Regioseçici Biolistik Modifiye Gen Tabancası kullanarak Organotipik Beyin Dilimleri Hedefleme

Bu prosedürün amacı, bir gen tabancası kullanarak organotipik dilimlerin farklı bölgelerini hızlı ve verimli bir şekilde transfekte etmek veya etiketlemektir. Bu, önce beynin veya diğer dokuların canlı organotipik dilimlerinin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, biyotik dağıtım için DNA veya kodu çözülmüş altın parçacıkları üretmektir.

Daha sonra, organotipik dilim stabilize edilmiş bir gen tabancası yuvasının altına yerleştirilir ve kaplanmış parçacıklar dokuya veya epizomal dönüşüme veya etiketlemeye ateşlenir. Son adım, izole bölgelere iletilen heterolog genlerin etkisini gözlemlemek veya analiz etmektir. Sonuç olarak, bu yaklaşım, kullanıcının organ dilimlerinin farklı bölgelerini çeşitli heterolog genlerle hassas bir şekilde transfekte etmesine izin verir.

Bu yöntemin mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, biyolojistiğin terminal olarak farklılaşmış hücrelerin transfekte edilmesine izin vermesinin yanı sıra, etki yarıçapını küçük bir çapla sınırlamasıdır. Bu yöntem, tek bir genin bölgesel katkısını anlamak gibi önemli nörobiyolojik soruların anlaşılmasına yardımcı olabilir. Bu işleme küçük bir alıcı kalıba taze bir beyin yerleştirerek başlayın.

Oda sıcaklığının biraz üzerine çağrılan ARO solüsyonu ile örtün. Daha sonra kalıbı buzun üzerine yerleştirerek hızla dört santigrat dereceye soğutun. Aros ayarlandığında.

Beş ila 10 dakika sonra, aros gömülü beyni kalıptan çıkarın. Bundan sonra, fibro dilimleyici platformuna yapıştırın. Ardından platformu steril, buz gibi soğuk PBS içeren Vibra dilimleyici odasına aktarın.

Dilimlemeden sonra, dilimleri, ekin dışında kültür ortamı bulunan altı çok oyuklu bir tepsiye hücre kültürü eklerinin üzerine nazikçe yerleştirin. Bunları% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede nemlendirilmiş bir inkübatörde inkübe edin. Bu prosedürde, nano mermileri 40 nanometre çapında altın parçacıkları kullanarak, önce 50 mikrolitre 0.05 molar sperm aine ve 10 miligram altın parçacığına mililitre başına bir miligramda 10 mikrolitre DNA ekleyerek hazırlayın.

Daha sonra, DNA moleküllerinin altın nanopartiküllere bağlanmasına yardımcı olmak için çözelti karışımına kalsiyum klorür ekleyin. Daha sonra, çözeltiyi bir şırınga ile tüpe çekin. Boruyu boru hazırlama istasyonuna yerleştirin.

Altın parçacıklarının yerleşmesine izin verin. Sonra supinatı aspirasyon ile çıkarın Bir şırınga ile. Altın parçacıklarını eşit şekilde yaymak için boruyu döndürün.

Daha sonra, parçacıkları dakikada beş litre sabit bir nitrojen akışı altında kurutun. DNA mermileri oluşturmak için, bir boru kesici kullanarak boruyu bir santimetrelik parçalar halinde kesin. Daha sonra bunları ya hemen gende yetiştirilen kartuşa yerleştirin ya da steril bir lamina akış başlığında kullanılana kadar dört santigrat derecede kurumuş halde tutun, DNA kaplı altın içeren kartuşu kartuş tutucuya yükleyin.

Ardından tutucuyu gen tabancasına yükleyin. Modifiye edilmiş gen tabancası namlusunu steril forseps kullanarak ona takın. Steril bir plastik tabağa organotipik bir dilim içeren bir filtre eki yerleştirin.

Ortamı organotipik dilimden çıkarın. Ardından, montajı kullanarak gaz basıncını 50 PSI'ye ayarlayın. Gen tabancasını, genetik iletim için dilimin istenen bölgesinin 10 milimetre yukarısına yerleştirin.

Daha sonra dikkatlice namlunun merkezini hedefleyin ve kaplanmış parçacıkları dokuya ateşleyin. Biyotik transfeksiyondan sonra, dilimi PBS ile iki kez nazikçe yıkayın. Daha sonra dilimi PBS'de %4 buz gibi PFA'da 20 dakika inkübe ederek sabitleyin.

Bundan sonra, dilimi PBS'de iki kez yıkayın. Yine, dilimi bozmadan bir neşter kullanarak zarı parçadan nazikçe kesin. Daha sonra membran desteğini forsepsli bir mikroskop lamı üzerine yerleştirin ve organotipik dilimin üzerinde dinlenmesine izin verin.

Ardından, dilimin üzerine bir damla montaj ortamı ekleyin. Doku ile doğrudan temas edecek herhangi bir kuvvet olmadan nazikçe bir kapak fişi yerleştirin. Daha sonra, kapak astarını ince bir tırnak cilası tabakası ile sabitleyin.

Bu şekil, floresan protein kodlu DNA'nın altı haftalık bir farenin organotipik dilimine biyotik olarak verilmesini göstermektedir. Burada görülebileceği gibi, bikini tabakasının ve serebellumun moleküler tabakasının arayüzünde bulunan dikkate değer bir dendritik limana sahip bir bikini nöronu, P-E-G-F-P-N ile geçici biyotik transfeksiyonu takiben belirgin etiketleme gösterir. Burada dendritlerin dikenlerle daha yüksek bir büyütmesi var ve burada hipokampusun bir bölgesinde bulunan bir parametal hücre var.

PDS Kırmızı FP kaplı altın nanopartikülün biyotik dağıtımını takiben Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, bu prosedürü takip eden üç ila dört günlük süre boyunca sadece birkaç saat içinde gerçekleştirilebilir. Konfokal mikroskopi gibi diğer yöntemler, belirli nöronların komşu bölgelere nasıl bağlandığı gibi ek soruları yanıtlamak için kullanılabilir.