Name: Polikistik Böbrek Hastalığı Olası Zebra balığı Modeli: demonte Wnt5a Zebra balığı Böbrekler Kistler Nedenler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-02T11:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Öğrenin polikistik böbrek hastalığı için zebra balığı modeli oluşturma yöntemini. Wnt5a geni susturularak böbrek kistleri gözlemlenir ve floresan mikroskopi ile yapı analiz edilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser (LH DK093625 ve DK069909 ve DK047757 JHL için) NIH tarafından desteklenen ve VA (Başarı Ödülü JHL için I01BX000820). Biz gerekli desteği sağlamak için Pennsylvania Zebra balığı Core Üniversitesi&#39;nden Dr. Michael Paketi ve Dr Jie He teşekkür etmek istiyorum.

NOT: Etik Açıklama: Tüm zebrabalıkları deneyler Eastern Virginia Medical School Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi. 1. Morfolino Hazırlık <ol><li> (Şekil 1A), üreticinin talimatlarına uygun olarak söz konusu gen için tasarım ve sentez için engelleme (AUG-) ve ek yeri engelleyici (Splice-), anti-sens morfolino (MO) oligonükleotidleri. Tablo 1&#39;de üreticinin bilgilerine bakın lütfen. NOT: MOs cam şişelerde liyofilize hisse senetleri olarak sevk edilir. </li><li> 25 ug / ml&#39;lik bir son konsantrasyona kadar MOS yeniden askıya cam şişelere yüksek dereceli steril su ekle. Oligonükleotid tamamen eriyene emin olun. Bazı katı kalıntılar ise, 5 kısaca dk ve vorteks 10 için 65 ° C&#39;de stok oligonükleotid çözeltisi içeren flakon ısı. </li><li> Oda sıcaklığında MO stok solüsyonu saklayın. 4 ° C veya -20 ° C&#39;de saklayın etmeyinC daha düşük sıcaklıklar MO oligonükleotid konteyner duvarına bağlamak için neden olabilir çünkü. Bir spektrofotometre kullanılarak stok çözeltisinin konsantrasyonunu ölçmek, yeni bir MO stok çözeltisi yapılan her zaman (Tablo1 bakınız). </li><li> Istenen doz, yüksek dereceli steril su ile stok çözelti seyreltilerek enjeksiyonu gününde, MO çalışma çözeltisi hazırlayın. % 0.05&#39;lik bir konsantrasyon elde etmek üzere% 0.5 fenol-kırmızı ekleyin. Örneğin, 15 ng / nL bir konsantrasyon ile 5 ul çalışma solüsyon elde etmek amacıyla 3 ul MO stok çözeltisi ve 0.5 ul% 0.5 fenol kırmızısı su, 1.5 ul ekle. NOT: Bu çalışma konsantrasyonu ile enjeksiyon her damla (500 pl) MO 7.5 ng içerir ve iki damla MO 15 ng içerir. </li></ol> Enjeksiyon Aparatı 2. Hazırlık <ol><li> Satınalma cam (Ayrıntılı bilgi için bakınız Tablo 1 lütfen) iğneler önceden çekti. Alternatif olarak, cam enjeksiyon iğnesi wi çekinBir iğne çektirmesi inci. </li><li> Hava kompresörü açın ve 50 psi basınç ayarı ayarlayın. Diseksiyon mikroskobu ışık kaynağı ve Pico mikro-enjeksiyon pompası açın ve aşağıdaki gibi ayarları: basıncı 20 psi tutun, basınç 10 psi, yolluk 2,5 ve 100 mikro saniye aralığı süresi değerini çıkarma. </li><li> Enjeksiyon çözeltisi 5 ul camını önceden çekti iğne yükleyin ve ucu aşağı bakacak şekilde dikey konumda iğne yerleştirin. Tüm çözüm görünür hava kabarcıkları ile iğne ucu ulaşana kadar bekleyin. Mikroskop yanında uygun bir konumda iğne tutucu yerleştirin ve tutucu içine cam iğne yerleştirin. 45 derece enjeksiyon açısını ayarlayın. </li><li> Yüksek sahneden, mikroskop altında görünümü içine iğne ucu getir, ve ucu ince bölgeye odaklanmak. İnce nokta cımbız ile iğne ucu kırın. </li><li> Bir cetvel ve mikroskop altında yan 0,15 mm tarafının iç çapa sahip bir kılcal tüp yerleştirin;bir sıvı sütununu yapmak için kılcal borunun bir ucuna solüsyonu enjekte edilir. 1 mm uzunluk sıvı kolon başına her 17 damla ulaşmak için çıkarma zamanı ayarlayın, daha sonra her damla hacmi 1 nl sıvı sütunun = π x yarıçapı 2 x uzunluk (damla hacmi () damla / sayımı () &#39;dir. Not: 0.1 mm bir çapı olan bir damla 500 ul bir enjeksiyon hacmi (damla hacmi = 4/3 x π X yarıçapı 3) elde edilir. </li></ol> Morpholinos 3. döllenmiş Zebra balığı Embriyolar hazırlanması ve Enjeksiyon <ol><li> Standart Zebra balığı yetiştiriciliği ve bakım için yayınlanan protokollere göre transgenik zebra balığı üreyen: Tg (GFP wt1b) ayarlayın. Doğal yumurtlama sonra embriyolar toplamak ve E3 su ile dolu bir 10 cm Petri için (5 mM NaCI, 0.17mm KCI, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO 4) &#39;de muhafaza edin. Hemen 13 MO enjeksiyon başlatın. Mikroskop altında embriyo morfolojisi izlemek ve emin olun MO enjeksiyon tek olanHücre sahne, ya da dört-hücre aşamasında daha sonra. <ol><li> Ile 10 cm&#39;lik bir petri tabağına embriyoların transferi olukları agar kama şeklinde tasarlanmış olmasıdır. Ekstra E3 suyu aspire ve yavaşça olukları içine embriyolar basın. </li><li> Mikroskop altında 1-hücre aşaması embriyo görselleştirmek için mikropipet ile embriyolar işleyin. Yumurta sarısı (1 damla = 500 ul) içine MO bir iki damla enjekte koryon ve yumurta sarısı nüfuz. E3 su ile 10 cm&#39;lik petri enjekte embriyolar transfer ve 28.5 ° C&#39;de inkübe. </li></ol></li><li> Enjeksiyondan sonra, ölü embriyolar kaldırmak ve enjekte edilen embriyoların sayısını kaydetmek. Çanak, her 24 ila 48 saat içinde E3 suyu değiştirin. </li></ol> 4. Fenotip Kurtarma Deneyler <ol><li> Kurtarma MO dayanıklı nedenle, farklı bir birincil baz çifti yapısı (genellikle 3-7 baz çifti uyumsuzlukları) sahiptir ve başka türlerden, bir ortolog seçin. Örneğin, bu deneyde, seçtikfare fare Wnt5a mRNA dizisi Zebra balığı diziden farklı olduğu için. </li><li> Ileri primer translasyon sitesi ve mRNA kodlama bölgesinin sonuna yakın bir ters primer olarak başlayan bir primer tasarımı. Ileri primer dizisinin 5&#39;-ucunda, bir T7 yükseltici seri ekleyin. Bu deneyde, aşağıdaki primer dizileri kullanılır; ileri: 5&#39;taa tac gac tca cta etiketi gga cta TGA tgc tgc TGA agc TGA a- 3 &#39;ve ters: 5&#39;tca CTT DHA gac gta ctg gtc- 3&#39;. </li><li> Yukarıda tasarlanmış bir primer grubu (her bir primerden 0.5 uM) ve Aşağıdaki PCR programı ile fare Wnt5a cDNA sekansını ihtiva eden 0.1 ug şablon DNA ile birlikte 50 ul Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) yapın: 5 dakika boyunca 95 ° C &#39;de 1 döngü; 95 ° C (30 saniye), 58.5 ° C (30 saniye), 72 ° C (1 dakika) 35 döngü; ve son uzatma adımı, 7 dakika boyunca 72 ° C&#39;de dayanıklılığı. </li><li> T bitirdikten sonraO döngüsü, bant doğru boyutta olduğundan emin olmak için% 1 agaroz jel üzerinde PCR ürünü 2 ul çalıştırın. Üreticinin talimatlarına uygun olarak bir PCR saflaştırma kiti ile PCR ürünü saflaştırılır. Bir spektrofotometre ile DNA konsantrasyonu kontrol edin. -20 ° C&#39;de saflaştırılmış PCR ürünü depolamak ya da doğrudan bir sonraki aşamada başlıklı RNA transkripsiyonu kullanın. </li><li> Üreticinin talimatlarına göre bir başlıklı bir RNA sentez takımı ile mRNA başlıklı in vitro sentez. 20 ul RNazsız su içinde seyreltilir ve mRNA konsantrasyonunu belirlemek. -80 ° C de, RNA ve mağaza alikosu. </li><li> Enjeksiyon gününde, RNaz içermeyen steril su ile bir mRNA çalışma çözeltisi hazırlayın. 40 ug RNA, spesifik ya da toksik etkilere yol açmaz olan en yüksek doz genel olarak bir RNA olduğuna dikkat edin. Buz üzerinde çalışma çözüm tutun. MO ile embriyo ve daha sonra kurtarma mRNA, enjekte veya birlikte hem eş-enjekte. Örneğin, mRNA HAZIRLIK konsantrasyonuHer bir enjeksiyonun aşama 4.5 ed 0.08 ug / ul son konsantrasyon için RNazsız su içinde 4.33 ul mRNA (0.4 ug), 0.67 ul, 0.6 ug / ml, sonra bir damla (500 ul) 40 ug içeren mRNA. Aşama 3&#39;te tarif edildiği gibi MO hazırlayın. </li></ol> Floresan Görüntüleme Enjekte Embriyolar 5. hazırlanması <ol><li> 28.5 ° CO kuluçkalandıktan sonra / N, floresan mikroskopi kullanılarak pronephros yapının gözlenmesini etki melanization önlemek için E3 su ile% 0.003, N-feniltiyoüre (PTU) ekleyin. Erken embriyo gelişimini etkiler çünkü Ancak, gastrulasyon önce PTU eklemeyin. </li><li> 48 hpf, elle ince cımbız ile embriyolar dechorionate. Bir ışık diseksiyon mikroskobu altında 48 ve 72 hpf embriyoların görüntüleri çekmek. NOT: Bu resimler anestezi olmadan alınabilir. </li><li> , Flöresanlı mikroskop altında görüntüleme yerleştirerek embriyolar anestezi için yaklaşık 10 dakika önce160 ug / ml tampon Tricaine içeren 10 cm&#39;lik bir petri kabı. 5-10 dakika bekleyin, sonra hafifçe hareket etmeyecek ve bu nedenle anestezi çalıştığını onaylamak için zebrafish dokunun. </li><li> Embriyolar anestezi sonra, (Tablo 1 bakınız)% 3 metil selüloz onları monte ve onları mikroskop altında yüzüstü pozisyonda yönlendirmek. </li><li> Bir floresan mikroskop altında pronephros yapısını dikkate alınmalıdır (Tablo 1 bakınız) ve farklı büyütme (10X ve 20X) ile fotoğraf çekmek. </li></ol>

<ol><li>Choi, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdc42+deficiency+causes+ciliary+abnormalities+and+cystic+kidneys%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Cdc42 deficiency causes ciliary abnormalities and cystic kidneys.</a> J Am Soc Nephrol. 24 (9), 1435-1450 (2013).</li>
<li>Hostetter, C. L., Sullivan-Brown, J. L., Burdine, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+pronephros%3A+a+model+for+understanding+cystic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Zebrafish pronephros: a model for understanding cystic kidney disease.</a> Dev Dyn. 228 (3), 514-522 (2003).</li>
<li>Nyengaard, J. R., Bendtsen, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glomerular+number+and+size+in+relation+to+age%2C+kidney+weight%2C+and+body+surface+in+normal+man%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Glomerular number and size in relation to age, kidney weight, and body surface in normal man.</a> Anat Rec. 232 (2), 514-201 (1992).</li>
<li>Keller, G., Zimmer, G., Mall, G., Ritz, E., Amann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nephron+number+in+patients+with+primary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Nephron number in patients with primary hypertension.</a> N Engl J Med. 348 (2), 101-108 (2003).</li>
<li>Cullen-McEwen, L. A., Kett, M. M., Dowling, J., Anderson, W. P., Bertram, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nephron+number%2C+renal+function%2C+and+arterial+pressure+in+aged+GDNF+heterozygous+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Nephron number, renal function, and arterial pressure in aged GDNF heterozygous mice.</a> Hypertension. 41 (2), 335-340 (2003).</li>
<li>Gerlach, G. F., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+organogenesis+in+the+zebrafish%3A+insights+into+vertebrate+nephrogenesis+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 559-585 (2013).</li>
<li>Igarashi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview%3A+nonmammalian+organisms+for+studies+of+kidney+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Overview: nonmammalian organisms for studies of kidney development and disease.</a> J Am Soc Nephrol. 16 (2), 296-298 (2005).</li>
<li>Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+mesonephric+development+and+regeneration+using+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 299 (5), 1040-1047 (2010).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+defect+in+a+novel+Nek-family+kinase+causes+cystic+kidney+disease+in+the+mouse+and+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A defect in a novel Nek-family kinase causes cystic kidney disease in the mouse and in zebrafish.</a> Development. 129 (24), 5839-5846 (2002).</li>
<li>Slanchev, K., Putz, M., Schmitt, A., Kramer-Zucker, A., Walz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nephrocystin-4+is+required+for+pronephric+duct-dependent+cloaca+formation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Nephrocystin-4 is required for pronephric duct-dependent cloaca formation in zebrafish.</a> Hum Mol Genet. 20 (16), 3119-3128 (2011).</li>
<li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Wnt5a+in+prostate+gland+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of Wnt5a in prostate gland development.</a> Dev Biol. 328 (2), 188-199 (2009).</li>
<li>Andre, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Wnt+coreceptor+Ryk+regulates+Wnt%2Fplanar+cell+polarity+by+modulating+the+degradation+of+the+core+planar+cell+polarity+component+Vangl2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The Wnt coreceptor Ryk regulates Wnt/planar cell polarity by modulating the degradation of the core planar cell polarity component Vangl2.</a> J Biol Chem. 287 (53), 44518-44525 (2012).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>Torres, V. E., Harris, P. C., Pirson, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autosomal+dominant+polycystic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Autosomal dominant polycystic kidney disease.</a> Lancet. 369 (9569), 1287-1301 (2007).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Polikistik böbrek hastalığı (PKD) insanlarda son dönem böbrek hastalığının önde gelen nedenlerinden biridir ve ilerici kist oluşumu, böbrek genişlemesi, ve anormal tübül geliştirme 14 ile karakterizedir. Otozomal dominant PKD (polikistik böbrek), genetik hastalık olan ya PKD1 mutasyonu, polikistin-1 (PC1) veya PKD2 kodlayan polikistin-2 (PC2) kodlayan, polikistik böbrek sonuçlanır. Diğer birçok gen, birincil cilium bulunan proteinleri kodlayan özellikle, böbrek kist gelişimi dahil olmak üzere düşünce ve bugün...

Balığı (Danio rerio) embriyo yaygın böbrek gelişim ve polikistik böbrek hastalığı çalışmak için bir model olarak kullanılmıştır. Orada bir hayvan modeli olarak zebrafish kullanarak pek çok avantajı vardır: genetik etkileşimlerin incelenmesinde fizibilite protein demonte için antisens morpholinos (MO) kullanma yeteneği fırsat hızlı bir şekilde embriyo sayıda tahlil edilmesi ve organ fenotipleri görüntüleme kolaylığı larva 1 yaşayan. pronephros omurgalılarda geliştirmek için ilk böbrek ve larva zebrafish 2 işlevseldir. zebra balığı pronephros yapısının memeli metanephros nispeten basit karşılaştırıldığında, üçüncü ve son böbrek, memelilerde geliştirmektir. nefron zor tek nefron yapısını gözlemlemek için yapım, 500,000-1,000,000 nefron 3,4 ve yaklaşık 13.000 nefron 5 olan her bir fare böbrek arasındaki içeren her insan böbreği ile, böbrek çalışma birimi in insan ya da fare böbrekler. zebra balığı iki nefron vardır ve her zebra balığı nefron glomerülleri ve fareler ve insanlarda 6 ve benzeri özelleştirilmiş böbrek hücre tiplerinin tübüllerde bulunan tüm ana bileşenleri içerir. Kapalı bir sistem 7 çünkü böyle Xenopus gibi diğer omurgalı modellere göre, zebra balığı nefron daha yakından memeli nefron benzer. Son yıllarda, zebra balığı genom genetik araçlar, geniş mutan kaynakları ve zebra balığı modelleri transgenik raportör hatları koleksiyonları geniş giriş sağlayan dizilenmiştir. 12-72 saat sonra döllenme (hpf) arasında Zebra balığı pronephros formları şeffaf embriyolar kolayca görülebilir. Wilm tümörü proteini WT1 böbrek gelişimi için önemli bir faktördür. Wt1b promoteri Tg kontrolü altında yeşil floresan protein (GFP) ifade eden transjenik zebrabalıkları hatları (wt1b GFP) GFP Expre göstermektedirsalgılanması, özellikle 17 hpf 8 başlayarak, Zebra balığı embriyolarının Pronephric bölgelerde yer. Nefronofitizi (NPHP), otozomal resesif kistik böbrek hastalığı, NPHP genlerinin 9 mutasyonlar neden olur. (Wt1b GFP) morfolino tarafından demonte NPHP4 Tg kist oluşumuna yol açtı. Balık 10 Bu nedenle, bu transjenik balık böbrek gelişimi esnasında böbrek yapıları ve kist oluşumunun gözlenmesi için uygun bir modeldir. Daha da önemlisi, böbrek gelişim modülatörlerinin etkisi, zaman ve iş gücü verimli bir şekilde, bu suşu kullanılarak incelenebilir. Gen modülasyonu sonrası böbrek kist oluşumuna görselleştirmek için bir model olarak, balık: Bizim kağıt Tg (GFP wt1b) kullanımını tarif etmektedir. Biz zebrafish Wnt5a geni yıkmak için başlangıç ​​ve bağlayıcı sitesi, anti-duyu MOS kullanılır. Wnt5a çeşitli organ ve hücre sonrası gelişiminde önemli bir rol oynar, Wnt ailesinin bir kanonik salgılanan bir glikoprotein olup,Fonksiyon 11. Wnt5a renal tübüler uzama esnasında yönlendirilmiş hücre bölünmesi bir rol oynadığı tespit edilmiştir düzlemsel hücre polarite (PCP) yol da dahil olmak üzere olmayan doğal Wnt yollar üzerinden çalışır. Wnt5a, bundan başka Vangl2 stabilite 12 teşvik VANGL düzlemsel hücre kutup protein 2 (Vangl2) ile bir kompleks oluşturarak Wnt5a sinyal çeviren tirozin kinaz benzeri reseptör (Ryk) ile bir kompleks oluşturarak Wnt / PCP yolu düzenler. PCP yolunda kusurlar rastgele hücre bölünmesi sonucu ve böbrek kist oluşumuna neden olabilir. Wnt5a demonte aşağıdaki böbrek kist oluşumunu gözlemlemek için Zebra balığı çizgi: Biz Tg (GFP wt1b) kullanılır. Tg (wt1b: GFP) Zebra balığı modeli canlı görüntüleme ve böbrek yapısının zamanında gözlem izin verir. Wnt5a demonte sonra, böbrek kist oluşumu 24 hpf başlayan bulundu; 72 hpf, kistler glomeruli ve proksimal tübüllerde bulunamadı. Bu yöntem aynı zamanda s kullanılabilirböbrek kist oluşumuna neden olabilir creen diğer genler.

<table><tbody><tr><td>% 0.5 Fenol-Kırmızı</td><td>Sigma</td><td>P0290</td><td>Enjeksiyon için renk göstergesi</td></tr><tr><td>Morpholino</td><td>Genn Tools, LLC</td> <td>(özelleştirilmiş)</td> <td>İlgilenilen gene göre özelleştirilmiş</td></tr><tr><td>Önceden çekilmiş iğne</td><td>Tritech Research</td><td>MINJ-PP</td><td>Çok miktarda iğne gerekiyorsa, bir iğne çektirmesi de satın alabilir ve iğneyi laboratuvarda hazırlayabilirsiniz</td></tr><tr><td>T7 mMessage Kit</td><td>Ambion</td><td>1344</td><td>Kurtarma deneyi için kapaklı mRNA yapmak için in vitro transkripsiyon için</td></tr><tr><td>N-Fenilthiourea</td><td>Sigma</td><td>P7629</td><td>Melanizasyonun önlenmesi için</td></tr><tr><td>Trikain</td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td>Zebra balığı anestezisi için etil 3-aminobenzoat olarak da adlandırılır</td></tr><tr><td>Metil Selüloz</td><td>Sigma</td><td>M-0387</td><td>Zebra balığının pozisyonu için&nbsp;</td></tr><tr><td>QIAquick PCR Arıtma Kiti&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>Kapak RNA sentezi için PCR ürününün saflaştırılması için.</td></tr><tr><td>PCR Etiketi için dNTP karışımı</td><td>Promega</td><td>U1511</td><td></td></tr> DNA <tr><td>Polimeraz</td><td>Invitrogen</td><td>10342-053</td><td>PCR</td></tr><tr><td>NanoDrop spektrofotometre</td> için <td>Thermo Scientific</td><td>ND-1000</td><td>Morfolino ve RNA konsantrasyonunu ölçmek için</td></tr><tr><td>Hava</td><td>Kompresörü Werther International, Inc.</td><td>Panther Compact 106</td><td>Enjeksiyon için hava kaynağı</td></tr><tr><td>Pico mikro enjeksiyon pompası</td><td>World Precision Instruments Inc</td><td>PV830 Pnematic PicoPump</td><td>Diğer mikroenjeksiyon sistemi türleri kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Mikro manuplator</td><td>World Precision Instruments Inc</td><td>MMJR</td><td>Sağ elini kullanan (sol elini kullananlar için MMJL)</td></tr><tr><td>İğne tutucu</td><td>World Precision Instruments Inc</td><td>5430-ALL</td><td>Mikromanipülasyon için iğneyi tutmak için</td></tr><tr><td>Dumont Cımbız</td><td>İnce Cerrahi Aletler</td><td>11253-20</td><td>İğne ucunu kırmak için</td></tr><tr><td>Diseksiyon mikroskobu</td><td>Leica M205C&nbsp;</td><td></td><td>Zebra balığı embriyolarını gözlemlemek ve görüntülemek için</td></tr><tr><td>Floresan mikroskobu</td><td>Zeiss Axio Obserer D1m &nbsp;</td><td></td><td>Zebra balığı pronephroslarını görüntülemek için</td></tr><tr><td>Kılcal tüp (İç çap 0,15 mm)</td><td>VitroCom</td><td>CV1525Q-100</td><td>Enjekte edilen her damlanın hacmini ölçmek için</td></tr></tbody></table>

polikistik böbrek hastalığı olası zebra balığı modeli: demonte wnt5a zebra balığı böbrekler kistler nedenler

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

Polikistik böbrek hastalığı (PKD), tedavisi olmayan yıkıcı bir hastalık olan son dönem böbrek hastalığının en yaygın nedenlerinden biridir. PKD'de kist oluşumuna yol açan moleküler mekanizmalar biraz belirsizliğini korumaktadır, ancak birçok genin dahil olduğu düşünülmektedir. Wnt5a, çok çeşitli gelişimsel süreçleri düzenleyen kanonik olmayan bir glikoproteindir. Wnt5a, renal tübüler hücre uzaması sırasında yönlendirilmiş hücre bölünmesini düzenleyen düzlemsel hücre polaritesi (PCP) yolu aracılığıyla çalışır. PCP yolağının kusurlarının böbrek kisti oluşumuna neden olduğu bulunmuştur. Makalemizde, wnt5a antisens morfolino (MO) oligonükleotidleri ile wnt5a geninin yıkılmasıyla bir zebra balığı kistik böbrek hastalığı modeli geliştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Tg(wt1b:GFP) transgenik zebra balığı, wnt5a yıkımını takiben böbrek yapısını ve böbrek kistlerini görselleştirmek için kullanıldı. İki farklı antisens MO (AUG - ve ekleme bölgesi) kullanıldı ve her ikisi de wnt5a yıkımından sonra kıvırcık kuyruk aşağı fenotipi ve kist oluşumu ile sonuçlandı. Primer baz çifti yapısındaki bir farklılık nedeniyle MO'lara dirençli fare Wnt5a mRNA'sının enjeksiyonu, anormal fenotipi kurtardı ve fenotipin morfolinin "hedef dışı" etkilerinden kaynaklanmadığını gösterdi. Bu çalışma, böbrekteki wnt5a fonksiyonunu incelemek için bir zebra balığı modeli kullanmanın geçerliliğini desteklemektedir.

Wnt5a yıkmak çeviri MO engelleme getirerek elde edildi (Ağustos-MO) veya bir hücre aşamada Zebra balığı embriyolarının için ekson / intron sınır ekleme MO (ekleme-MO). Ağustos-MO nedenle, hem anne ve zigotik Wnt5a mesajını engeller, başlangıç ​​kodonu hedef ve. ek yeri MO, üçüncü parça verici bölge hedef ve Wnt5a (Şekil 1A) yalnızca zigotik transkript inhibe eder. AUG- ve splice- morphants kıvırcık kuyruk altındaki vücut ekseni ve kalp çevresi ödemine (Şekil 1B) de dah...

Polikistik böbrek hastalığının olası bir zebra balığı modelini oluşturmak için bir yöntem açıklıyoruz. Böbrek yapısını görselleştirmek için Tg(wt1b:GFP) balığı kullandık. Wnt5a'nın yıkılması morfolino enjeksiyonu ile yapıldı. Bu GFP transgenik zebra balığında wnt5a knockdown sonrası pronefrik kist oluşumu gözlendi.

Polikistik Böbrek Hastalığı Olası Zebra balığı Modeli: demonte Wnt5a Zebra balığı Böbrekler Kistler Nedenler

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, polikistik böbrek hastalığının olası bir zebra balığı modelini oluşturmaktır. Bu, bir hücre aşamasında transgenik WT'de bir BGFP zebra balığı embriyosunda Wind five A'ya karşı morf enjekte edilerek elde edilir. Daha sonra, fare Wint five A Mr.Nna'nın mikroenjeksiyonu ile bir kurtarma deneyi gerçekleştirilir ve Wint five a morpho ile yapılır.Daha sonra enjekte edilen embriyolar, böbrek yapısını ve kist oluşumunu izlemek için döllenmeden 48 ve 72 saat sonra uyuşturulur ve gömülür. Beşinci rüzgar A yıkımından sonra, sonuçlar, eğilimli böbrek yapılarının floresan mikroskobuna dayalı olarak transgenik WT bir BG FP zebra balığında beş A yıkımının eğilimli böbrek kisti oluşumuna neden olduğunu göstermektedir. Bu tekniğin sonuçları, böbrek hastalığının bir modelini oluşturmaya doğru uzanır, çünkü böbreğe özgü Fluor protein transgenik kullanımıyla kaplanan balık embolünün şeffaflığı, bir AL organizmasındaki böbrek yapılarının doğrudan bir görünümüne izin verir.Bu yöntem, zebra balığı böbrek kisti oluşumuna neden olan beşinci galibiyet hakkında fikir verebilir. Böbrek kisti oluşumuna neden olduğundan şüphelenilen diğer birçok geni test etmek için de uygulanabilir. Bu protokol basit ve daha az zaman alıcıdır.Morfosları üreticinin talimatlarına göre tasarladıktan ve sentezledikten sonra, mikrolitre başına 25 mikrogramlık bir nihai konsantrasyona iyice yeniden süspanse etmek için cam şişelere yüksek dereceli steril su ekleyin. Konsantrasyonu ölçmek için bir spektrofotometre kullanın ve stok çözeltisini enjeksiyon gününde oda sıcaklığında saklayın, morfosu istenen konsantrasyona seyreltmek için yüksek dereceli steril su kullanın ve% 0.5 fenol kırmızısında% 0.05'lik bir nihai konsantrasyona kadar Hava kompresörünü açın ve basınç ayarını 50 si'ye ayarlayın. Ardından diseksiyon mikroskobu ışık kaynağını ve pico mikro enjeksiyon pompasını açın ve ayarları aşağıdaki gibi yapın.Önceden çekilmiş bir cam iğne yüklemek için beş mikrolitre enjeksiyon solüsyonu kullanın ve görünür hava kabarcığı olmadığında iğneyi bir ucu aşağı bakacak şekilde dikey konuma getirin, iğneyi tutucuya yerleştirin. Enjeksiyon açısını 45 dereceye ayarlayın. İğne ucunu mikroskop altında, sahneden yüksekte görün ve ucun en ince bölgesine odaklanın.Daha sonra iğneyi kırmak için ince uçlu cımbız kullanın. İpucu, mikroskobun altına iç çapı 0,15 milimetre olan bir kılcal boru yerleştirin. Çözeltiyi bir ucuna enjekte edin.Pico mikroenjeksiyon pompasındaki çıkarma süresinin 17 damla olana kadar ayarlanması, bir milimetre uzunluğunda bir sıvı sütunu oluşturur. Bu, her damlanın hacmini bir nanolitreye eşit yapar. Standart zebra balığı yetiştiriciliği ve bakımı için yayınlanmış protokollere göre transgenik WT bir BG FP zebra balığı yetiştirme çiftleri kurun.Doğal bir yumurtlamanın ardından, embriyoları toplayın ve bunları E üç su ile bir Petri kabına aktarın. Bir ila dört hücre aşaması arasındaki embriyoları kullanarak, bunları kama şeklinde burgu olukları olan 10 santimetrelik bir Petri kabına aktarın. Ortamı aspire ettikten sonra, embriyoları oluklara hafifçe bastırın Diseksiyon mikroskobu altında, hücreyi görselleştirmek için embriyoları yönlendirin.Daha sonra enjeksiyon iğnesi ile Corian'a ve ardından yumurta sarısına nüfuz ederek yumurta sarısına bir veya iki damla morpho enjekte edin. Enjekte edilen embriyoları E 3 su ile 10 santimetrelik bir Petri kabına aktarın ve 28.5 santigrat derecede inkübe edin. Bir fenotip kurtarma deneyi gerçekleştirmek için enjekte edilen canlı embriyoların sayısını kaydedin.Farklı bir birincil baz çifti yapısına sahip olan ve bu nedenle morfoya dirençli olan başka bir türün geninden bir orto log seçin. Bu örnekte fare gitti beş A seçilmiştir. Translasyonel başlangıç bölgesinden başlayarak ön astar ve MR NA kod bölgesinin sonuna yakın ters astar ile bir astar seti tasarlayın.Primerler ve fare rüzgarını içeren bir mikrogram şablon DNA ile ileri primer dizisinin beş asal ucuna bir T yedi promotör dizisi ekleyin. Beş A-C-D-N-A dizisi. 50 mikrolitrelik bir PCR reaksiyonu ayarlayın ve burada gösterilen programı kullanarak çalıştırın.PCR ürününün boyutunu doğruladıktan, saflaştırdıktan ve konsantrasyonu kontrol ettikten sonra, in vitro kapaklı mRNA'yı sentezlemek için kapaklı bir RNA sentez kiti kullanın. Üreticinin talimatlarına göre, MR NA'yı seyreltmek ve alikot konsantrasyonunu belirlemek için 20 mikrolitre RNA serbest su kullanın ve RNA'yı enjeksiyon gününde eksi 80 santigrat derecede saklayın. Embriyoya spesifik olmayan veya toksik etkilerden kaçınmak için 40 pikogram veya daha düşük bir doz verecek MR NA'nın çalışan bir çözeltisini hazırlayın.MNA çözeltisini buz üzerinde tutarak morfozları ve ardından mRNA'yı embriyolara enjekte edin veya çözeltileri birlikte enjekte edin. Ertesi gün, ölü embriyoları çıkarın ve embriyoların gaz geçirdiğinden emin olmak için kontrol edin. Daha sonra, döllenmeden 48 saat sonra kavunu önlemek için E üç suyuna% 0.003 uç fenil THREA veya PTU ekleyin.Hemen görüntü almak için bir diseksiyon mikroskobu kullanmadan önce embriyoları manuel olarak kaplamak için ince cımbız kullanın ve döllenmeden yaklaşık 10 dakika sonra döllenmeden yaklaşık 10 dakika sonra, embriyoları mikrolitre başına 160 mikrogram tamponlu trica içeren 10 santimetrelik bir Petri kabına yerleştirerek uyuşturun. Embriyoları monte etmek için% 3 metilselüloz kullanın ve diseksiyon mikroskobu altında yüzüstü pozisyonda yönlendirin. Daha sonra 10 kat ve 20 kat büyütme görüntüsü kullanarak.Bir floresan mikroskobu altındaki embriyolar, zebra balığı embriyolarına ek morfosu olarak da adlandırılan, aynı zamanda bir UG morfosu veya ekzon giriş sınır ek morfosu olarak da adlandırılan translasyon bloke edici morfo eklenerek beş A nakavt elde edildi. Bir hücre aşamasında, A UG morfosu başlangıç kodonunu hedefler ve bu nedenle hem maternal hem de zigotik beş bir ekspresyon kazanır. Ek morfu, üçüncü ek donör bölgesini hedefler ve yalnızca beş A kazanmanın zigotik transkriptini inhibe eder Burada gösterildiği gibi, A UG ve ek morfinleri feno, kıvırcık kuyruk, aşağı gövde ekseni ve perikardiyal ödem dahil olmak üzere çoklu kusurlarla birbirini kopyaladı.Bu şekil, farenin beşe gittiğini göstermektedir: bir mRNA, morf fenotipini kısmen kurtarır ve bunun burada gösterilen hedef dışı etkilerden kaynaklanmadığını gösterir. Transgenik WT one BGFP balığı, WT one B promotörü tarafından yönlendirilen GFP'yi ifade eder ve profik yapıyı ana hatlarıyla belirtir. Balık, döllenmeden 48 saat sonra rüzgarın beşi ve yıkılmasından sonra glomerüler kist oluşumu gösterdi.Sadece fenol kırmızısı enjekte edilen kontrol balığı, döllenmeden 72 saat sonra yanal olarak uzanan tübüllerle U şeklinde kaynaşmış glomerüler oluşturan normal eğilimli frik gelişimi gösterdi. Glomerüler yapılar vasküler döngülerle daha da gelişti ve hem A UG hem de splice morph enjekte edilen embriyolarda glomerüllerde ve proksimal tüplerde kistler geliştirdi, bu şekilde görüldüğü gibi HNE döllenmeden 72 saat sonra transvers histolojik kesitlerde boyandı, morant embriyolarda kist oluşumu, bozulmuş glomerüler yapılar ve genişlemiş renal tüpler ortaya çıktı. Bu videoyu izledikten sonra, kistik böbrek hastalığının olası bir gery faz modelinin nasıl geliştirileceğini iyi anlamalı ve rüzgar yaşlanmasını yıkarak sistem oluşumunu gözlemlemeli, grip raporu yüz çizgisi ile sistem oluşumunu gözlemlemelisiniz.Gen mutasyonunun zebra balıklarında böbrek kisti oluşumuna yol açtığı gösterildikten sonra, böbrek kisti oluşumunun ayrıntılı mekanizmalarını araştırmak için daha fazla deney yapılabilir.

a-possible-zebrafish-model-polycystic-kidney-disease-knockdown-wnt5a

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Burada, geliştirmek için sistematik bir yaklaşım sunmak fizyolojik, ilgili duyarlı ve...

Br.rerio kullanarak Morbid İnsan Genomu İn Vivo Modelleme

Zebra balığı yetişkin böbrek böbrek yenilenmesi ve hastalık çalışmalar için mükemmel bir sistemdir. Böyle bir araştırmanın önemli bir yönü nefron yapısı ve fonksiyonu değerlendirmesidir. Bu protokol nefron borucuk kompozisyonunun ve böbrek geri emiliminin değerlendirilmesi için uygulanabilecek çeşitli yöntemler anlatılmaktadır.

Yetişkin Zebra balığı Böbrek Nefron Kompozisyon ve Fonksiyon Analizi

Zebra balığı, daha yüksek omurgalılarla genetik benzerlikleri nedeniyle gelişimsel biyoloji ve insan hastalıkları araştırmaları için güçlü bir model sistemdir. Bu protokol, erken embriyogenez için gerekli olan genlerdeki resesif mutasyonları tanımlamak için ileri tarama stratejileri için kullanılabilecek haploid zebra balığı embriyoları oluşturmak için bir metodolojiyi açıklar.

Haploit Zebra balığı Embriyolar üretimi ile<em&gt; In Vitro</em&gt; Gübreleme

Zebra balığı omurgalı gelişimsel süreçleri ve model insan hastalığı araştırmak için mükemmel bir deneysel organizmadır. Burada, bir ile zebra balığı embriyolarının bir manuel yüksek verimli kimyasal ekran gerçekleştirmek için nasıl bir protokol tarif Okuması in situ hibridizasyon (VVISH) içinde tüm montaj.

Zebra balığı Embriyolar kullanılarak Yüksek verim Yaklaşıyor A Manuel Küçük Molekül Ekran

Zebra balığı, kronik böbrek hastalığı (KBH) modellemek için popüler bir araçtır. Ancak, kendi küçük boyutu imkansız geleneksel yöntemlerle böbrek fonksiyonlarını değerlendirmek için yapar. Biz CKD zebrafish böbrek fonksiyonunun kantitatif analiz sağlayan bir floresan boya böbrek boşluk tahlil 1 açıklar.

Bir Floresan Gümrükleme Testi kullanarak Zebra balığı Böbrek Fonksiyon Değerlendirilmesi

Burada anlatılan yöntemi fokal ve düzlemsel kaymasını düzeltmek için optik bölümlendirilmeleri ve güçlük basit stratejileri yürütebilecek diseksiyon mikroskobu bir floresan kullanılarak Zebra balığı embriyolarının organ gelişiminin time-lapse analiz sağlar.

diseksiyon mikroskobu kullanılarak Time-lapse Görüntüleme ile Zebra balığı Böbrek Kalkınma Analizi Optik Kesit için donatılmış

kemoterapötik antibiyotik arasında değişen ilaçlar yer alır nephrotoxins, kaynaklanacak böbrek yaralanmaları, kimin patogenezi tam olarak anlaşılamamıştır karmaşık bozuklukları oluşabilir. Bu protokol, zebra balığı böbrek koruyucu önlemlerin tanımlanması için uygulanabilir, bu koşullar, hastalık modelleme için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.

Zebra balığı Nephrotoxin Mikroenjeksiyon Akut Böbrek Yaralanması Model

Bu çalışma, böbrek GFP transgenik zebra balığı kullanılarak segmental böbrek hasarının yeni bir in vivo modeli sunmaktadır. Model böbrek epitel hücrelerinin hedeflenen ablasyonunun indüksiyonuna izin vererek nefron hasarının ve onarımının hücresel mekanizmalarını gösterir.

Zebra balığı Gelişen Akut Böbrek Hasarının Modellenmesi İçin Hassas Hücresel Ablasyon Yaklaşımı

Kirpikler geliştirme için uygun organogenesis hayati önem taşımaktadır. Bu iletişim kuralı etiket ve Zebra balığı siliyer hücreleri görselleştirmek için en iyi duruma getirilmiş bir yöntemini açıklar.

Zebra balığı bütün Dağı Floresan Situ hibridizasyon ve ayirt kombine bir protokol aracılığıyla Multiciliated hücrelerde görüntülenmesi

Burada, DEPDC5 geninin geçici inhibisyonundan kaynaklanan bir zebra balığı epilepsi modelinin geliştirilmesi ve karakterizasyonu için bir protokol sunuyoruz.

Zebra balığı epilepsi modelinde davranışsal ve fizyolojik analiz

Bu protokol, cisplatin'i nefrotoksik ajan olarak kullanarak yetişkin zebra balıklarında Akut Böbrek Yaralanmasına (AKI) neden olacak prosedürleri açıklar. Renal dokuda inflamasyon ve hücre ölümünü analiz etmek için tekniğin tekrarlanabilirliğini ve iki tekniği değerlendirme adımlarını, akış sitometrisini ve TUNEL'i ayrıntılı olarak detaylandırdık.

Yetişkin Zebra Balıklarında Cisplatin tarafından İndüklenen Akut Böbrek Yaralanması Modeli

Öğrenin polikistik böbrek hastalığı için zebra balığı modeli oluşturma yöntemini. Wnt5a geni susturularak böbrek kistleri gözlemlenir ve floresan mikroskopi ile yapı analiz edilir.

Polikistik Böbrek Hastalığı Olası Zebra balığı Modeli: demonte Wnt5a Zebra balığı Böbrekler Kistler Nedenler

Daha fazla video keşfet