magnezyum klorür konsantrasyonu bir milimolar olur. Kinesin çözeltisinin toplanmasından sonra, uygun bir magnezyum içermeyen tampon kullanarak kinesini hızlı bir şekilde elüte edin. Toplama tüpünde magnezyum klorürün bulunması, Ian'ın kolondan hemen sonra kinesinin stabilize edilmesine yardımcı olur, kinesini buz üzerinde saklar ve bir ila iki saat içinde kullanır.Bu arada, bir adama bir TP konsantrasyon serisi hazırlayın. Mevcut kinesin konsantrasyonuna göre konsantrasyon aralığını seçin. Her mant konsantrasyonu için bir TP, insan etiketli nükleotid, kinesin nükleotid bağlanma bölgeleri üzerinde beş ila on kat molar fazlalıkta olacak şekilde uygun bir kinesin konsantrasyonu hazırlar.Durdurulmuş akış florimetresindeki uyarma dalga boyunu 365 nanometre ve emisyon dalga boyunu uzun geçiren bir filtre ile 400 nanometrenin üzerine ayarlayın. Ardından, en düşük Manta TP konsantrasyonundan başlayarak, manta TP ve nükleotid içermeyen kinesini bire bir hacim / hacim oranında karıştırmak için durdurulmuş akış florimetresini kullanın. Aşağıdaki formülü kullanarak, mant A TP konsantrasyonunu üstel bir fonksiyona öğretmek için floresan yoğunluk ölçümündeki değişikliği ve ayrıca mant grubunun fotoağartılmasını hesaba katmak için sabit bir negatif eğim çizgisini uygun hale getirin.Bu uyumlardan, her mant konsantrasyonunda bir hız sabiti belirleyin. Bir TP daha sonra kopları mant konsantrasyonuna karşı diş ipi ile değiştirerek ilişkilendirme ve ayrışma oranlarını devreder. Bir TP Daha sonra gradyan ve y ekseni kesişimini elde etmek için bu verileri doğrusal bir fonksiyona sığdırın.Gradyan, saniyede molar başına birimlerle bir TP ilişkisi olan adam için hız sabitini temsil eder. Kesişme noktası, saniyedeki birimlerle ayrışma hızı sabitini temsil eder. Ayrışma hızı sabitini ölçmek için, bir DP'yi 50'de uygun bir tamponda iki mikromolar kinesin çözeltisine fermente edin.Mikromolar, 30 dakika boyunca 25 santigrat derece bir DP inkübatörü anlamına geliyordu. Kinesinden fre mant, A DP'yi çıkarmak için bir G 25 Sedex sütunu kullandıktan sonra, mant A DP ile yüklendikten ve bu videoda daha önce açıklandığı gibi durdurma akışı olukunu ayarladıktan sonra, mant A DP Kinine kompleksini 50 kat veya daha büyük molar fazla etiketsiz A TP ile bire bir hacim / hacim oranı uyumunda karıştırmak için durdurulan akışı kullanın. Zaman içinde tek bir üstel fonksiyona gözlemlenen floresan yoğunluğundaki azalma ve ayrıca grubun foto-ağartılmasına izin vermek için sabit bir negatif eğim çizgisi.Bu uyumdan belirlenen kops, mant A DP'nin saniyedeki birimlerle ayrışması için hız sabitidir. Manto ağacı nükleotidinin bağlanması veya ayrışması üzerine sinyal değişikliğinin büyüklüğü, belirli kinesine bağlıdır. Bu nedenle, bir floresan yoğunluk değişikliğinin hem varlığını hem de büyüklüğünü doğrulamak için önce denge ölçümleri yapmak yararlıdır.Floresan spektrumlar bir TP'yi fermente eder ve kinesin M CAC'nin hem çözeltisinde hem de kompleksinde bir DP anlamına gelir. Bu şekil, insanın bir TP'sini nükleotid içermeyen kinesin ile karıştırması üzerine meydana gelen reaksiyonu göstermektedir. İnsan A TP'nin M CAC'ye bağlanması üzerine meydana gelen floresan yoğunluğundaki artış, adama karşı hız sabitine uygun olarak burada gösterilmiştir.Burada görüldüğü gibi doğrusal bir fonksiyona bir TP konsantrasyonu, kops'a katkıda bulunan hız sabitinin evrişimine izin verir ve birleşme ve ayrışma hızı duruş duruşu fermenti A TP'yi sağlar. Bu şekil, burada gösterildiği gibi M CEC'den ayrışma üzerine ferment A DP'de gözlemlenen floresan yoğunluğu düşüşünü göstermektedir. Mant A DP'nin Kinesin'den ayrışması için hız sabiti, bu verinin üstel bir fonksiyona uydurulmasıyla belirlenir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu protokollerin her biri üç saatten daha kısa sürede tamamlanabilir.Bu yöntem kinesin hakkında bilgi sağlayabilse de, miyozin ve G proteinleri gibi diğer nükleotid bağlayıcı proteinlere de uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, bir kinesin için nükleotid bağlanma ve ayrışma kinetiğini ölçmek için floresan etiketli nükleotidlerin ve bir durdurma akış ölçerin nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.

use-stopped-flow-fluorescence-labeled-nucleotides-to-analyze-atp

Research

JoVE Journal

Chemistry

Kimya

Fonksiyonlu mikrotübül üzerinde kayma yüzeyi yapıştırılır kinesin motorlu proteinlerinin nano ölçekli bir taşıma sistemi olarak hizmet verebilir oluşan Moleküler mekik. Burada, tipik bir servis sistemi montaj açıklanmıştır.

Kinesin Powered Moleküler minibüsleri üzerine Kargo Yükleniyor

Burada, bir protokol kinesin-1 yükleri belirlemek için sunulmuştur. Kinesin-1 ağır zincir (KIF5B) bir motorsuz mutant sitoplazmasında agrega ve kargoların agregasyonunu uyarır. Her iki agrega floresan mikroskobu altında tespit edilir. Benzer bir yöntem, diğer motor proteinlerinin yükleri tespit edilmesi için kullanılabilir.

Floresan mikroskobu kullanarak kinesin-1 Cargos Tanımlanması

Biz nasıl sıkı BAĞLAMAK ve photoactivation gibi mikro - ve photomanipulation teknikleri hareketliliği parametreleri belirlenmesi etkinleştirmek ve proteinler geçiş içinde kronolojik zamanmekansal dinamikleri hücreleri tanımlamak. Deneysel veriler hücre altı dinamikleri ve ciro hareketliliği düzenleyiciler veya temel aktin sitoiskeleti içerir.

Morfogenetik dinamiklerini analiz ve hücre iskeleti düzenleyiciler ciro sağlayan Embriyolardan teknikleri

Biz moleküler mekikler, kurmak için bir protokol nerede yüzeye yapıştırılır kinesin motor proteinler boya etiketli mikrotübüller itmek mevcut. Kinesins yüzeyi ile zayıf etkileşimler tersinir kendi eki sağlar. Bu dinamik montaj ve demontaj bir bileşen işlevselliğini korurken sergileyen bir nano sistemi oluşturur.

Moleküler mekikler Powered by geri dönülebilir olarak montaj Kinesins bağlı

Bu protokol, hücresel bir ortamda reseptörlere gerçek zamanlı olarak adenin nükleotid bağlanmasını ölçmek için bir yöntem sunar. Bağlanma, trinitrofenil nükleotid türevleri ile kanonik olmayan, floresan amino asit ile etiketlenmiş protein arasındaki Förster rezonans enerji transferi (FRET) olarak ölçülür.

Sağlam, fonksiyonel membran proteinlerine bağlanan nükleotidin gerçek zamanlı olarak ölçülmesi

Burada, iki mikrotübül popülasyonunun dinamiklerini aynı anda ölçmek ve karşılaştırmak için TIRF mikroskopi tabanlı in vitro resusyon testi sunulmaktadır. Çapraz bağlı mikrotübül demetleri ve tek mikrotübüller üzerindeki çoklu mikrotübül ile ilişkili proteinlerin kolektif aktivitesini eşzamanlı olarak görüntülemek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Çapraz Bağlı ve Tek Mikrotübüllerin Dinamiğinin In Vitro TIRF Mikroskobu ile Eşzamanlı Görselleştirilmesi

Çift yönlü mitotik kinesin-5 Cin8, hareketlilikleri sırasında bölünen ve birleşen kümelerde birikir. Kümelerdeki birikim ayrıca Cin8'in hızını ve yönlülüğünü de değiştirir. Burada, saflaştırılmış Cin8-GFP ile motilitesi tahlilleri ve tek moleküllerin ve Cin8 kümelerinin hareketli özelliklerinin analizi için bir protokol açıklanmaktadır.

Tek Moleküllerin Motilitesi ve S. cerevisiae Hücrelerinden Saflaştırılmış Çift Yönlü Kinesin-5 Cin8 Kümeleri

Dinamik mikrotübüllerin ve floresan olarak etiketlenmiş mikrotübülle ilişkili proteinlerin eşzamanlı görüntülenmesi için girişim-yansıma mikroskobu ve toplam-iç-yansıma-floresan mikroskobu uygulamak için bir protokol sunuyoruz.

Dinamik Mikrotübülleri ve İlişkili Proteinleri Görüntülemek için Eşzamanlı Girişim Yansıması ve Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu

Burada, mikrotübül demetlerini in vitro olarak yeniden yapılandırmak ve eşzamanlı optik yakalama ve toplam iç yansıma floresan mikroskobu kullanarak içlerinde uygulanan kuvvetleri doğrudan ölçmek için bir protokol sunuyoruz. Bu tahlil, aktif mikrotübül ağları içindeki protein toplulukları tarafından üretilen kuvvetlerin ve yer değiştirmelerin nano ölçekte ölçülmesine izin verir.

Yeniden yapılandırılmış aktif mikrotübül demetleri içindeki kuvvetleri doğrudan ölçme

Bu çalışma, kinezin-3 ailesinin bir üyesi olan KIF1A'nın (1-393LZ) Sf9-bakülovirüs ekspresyon sistemi kullanılarak saflaştırılmasını detaylandırmaktadır. Bu saflaştırılmış motorların in vitro tek moleküllü ve çok motorlu kayma analizi, memeli hücre lizatından elde edilen motorlarla karşılaştırılabilir sağlam hareketlilik özellikleri sergilemiştir. Bu nedenle, Sf9-bakülovirüs sistemi, ilgilenilen motor proteini ifade etmek ve saflaştırmak için uygundur.

Sf9 Saflaştırılmış Süperprosesif Kinesin-3 Ailesi Motorlarının Tek Moleküllü Analizi

Basit aktin filament mikroakışkan tahlilleri için, floresan mikroskobu ile birlikte, bireysel aktin filamentlerini gerçek zamanlı olarak doğru bir şekilde izlemeyi ve sırayla farklı protein çözeltilerine maruz bırakmayı sağlayan protokoller sunuyoruz.

Tek Aktin Filamentlerin ve Demetlerin Montaj Dinamiğini İncelemek için Mikroakışkanlar ve Floresan Mikroskobu Kullanma

Öğrenin, kinesin ATP devir döngüsünde nükleotid bağlanma ve ayrışma kinetiğini floresan etiketli nükleotidler ve durdurulmuş akış floresansı kullanarak nasıl ölçülür. Bu yöntem motor protein fonksiyonlarını anlamak için temel bilgiler sağlar.

Floresan-Akış durdu ve Etiketli Nükleotidlerinin Kullanım kinesinlerin ATP Ciro Döngüsü Analiz için

Daha fazla video keşfet