Bir Model Olarak Koku Sistemi Akson Büyüme Modelleri ve Morfoloji Eğitim için In Vivo

Bu prosedürün genel amacı, aksonal morfolojiyi ve gelişimi görselleştirmek için koku alma duyu nöronlarını in vivo olarak etiketlemektir. Bu, ilk olarak floro dört bağlı dekstranın tek koku alma duyu nöronlarına gözeneklenmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, boyanın duyusal nöronların aksonal süreçlerine yayılmasına izin vermek için 24 saat beklemektir.

Daha sonra, bir kurbağa yavrusu uyuşturulur ve çoklu foton mikroskobu kullanılarak koku alma ampulünün üç boyutlu bir görüntü yığını elde edilir. Son adım, belirtilen zaman aralıklarından sonra aynı hayvanda etiketli nöronu tekrar tekrar incelemektir. Sonuçta, hücresel morfolojinin yeniden yapılandırılması, aksonal morfolojideki değişikliklerin görselleştirilmesine izin verir.

Bu yöntem, aksonların ön beyindeki hedef bölgelere doğru nasıl büyüdüğü ve sinapsisin nasıl oluştuğu gibi sinirbilim alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Deneyden önce. Elektroporasyon kurulumunun geniş bir çalışma mesafesine sahip bir stereo mikroskoptan oluştuğundan ve boya için floresan aydınlatma ve filtre setleri ile donatıldığından emin olun.

Elektroporasyon için kullanılır, ya özel bir tek hücreli elektroporasyon ya da bir osiloskopa bağlı genel bir kare darbe üreteci kullanın. Elektroporasyon çıkışlarını bir pipet tutucuya ve bir banyo elektroduna bağlayın. Hem pipet tutucunun hem de banyo elektrodunun ince bir gümüş klorür tabakası ile kaplanmış gümüş teller içerdiğinden emin olun.

Ardından, hassas konumlandırmaya izin vermek için pipet tutucuyu bir mikro manipülatöre monte edin. Bundan sonra, mikro pipetleri, dahili bir filamente sahip bo silikat cam kılcal damarlar ile elektroporasyon için üretin. Tek hücreli elektroporasyon için yüksek pipet direncine sahip daha uzun bir şaft ve daha küçük uç açıklıklı bir mikro pipet elde etmek için mikro pipet polarının parametrelerini ayarlayın.

Ardından, pipet direncini doğrudan özel tek hücreli elektroporasyonlu ile ölçün. Bu prosedürde, floro dört bağlı dekstranı kurbağa halkasında üç milimolar konsantrasyonda çözün. Bu stok çözeltisini küçük parçalara bölün ve ileride kullanmak üzere dondurucuda saklayın.

Ardından, mikro pipeti bir ila beş mikrolitre dekstran çözeltisi ile doldurun. Pipet ucunda kalan hava kabarcıklarını temizlemek için mikro pipeti dikkatlice hafifçe vurun. Ardından mikro pipeti pipet yuvasına monte edin.

Pipetin içindeki gümüş telin boya çözeltisiyle temas halinde olduğundan emin olun. Şimdi, bir Petri kabına küçük bir doku parçası koyun ve üzerini %0.02 trica içeren az miktarda su ile kaplayın. Daha sonra,% 0.02 trica içeren suda pre metamorfik bir kurbağa yavrusunu uyuşturun.

Dokunarak ve yanıt vermediğinden emin olarak uygun anesteziyi onaylayın. Daha sonra kurbağa yavrusunu dikkatlice doku kaplı Petri kabına aktarın. Elektrotun ıslak doku ile temas halinde olduğundan emin olun ve mikro pipet ucunu bir mikro manipülatör kullanarak kurbağa yavrusunun koku alma organına yakın konumlandırın.

Bundan sonra, koku alma organını kaplayan cilde nüfuz edin. Pipet ucu ile ucu dikkatli bir şekilde ana koku alma epitelinin veya MRO burun epitelinin merkezi olarak yerleştirilmiş duyusal nöron tabakasına ilerletin. Şimdi, tek bir voltaj kutbu veya çoklu darbe dizileri uygulayarak boyayı duyusal nöronlara aktarmak için pozitif kare voltaj darbelerini tetikleyin.

Ardından, bir floresan stereo mikroskobu kullanarak başarılı boya ekstrüzyonunu ve elektroporasyonu görselleştirin. Boya, başarılı bir elektroporasyondan sonra hücre gövdesine ve dendritlere hızla yayılır. Kurbağa yavrusunun ikinci koku alma organı için prosedürleri tekrarladıktan sonra, kurbağa yavrusunu geri kazanım için tatlı suyla dolu bir behere aktarın ve elektroporasyonlu boyanın duyusal nöronlara ve koku soğancığına yayılmasına izin verin.

Elektroporasyondan en az 24 saat sonra, kurbağa yavrusunu% 0.02 trica içeren suda uyuşturun. Ardından, kurbağa yavrusunu dikkatlice bir görüntüleme odasına aktarın. Bir param şeridinden küçük bir dikdörtgen kesin.

Ardından kurbağa yavrusunu param ile örtün ve ön kuyruk sefalonunu kesme penceresinden bırakın. Kurbağa yavrusuna zarar vermeden paramı iğnelerle tabağa sabitleyin ve kurbağa yavrusunun %0,02 Trika içeren yeterli suya batırıldığından emin olun. Daha sonra, görüntüleme odasını dik bir çoklu foton mikroskobu veya konfokal bir mikroskop sahnesine monte edin.

Koku soğancığının üç boyutlu bir görüntü yığınını elde edin ve görüntüleme prosedürünün 10 ila 15 dakikayı geçmediğinden emin olun. Bundan sonra, kurbağa yavrusunu ayrı bir tankta normal suya geri koyun ve ışığa maruz kalmasını önleyin. Bu görüntüde, farklı floro dörtlülerine bağlı dört güverte ipliği, koku alma organının dört uzak yerinde, yeşil ile gösterilen yanal, kırmızı ile gösterilen sarı medial ile gösterilen ara ve turuncu ile gösterilen vomer nazal organ olan elektroporasyona tabi tutuldu.

Bu, aksesuar koku ampulünün ve ana koku ampulünün üç ana projeksiyon alanının görselleştirilmesini sağlar. Bu görüntü, koku soğancığının yapısı üzerine bindirilmiş tek koku alma duyu nöronlarının farklı aksonal büyüme modellerinin üç boyutlu rekonstrüksiyonlarını göstermektedir ve burada, koku soğancığına çıkıntı yapan ve küresel glomerüler içinde püsküllü arborizasyon oluşturan tek bir koku alma duyusal nöron aksonunun bir örneği verilmiştir. Burada Opus Levu'da görüldüğü gibi, bu aksonlar bir, iki veya çoklu gmer'e bağlanmadan önce düzenli olarak çatallanır.

Bu, aksonal morfolojide sürekli değişiklikler gösteren in vivo hızlandırılmış görüntüleme ile tekrar tekrar araştırılan bireysel bir koku alma duyu nöronunun temsili bir örneğidir. Bu videoyu izledikten sonra, koku alma duyu nöronlarını elektroporasyon yoluyla nasıl etiketleyeceğinizi ve in vivo TimeLapse görüntüleme kullanarak gelişimlerini nasıl izleyeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.