ChIP-seq Denemeleri otomatikleştirme 10.000 HeLa Hücreleri üzerinde epigenetik Profilleri oluşturmak için
10 Aralık 2014
İn vivo protein-DNA etkileşimlerini haritalama yöntemleri, genomik araştırmanın her yönü için çok önemli hale geliyor, ancak zahmetli, maliyetli ve zaman alıcı. Burada, sınırlı miktarda hücre ile in vivo protein-DNA etkileşimlerini haritalamak için kromatin immünopresipitasyonunu otomatikleştiren, ticari olarak temin edilebilen bir robotik sıvı işleme sistemi sunulmaktadır.
Bu prosedürün genel amacı, araştırmacılara sadece 10.000 hücre üzerinde kromatin immünopresipitasyon deneyleri yapabilen otomatik bir platform sağlamaktır. Bu, önce kromatin immünopresipitasyonu için yüksek kaliteli kesilmiş kromatin hazırlanarak gerçekleştirilir. İkinci adımda, otomatik bir kromatin immünopresipitasyon deneyi oluşturulur ve immüno-çökeltilmiş DNA ile otomatik kütüphaneler çalıştırılır.
İmmün çökeltilmiş DNA, kantitatif PCR ve yeni nesil dizileme ile analiz edilir. Sonuç olarak, otomatik teknolojinin başarısı, orijinal 10.000 hücre numunesi üzerinde oluşturulan kromatin immünopresipitasyon dizi profillerinin 100.000 hücre üzerinde yapılan deneyler ve referans için mevcut veri setleri ile karşılaştırılması yoluyla doğrulanabilir. Bu yöntem, çeşitli dokulardaki spesifik biyobelirteçlerin işlevlerini daha iyi anlamamızı sağlamak için epigenetik alandaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir.
Gelişim aşamaları ve hastalık durumları. Bu tekniğin, sağlık ve hastalıkta epigenetik biyobelirteçlerin tanımlanmasına yardımcı olacağından, birden fazla hastalığın teşhisine yönelik etkileri vardır, Doğru ve güvenilir. Otomatik teknolojiler, belirli hücre tiplerinin, alt popülasyonların ve biyopsilerin epigenetik analizinde araştırmacılar için önemli araçlardır.
Standart bir otomatik kromatin immünopresipitasyon deneyi için, bir ila 2 milyon hücreden 100 mikrolitre kesilmiş kromatine 120 mikrolitre kromatin immünopresipitasyon tamponu H ekleyerek başlayın ve giriş numunesi için iki ila 20 mikrolitre kromatin ayırın. Ardından, otomatik deneyi IP yıldızı kompaktında kurmak için protokolleri seçin ve kromatin immünopresipitasyon simgesine tıklayın. Kromatin immünopresipitasyon doğrudan yöntemini seçin ve ardından bir sonraki ekranda kromatin immünopresipitasyon 200 mikrolitre protokolünü seçin ve numune numarasını belirtin.
Antikor kaplaması için kromatin immünopresipitasyon deneysel parametrelerini dört saate ayarlayın. Adım İmmünopresipitasyon adımı için 15 saat ve her yıkama adımı için beş dakika. Ardından, yerleşim bilgileri ekranında görüntülenen talimatları izleyerek reaktifleri ayarlayın ve uygun reaktifleri ve yüksek oranda doğrulanmış ChIP-seq dereceli antikorları ekleyin.
Daha sonra her reaksiyon için 20 mikrolitre protein, A kaplı manyetik boncuklar ekleyin ve gece boyunca çip protokolü ve ters çapraz bağlama bittikten sonra kromatin örnekleri ekleyin. DNA'yı manyetik boncuk bazlı bir DNA saflaştırma kiti ile saflaştırın. İmmün çökeltilmiş DNA'yı ölçmek için oldukça hassas bir ticari floro metrik testi kullanın.
Daha sonra, en az bir pozitif ve bir negatif kontrol genomik bölgesi için primerler kullanmak. İmmün çökeltilmiş DNA'nın kalitesini, analiz için malzemelerin uygun parametrelerine göre kantitatif PCR ile analiz edin. Sonuçlar, protokoller altında yeni nesil dizileme için girdinin geri kazanım yüzdesi olarak ifade edilir.
Şimdi kitaplık hazırlama simgesine tıklayın, ardından tercih ettiğiniz kitaplık hazırlama teknolojisini seçin ve reaktifleri düzen bilgileri ekranındaki talimatlara göre ayarlayın. Örneğin, bu deneyde, gen ekspresyonu ile ilişkili altı farklı histon modifikasyonu için dizileme profilleri oluşturuldu. Bu histon belirteçleri arasında gözlemlenen yüksek tepe korelasyonu, otomatik sistemin doğru ve güvenilir veriler üretme yeteneğini gösterir.
Ayrıca, bu grafikler, belirli genomik bölgelerdeki farklı histon modifikasyonları için piklerin dağılımını göstermektedir. Son olarak, düşük hücre sayısına sahip numuneler için otomatik bir kromatin immünopresipitasyon deneyi için, otomasyon sisteminde otomatik kromatin immünopresipitasyon 200 mikrolitre protokolünü az önce gösterildiği gibi ayarlayın. Daha sonra, sistemi ChIP-seq ile yükleyin, sınıf antikorları ve reaktifler, her reaksiyon için sadece 10 mikrolitre protein, A kaplı manyetik boncuk kullanarak 10.000 ila 100.000 hücre arasındaki kromatin miktarları üzerinde çalışacak şekilde optimize edilir.
Çipten sonra, kitaplık hazırlığını çalıştırın, mikro plex kitaplık hazırlık protokolünü seçin ve düzen bilgi ekranında görüntülenen talimatları izleyerek reaktifleri kurun. 10.000 hücreli bir başlangıç örneğinden bir kromatin immünopresipitasyonunun bu temsili kantitatif PCR'sinde, pozitif kontrol bölgelerinde anti histon antikorları ile önemli zenginleştirmeler ve negatif kontrol bölgelerinde ihmal edilebilir sinyaller gözlenmiştir. Burada, manuel bir kromatin immünopresipitasyon deneyi ile tekrarlanabilir ve yüksek oranda karşılaştırılabilir olan bir dizi 10 immünopresipitasyon reaksiyonu gösterilmiş olup, otomatik sistemin, manuel immünopresipitasyona kıyasla değişkenliği denemek için deneyde gözle görülür bir artış olmaksızın düşük hücre miktarlarıyla çalışabilme yeteneğini göstermektedir.
Bu veriler, 10.000 ve 100.000 dizi kütüphanelerinin biyoinformatik analizlerini göstermektedir. Kromatin immünopresipitasyonundan sonra bir S3 hücresi, düşük hücre sayılı kromatin immünopresipitasyon örneklerinden olağanüstü sonuçlar göstermiştir. 10.000 hücreli başlangıç materyali ile yapılan deneye karşılık gelen bu veri seti, hem 100.000 hücre veri seti hem de Broad Institute referans veri seti tarafından onaylanan son derece güvenilir zenginleştirme tepe noktalarına sahip düşük arka plan gürültüsü içerir.
Kodlama projesi için, 10.000 hücre verisinin, son kod projesinde kullanılan önemli puana göre sıralanan tepe noktalarının en iyi %40'ının %98'lik bir örtüşme oranıyla Broad Institute verileriyle neredeyse aynı tepe noktalarını gösterdiğine dikkat etmek önemlidir. IP star otomatik sistem, minimum operatör müdahalesi gerektirir ve kromatin immünopresipitasyonunun HandsOn süresini sadece bir ila iki saate indirir. Ek olarak, otomatik proses, manuel kromatin immünopresipitasyonunun çok sayıda hataya eğilimli adımının yerini alır ve son derece tutarlı sonuçlar verir.
Bu prosedürü denerken, iyi kromatin immünopresipitasyonunun ve yüksek derecede spesifik ve hassas antikorların iyi bir seçiminin deneyin başarısı için anahtar olduğunu hatırlamak önemlidir. Bu teknoloji, biyolojinin her alanındaki araştırmacıların tedavinin doğruluğunu, tekrarlanabilirliğini ve tutarlılığını geliştirmesinin yolunu açtı. Epigenetik çalışmalar.
Genel Bakış
Bu makale, özellikle 10.000 hücre gibi düşük hücre sayılarını verimli bir şekilde işleyebilen, kromatin immünopresipitasyon (ChIP) için otomatikleştirilmiş bir platform sunmaktadır. Yöntem, genomik araştırmalar için temel önem taşıyan protein-DNA etkileşimlerinin haritalanmasını kolaylaştırmayı amaçlamaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Genomik
- Epigenetik
- Otomatik Laboratuvar Teknikleri
Arka Plan
- Protein-DNA etkileşimleri, gen regülasyonunun anlaşılması için kritik öneme sahiptir.
- Geleneksel ChIP yöntemleri emek yoğundur ve yüksek hücre sayıları gerektirir.
- Otomasyon, genomik deneylerde verimliliği ve tekrarlanabilirliği artırabilir.
- Bu çalışma, manuel müdahaleyi minimize eden robotik bir sisteme odaklanmaktadır.
Çalışmanın Amacı
- Düşük hücre sayıları için otomatik bir ChIP yöntemi geliştirmek.
- Otomatik sistemin etkinliğini geleneksel yöntemlere karşı doğrulamak.
- Sağlık ve hastalık durumlarında epigenetik biyobelirteçlerin tanımlanmasını kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- 10.000 hücreden yüksek kalitede fragmente edilmiş kromatin hazırlanması.
- Robotik bir sıvı taşıma sistemi kullanılarak ChIP sürecinin otomatize edilmesi.
- İmmünopresipite edilmiş DNA'nın kantitatif PCR ve yeni nesil dizileme ile analizi.
- Sonuçların, daha büyük hücre örneklerinden elde edilen verilerle ve mevcut veri setleriyle karşılaştırılması.
Temel Sonuçlar
- Otomatik sistem, manuel yöntemlerle karşılaştırılabilir, güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar üretmiştir.
- Pozitif kontrol bölgelerinde belirgin histon modifikasyonu zenginleşmesi gözlemlenmiştir.
- Referans veri setleriyle olan yüksek korelasyon, otomatik yaklaşımın doğruluğunu göstermiştir.
- Minimum operatör müdahalesi, uygulama süresini önemli ölçüde azaltmıştır.
Sonuçlar
- Otomatik ChIP yöntemi, düşük hücre sayıları için etkilidir.
- Bu teknoloji, epigenetik araştırmaları ve biyobelirteç keşiflerini geliştirebilir.
- Otomasyon, genomik analizlerin tutarlılığını ve güvenilirliğini artırır.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
Düşük hücre girdileri için ChIP-seq işleminin otomatikleştirilmesi, epigenetik hedef doğrulamasındaki kritik bir darboğazı gidererek, kısıtlı primer veya nadir hücre popülasyonları kullanılarak hipotezlerin mekanistik olarak riskten arındırılmasını sağlar. Bu yetenek, sınırlı örneklerden tekrarlanabilir epigenomik profiller oluşturarak erken keşif aşamasındaki öngörü güvenini artırır, portföy seçimine ve biyobelirteç odaklı karar verme süreçlerine destek olur. Bu teknoloji, epigenomik assayleri, hedef tanımlamadan preklinik doğrulamaya kadar olan translasyonel süreklilikle uyumlu, ölçeklenebilir ve yeniden kullanılabilir keşif araçları olarak konumlandırır.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Düşük girdili örneklerden elde edilen histon modifikasyon profillemesi kullanarak terapötik hipotezlerin sorgulanmasına ve yolakların aydınlatılmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: 10.000 hücreden tekrarlanabilir ChIP-seq verileri üreterek biyolojik risk azaltma ve fonksiyonel hedef doğrulama süreçlerini destekler.
- Öngörücü Değer: Referans veri setleri ve manuel kıyaslamalarla korele olan güvenilir epigenomik okumalar aracılığıyla portföy önceliklendirmesini kolaylaştırır.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Bilimsel Değer: Standardize edilmiş ve otomatize edilebilir ChIP-seq iş akışları oluşturarak, doğrulanmış biyolojik sistemleri sonraki tarama aşamalarına hazırlar.
- Operasyonel Değer: Manyetik boncuk tabanlı otomasyon ve qPCR/NGS okumaları aracılığıyla analiz standardizasyonu, tekrarlanabilirlik ve kantitatif çıktılar sağlar.
- Ölçeklenebilirlik: Azaltılmış manuel çalışma süresi ve minimum operatör müdahalesi ile tarama hazırlığını ve platformun yeniden kullanılabilirliğini vurgular.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: Düşük hücreli ChIP-seq kullanarak sağlıklı ve hastalıklı durumlarda epigenetik biyobelirteç tanımlaması yoluyla hastalıkla olan ilişkinin tartışılması.
- Preklinik Uyum: Farklı örnek boyutları arasında tutarlı epigenomik profilleme sağlayarak, keşiften preklinik doğrulamaya kadar olan sürekliliğin tanımlanması.
- Risk Ayarlı İlerleme: 100.000 hücreli ve referans veri setleriyle doğrulanmış, düşük arka plan gürültüsüne sahip tekrarlanabilir veriler aracılığıyla karar alma süreçlerinin desteklenmesi.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Otomatik ChIP-seq yöntemi, hipotez testinden öncü belirlemeye kadar keşif sürekliliğine entegre olarak, sınırlı materyalle erken aşamalarda epigenomik profilleme yapılmasına olanak tanır.
- Keşif Biyolojisi: Düşük hücre girdilerinden histon modifikasyon profilleri oluşturarak hipotez testlerini ve yolakların netleştirilmesini destekler.
- Tarama: Otomatik kütüphane hazırlama ve kantitatif DNA geri kazanım metrikleri aracılığıyla analiz hazırlığı ve tekrarlanabilirlik sağlar.
- Analitikler: Koşul karşılaştırması için qPCR (% girdi geri kazanımı) ve NGS pik korelasyonu yoluyla kantitatif bağımlı değişken ölçümleri sunar.
- Translasyonel Araştırma: Ortogonal veri setleri ile valide edilmiş, biyobelirteçlerle uyumlu epigenomik profiller aracılığıyla preklinik süreklilikle bağlantı kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Robotik platformu, projeler arası epigenetik analizler için yeniden kullanılabilir bir yetkinlik olarak yapılandırarak tekrarları azaltır.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Epigenetik mekanizma çalışmalarında öngörü güveni, hedef doğrulama ve mekanistik belirsizliğin azaltılması.
- Operasyonel Değer: Otomatik sıvı aktarımı ve minimize edilmiş manuel adımlar aracılığıyla sağlanan standardizasyon, tekrarlanabilirlik ve ölçeklenebilirlik.
- Stratejik Değer: Güvenilir, düşük girişli epigenomik veriler yoluyla daha iyi devam/durdurma kararları, sermaye verimliliği ve azaltılmış geç evre biyolojik risk.
- Portföy Etkisi: Tekrarlanabilir, referansla ilişkili ChIP-seq sonuçlarının desteklediği risk ayarlı önceliklendirme ve ilerletme kararları.
Uygulama Hususları
- Kromatin hazırlama, antikor validasyonu ve otomatik sıvı taşıma sistemi kullanımı konularında uzmanlık gerektirir.
- Robotik platform (örn. IP-Star Compact), manyetik boncuk işleme ve qPCR/NGS analitik altyapısı dahil olmak üzere enstrümantasyon gereklidir.
- Tekrarlanabilirlik için antikor seçimi, kromatin parçalama ve protokol parametrelerinin ekipler arası standardizasyonu gereklidir.
- Hücre sayısının 10.000'den 100.000'e çıkarılması veya primer biyopsilere ve alt popülasyonlara uygulanması durumunda adaptasyon değerlendirmeleri gerektirir.
- Pratik kısıtlamalar arasında, düşük girdi başarısı için yüksek kaliteli, spesifik antikorlara ve optimal kromatin parçalamaya olan bağımlılık yer alır.
