Name: Bir Model Olarak Koku Sistemi Akson Büyüme Modelleri ve Morfoloji Eğitim için In Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Öğrenin, canlı organizmada koku duyu nöronlarını elektroporasyonla etiketleme ve çok foton mikroskobisiyle görüntüleme yöntemini. Bu teknik, aksonal büyüme ve sinir hücresi morfolojisindeki değişiklikleri zaman içinde izlemeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, DFG Schwerpunktprogramm 1392 (proje MA 4113/2-2), Mükemmeliyet kümesi ve DFG Araştırma Merkezi Nano Ölçekli Mikroskopi ve Beynin Moleküler Fizyolojisi (proje B1-9) ve Alman Araştırma ve Eğitim Bakanlığı (BMBF; proje 1364480) tarafından desteklenmiştir.

NOT: Hayvan Deneyleri Etik için Göttingen Üniversitesi Komite tarafından onaylanmış Hayvan taşıma ve deneyler yapıldı. Göstergeler ve Pipet Fabrikasyon 1. Hazırlık <ol><li> Elektroporasyon kurulum büyük çalışma mesafesi ile stereomicroscope oluşur ve kullanılan boya için floresan aydınlatma ve filtre setleri ile donatılmış olduğundan emin olun. </li><li> Elektroporasyon için özel tek bir hücre elektrogözenekleme veya bir osiloskop bağlı bir genel kare darbe jeneratörü kullanabilirsiniz. Bir pipet tutucu ve bir banyo elektrot için Electroporator çıkışlarını bağlayın. Mikropipet tutucu ve banyo elektrot negatif terminaline darbe üretecinin pozitif terminaline bağlayınız. Pipet tutucu ve banyo elektrot hem gümüş klorür ince bir tabaka ile kaplı gümüş telleri içerir emin olun. </li><li> Tam olarak konumlandırılmasını sağlamak için bir mikromanipülatör pipet tutucu monte edin. </li&gt; <li> İç filament borosilikat cam kılcal damarlardan elektroporasyon Mikropipetler Üretiyor. </li><li> Yatay bir mikropipet çekme aleti kullanarak ve Bestman ve diğ., 13 tarafından tarif edildiği gibi bağlantı klemp deneyleri için pipetler üretimi için değiştirilmiş bir protokol uygulanır. </li><li> Uzun bir sap ve tek hücre elektroporasyon için yaklaşık 15-20 MOhm daha yüksek bir pipet direnç sonuçlanan küçük bir ipucu açılış üretmek için parametreleri uyarlayın. Pipet direnci hücre grubunun etiketlenmesi için, 3-4 Mohm, örneğin, daha düşük olmalıdır. </li><li> Özel tek hücreli elektroporatörü ile pipet direnci ya doğrudan ölçmek veya tanımlanmış bir gerilim darbesi uygulamasından sonra bir osiloskop ile akım ölçümü sonra Ohm Kanunu ile hesaplayın. </li></ol> Elektroporasyon Çözüm 2. Hazırlık <ol><li> Kurbağa zil (98 mM NaCI, 2 mM KCI içinde florofor ile eşleştirilen dekstran çözülür, 1 mM CaCI2, 2 mM MGCl, 2, 3 mM&#39;lik bir konsantrasyonda, 5 mM glukoz, pH 7.8 ayarlanır, 5 mM&#39;lık Na-piruvat, 10 mM HEPES, ozmolarite mOsmol / l, 230 idi). Düşük boya konsantrasyonları kullanıldığında hücreler bu şekilde parlak etiketli olabilir. Bir büyük hacimli stok çözeltisi hazırlayın ve küçük parçalar bölün. Depolama (ay boyunca stabil) onları dondurun. NOT: Dekstranlar farklı boyutlarda ve emisyon / uyarma spektrumları çeşitli mevcuttur (. Örneğin, Alexa 488-dekstran 10KD, Alexa 546-dekstran 10KD, Alexa 568-dekstran 10KD, Alexa 594-dekstran 10KD, TMR-dekstran 3kD). </li><li> Dekstran çözeltisi (1-5 ul) küçük bir hacim ile ince uzun bir pipet ucu ile mikropipet Dolgu. Dikkatle pipet ucundan artık hava kabarcıklarını çıkarmak için parmak ile mikropipet fiske. </li><li> Pipet tutucu mikropipet monte edin. Pipet içine gümüş tel boya çözeltisi ile temas içinde olduğundan emin olun. </li></ol> Larva X. 3. Seçim laevis &lt;/ Em&gt; <ol><li> X. albino larvaları kullanın deneyler için laevis. Yabani tip hayvanlarda konfokal / multiphoton görüntüleme sırasında otofloresan emisyon göstermektedirler ve bu nedenle tarif edilen deneyler için uygun değildir pigment doldurulmuş melanophores sahiptir. </li><li> Nieuwkoop ve Faber 14 sonra premetamorphotic Kurbağa yavrularını Sahne. Deneyler için aşamaları 45-53 ve Kurbağa yavrularını seçin. </li></ol> Florofor çiftli dekstranlar 4. Elektroporasyon <ol><li> Bir petri çanağı içinde doku küçük bir parça yerleştirilir ve (pH 7&#39;ye ayarlanır Etil 3-aminobenzoat metansülfonat),% 0.02 tricaine ihtiva eden küçük bir su hacmi ile örtün. </li><li> % 0.02 tricaine içeren su içinde yavrularını anestezisi. Birkaç dakika sonra hayvanlar hareket ateşkes. Kurbağa yavrularını dokunarak uygun anestezi onaylayın. Onlar sigara duyarlı olmalıdır. </li><li> Dikkatlice doku kapalı petri anestezi gelen, tetra aktarın. </li><li> Emin banyo Electr olungazel elektroporasyon devresini kapatır. Elektrot ıslak doku ile temas halinde olduğunu temin etmek; tadpole doğrudan temas gerekli değildir. </li><li> Mikromanipulatör kullanılarak Koku alma organı mikropipet ucu yakın yerleştirin. </li><li> Pipet ile koku organı çevreleyen cilde nüfuz ve dikkatli ana koku epiteli veya vomeronasal epitel merkezi konumdaki duyusal nöron tabakası içine ucu ilerlemek. </li><li> Duyu nöronlarının içine boya aktarmak için pozitif kare voltaj darbeleri tetikler. Tek bir gerilim darbe uygulamak (örn., 25 V, darbe uzunluğu 25 msn) veya birden darbelerinin trenler (örn., 50 V, darbe uzunluğu 300 mikro saniye, 200 Hz 400 msn tren süresi). Etiketleme uzatmak istenen optimal gerilim darbe parametreleri belirleyin: NOT. Etiketli hücrelerin sayısını düşürmek için gerilim darbe genliği, süresi ve tekrarlama sayısını azaltın. P yüksek gerilim darbe genlik, süresini ve sayısını Uyguladaha yaygın bir etiketleme ulses. </li><li> Stereomicroscope floresan aydınlatma kullanılarak tetiklenen darbeleri başarılı boya ekstrüzyon ve elektroporasyon gözünüzde canlandırın. Boya başarılı elektroporasyon sonra bir hücre gövdesi ve dendritin içine hızla yayılır. </li><li> Tekrar tadpole ikinci koku organı için 4,5-4,9 adımları. </li><li> Geri kazanım taze su ile dolu bir beher içine, tetra aktarın. Ca sonra 5 dk iribaşları anesteziden uyanmak ve normal yüzme hareketleri başlar. </li><li> 24 saat sonra elektroporasyonlu boya duyu nöronlarında yayılır ve sonunda aksonal taşıma araçları ile koku ampul ulaşır. </li></ol> Hücreler ve Akson Süreçlerinin İn Vivo Görselleştirme 5. Montaj Hayvanlar <ol><li> % 0.02 tricaine içeren su içinde yavrularını anestezisi. </li><li> Dikkatle örneğin bir görüntüleme odasının içine Kurbağa yavrularını aktarmak, küçük bir silikon kauçuk bir iribaş ölçekli girinti ile petri kaplı. &lt;/ Li&gt; <li> Parafilmlerin bir şerit içine küçük bir dikdörtgen kesin. Kesik pencere içinden açıkta kalan ön Telencephalon bırakarak Parafilm ile, tetra örtün. Iribaş zarar vermeden yemeğin üzerine iğne ile Parafilm sabitleyin. </li><li> Iribaş% 0.02 tricaine içeren yeterli su altında olduğundan emin olun. </li><li> Dik multiphoton mikroskop veya konfokal mikroskop sahnede görüntüleme odasına monte edin. </li><li> Koku ampul görüntüleri üç boyutlu yığın edinin. Görüntüleme işlemi mümkün olduğu kadar kısa ve 10-15 dk aşmamasına dikkat edin. </li><li> Ayrı bir tanka normal suya iribaş dönmek ve ışığa maruz kalmasını önlemek. 5 dakika sonra, tetra anestezi uyanır. </li><li> Tekrar, belirlenen zaman aralıklarında sonra 5,1-5,7 adımları örn., Her gün. </li></ol> Hücreler ve Akson Süreçlerinin Ex Vivo Görsellik 6. Montaj Hayvanlar <ol><li> Alternatif bölüm 5protokol, etiketli duyusal nöronlar görselleştirmek için bir kesilmiştir beyin hazırlık kullanın. </li><li> Anestezisi ve omuriliğe geçişte beynin transeksiyonu ile, tetra öldürür. Koku organları, koku sinirleri ve ön Telencephalon içeren bir doku blok tüketim. </li><li> Kurbağa zil çözüm doku bloğu aktarın ve beynin ventral tarafında ortaya çıkarmak için ince makas ile bağ dokusu kaldırmak. </li><li> Bir görüntüleme odasına doku bloğu aktarın ve naylon ipliklerle telli bir platin çerçeve ile bunu düzeltmek. </li><li> Konfokal / multiphoton mikroskop sahnede görüntüleme odasına monte edin. </li><li> Koku ampul görüntüleri üç boyutlu yığın edinin. </li></ol> 7. Görüntü İşleme ve Veri Değerlendirme <ol><li> Coupé&#39;si, P. ve arkadaşları tarafından tarif edildiği gibi uygun hale getirilmesi ve görüntü kalitesi ve nöronal yapıları görselleştirme artırmak için filtreleme yerel olmayan araçlar uygulanır. 15.. NOT: canlı örneklerin derin doku katmanları görüntüleme deneylerinden veriler genellikle gürültülü. </li><li> Genel bir bakış için görüntü yığınlarının maksimum yoğunluğu projeksiyonları oluşturun. </li><li> Time-lapse görüntüleme deneyleri duyu nöronlarının tek belirgin olarak teşhis akson için veri setleri ekran. </li><li> Peng ve arkadaşları tarafından tarif edildiği gibi nöronal işlemin yazılım destekli izleme ile hücre morfolojisi yeniden yapılandırma. 16. </li></ol>

<ol><li>Huard, J. M., Youngentob, S. L., Goldstein, B. J., Luskin, M. B., Schwob, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+olfactory+epithelium+contains+multipotent+progenitors+that+give+rise+to+neurons+and+non-neural+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Adult olfactory epithelium contains multipotent progenitors that give rise to neurons and non-neural cells.</a> J. Comp. Neurol. 400 (4), 486-4810 (1998).</li>
<li>Schwob, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+regeneration+and+the+peripheral+olfactory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Rec%22%5BJournal%5D)">Neural regeneration and the peripheral olfactory system.</a> Anat. Rec. 269 (1), 33-49 (2002).</li>
<li>Leung, C. T., Coulombe, P. A., Reed, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+olfactory+neural+stem+cells+to+tissue+maintenance+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Contribution of olfactory neural stem cells to tissue maintenance and regeneration.</a> Nat. Neurosci. 10 (6), 72-726 (2007).</li>
<li>Lodovichi, C., Belluscio, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant+receptors+in+the+formation+of+the+olfactory+bulb+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%28Bethesda%22%5BJournal%5D)">Odorant receptors in the formation of the olfactory bulb circuitry.</a> Physiology (Bethesda. 27 (4), 212-2110 (2012).</li>
<li>Mori, K., Sakano, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+is+the+olfactory+map+formed+and+interpreted+in+the+mammalian+brain%29%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">How is the olfactory map formed and interpreted in the mammalian brain).</a> Annu. Rev. Neurosci. 34, 467-499 (2011).</li>
<li>De Vry, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation+of+the+central+nervous+system%3A+a+non-viral+approach+for+targeted+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation of the central nervous system: a non-viral approach for targeted gene delivery.</a> Prog. Neurobiol. 92 (3), 227-244 (2010).</li>
<li>Hovis, K. R., Padmanabhan, K., Urban, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+in+vitro+electroporation+allows+visualization%2C+recording%2C+and+calcium+imaging+of+local+neuronal+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method of in vitro electroporation allows visualization, recording, and calcium imaging of local neuronal circuits.</a> J. Neurosci. Methods. 191 (1), 1-10 (2010).</li>
<li>Chen, C., Smye, S. W., Robinson, M. P., Evans, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+electroporation+theories%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Biol.+Eng.+Comput%22%5BJournal%5D)">Membrane electroporation theories: a review.</a> Med. Biol. Eng. Comput. 44 (1-2), 5-14 (2006).</li>
<li>Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+electroporation+in+Xenopus+tadpoles+in+vivo--from+single+cells+to+the+entire+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo--from single cells to the entire brain.</a> Differentiation. 70 (4-5), 148-154 (2002).</li>
<li>Hewapathirane, D. S., Haas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+electroporation+in+vivo+within+the+intact+developing+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain.</a> J. Vis. Exp. (17), (2008).</li>
<li>Gliem, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bimodal+processing+of+olfactory+information+in+an+amphibian+nose%3A+odor+responses+segregate+into+a+medial+and+a+lateral+stream%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Bimodal processing of olfactory information in an amphibian nose: odor responses segregate into a medial and a lateral stream.</a> Cell. Mol. Life Sci. 70 (11), 1965-1984 (2013).</li>
<li>Hassenklöver, T., Manzini, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+wiring+logic+in+amphibians+challenges+the+basic+assumptions+of+the+unbranched+axon+concept%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Olfactory wiring logic in amphibians challenges the basic assumptions of the unbranched axon concept.</a> J. Neurosci. 33 (44), 17252-1710 (2013).</li>
<li>Bestman, J. E., Ewald, R. C., Chiu, S. -L., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+single-cell+electroporation+for+transfer+of+DNA+and+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vivo single-cell electroporation for transfer of DNA and macromolecules.</a> Nat. Protoc. 1 (3), 1272-1210 (2006).</li>
<li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNieuwkoop%2C+PD+%22Normal+table+of+Xenopus+laevis%22">Normal table of Xenopus laevis</a>. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. , Garland Publishing, Inc. New York and London. (1994).</li>
<li>Coupé, P., Munz, M., Manjón, J. V., Ruthazer, E. S., Collins, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CANDLE+for+a+deeper+in+vivo+insight%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Image+Anal%22%5BJournal%5D)">A CANDLE for a deeper in vivo insight.</a> Med. Image Anal. 16 (4), 849-864 (2012).</li>
<li>Peng, H., Ruan, Z., Long, F., Simpson, J. H., Myers, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((V3D+enables+real-time+3D+visualization+and+quantitative+analysis+of+large-scale+biological+image+data+sets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">V3D enables real-time 3D visualization and quantitative analysis of large-scale biological image data sets.</a> Nat. Biotechnol. 28 (4), 348-353 (2010).</li>
<li>Falk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+cDNA%2FMorpholinos+to+targeted+areas+of+embryonic+CNS+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus.</a> BMC Dev. Biol. 7 (107), (2007).</li>
<li>Nezlin, L. P., Schild, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+olfactory+sensory+neurons+project+into+more+than+one+glomerulus+in+Xenopus+laevis+tadpole+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Individual olfactory sensory neurons project into more than one glomerulus in Xenopus laevis tadpole olfactory bulb.</a> J. Comp. Neurol. 481 (3), 233-239 (2005).</li>
<li>Nagayama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+simultaneous+tracing+and+Ca2%2B+imaging+of+local+neuronal+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">In vivo simultaneous tracing and Ca2+ imaging of local neuronal circuits.</a> Neuron. 53 (6), 789-803 (2007).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Burada tarif edilen deney prosedürü, larva X&#39;in koku organı etiketlenmesi duyu nöronları karşılaştırın fluoroforla birleştiğinde Dekstranların ve canlı hayvanın duyusal akson büyüme sonraki görselleştirme elektroporasyon ile laevis. In vivo elektroporasyon parametrelerinin değiştirilmesi ile, bu etiketlenmiş duyusal nöronların sayısını kontrol etmek mümkündür. Bu çok az ya da tek hücrelerin bir duyu epitel, nöron büyük gruplarını etiketlemek için mümkün olmaktadır. O mikropipet özellikleri ve elektroporasyon bakliyat konusunda özellikle dikkatli olmak önemlidir nöronal etiketleme uzatmak arzu sağlamak. Yükseköğretim pipet dirençleri ve gerilim darbe genlik, süre ve tekrarlama sayısının azaltılması daha yaygın etiketlemeye neden olabilir pipet dirençleri ve yüksek gerilim darbe genliği, süresi ve bakliyat sayısının azaltılması ise, etiketli hücrelerin miktarını azaltabilirsiniz. Thelektroporasyon için floresan dekstranlardan e kullanılması uygulanan ayarlarının uygun olup olmadığını anında görsel geri bildirim sağlar. Dikkatli olun bu genlik, süre ve potansiyel hücre hasarına hatta ölüme 17 hücre olabilir protokolde verilen değerleri aşması darbelerinin sayısı parametreleri kullanılarak. Mikropipetlerin tıkanmış veya kırık uçlar da başarılı Elektroporasvon sürebiliyor. X&#39;in Koku alma organı in vivo elektroporasyon postmetamorphotic kurbağaların deri sert ve kolay bir mikropipet ile nüfuz edilemez çünkü laevis larva aşamasında sınırlıdır. Nöron in vivo görüntüleme derin beyin alanlarında ya da kan damarları ile uyarım / emisyon ışık saçılmasıyla engellenmiş edilebilir. Bu sorun, daha büyük bir beyin için daha yüksek bir larva aşamalarında, özellikle belirgin hale gelir ve ince aksonal süreçlerin açıkça tanımlanması daha zor hale gürültülü sinyallere neden olabilir. <p= &quot;jove_content&quot;&gt; Sunulan protokol izinler sınıf tüm hücre yama etiketleme gibi, hayvan diseksiyon etiketleme sırasında hücreler zarar, doku dilimleri hazırlamak veya alternatif yöntemleri için gerekli doku sabitleme olmadan sağlam koku sistemi duyusal nöronlar görselleştirmek için -clamp deneyleri 18. İn vivo zaman atlamalı görüntüleme ile veya çok az bir sensor nöronlarının etiketleme birleştirirken, bu uzun bir süre boyunca tek bir olgun duyu nöronlarının glomerüler bağlantıları görüntülemek mümkündür. Bu şekilde, bir kaç hafta boyunca olgunlaşmamış duyu nöronlarının akson projeksiyon desen gelişimini izlemek de mümkündür. Bu canlı bir hayvanda tek bir akson büyümesi düzeninin kaydedilerek olanak sağladığı için bu sonuncu seçenek, özellikle ilgi çekicidir. Bu akson rehberlik ve yol bulmanın kontrol hücresel ve moleküler mekanizmaları araştırmak için olasılık açılır. Koku reseptör ifadesi de dahil olmak üzere birçok faktör, çeşitli axon, rehberlik molekülleri ve duyu nöronlarının indüklenen-koku / spontan aktivite duyumsal nöron akson 4,5 hedef bulma regüle ettiği gösterilmiştir. Protokolün uygulanması koku duyusal nöronlar ile sınırlı değildir, aynı zamanda, örneğin, diğer hücre tipleri, çalışma için uygulanabilir., Gelişmekte olan beyin ya da koku ampul hücre mitral nörojenik bölgelerin / projenitör hücrelerini. Buna ek olarak gösterilen teknik de etiketli nöron ve / veya bağlı devre 7,19 ile ilgili işlevsel bilgi almak için zan-geçirgen kalsiyum boyalar kalsiyuma duyarlı dekstranlar ile kombinasyon halinde kullanılabilir ya da enjekte edilebilir. Dekstranlar bağlanmış florofor geniş kullanılabilirliği çoklu bireysel hücreler ya da farklı renklere sahip popülasyonlarının etiketleme izin verir. Ayrıca, flüoresan protein için, örneğin, kodlama için bir DNA çözeltisi, plazmit elektroporasyon için müsait olan ve bundan başka versatili artırabilirty ve tekniğin 6 kullanışlılığı. Protokol daha dekstranlar ve DNA ya da yüklü morpholinos birleşik elektroporasyon gen ekspresyonunu 13,17 işlemek için izin vermek için geliştirilmiş olabilir. Anlatılan yöntem kesinlikle kompleksi ve omurgalı koku sistemi aksonal rehberlik düzenleyen hala tam olarak anlaşılmış değildir süreçlerini araştırmak için yeni bir araç temsil eder.

Duyusal nöronların yaşam boyu döngüsü, koku alma sistemini diğer birçok duyusal ve nöronal sistemden ayırır1,2. Yeni oluşan duyusal nöronlar, koku alma epitelinin3 bazal kısmında sürekli olarak üretilir ve aksonlarını, koku alma sisteminin4 ilk röle istasyonu olan koku soğancığına uzatır. Bununla birlikte, koku haritasının oluşumunu ve sürdürülmesini kontrol eden hücresel ve moleküler mekanizmalar tam olarak anlaşılmaktan uzaktır4,5.
Burada, larva X. laevis'in koku alma organının duyusal nöronlarını, floroforla birleştirilmiş dekstransın in vivo elektroporasyonu ile etiketlemek için bir protokol açıklıyoruz. Sunulan protokol, aksonal morfoloji ve bağlantının görselleştirilmesine, zaman içindeki aksonal gelişimin izlenmesine ve aksonal kablolama ve rehberliği düzenleyen mekanizmaların incelenmesine olanak tanır.
Elektroporasyon, dekstran bağlı boyalar ve DNA gibi yüklü makromolekülleri6,7 hücrelerine sokmak için iyi bilinen bir yöntemdir. Hücre zarı, kısa voltaj darbelerinin uygulanmasıyla geçirgen hale getirilir ve moleküller elektroforetik olarak sitozol8'e iletilir. Bir mikropipet kullanılarak uzamsal olarak kısıtlanmış elektroporasyon, nöronlar dahil hücrelerin seçici olarak etiketlenmesine izin verir ve X. laevis9,10'un görsel sistemi de dahil olmak üzere çeşitli nöronal sistemlerde uygulanmıştır.
Elektroporasyonlu hayvanların, konfokal lazer tarama veya çoklu foton mikroskobu kullanarak canlı hayvanlarda aksonal büyüme paternlerini ve morfolojisini incelemek için nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz. Açıklanan prosedür, ana ve aksesuar koku alma sisteminin11,12 duyusal nöronlarının aksonal projeksiyonlarının kaba topolojisinin tanımlanmasına izin verir. İn vivo zaman atlamalı görüntüleme kullanılarak, tek olgun duyusal nöronların glomerüler bağlantılarını denetlemek ve olgunlaşmamış duyusal nöronların aksonal projeksiyon modellerinin evrimini izlemek de uygundur12. Açıklanan protokol, sağlam hayvanda koku alma devrelerinin yapısını ve oluşumunu araştırmak için uygulanabilir ve koku alma ve diğer nöronal sistemler içindeki diğer hücre tiplerine uyarlanabilir.

<table><tbody><tr><td>Floresan aydınlatmalı</td> <td>SZX16</td><td>Olympus</td><td></td> Stereomikroskop</tr><tr><td>Axon Axoporator 800A</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td></td><td>Tek hücreli elektroporatör</td></tr><tr><td>ELP-01D</td><td>npi elektronik</td><td></td><td>Elektroporatör</td></tr><tr><td>MMJ</td><td>M&auml; rzh&auml; kullanıcı: Wetzlar</td><td></td><td>Manuel mikromanipülatör</td></tr><tr><td>P-1000</td><td>Sutter</td><td></td><td>Yatay mikropipet çektirme</td></tr><tr><td>G150F-4</td><td>Warner Instruments Elektroporasyon</td><td></td><td>pipeti üretimi için cam kılcal damarlar; iç filament geri doldurmayı kolaylaştırır</td></tr><tr><td>Alexa 488-dekstran 10 kD</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>D22910</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 546-dekstran 10 kD</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>D22911</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 568-dekstran 10 kD</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>D22912</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 594-dekstran 10 kD</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>D22913</td><td></td></tr><tr><td>TMR-dekstran 3 kD (mikro Yakut)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>D7162</td><td></td></tr><tr><td>Mikro yükleyici pipet uçları</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>Trikain (Etil 3-aminobenzoat metansülfonat)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>Anestezik; eldiven kullanın</td></tr><tr><td>A1-MP</td><td>Nikon</td><td></td><td>Multifoton mikroskobu</td></tr><tr><td>LSM 780</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Konfokal mikroskop</td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td></td><td>Nöronal izleme için alternatif yazılım</td></tr></tbody></table>

bir model olarak koku sistemi akson büyüme modelleri ve morfoloji eğitim için in vivo

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

Koku alma sistemi, bir organizmanın ömrü boyunca yeni nöronlar üretme konusunda alışılmadık bir kapasiteye sahiptir. Koku alma epitelinin bazal kısmındaki koku kök hücreleri, sürekli olarak aksonlarını koku soğancığına uzatan yeni duyusal nöronlara yol açar ve burada mevcut devrelere entegre olma zorluğuyla karşı karşıya kalırlar. Bu özel özellik nedeniyle, koku alma sistemi, aksonal kablolamayı ve rehberliği izlemek ve sinaps oluşumunu araştırmak için eşsiz bir fırsatı temsil eder. Burada, duyusal nöronların in vivo etiketlenmesi ve ardından amfibi Xenopus laevis'in larvalarının koku alma sistemindeki aksonların görselleştirilmesi için bir prosedürü açıklıyoruz. Koku alma organındaki duyusal nöronları boyamak için elektroporasyon tekniğini benimsiyoruz. İn vivo elektroporasyon, floroforla birleştirilmiş dekstran veya diğer makromolekülleri canlı hücrelere iletmek için yerleşik bir tekniktir. Lekeli duyusal nöronlar ve aksonal süreçleri daha sonra canlı hayvanda konfokal lazer tarama veya multifoton mikroskobu kullanılarak izlenebilir. Etiketli hücrelerin sayısını hayvan başına az veya tek hücreye indirgeyerek, tek aksonlar koku soğancığına kadar izlenebilir ve morfolojik değişiklikleri, bir dizi in vivo hızlandırılmış görüntüleme deneyi yapılarak haftalar boyunca izlenebilir. Açıklanan protokol, koku alma duyusal nöronlarının etiketlenmesini ve izlenmesini örneklendirirken, koku alma ve diğer sistemler içindeki diğer hücre tiplerine de uyarlanabilir.

Açıklanan protokol, başarılı bir elektroporasyon ve anestezi X'in koku alma sisteminin duyusal nöronların aksonal süreçleri in vivo görüntüleme uygulanabilir laevis, odaklı lazer-tarama veya multiphoton mikroskobu (Şekil 1) kullanılarak. Elektroporasyon fluoroforla birleştiğinde dekstranları girmek için ve hızla koku organın hücreleri içinde yayılmasını sağlar. Bu voltaj darbeleri tetikleyen sonra başarılı etiketleme doğrulamak için floresan aydınlatma uygulamak yararlı olacaktır. , Elektroporasyon parametrelerine bağlı olarak örn., Pipet direnci, hücreleri (Şekil 2A, B) ya da koku organın tek hücreler (Şekil 2C) grupları etiketlenir. Etiketli duyu nöronlarının akson koku sinir (Şekil 2B) olarak görülebilir ve aksonal işlemler başarılı Elektroporasyondan sonra, koku ampul de, genellikle 24 saat gözlenebilir(Şekil 3). Duyusal nöronların gruplarının Elektroporasyon koku ampul (Şekil 3A) içindeki kaba kablo desenleri görselleştirme sağlar. Tek hücre elektroporasyon koku ampul (Şekil 3C-E), glomeruler yapılar tek tek aksonal projeksiyon desenler, aksonal dallanma ve bağlantı araştırmak için uygulanabilir. X Şeffaf albino iribaşları vivo confocal veya anestezi tadpole bozulmamış beyin etiketli duyu nöronlarının multiphoton görüntülenmesinde laevis izni. Aynı etiketli duyu nöron (Şekil 4) in vivo görselleştirme tekrarlanan tarafından aksonal büyüme desen gelişimi birkaç gün / hafta içinde izlenebilir. Koku ampul akson desen önemli ölçüde değişebilir elektroporasyon zaman noktasında duyusal nöronun vadesine bağlı. Olgun nöronlar zaten bir tutam bulunuyor ayrıntılı akson dalları sahipglomerüllere bağlı ed alanları. Olgun nöronların aksonal büyüme paterni oldukça kararlı olduğunu, ancak akson dalları ve glomerüler kümelerinin inceliklerinin uzama (Şekil 4A-E) gözlenebilir. Duyu nöronlar, uzun süreler boyunca in vivo olarak görülebilir, örneğin., Üç haftadan daha uzun (Şekil 4F) elde edilir. Diğer taraftan, olgun olmayan nöron aksonları, bir araya getirilen arborizations sahip olmayan, ilk büyüme sürecinde hala ve henüz nihai glomerüler hedeflerine bağlı değil. Deneysel protokol, olgunlaşma sırasında bu nöronların gelişimini izlemeye olanak sağlar, örneğin., Akson uzama, çatallanma ve bir araya getirilen arborizations (Şekil 4 J-L) oluşturulması. Daha fazla örnek için de Hassenklöver ve Manzini 12 bkz. <img alt="Şekil 1," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52143/52143fig1highres.jpg" width="500"> Anestezi X'in koku organı deneysel protokol Şekil 1. şematik genel bakış. (A) ana koku epiteli Duyu nöronları (MEB) veya vomeronasal organı (VNO) laevis larva fluoresan dekstran çözeltisi ile dolu bir cam pipet kullanılarak elektroporasyon yoluyla etiketlenir. Etiketli nöronların aksonları koku sinir (ON) ile takip ve sonunda koku ampul (OB) ulaşır. (B), larva anesteziye tabi tutulmuş ve işaretli sinir art arda belli bir zaman aralığında, bir eş odaklı veya multiphoton mikroskop kullanılarak incelenmiştir edilebilir. (C) işaretli hücrelerin aksonal büyüme kalıpları artan gelişimi hafta gün zaman dönemlerini kapsayan takip edilebilir. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52143/52143fig2highres.jpg" width="500"> Şekil 2. ElecKoku alma organı duyusal nöronların troporation. düşük dirençli bir pipet (A) Elektroporasyon koku organda birden fazla hücre etiketlenmesi yol açar. Bu temsilci örnekte birden fazla koku reseptörü nöronlar (ORNs, dolu ok başları) ve iki sütunlu şeklindeki destekleyici hücreleri (AVM'ler, yıldız) boyandı. Kesikli çizgiler pipet direncini artırarak, etiketli hücrelerin sayısını sınırlar, koku epiteli (OE). (B) elektroporasyon parametreleri koyan örneğin. Sınırlarını ayırmak. Bu örnekte, tek bir duyu nöronu (dolu ok başları) ve bir bitişik destek hücresi (yıldız) elektroporasyon sonra boyandı. Koku epiteli (açık ok başları) bırakarak tek akson unutmayın. (C) Başarılı tek hücre elektroporasyon bireysel duyusal nöron (dolu ok başı) ve koku epiteli onun bağlı akson (açık ok başları) özel etiketleme yol açar. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/52143/52143fig3highres.jpg" width="400"> Şekil 3. eksize koku ampul koku alma akson projeksiyonlar görselleştirme. (A) koku ampul duyu nöronlarının aksonal projeksiyonlar kaba topoloji düşük direnç elektroporasyon pipetler kullanılarak görülebilir. Bir koku ampul hemisfer ve ilişkili koku sinir (ON) tasvir edilmektedir. Farklı fluorophoresle bağlanmış dört dekstranları Koku alma organı dört uzak yerlerde elktroporatlandı: Lateral (yeşil), orta (sarı), Moe (kırmızı) ve VNO (turuncu) medial. Bu aksesuar koku ampul (AOB) ve ana koku ampul (MOB) olarak üç ana projeksiyon alanları görselleştirme sağlar. (CE) Örnekler. X dikkat ediniz koku aksonlar (dolu ok başları da Hassenklöver ve Manzini 12), bir, iki veya çoklu glomerül bağlanmadan önce düzenli (açık ok uçları) iki kola ayrılmış laevis. <img alt="Şekil 4," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52143/52143fig4highres.jpg" width="500"> Tek bir koku nöron akson vivo time-lapse görüntüleme Şekil 4.. (AE)Başarılı tek hücre Elektroporasyondan sonra etiketli akson defalarca koku ampul (OB) olarak görülebilir. Bu örnek, bir hafta boyunca araştırılmıştır bağımsız bir akson göstermektedir. Genel morfolojisi önemli ölçüde değişmez ve iki büyük dallanma noktaları (açık ok başları) tespit edilebilir. Diğer iki glomerüler kümeleri sabit (yıldız) olarak kalır süresi boyunca, tek bir glomerüler elyaf, sürekli bir azalma (dolu ok başı) maruz unutmayın. (FI) Bu temsili bir örneği, uzun süreli gözlemlerin canlılığını gösteren bu spesifik akson araştırılmıştır olarak fazla üç hafta boyunca. Büyüme modelinin belirgin bir değişiklik tespit edilebilir. (JL) büyüme sürecinde olgunlaşmamış duyusal akson bir örnek tasvir edilmiştir. Henüz glomerüllere ve karakteristik glomerüler püskülleri eksik bağlı değil. Aksonal dalları uzatılmış 5 gün sonra, akson birden çok kez, ince arborizations olan çatalkurdu.

Nöronal morfolojiyi ve zaman içindeki gelişimini görselleştirmek için koku alma duyu nöronlarının elektroporasyon ve ardından konfokal lazer tarama veya çoklu foton mikroskobu ile in vivo olarak etiketlenmesi için bir protokol açıklıyoruz.

Bir Model Olarak Koku Sistemi Akson Büyüme Modelleri ve Morfoloji Eğitim için In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Bu prosedürün genel amacı, aksonal morfolojiyi ve gelişimi görselleştirmek için koku alma duyu nöronlarını in vivo olarak etiketlemektir. Bu, ilk olarak floro dört bağlı dekstranın tek koku alma duyu nöronlarına gözeneklenmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, boyanın duyusal nöronların aksonal süreçlerine yayılmasına izin vermek için 24 saat beklemektir.Daha sonra, bir kurbağa yavrusu uyuşturulur ve çoklu foton mikroskobu kullanılarak koku alma ampulünün üç boyutlu bir görüntü yığını elde edilir. Son adım, belirtilen zaman aralıklarından sonra aynı hayvanda etiketli nöronu tekrar tekrar incelemektir. Sonuçta, hücresel morfolojinin yeniden yapılandırılması, aksonal morfolojideki değişikliklerin görselleştirilmesine izin verir.Bu yöntem, aksonların ön beyindeki hedef bölgelere doğru nasıl büyüdüğü ve sinapsisin nasıl oluştuğu gibi sinirbilim alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Deneyden önce. Elektroporasyon kurulumunun geniş bir çalışma mesafesine sahip bir stereo mikroskoptan oluştuğundan ve boya için floresan aydınlatma ve filtre setleri ile donatıldığından emin olun.Elektroporasyon için kullanılır, ya özel bir tek hücreli elektroporasyon ya da bir osiloskopa bağlı genel bir kare darbe üreteci kullanın. Elektroporasyon çıkışlarını bir pipet tutucuya ve bir banyo elektroduna bağlayın. Hem pipet tutucunun hem de banyo elektrodunun ince bir gümüş klorür tabakası ile kaplanmış gümüş teller içerdiğinden emin olun.Ardından, hassas konumlandırmaya izin vermek için pipet tutucuyu bir mikro manipülatöre monte edin. Bundan sonra, mikro pipetleri, dahili bir filamente sahip bo silikat cam kılcal damarlar ile elektroporasyon için üretin. Tek hücreli elektroporasyon için yüksek pipet direncine sahip daha uzun bir şaft ve daha küçük uç açıklıklı bir mikro pipet elde etmek için mikro pipet polarının parametrelerini ayarlayın.Ardından, pipet direncini doğrudan özel tek hücreli elektroporasyonlu ile ölçün. Bu prosedürde, floro dört bağlı dekstranı kurbağa halkasında üç milimolar konsantrasyonda çözün. Bu stok çözeltisini küçük parçalara bölün ve ileride kullanmak üzere dondurucuda saklayın.Ardından, mikro pipeti bir ila beş mikrolitre dekstran çözeltisi ile doldurun. Pipet ucunda kalan hava kabarcıklarını temizlemek için mikro pipeti dikkatlice hafifçe vurun. Ardından mikro pipeti pipet yuvasına monte edin.Pipetin içindeki gümüş telin boya çözeltisiyle temas halinde olduğundan emin olun. Şimdi, bir Petri kabına küçük bir doku parçası koyun ve üzerini %0.02 trica içeren az miktarda su ile kaplayın. Daha sonra,% 0.02 trica içeren suda pre metamorfik bir kurbağa yavrusunu uyuşturun.Dokunarak ve yanıt vermediğinden emin olarak uygun anesteziyi onaylayın. Daha sonra kurbağa yavrusunu dikkatlice doku kaplı Petri kabına aktarın. Elektrotun ıslak doku ile temas halinde olduğundan emin olun ve mikro pipet ucunu bir mikro manipülatör kullanarak kurbağa yavrusunun koku alma organına yakın konumlandırın.Bundan sonra, koku alma organını kaplayan cilde nüfuz edin. Pipet ucu ile ucu dikkatli bir şekilde ana koku alma epitelinin veya MRO burun epitelinin merkezi olarak yerleştirilmiş duyusal nöron tabakasına ilerletin. Şimdi, tek bir voltaj kutbu veya çoklu darbe dizileri uygulayarak boyayı duyusal nöronlara aktarmak için pozitif kare voltaj darbelerini tetikleyin.Ardından, bir floresan stereo mikroskobu kullanarak başarılı boya ekstrüzyonunu ve elektroporasyonu görselleştirin. Boya, başarılı bir elektroporasyondan sonra hücre gövdesine ve dendritlere hızla yayılır. Kurbağa yavrusunun ikinci koku alma organı için prosedürleri tekrarladıktan sonra, kurbağa yavrusunu geri kazanım için tatlı suyla dolu bir behere aktarın ve elektroporasyonlu boyanın duyusal nöronlara ve koku soğancığına yayılmasına izin verin.Elektroporasyondan en az 24 saat sonra, kurbağa yavrusunu% 0.02 trica içeren suda uyuşturun. Ardından, kurbağa yavrusunu dikkatlice bir görüntüleme odasına aktarın. Bir param şeridinden küçük bir dikdörtgen kesin.Ardından kurbağa yavrusunu param ile örtün ve ön kuyruk sefalonunu kesme penceresinden bırakın. Kurbağa yavrusuna zarar vermeden paramı iğnelerle tabağa sabitleyin ve kurbağa yavrusunun %0,02 Trika içeren yeterli suya batırıldığından emin olun. Daha sonra, görüntüleme odasını dik bir çoklu foton mikroskobu veya konfokal bir mikroskop sahnesine monte edin.Koku soğancığının üç boyutlu bir görüntü yığınını elde edin ve görüntüleme prosedürünün 10 ila 15 dakikayı geçmediğinden emin olun. Bundan sonra, kurbağa yavrusunu ayrı bir tankta normal suya geri koyun ve ışığa maruz kalmasını önleyin. Bu görüntüde, farklı floro dörtlülerine bağlı dört güverte ipliği, koku alma organının dört uzak yerinde, yeşil ile gösterilen yanal, kırmızı ile gösterilen sarı medial ile gösterilen ara ve turuncu ile gösterilen vomer nazal organ olan elektroporasyona tabi tutuldu.Bu, aksesuar koku ampulünün ve ana koku ampulünün üç ana projeksiyon alanının görselleştirilmesini sağlar. Bu görüntü, koku soğancığının yapısı üzerine bindirilmiş tek koku alma duyu nöronlarının farklı aksonal büyüme modellerinin üç boyutlu rekonstrüksiyonlarını göstermektedir ve burada, koku soğancığına çıkıntı yapan ve küresel glomerüler içinde püsküllü arborizasyon oluşturan tek bir koku alma duyusal nöron aksonunun bir örneği verilmiştir. Burada Opus Levu'da görüldüğü gibi, bu aksonlar bir, iki veya çoklu gmer'e bağlanmadan önce düzenli olarak çatallanır.Bu, aksonal morfolojide sürekli değişiklikler gösteren in vivo hızlandırılmış görüntüleme ile tekrar tekrar araştırılan bireysel bir koku alma duyu nöronunun temsili bir örneğidir. Bu videoyu izledikten sonra, koku alma duyu nöronlarını elektroporasyon yoluyla nasıl etiketleyeceğinizi ve in vivo TimeLapse görüntüleme kullanarak gelişimlerini nasıl izleyeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.

the-olfactory-system-as-model-to-study-axonal-growth-patterns

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Kaynak: Portela-Lomba, M., et. al. Aksotomize Sıçan Retinal Ganglion Nöronlarının Koku Alma Kılıfı Glia ile Kokültürü, Yetişkin Aksonal Rejenerasyonun İn Vitro Modeli Olarak. J. Vis. Uzm. (2020). Bu video, ölümsüzleştirilmiş insan koku alma kılıflayıcı glia hücreleri ile birlikte kültürlenmiş aksotomize sıçan retinal ganglion nöronlarında (RGN'ler) aksonal rejenerasyonun görüntülenmesini ve niceliklendirilmesini göstermektedir. RGN'ler, kırmızı somalar ve yeşil aksonlar ile immün olarak...

Aksotomize Sıçan Retinal Ganglion Nöronlarında Aksonal Rejenerasyonun Görüntülenmesi ve Miktar Tayini

Burada SC'ler uzanan aksonlar boyunca geliştirmek için mümkün olduğu bir Schwann hücresi (SC) göç tahlil tarif.

Büyüyen Aksonlar boyunca murin Schwann Hücresi Kalkınma Analizi

Lazer nanodissection bağlanmış iki foton görüntüleme, hücre içi çözünürlük ile merkezi sinir sisteminin dejeneratif ve rejeneratif işlemlerini incelemek için yararlı araçlardır. Bu protokol, etiket görüntü ve in vivo serebellar korteks bir tırmanma lifleri incelemek için gösterilmiştir.

Serebellar Aksonlar Lazer Nanosurgery<em&gt; In Vivo</em

Koku duyu nöronları, uygun sinirsel devreleri oluşturmak için çok çeşitli akson sıralama moleküllerini ifade eder. Bu protokol, olfaktör duyu nöronlarının akson ucunda akson sıralama moleküllerinin kombinatoryal ifadelerini görselleştirmek için bir immünohistokimyasal boyama yöntemi tarif eder.

Koku Meşfatının Olfaktör Duyusal Akson Moleküler Kimlik Kodlarının Görselleştirilmesi İçin Dörtlü İmmün Sulanması

Burada, motor nöron projeksiyon ve transgenik Hb9::GFP fare embriyo axon arborization görüntülenmesi için bir protokol açıklayın. Motor nöronlar için immunostaining sonra hafif levha Floresans mikroskobu Image embriyolar için sonraki kantitatif analiz için kullanılan. Bu iletişim kuralı diğer nöron gezinti süreçlerinde merkezi sinir sistemi için geçerlidir.

Görselleştirme Motor Axon navigasyon ve hafif levha Floresans mikroskobu kullanarak fare embriyo Axon Arborization miktar

Xenopus kurbağa yavrularını içinde vivo sinir sisteminin işlevi araştırmak için benzersiz bir platform sunuyoruz. Biz metodolojileri yaşayan koku bilgi işleme değerlendirmek için tarif Xenopus larva normal yetiştirme koşullarında veya yaralanma sonra.

Fonksiyonel yaşam Xenopus kurbağa yavrularını koku yollar değerlendirilmesi

Bir ex vivo dilim tahlil gerçek zamanlı olarak görüntülenmiş olmak okülomotor sinir büyüme sağlar. Dilim E 10.5 ISLMN katıştırarak oluşturulur: agarose 'de Gfp embriyolar, bir vibratom üzerinde dilimleme, ve bir aşama-üst kuluçç büyüyen. Axon rehberlik yollarının rolü, kültür ortamına inhibitörler ekleyerek değerlendirilir.

Olomotor sinir gelişimi için zaman aşımı görüntüleme için embriyonik GFP-Ifade fareler dan ex vivo okülomotor dilim kültürü

Nöral yaralanmadan sonra koku alma glia (OEG) nörojeneratif kapasitesini değerlendirmek için bir in vitro model sunuyoruz. RGN aksonal ve somatodendritik belirteçleri analiz ederek, OEG monolayerleri üzerinde axotomized adult retinal ganglion nöronlarının (RGN) bir kokülatürüne ve daha sonra aksonal rejenerasyon çalışmasına dayanmaktadır.

Beyazlatılmış Sıçan Retinal Ganglion Nöronlarının Koku Alma Ensheathing Glia ile Birlikte, Yetişkin Aksonal Rejenerasyonun In Vitro Modeli Olarak

Bu protokol, koku alma devresi düzeneğinin incelenmesi için diseksiyon prosedürünü, kültür durumunu ve anten-beyin eksplant sisteminin canlı görüntülenmesini açıklar.

Drosophila'da Koku Alma Devresi Düzeneğinin Hızlandırılmış Görüntüleme Çalışmaları için Bir Explant Sistemi

Bu protokol, in situ akson büyümesi ve büyüme konisi dinamiklerini incelemek için basit ve sağlam bir yöntem göstermektedir. Fizyolojik olarak ilgili akut beyin dilimlerinin ex vivo olarak nasıl hazırlanacağını açıklar ve kullanıcı dostu bir analiz boru hattı sağlar.

Yerinde Akut Ex Vivo Embriyonik Beyin Dilimi Kültürlerinde Akson Büyümesi ve Büyüme Koni Dinamiğinin Görselleştirilmesi

Burada, Drosophila juvenil beynindeki anten lobu sinaptik glomerüllerinin koku alma deneyimine bağlı yeniden şekillenmesini indükleme ve analiz etme yöntemlerini açıklıyoruz.

Erken Yaşamın Kritik Bir Döneminde Juvenil Beyin Koku Alma Duyusal Nöron Sinaptik Bağlantısının Deneyime Bağlı Yeniden Modellenmesi

Öğrenin, canlı organizmada koku duyu nöronlarını elektroporasyonla etiketleme ve çok foton mikroskobisiyle görüntüleme yöntemini. Bu teknik, aksonal büyüme ve sinir hücresi morfolojisindeki değişiklikleri zaman içinde izlemeyi sağlar.

Bir Model Olarak Koku Sistemi Akson Büyüme Modelleri ve Morfoloji Eğitim için In Vivo

Daha fazla video keşfet