Name: Türetilmesi ve Karakterizasyonu bir Transgen ücretsiz İnsan Kaynaklı Pluripotent Tanımlı Klinik dereceli Koşullar içine Hücre Hattı ve Dönüşüm Kök (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: Keşfedin yetişkin dermal fibroblastları lentiviral yöntemle yeniden programlayarak faktör içermeyen hiPSC'ler elde etme ve bunları klinik kullanıma uygun GMP koşullarına dönüştürme yöntemini.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Patrick C. Lee, Cyril Ramathal ve Saravanan Karumbayaram'a (SK) iPSC türetme ve karakterizasyon deneylerinin gerçekleştirilmesindeki yardımları için teşekkür ederiz; iPSC analiz deneylerini gerçekleştirmek için Aaron Cooper; Vittorio Sebastiano ve Renee A. Reijo Pera, ilk yeniden programlama çabalarını yönettikleri için; SK, William E. Lowry, Jerome A. Zack ve Donald B. Kohn, klinik dereceli iPSC'lerin dönüştürülmesine ve karakterizasyonuna izin veren UCLA GMP tesislerinin kurulmasını yönetmek için; Gustavo Mostoslavsky, bize STEMCCA polisistronik yeniden programlama vektörünü sağladığı için. Bu çalışma, güvenli kişiselleştirilmiş hücresel terapötikler oluşturmak için Fibrocell Science ve Dermal Mezenkimyal Olarak Elde Edilen Türevler için Klinik Araştırmalar (CIDMOD) Girişimi ile yapılan bir araştırma işbirliğine dayanmaktadır. Bu çalışma, UCLA'daki Eli ve Edythe Geniş Rejeneratif Tıp ve Kök Hücre Araştırma Merkezi, Phelps Aile Vakfı, Fibrocell Science, Inc. ve UCLA CTSI Scholar'ın JAB'a verdiği fonlarla desteklenmiştir.

Not:. Bu yöntem, Awe ark 10&#39;da rapor araştırmada kullanılmıştır. STEMCCA 1. yeniden programlanması Yetişkin insan dermal fibroblastlarında <ol><li> Çözülme yetişkin dermal insan fibroblastlarının (HUFS), 2 dakika boyunca 37 ° C su banyosu içinde geçiş 4 ya da daha düşük, su ile şişenin üst batırmak için özen. </li><li> 15 ml konik bir şişe, insan fibroblast 1 ml&#39;lik bir bulamaç koyun ve yavaş yavaş damla damla bir tarzda, 37 ° C&#39;ye önceden ısıtılmış, standart HUF ortam, 4 ml yerleştirmek, dimetil sülfoksit (DMSO) sulandırmak ve yeniden askıya hücreleri. </li><li> Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 200 x g&#39;de şişe santrifüjleyin. Süpernatan aspire ve / mi 100,000 hücre süspansiyonu elde etmek üzere ortam yeterli bir hacimde hücrelerin yeniden askıya ve daha sonra, altı gözlü bir plakanın bir kuyuya 2 mi ekleme,% 0.2 jelatin ile 20 dakika için önceden kaplanmış. NOT: hat ve durumun başına hücre eşit sayıda iyi bir kardeş fo seribaşı gerekiyorr hücre sayımı / enfeksiyon (İB) hesaplama çokluğu. </li><li> Eşit hücreleri dağıtmak için ileri geri yan ve plaka yan Kaya. Nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 seviyesinde bir gece boyunca inkübe edin. </li><li> Transdüksiyon gününde hücre kardeş gelen sayısı (ler) de, ilk HUF sonra kaplama (lar) ile, takriben 24 saat elde edin. </li><li> 2 x 10 8 TU, ya da eşdeğeri, lentiviral konsantre (STEMCCA) çözülme ve HUF medya 1 x 10 8 TU / ml sulandırmak. </li><li> 8 ug / ml transfeksiyon maddesi ile takviye edilmiş HUF ortam içinde 10-İB oranında hücreleri nakletmek. Eşit kalıt kuyu karıştırın ve nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 seviyesinde bir gece boyunca inkübe edilir. </li><li> Lentiviral transdüksiyon sonra yaklaşık 24 saat, standart insan pluripotent kök hücre (PSC) orta HUF medya geçiş. </li><li> Gün 2 6 aracılığıyla, insan PSC orta günlük ortamı değiştirmek. </li><li> 6. günde, iki% 0.2 jelatin kaplı 10 cm plakayıHUF ortam 12 CF1 fareler elde edilen 1,5 ila 10 x 1.75 ila 6 MEF&#39;ler. </li><li> Günde 7 günü, dikkatli olmak arasında eşit tüm hücreleri kaplama ile, bir 1:16 oranında altı plaka ve geçit bir kuyudan günde 7 yeniden programlanması fibroblastlar kaldırın 100&#39;den fazla xg, kullanım oda sıcaklığı tripsin santrifüj değil bir gün önce MEF&#39;ler ile kaplandı taze insan PSC medya, iki 10 cm tabak,. 37 ° C bir saat yönünde sarmal hareket ve yer hücre toplulukları dağıtmak,% 5 CO2, gece boyunca inkübatör nemlendirilmiş. </li><li> Yaklaşık 48 saat sonra MEF&#39;ler ve her gün üzerine yeniden programlanması hücreleri tohumlama sonra, taze medya ile harcanan insan PSC medya dışarı değiştirmek. </li><li> 3-4 hafta sonra, bir 21 gauge iğne ile morfoloji gibi tipik ESC ile ayrı ayrı koloniler, çekme ve% 0.2 jelatin kaplı tek tek oyuklara belirli kolonilerin yaklaşık 8-10 bireysel parçaları yerleştirilerek 24 kuyucuklu plaka içerisine alt klonlamak 24-iyi plaka ön-çekirdekİnsan PSC ortamda CF1 fareler türetilen MEF&#39;ler ile ed. NOT: seçilmiş kolonilerin büyütüldükten sonra, koloniler protein seviyesinde embriyoit vücut formasyonu ve Pluripotency markerlerinin ifadesi analizi ile pluripotent, özelliği gerekir. </li></ol> 2. Vektör Entegrasyon Site Analizi ve STEMCCA eksizyonu <ol><li> 10 anlatıldığı gibi olmayan kısıtlayıcı doğrusal amplifikasyon PCR ile STEMCCA entegrasyon siteyi analiz. </li><li> Eski insan ESC orta kapalı aspire genomu, tüketim STEMCCA istenen alana bir entegrasyon sağlamak için tahlil sonra. Daha sonra, 24 saat süre ile standart PSC ortam 3 ml 8 ug / ml transfeksiyon maddesi ile konsantre Adeno Cre PuroR virüsünün 45 ul birleştirir. </li><li> 24 saatlik bir bekletme süresinden sonra, karışık bir viral süpernatan aspire ve insan PSC ortamı ile iki kez yıkama hücreleri. 5 gün arasında bir süre için 2 ug / ml puromisin ile taze insan PSC ortamlarını ortam günlük wit değiştirmekh taze medya ve antibiyotik. </li><li> 5 gün sonra, alt-klon 12-oyuklu bir plaka içerisinde,% 0.2 jelatin kaplı oyuklara üzerine 21-gauge iğne ile koloniler kalan CF1mice türetilen MEF&#39;ler ile önceden kaplanmış ve yukarıda açıklandığı gibi genişletmek. Not: yeterli genişleme donmuş stok elde etmek üzere sonra besleyici içermeyen koşullar dönüştürme gereklidir. En hücreler başarılı bir şekilde transdüksiyona olmayacak ve kuluçkalama 5 günlük bir süre boyunca antibiyotiğe ölmek olarak en az% 95, kök hücre koloni ölümü bekliyoruz. Adeno Cre PuroR faktörü içermeyen koloni örnek reexposing, enfekte olmuş hücrelerin konukçu kromozomları içine 0.001-1 verimliliği% entegre olmasına rağmen, entegrasyon 13 oluştu doğrular% 100 hücre ölümünü sağlamak için puromisin için. </li><li> Matris bir sıvı olduğu kadar, yaklaşık 2 saat (imalatçının önerileri) bir süre boyunca buz üzerinde ön aliquoted taban membran matrisi bir vial çözülme ve soğuk bazal ortam içinde 1:30 arasında nihai bir konsantrasyona kadar sulandırmak. Cooyuk başına 1 ml bir altı yuvalı plaka içindeki yuvalara istenen sayıda. 1 saat oda sıcaklığında bekletin. </li><li> Bir de daha önce MEF&#39;ler ile kaplanmış 30 koloniler en az 20 (18 iğne, ya da bir cam veya plastik &quot;ucu&quot; kullanarak) çapraz çizgili. MEF canlandıran azaltmak ve plaka aktarmak dikkatli olun. <ol><li> Steril plastik pipet basit kullanımına açık alev üzerinde, daha karmaşık ısıtma, farklı yaklaşımların bir numara ile bir cam Pasteur pipet çekerek ve terbiye çapraz tarama cihazı üretmek ya, bizim olduğu gibi, 21- ve / veya 18 gauge iğne. </li></ol></li><li> Kaplanmış de sonra inkübasyon matrisi aspire. </li><li> 200 ul pipet ile eski plaka hafif bir kazıma ile kolonilerin parçasını çıkarın ve dikkatli bir şekilde matris kaplı plaka taze kombine ortam 1, 3 ml içine koyun. 37 ° C,% 5 CO2 ile nemlendirilmiş kuluçka makinesi içinde bir gece boyunca inkübe edin. Değişim Medya 48 saat Pasajlanması sonra. </li><li> Ticari DNA ekstraksiyon kitleri kullanılarak,% 80&#39;den fazla confluency, eksize-sonrası ve besleyici içermeyen dönüştürülen hiPSCs genomik DNA ayıklayın. </li><li> STEMCCA lentivirüs eksojen entegrasyon için özel primerler ile birlikte uygun bir eksizyon için Analiz: gDNA-Hendo-MycS ileri, 5&#39;-acgagcacaagctcacctct-3 &#39;; gDNA-hWPRE-ters, 5&#39;-tcagcaaacacagtgcacacc-3 &#39;. 10-uM stok solüsyonu PCR-dereceli su ile Liyofilize primerler sulandırın. </li><li> Aşağıdaki beş aşamalı protokol ile bir PCR çalıştırın: ilk denatürasyon 3 dakika boyunca 95 ° C&#39;de; 15 saniye için 72 ° C &#39;de 15 saniye ve uzatılması için 62 ° C&#39;de 20 saniye, primer tavlama için 98 ° C&#39; de denatürasyon, aşağıdaki her bir 35 döngü 3 dakika boyunca 72 ° C &#39;de, tek bir döngü son uzatma eklenmiştir. </li><li> Agaroz 1.5 gram tartılması ve 50 mi 1 x Tris-asetat-EDTA tampon içine yerleştirerek bir% 3 agaroz jel olun. Agaroz kadar Mikrodalga çözülmüş ve DNA jel leke olarak yer p de olduğuroper seyreltme, karıştırma, ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca katılaşmaya jel kasetine doğru hacminin dağıtımı. </li><li> PCR ürününün yüklenebilir 12 ul% 3 agaroz jel içine yükleme boyası 3 ul ile karıştırılır. 80 V de 30 dakika boyunca jel başlat </li><li> Uygun eksizyon gösteren bir grubun olmaması için ultraviyole ışık ile gözünüzde canlandırın. </li></ol> Öncesi ve Sonrası-kesilmiş hiPSCs gelen Kantitatif PCR kullanarak Gen İfadesi Farklar 3. kantitasyonu <ol><li> Ticari RNA ekstraksiyon kitleri kullanılarak kesilmiştir-sonrası ve besleyici içermeyen dönüştürülen hiPSCs toplam RNA ayıklayın. </li><li> -Ters uyarlamak üreticinin talimatlarına uygun olarak ticari kitler kullanılarak toplam RNA 1 ug kadar. Demirli-oligo (dT) 18 ve rasgele heksamer primer kullanın. NOT: PCR protokolü 4 kb daha fazla veya daha az gen transkriptleri için özel olduğundan emin olun. Spesifik primerler hangisi gen STEMCCA başlangıçta entegre i için yapılan gerekecektirnGoogle&#39;a. </li><li> 20 mcM stok solüsyonu PCR-dereceli su ile liyofilize astar sulandırın. </li><li> 10 mcM UPL prob oluşan reaksiyon 20 ul, 2x LightCycler 480 Problar Lisans başına numune 5 ng kullanın ve ileri 20 uM ve geri primerler. </li></ol> GMP dereceli Koşullar içine 4. Dönüşüm <ol><li> GMP dereceli koşullarına üzerinde post-eksize hiPSCs geçiş ilk gününde, kombine insan PSC oluşan medya karışımı yapmak ortam 1 (kombine medya 1) ve klinik notu iyi üretim uygulamaları (GMP) uyumlu medya (kombine medya 2 ) 80:20 oranında. </li><li> Aspire eski kombine medya 1 ve 80:20 oranında yeni kombine medya 1 ve 2, önceden ısıtılmış 3 ml, koyun kapalı. Bu özel oran ile 3 gün boyunca günde ortamı değiştirin. Lütfen 37 ° C,% 5 CO2 inkübatör içine yerleştirin hücreleri. </li><li> 4. günde, 50:50 oranında bir araya ortamı 1 ve 2 olun. Eski orta ve Replac kapalı aspire50:50 oranında bir araya ortam 1 ve 2 ile önceden ısıtılmış ortam, e. Bu özel oran ile 3 gün boyunca medya değiştirin. Lütfen 37 ° C,% 5 CO2 inkübatör içine yerleştirin hücreleri. </li><li> 7. günde, bir 20:80 oranında bir araya ortamı 1 ve 2 olun. Aspire eski orta kapalı ve 20:80 oranında kombine medya 1 ve 2 ile, önceden ısıtılmış medya ile değiştirin. Bu özel oran ile 3 gün boyunca medya değiştirin. Lütfen 37 ° C,% 5 CO2 inkübatör içine yerleştirin hücreleri. </li><li> 100 oranında: günde 10, bir 0 kombine Ortam 1 ve 2 yapmak. Aspire eski orta kapalı ve 0 kombine medya 1 ve 2 ile, önceden ısıtılmış medya ile değiştirin: 100 oranında. Bu özel bir oranda her gün medya değiştirin. Hücreler, tam olarak tanımlanmış kseno-içermeyen ortam artık. Lütfen 37 ° C,% 5 CO2 inkübatör içine yerleştirin hücreleri. Not: Bu, tüm dönüştürme işlemi sırasında bir 18 gauge iğne ile rutin pasajı uygun koloni büyüklüğü ve yoğunluğu sağlamak için gereklidir. S Planıkoloni boyutu akma ve farklılaşma olarak her 4-5 gün hücreler assaging. </li><li> Üretici tarafından tavsiye edildiği gibi tanımlanmış bir kseno-serbest alt-tabaka ile, altı gözlü bir plakanın üzerindeki çukurların kaplayın on. </li><li> Mekanik geçit konfluent iyi, zaten 18-gauge iğne ile altı-kuyu plaka, kseno ücretsiz medya koşullarını dönüştürülür. Önemlisi, medya pre-condition için pasaj önce, 1 saat 1x ROCK inhibitörü olan hücreler üzerinde yeni medya (kombine medya 2) yerleştirin. </li><li> Hücreler transfer ediliyor, yeni plaka kapalı sentetik substrat solüsyonu aspire. Eski plaka kök hücre kümeleri içeren tüm ortamları çıkarın ve yeni plaka transfer. </li><li> (Kez inkübatör içinde, doğrudan herhangi bir şekilde dokunulmaz olan ideal plakaları) geri az fiziksel rahatsızlık ile 2 gün boyunca 37 ° C,% 5 CO 2 kuvöz içine yerleştirin hücreleri maksimum eki izin vermek. NOT: Hücreler günlük medya değişiklikleri gerektirir. Sürekli passaging her 4 günde önemli olacaktır. 21-gauge iğne, optimum ESC-benzeri morfolojisi (yüksek Nükleositoplazmik oranı) ile kolonilerin geçişi yalnızca parçalarını kullanarak. Bu iyi büyür ve sonunda homojen koloniler verecek uygun hiPSC koloniler için seçimi sağlayacaktır. Kolonilerin gibi ESC derivasyon genel zaman ilk kombine medya değişiminden sonra 15-20 gün arasındadır. </li><li> 18-gauge iğne ile ilk çapraz-hatch ile kolonilerin tüm GMP dereceli sonrası eksize hiPSCs aşağı dondurun. 200 ul pipet kullanılarak atık tüm parçaları kaldırın ve 4 ° C&#39;de 5 dakika süreyle 200 x g&#39;de 15 ml konik bir şişe ve santrifüj hücreleri ihtiva eden tüm medya aktarın. </li><li> Hücreler santrifüje tabi olsa da, soğuk kombine ortam 2 eşit hacimlerde oluşan ve% 7.5 nihai bir DMSO konsantrasyonu ile orta donması dondurma ortamı olun. </li><li> Hücreler pelet sonra, eski orta aspire ve dondurma medya ile pelet yeniden askıya-damla damla. Hemen trdonma şişelere ansfer ve ° C derin dondurucuda bir -80 koydu. </li></ol> 5. karakterizasyon GMP dereceli Post-eksize hiPSCs <ol><li> 3. adımda qPCR yöntemleri de belirtildiği gibi takip anahtar Pluripotency belirteçlerinin (Sox2 Oct4 ve Nanog) aynı adımları Tablo 1&#39;de listelenen primerler kullanılarak ifadesinin miktarını belirlemek için, QPCR kullanarak Pluripotency belirteçlerinin sonrası dönüşüm uygun bir ifade sağlamak için Aşama 3 &#39;de gösterildiği gibi, aynı adım. </li><li> Kullanımlar, daha önce 10 yayınlanan kitte yer alan standart koşullara uygun olarak, insan olmayan bir sialik asit Neu5Gc (N -glycolylneuraminic asit) tespit etmek için akış sitometrisi. </li><li> Yavaşça 1x Fosfat tamponlu serum fizyolojik (PBS) kullanarak, hücrelerin bulunduğu hücre kültürü plakaları yıkayın. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1x ayrışma ajanı kullanılarak koloni ayrıştırmaları. </li><li> Aşama 5.4, 5-dakikalık inkübasyon süresi esnasında verilen engelleme çözeltisi (hazırlamakbuz soğukluğunda PBS içinde bloke edici madde, bir% 0.5 yaparak Kit) birleştirildi. </li><li> Flow sitometri analizi için tüplerin aşağıdaki kümesi Etiket: lekesiz; 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) DAPI; Kontrol antikoru 1: 200; Birincil antikor, 1: 200; İkincil antikor, 1: 200 Eşek anti-tavşan IgG&#39;si (H + L); Örnek MEF&#39;ler; Matris üzerinde örnek sonrası eksize hücreler; ve Numune sentetik alt tabaka üzerine hücreleri sonrası çıkarıldı. </li><li> Yavaşça, 15 ml konik bir tüp çözeltisi ve aktarma içeriği bloke 2 ml ilave adım 5.4 hücre agregatları neden olacaktır. 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 80 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Adım 5.7 belirtildiği gibi çözüm ve santrifüj engelleme ile iki kez hücreleri yıkayın. </li><li> Yavaşça her bir antikorun uygun seyrelme hacmi ile bloke etme çözeltisi 100 ul, yaklaşık 1 x 10 6 hücre yeniden askıya. Yumuşak, 1 saat boyunca 4 ° C&#39;de sallanarak inkübe edin. </li><li> Adım 5.8 gibi yıkar üç kez tekrarlayın. </li><li> Seyreltici Bu yüklenmiştir 400 ul hücre pelletini yeniden askıyaffer 1 ile (kit): tüpler 2, 6, 7 için DAPI 100 ve 8 adımda 5.6 altında listelenen. </li><li> 40 mcM süzgecinden Gerinim hücreleri ve akış sitometresinin koşuyoruz. </li></ol>

<ol><li>Sommer, C. A., Mostoslavsky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolving+field+of+induced+pluripotency%3A+Recent+progress+and+future+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">The evolving field of induced pluripotency: Recent progress and future challenges.</a> J Cell Physiol. 228, 267-275 (2013).</li>
<li>Lu, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+defined+xeno-free+and+feeder-free+culture+system+for+the+derivation%2C+expansion+and+direct+differentiation+of+transgene-free+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A defined xeno-free and feeder-free culture system for the derivation, expansion and direct differentiation of transgene-free patient-specific induced pluripotent stem cells.</a> Biomaterials. 35, 2816-2826 (2014).</li>
<li>Karumbayaram, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+skin+biopsy+to+neurons+through+a+pluripotent+intermediate+under+Good+Manufacturing+Practice+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">From skin biopsy to neurons through a pluripotent intermediate under Good Manufacturing Practice protocols.</a> Stem Cells Transl Med. 1, 36-43 (2012).</li>
<li>Mostoslavsky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+the+magic+act+of+generating+induced+pluripotent+stem+cells%3A+many+rabbits+in+the+hat%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: the magic act of generating induced pluripotent stem cells: many rabbits in the hat.</a> Stem Cells. 30, 28-32 (2012).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Sommer, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+generation+using+a+single+lentiviral+stem+cell+cassette%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette.</a> Stem Cells. 27, 543-549 (2009).</li>
<li>Somers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+transgene-free+lung+disease-specific+human+induced+pluripotent+stem+cells+using+a+single+excisable+lentiviral+stem+cell+cassette%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Generation of transgene-free lung disease-specific human induced pluripotent stem cells using a single excisable lentiviral stem cell cassette.</a> Stem Cells. 28, 1728-1740 (2010).</li>
<li>Sommer, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excision+of+reprogramming+transgenes+improves+the+differentiation+potential+of+iPS+cells+generated+with+a+single+excisable+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Excision of reprogramming transgenes improves the differentiation potential of iPS cells generated with a single excisable vector.</a> Stem Cells. 28, 64-74 (2010).</li>
<li>Papapetrou, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+safe+harbors+permit+high+beta-globin+transgene+expression+in+thalassemia+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Genomic safe harbors permit high beta-globin transgene expression in thalassemia induced pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 29, 73-78 (2011).</li>
<li>Awe, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+characterization+of+transgene-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+and+conversion+to+putative+clinical-grade+status%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Generation and characterization of transgene-free human induced pluripotent stem cells and conversion to putative clinical-grade status.</a> Stem Cell Res Ther. 4, (2013).</li>
<li>Receives FDA Clearance to Begin World's First Human Clinical Trial of Embryonic Stem Cell-Based Therapy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Geron+Corporation+Press+Release%22">Geron Corporation Press Release</a>. , Geron. (2009).</li>
<li>Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+mouse+embryonic+fibroblast+cells+suitable+for+culturing+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> J Vis Exp. 64, 3810-383791 (2012).</li>
<li>Mitani, K., Kubo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+as+an+integrating+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Adenovirus as an integrating vector.</a> Curr Gene Ther. 2, 135-144 (2002).</li>
<li>Patterson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+nature+of+human+pluripotent+stem+cell+progeny%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Defining the nature of human pluripotent stem cell progeny.</a> Cell Res. 22, 178-193 (2012).</li>
<li>Schroder, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+integration+in+the+human+genome+favors+active+genes+and+local+hotspots%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots.</a> Cell. 110, 521-529 (2002).</li>
<li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+human+pluripotent+cells+using+TALE+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases.</a> Nat Biotechnol. 29, 731-734 (2011).</li>
</ol>

James A. Byrne (JAB) ve Agustin Vega-Crespo, Fibrocell Science, Inc.'den araştırma fonu alıyor. JAB, Fibrocell Science, Inc.'in bilimsel danışmanıdır. Başka hiçbir yazarın açıklayacak herhangi bir rakip çıkarı yoktur.

Biz faktör ücretsiz hiPSCs kaynaklanan ve gelecekteki insan tedavide mansap hücre farklılaşması için GMP dereceli koşulları içine bu hücrelerin dönüştürerek onları klinik açıdan yapma bir metodoloji açıklar. Bu protokol, hücre tiplerinde çeşitli geniş çapta uygulanabilir olsa da, bağlı hastadan çıkarma kolaylığı ve kişiye özel insan terapötiklere uygulanabilirlikleri, insan dermal fibroblastları yeniden programlamak seçtik. Sınırlamalar klinik açıdan anlamlı hücre türevleri içine tam farklılaşma kadarıyla giderildiği so...

Yetişkin insan hücrelerinin, dört temel transkripsiyon faktörünün4,5 lentiviral temelli ekspresyonunun bir sonucu olarak epigenetik yeniden şekillenme ve yeniden programlama geçirebildiği gösterilmiştir. Yeniden programlama alanındaki önemli bir gelişme, protein ekspresyonunun6'nın kesin bir stokiyometrik oranına izin veren dört yeniden programlama transkripsiyon faktörünün tümünü barındıran tek bir eksize edilebilir lentiviral kök hücre kasetinin (STEMCCA) kullanılmasıydı. Ek olarak, belirli çok sayıda enfeksiyon aralığında transdüksiyon yapıldığında, STEMCCA yeniden programlama işlemi sırasında ağırlıklı olarak tek genomik entegrasyon olaylarına yol açabilir7. Cre / loxP teknolojisini kullanan STEMCCA'nın eksize edilebilir bir versiyonunun piyasaya sürülmesi ve ardından kök hücre hattının türetilmesinden sonra yeniden programlama vektörünün çıkarılması, faktörsüz insan kaynaklı pluripotent kök hücre (hiPSC) hatlarının türetilmesini sağladı8. Ek olarak, hiPSC'lerin terapötik uygulamalarını geliştirmek için, kseno içeren koşullardan kseno içermeyen koşullara kadar iyi üretim uygulamaları (GMP) dereceli hücre hattı dönüşümü için yeni, hızlı ve kolayca uygulanabilir bir metodolojinin uygulanması gerekiyordu. Burada, özellikle bir introna entegre edildiğinde, entegre gen ekspresyonu farklılıklarını ve varsayılan GMP koşullarına klinik dereceli hücre dönüşümünü daha kesin bir şekilde değerlendiren ilgili bir metodolojiyi tartışıyoruz. 
Önceki araştırmalar, STEMCCA transdüksiyonundan sonra entegre genlerdeki gen ekspresyon farklılıklarını analiz etmek için yalnızca nispeten duyarsız mikrodizi transkripsiyonel analiz kullanmıştır3,9. Burada, entegre gen ekspresyonu farklılıklarını daha fazla incelemek için hassas kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) analizi metodolojisini tanıtıyoruz. Daha da önemlisi, mevcut güvenli liman kriterleri, viral entegrasyonlara sahip genlere sahip hiPSC'leri atmakta, böylece bu hücrelerin alt insan hücresel terapötikleri için uygulanabilirliğini sınırlamaktadır9. Mevcut durumun, tamamen karakterize edilmiş ve transgen içermeyen, tronik olarak yeniden programlanmış hiPSC'lerin kullanılmasıyla değişebileceğini öneriyoruz. Ek olarak, orijinal olarak kseno içeren koşullar10 altında türetilen çeşitli farklı hücre tiplerine kolayca uygulanabilen sağlam bir GMP dereceli hücre dönüştürme protokolü sunuyoruz. Bu, insan terapötik alaka düzeyini korumak için klinik dereceli koşullar gerektiren gelecekteki hücre yeniden programlama deneylerinin geliştirilmesi için önemli fırsatlar sağlar. 
Bu metodolojiler, mevcut güvenli liman kriterlerinin, entegre introndan STEMCCA eksizyonu sonrası normal bir gen ekspresyon profilini koruyan karakterize edilmiş STEMCCA yeniden programlanmış hiPSC hatlarını içerecek şekilde genişletilebileceği bir temel sağlar. Ayrıca, insan dışı hayvan antijenlerinden arınmış klinik dereceli koşullara tam dönüşüm, daha önce yeniden programlanmış ve yalnızca kseno içeren koşullarda karakterize edilmiş daha birçok hücre tipinin dahil edilmesine yardımcı olacaktır. Bu metodolojiler bir araya getirildiğinde, ABD Gıda ve İlaç Dairesi'nin (FDA) sınırlı onaylarını insan embriyonik kök hücre (ESC) bazlı terapötiklerden hiPSC bazlı terapötiklere genişletmeyi düşünmesi için ikna edici gerekçelerdir11. 
Son zamanlarda, tamamen karakterize edilmiş ve varsayılan klinik dereceli koşullara10 dönüştürülen faktörsüz bir hiPSC çizgisinin türetilmesini detaylandırdık. Burada, STEMCCA lentivirüsünü kullanarak hiPSC türetme protokolünü detaylandırıyoruz. Bu kök hücreler daha sonra bir eksizyon işlemine ve ardından gen ekspresyonu karakterizasyonuna tabi tutulur. Son olarak, hiPSC'ler yavaş bir dönüştürme metodolojisi ile GMP sınıfı koşullara dönüştürülür.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Media and reagents</td></tr><tr><td>DMEM/F12 (bazal media)</td><td>Invitrogen (Carlsbad, CA, ABD)</td><td>11330057</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Invitrogen</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>Minimum esansiyel ortam (MEM) esansiyel olmayan amino asitler (NEAA), 100x</td><td>Invitrogen</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax, 100x</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep, penisilin-streptomisin, 100x</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>4 ° C'de çözülme; C, aliquot ve &eksi olarak saklayın; 20 derece > C</td></tr><tr><td>Nakavt serum replasmanı</td><td>Invitrogen</td><td>10828028</td><td>4 ° C'de çözülür; C, aliquot ve &eksi olarak saklayın; 20 derece > C</td></tr><tr><td>Tripsin / EDTA,% 0.5</td> <td>İnvitrojen</td><td>15400-054</td><td>1x PBS'de% 0.05'e kadar seyreltin</td></tr><tr><td>Stok Temel fibroblast büyüme faktörü</td><td>GlobalStem (Rockville, MD, ABD)</td> <td>GSR-2001</td><td>10 & mikroya yeniden oluşturun; % 0.1 sığır serum albümininde g / ml stoğu, 1x PBS'de çözülür ve & eksi'de saklanır; 80 derece > C</td></tr><tr><td>&beta;-merkaptoetanol</td><td>Millipore (Billerica, MA, ABD)</td> <td>ES-007-E</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel (bazal membran matrisi)</td> <td>BD Biosciences (San Jose, CA, ABD)</td><td>356231</td><td>Stok Matrigel şişesini 10: 12 seyreltme için buz üzerindeyken 2 ml DMEM / F2 ile seyreltin. Aliquot ve &eksi mağaza; 20 derece >C.</td></tr><tr><td>CELLstart (Sentetik Substrat)</td><td>Invitrogen</td><td>A1014201</td><td></td></tr><tr><td>Stemmolecule Y27632</td><td>Stemgent (Cambridge, MA, ABD)</td><td>04-0012-02</td><td></td></tr><tr><td>Puromisin</td><td>Invitrogen</td><td>A1113802</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 Probları Master</td><td>Roche (Basel, İsviçre)</td><td>4707494001</td><td></td></tr><tr><td>ProFreeze-CDM Orta/dondurucu ortam</td><td>Lonza (Basel, İsviçre)</td><td>12-769E</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, ABD)</td> <td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>100 BP DNA Merdiven</td><td>İnvitrojen</td><td>15628019</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Güvenli DNA Jel Lekesi 10.000x</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA, ABD)</td><td>161-3101</td><td></td></tr><tr><td>Domuz derisinden elde edilen jelatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890-100G</td><td>PBS'de% 0,2 oranında stok yapın, otoklavlayın ve oda sıcaklığında saklayın.</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>Kök Hücre Teknolojileri (Vancouver, BC, Kanada)</td> <td>5850</td><td>Ek 5x'i temel ortam, alikot ile birleştirin ve 4 ° C'de saklayın; 2 haftaya kadar C.</td></tr><tr><td>Stemedia NutriStem XF/FF Kültür Orta</td><td>Stemgent</td><td>05-100-1A</td><td>4 ° C'de Çözülme; C O/N, alikot ve 4 &°C'de saklayın; 2 haftaya kadar C.</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen (San Diego, CA, ABD)</td><td>ant-pm-1</td><td></td></tr><tr><td>Aktataz (Dissosiyasyon Reaktifi)</td><td>Invitrogen</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>Eşek anti-Tavuk IgG AlexaFluor 488</td><td>Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, ABD)</td><td>703-546-155</td><td></td></tr><tr><td>Polibren / transfeksiyon ajanı</td><td>Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Plasticware</ güçlü</td></tr><tr><td>>12 kuyulu plakalar</td><td>VWR (West Chester, PA, ABD)</td><td>29442-038</td><td></td></tr><tr><td>6 oyuklu plakalar</td><td>VWR</td><td>29442-042</td><td></td></tr><tr><td>10 cm plakalar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z688819</td><td></td></tr><tr><td>18 gauge iğne</td><td>Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, ABD)</td><td>148265D</td><td></td></tr><tr><td>21 ayar iğne</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-829-10D</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>BD LSRII Akış Sitometresi</td><td>KSystem by Nikon (Tokyo, Japonya)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva Sürüm 6.1.3 Yazılım</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Kits</td></tr><tr><td>PureLink Genomik DNA Mini Kiti</td><td>Invitrogen</td><td>K182000</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HiFi Hotstart ReadyMix PCR Kiti</td><td>KAPA Biosystems (Wilmington, MA, ABD)</td><td>KK2601</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek Saf RNA İzolasyon Kiti</td><td>Roche</td><td>11828665001</td><td></td></tr><tr><td>Transkriptör İlk İplikli cDNA Sentez Kiti</td><td>Roche</td><td>4379012001</td><td></td></tr><tr><td>Sialix anti-Neu5Gc Temel Paket Kiti</td><td>Sialix (Newton, MA, ABD)</td><td>Temel Paket</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Media</td></tr><tr><td>Birleşik medya 1</td><td>Kök Hücre Teknolojileri ve Stemgent</td><td></td>, <td>mTeSR1 ve Nutristem</td></tr><tr><td>Combined media 2</td><td>StemCell Technologies'in eşit parçalarından oluşur ve Stemgent</td><td></td>, <td>TeSR2 ve Nutristem</td></tr><tr><td>HUF Media</td><td></td><td></td><td>Dulbecco'nun eşit parçalarından oluşur s değiştirilmiş Kartal' % 10 fetal sığır serumu, 1x esansiyel olmayan amino asit, 1x Glutamax ve 1x Primocin</td></tr><tr><td>İnsan Pluripotent Kök Hücre Ortamı</td><td></td><td></td><td>DMEM / F12 ile desteklenmiş s orta / F12 % 20 nakavt serum replasmanı, 1x Glutamax, 1x esansiyel olmayan amino asitler, 1x Primosin, 1x beta; - merkaptoetanol ve 10 ng / ml bazik fibroblast büyüme faktörü</td></tr>.<tr><td colspan="4">DMEM/F12, Dulbecco' s değiştirilmiş Kartal' s orta/F12; PBS, fosfat tamponlu tuzlu su.</td></tr></tbody></table>

türetilmesi ve karakterizasyonu bir transgen ücretsiz İnsan kaynaklı pluripotent tanımlı klinik dereceli koşullar içine hücre hattı ve dönüşüm kök

Derivation and Characterization of a Transgene-free Human Induced Pluripotent Stem Cell Line and Conversion into Defined Clinical-grade Conditions

İnsan uyarılmış pluripotent kök hücreler (hiPSCs) lentiviral bazlı yeniden programlama yöntemleri ile üretilebilir. Bununla birlikte, genomun aktif transkribe bölgelerde kalan potansiyel onkojenik genlerin izleri, insanlar için terapötik uygulamalar 1 kullanım için potansiyelini sınırlamaktadır. Buna ek olarak, tedavi edici olarak uygun türevleri olarak, kök hücre yeniden programlanması ya da farklılaşma elde edilen insan olmayan antijenleri, insan klinik bağlamda 2&#39;de kullanılan bu hiPSCs engellemektedir. Bu videoda, biz yeniden programlanması ve eksojen transjenlerin ücretsiz faktör ücretsiz hiPSCs analiz etmek için bir prosedür sunuyoruz. Bu hiPSCs sonra lentivirüs ihtiva eden özel bir intron gen sentezleme anormallikleri analiz edilebilir. Bu analiz, önceden gen ekspresyonu farklılıklarını 3 tespit etmek için kullanılan daha hassas teknikler üzerinde bir avantaja sahiptir hassas bir kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) kullanılarak gerçekleştirilebilir. Içine tam dönüşümKlinik dereceli iyi üretim uygulamaları (GMP) koşullar, insan klinik önemi veriyor. Bizim protokol sunan başka bir metodoloji sağlanan akım güvenli liman kriterleri genişletmek ve insan terapötik uygulamalar-nedeniyle insan olmayan antijenlere karşı herhangi bir immünojenisite riskini ortadan kaldırmak gerekir GMP dereceli hiPSCs, türetmek için faktör içermeyen karakterize hiPSC-tabanlı türevlerini içerir ki. Bu protokol, her tür lentiviral yeniden programlanması hücrelerin geniş çapta uygulanabilir GMP dereceli koşullarına programlanması hücreleri dönüştürmek için yeniden üretilebilir bir yöntem sağlar.

Bu STEMCCA Lentiviral bazlı yeniden programlama yaklaşımı kullanarak, klinik sınıf faktörü içermeyen hiPSCs türetmek için bir protokol mevcut. Şekil 1A MEF'ler bir tabakası üzerinde STEMCCA yaklaşımı ile yeniden programlama sonra, üç farklı önceden kesilmiş hiPSC hatları temsili görüntüsünü gösterir. STEMCCA yeniden programlama yaklaşımının temel avantajı, farklı araştırma grupları ve yerlerde, birden fazla bilim adamları tarafından elde tutarlı yeniden programlama başarı yatıyor. Şekil 1B</stro...

Lentiviral temelli, yeniden programlanmış ve karakterize edilmiş, faktörsüz insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin türetilmesi ve varsayılan klinik dereceli koşullara dönüştürülmesi için bir protokol tanımlıyoruz.

Türetilmesi ve Karakterizasyonu bir Transgen ücretsiz İnsan Kaynaklı Pluripotent Tanımlı Klinik dereceli Koşullar içine Hücre Hattı ve Dönüşüm Kök

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) can be generated with lentiviral-based reprogramming methodologies. However, traces of potentially oncogenic ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, lentiviral bazlı yeniden programlanmış faktörsüz insan kaynaklı pluripotent kök hücreleri türetmek ve bu hücreleri varsayılan klinik sınıf koşullara dönüştürmektir. Bu, ilk olarak yetişkin dermal insan fibroblastlarının tek bir ex büyük lentiviral kök hücre kaseti veya kök araba ile HI PSC'lere yeniden programlanmasıyla gerçekleştirilir. Daha sonra, yeniden programlanmış HI PSC'ler, tam eksizyon ve kök arabanın konakçı genomundan çıkarılması için adeno Cree purr virüsüne maruz bırakılır.Daha sonra besleyici serbest HI PSC'lerden genomik DNA ekstraksiyonu ve ardından agel analizi, uygun kök araba eksizyonunu doğrular. Son olarak, faktör üç H IPC'leri, tam olarak tanımlanmış kseno içermeyen koşullara yavaş bir dönüştürme metodolojisi ile varsayılan GMP sınıfı koşullara dönüştürülür. Sonuç olarak, insan yetişkin dermal fibroblastlarının viral temelli yeniden programlanması ve H IPC'lerin klinik sınıf koşullara tam olarak dönüştürülmesi, yetişkin insan hücrelerinin yeniden programlanması ve klinik olarak ilgili koşullara dönüştürülmesi için bu metodolojinin geniş uygulanabilirliğinin altını çizmektedir.Bu tekniğin etkileri, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin klinik uygulamalarına kadar uzanır, çünkü bunlar tamamen faktörsüzdür ve klinik sınıf koşullara dönüştürülür, bu da onları insan terapötikleriyle uyumlu hale getirir. Bu yöntemin görsel gösterimi kritiktir, çünkü faktör üç ve klinik derece insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin çözülmeye başlaması için izlenmesi gereken ana karmaşık ve spesifik prosedürler nedeniyle yeniden programlama, eksizyon ve klinik derece dönüşüm adımlarının öğrenilmesi zordur. Yetişkin dermal insan fibroblastları veya HAF'ler iki dakika boyunca 37 santigrat derece su banyosunda.Şişenin üst kısmını suya batırmamaya dikkat edin. Hücreleri yeniden süspanse etmek ve DMSO'yu damla damla bir şekilde seyreltmek için bir mililitrelik hücre bulamacını 15 mililitrelik bir kronik şişeye yerleştirin. Yavaşça dört mililitre önceden ısıtılmış huff medium ekleyin, menekşeyi 10 dakikalık oda sıcaklığında 200 kez G santrifüjleyin.Sonra sup, nacent ve reus'u aspire edin. Hücreleri mililitrede 100.000 hücreye kadar orta kısımda,% 0.2 jelatin ila altı oyuklu bir plaka prekoluğuna süspanse edin. İki mililitre hücre süspansiyonu ekleyin, ardından bir saniyeye iki mililitre süspansiyon ekleyin.Enfeksiyon veya MOI'nin çokluğunu ölçmek için kullanılmak üzere, hücreleri gece boyunca 37 santigrat derece ve nemlendirilmiş bir odada% 5 karbondioksitte inkübe etmeden önce eşit şekilde dağıtmak için plakayı yan yana ve ileri geri sallayın. 24 saat sonra, hücreleri saydıktan sonra, hücreler iki kez çözülür, sekiz transdüksiyon birimini veya eşdeğer lentiviral konsantrenin S'sini ortalayın ve bir kez 10'a seyreltmek için huff ortamı kullanın mililitre başına sekiz mikrogram transfeksiyon reaktifi ile desteklenmiş yarım ortam kullanılarak mililitre başına sekiz Ts'ye. Hücreleri 10 kat enfeksiyon oranında transdüksiyon yapın.Dönüştürücü kuyucukları eşit şekilde karıştırın ve lentiviral transdüksiyondan yaklaşık 24 saat sonra gece boyunca inkübe edin. Huff ortamını çıkarın ve standart insan pluripotent kök hücre veya PSC ortamı ile değiştirin. Altı günde iki ila altıncı günlerde ortamı günlük olarak iki% 0.2 Jelatin kaplı 10 santimetre tabak plakasına 1.5 ila 1.75 kez 10 kez kompleman bileşen faktörü bir veya CF'den türetilen altı fare embriyonik fibroblastına değiştirin.Yeniden programlanmış fibroblastların altı oyuklu bir plakasının bir kuyucuğuna oda sıcaklığında geziler ekleyin. Hücreleri nazikçe kaldırdı ve taze insan PSC orta plakası ile 100 kez G'yi döndürdü, tüm hücreleri iki adet 10 santimetre CFI meth plakası üzerinde bir ila 16 oranında döndürdü. Agregaları saat yönünde spiral bir hareketle dağıtın ve ortamı değiştirmeden önce yaklaşık 48 saat inkübe edin.Üç ila dört hafta sonra, tipik ESC benzeri morfolojiye sahip sekiz ila 10 ayrı spesifik koloni parçasını seçmek için 21 gauge iğne kullanın ve genişlemeden sonra bunları CFI MFS'nin ayrı kuyularına alt klonlayın. Ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi kök araba entegrasyon bölgesini doğruladıktan sonra embriyo gövdesi oluşumu ve işaretleyici ekspresyon analizi ile hücrelerin pluripotent olduğunu onaylayın. Önce eski insan PSC ortamını toplam üç mililitre standart PSC ortamına aspire ederek tüketim sapı arabası.45 mikrolitre konsantre adeno Cree pur veya mililitre transfeksiyon ajanı başına sekiz mikrogram içeren virüs. Daha sonra hücrelere ekleyin ve inkübasyondan sonra 24 saat inkübe edin, viral supinat aspire edilir, hücreleri iki kez yıkamak için insan PSC ortamını indükler. Daha sonra HPSC ortamını mililitre saf misin başına iki mikrogram ekleyin ve beş gün sonra günlük olarak değiştirin, kalan kolonileri alt klonlayın ve videoda daha önce açıklandığı gibi genişletin.Daha sonra, bir şişe pre Eloqua bazal membran matrisini buz üzerinde çözdürün ve soğuk bazal ortamı bir ila 30 arasında bir nihai konsantrasyona seyreltin. Altı oyuklu bir plakanın istenen sayıda oyuğu kaplamak için oyuk başına bir mililitre kullanın ve plakayı bir saat oda sıcaklığında bekletin. Daha sonra 18 gauge bir iğne kullanarak, daha önce mes ile kaplanmış bir kuyudan en az 20 ila 30 koloniyi çapraz taramadan geçirin.Canlandırıcı mes ve hücrelerin plakadan transferini azaltmaya özen gösterin. Bir saatlik inkübasyondan sonra, matrisi kaplanmış kuyudan 200 mikrolitrelik bir pipetle aspire edin. Kolonilerin parçalarını eski plakadan nazikçe kazıyarak çıkarın ve bunları biri matris kaplı bir plakada olmak üzere üç mililitre yeni birleştirilmiş ortama dikkatlice yerleştirin.48 saat inkübe ettikten sonra, eksize edilen ve besleyiciden arındırılmış dönüştürülmüş HI PSC'ler %80 co akıcılığına ulaştığında ortamı günlük olarak değiştirin. Kök araba lentivirüsünün eksojen entegrasyonları için spesifik olan burada gösterilen primerleri kullanarak genomik DNA'yı çıkarmak için ticari bir DNA ekstraksiyon kiti kullanın. Eksize edilen HI PSC'leri GMP derece koşullarına geçirmek için uygun eksizyon için DNA'yı PCR ile analiz edin.HPSC kombine ortam, bir ve klinik sınıf GMP uyumlu orta veya birleşik orta iki, 80 ila 20 ön ısıtma ila 37 santigrat derece oranında karıştırın. Eski birleşik ortamı hücrelerden aspire edin ve üç mililitre yeni ılık ortam çözeltisi ile değiştirin. Ortamı üç gün boyunca her gün değiştirin, metin protokolüne göre geçin, dördüncü günde uygun koloni boyutunu ve yoğunluğunu korumak için, ortamı 50: 50 ılık kombine ortam karışımı ile değiştirin, bir ve iki üç gün boyunca inkübe edin.Ortamı yedinci günde günlük olarak değiştirerek, sırasıyla bir ve iki ısıtılmış kombine ortamların 20 ila 80 oranına geçin ve üç gün boyunca günlük olarak değiştirin. 10. günde, ılık,% 100 birleşik orta ikiye geçin ve günlük olarak değiştirin. Hücreler artık tamamen tanımlanmış kseno içermeyen ortamdadır.Daha sonra, altı oyuklu bir plakanın bir kuyusunu kaplamak için tanımlanmış bir kseno içermeyen substrat kullandıktan sonra, kseno içermeyen ortamı, bir x kaya içeren taze ortamla bir birleşme hücresi kuyusuyla değiştirin. Bir saat inkübe ettikten sonra, hücreleri mekanik olarak taze hazırlanmış hücrelere dönüştürmek için 18 gauge bir iğne kullanın. Hücreleri metin protokolüne göre karakterize etmeden önce maksimum bağlanmaya izin vermek için hücrelerin iki gün boyunca rahatsız edilmeden kuluçkaya yatırılmasına izin verin.Bu şekil, bir mes tabakası üzerinde kök araba yaklaşımı ile yeniden programlandıktan sonra, önceden eksize edilmiş üç farklı H-I-P-S-C hattının temsili bir resmini göstermektedir, burada gösterilen, eksizyon sonrası ters transkripsiyon PCR jeli, kök arabaya endojen olan belirli bir diziye özgü bir amplikon bandının olmaması ile kanıtlandığı gibi, kök araba lentivirüsünden tamamen arındırılmış belirli bir alt klonu göstermektedir. Bu şekilde, kseno içeren bir matris üzerinde pre-con dönüştürülmüş IPC'ler ve sentetik matris üzerinde tüketim sonrası kseno içermeyen GMP sınıfı H IPC'ler, SOX iki, OCT dört ve nanog dahil olmak üzere standart pluripotens ile ilişkili faktörlerin kantitasyonu gösterilmiştir. QPCR kullanımı burada gösterilmiştir.Son olarak, burada görüldüğü gibi, pre-con dönüştürülmüş ve post dönüştürülmüş HI PSC'ler, insan dışı antijenlerin göstergesi olan sialik asit ve glikol nöronik asit için akış sitometrisi yoluyla test edildi. Bu videoyu izledikten sonra, insan yetişkin dermal fibroblastlarının stemco yeniden programlama virüsü ile nasıl yeniden programlanacağını, virüsün genomdan nasıl çıkarılacağını ve daha sonra bu HI PSC'lerin insan terapötikleriyle tamamen uyumlu klinik sınıf koşullara nasıl dönüştürüleceğini iyi anlamalısınız. Üçüncü nesil bir antiviral vektör olan staca ile çalışmanın son derece tehlikeli ve önlem alabileceğini unutmayın.Bu prosedür uygulanırken böyle uygun bir KKD ve VSL iki artı doku kültürü odası kullanılmalıdır.

derivation-characterization-transgene-free-human-induced-pluripotent

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Genetik modifikasyon alanında son gelişmelere rağmen, insan embriyonik kök hücreleri (hESC) aktarılmasının kaprisli bir süreç olmaya devam etmektedir. Bildiğimiz kadarıyla, insan kaynaklı pluripotent kök hücreler (iPSCs) transfekte etmek için sistematik ve etkili bir yöntem bildirilmemiştir. Burada, biz verimli transfekte ve insan iPSCs nucleofect sağlam protokoller açıklanmaktadır.

İnsan İsteyerek Pluripotent Kök Hücreler transfekte ve Nucleofecting

Biz insan nöronal atalarıdır ve sinir onarımı için gelişmekte olan MSS nöronal hücre tipleri büyük bir arz türetme sağlayan küçük moleküller ile tanımlanan koşullar altında tutulan pluripotent insan embriyonik kök hücreleri doğrudan neuroblasts indüksiyonu için bir protokol kurduk.

Küçük Molekül İndüksiyon Pluripotent İnsan Embriyonik Kök Hücreleri İnsan Nöronal atalarıdır ve Nöronlar Verimli türetilmesi

Biz retroviral Oct3 / 4, Sox2, Klf4 ve c-myc (OSKM) kodlayan vektörler ve canlı boyama ile doğru yeniden programlanması hiPSC belirlenmesi kullanarak insan kaynaklı pluripotent kök hücreler (hiPSC) Tra-içine insan somatik hücre verimli yeniden programlama için bir protokol sunmak 1-81 antikor.

İnsan İsteyerek Pluripotent Kök Hücre seçme ve ayırma Kolonileri Yetişkin Fibroblastlar gelen reprogrammed

Burada tek bir lentiviral yeniden programlanması vektörü kullanılarak periferal kan 3-4 ml insan iPSCs üretimi için basit ve etkili bir protokol göstermektedir. Hazır kan hücrelerinin yeniden programlanması daha geniş bir araştırma toplum için erişilebilir kılarak IPSC teknoloji kullanımı hızlandırmak için vaat ediyor.

STEMCCA lentiviral Vektör Kullanma Çevresel Blood İnsan İsteyerek Pluripotent Kök Hücre Üretimi

Burada, biz tutarlı sonuç ve geliştirilmiş verimlilik gösterir Sendai virüs ile transgen-özgür insan iPSCs içine insan somatik hücreleri yeniden programlamak için kurulan yöntem sunuyoruz.

Sendai-virüs ile İnsan Somatik Verimli Üretimi İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin

Uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi otolog nakli türetilmesi için ilginç umutları sağlar. Ancak, pluripotent devlet ve zahmetli yeniden farklılaşma yoluyla ilerleme hala klinik çeviri engellemektedir. Burada erişkin insan fibroblast türetme ve uyarılmış nöral progenitör hücrelerin içine doğrudan dönüşüm ve nöral soy içine sonradan farklılaşmayı açıklar.

Yetişkin İnsan Fibroblastları türetilmesi ve Genişletilebilir Sinir Progenitör Hücreler içine Doğrudan Dönüşüm

Bu protokol, yeniden programlama faktörleri içeren matrigel ve Sendai virüs vektörlerinin bir kombinasyonunu kullanarak, besleyicisiz koşullarda insan periferik T hücrelerinden indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin (iPSC'ler) nasıl üretileceğini açıklar.

Besleyici içermeyen şartlar Sendai virüs kullanılarak insan periferik T hücrelerinden uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

İndüklenmiş pluripotent kök hücrelerin (iPSC'ler) pluripotent durumlarının korunmasını belirlemek için düzenli karakterizasyonu, bu hücrelerin diğer uygulamalar için kullanılmadan önce önemli bir adımdır. Burada, immünositokimya yoluyla kolay ve rutin karakterizasyonlarını sağlamak için özel olarak tasarlanmış insan iPSC'lerinin küçük ölçekli yayılımı için bir yöntem açıklıyoruz.

Rutin İmmünositokimyasal Karakterizasyonu için serum serbest şartlar İnsan iPSCs küçük ölçekli Yayılım

Bu iletişim kuralı birincil amniyotik sıvı ve membran Mezenkimal kök hücrelerin içine İndüklenmiş pluripotent kök hücreler tamamen kimyasal olarak tanımlanan koşullarda bir sigara entegre episomal yaklaşım kullanarak yeniden programlama açıklar. Yordamlar, ayıklama, kültür, yeniden programlama ve elde edilen İndüklenmiş pluripotent kök hücreler sıkı yöntemlerle karakterizasyonu ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Birincil amniyotik sıvı ve membran hücreler Pluripotent Xeno-Alerjik koşullarında için yeniden programlama

İnsan kaynaklı pluripotent stem (hiPS) hücrelerinin sağlam türetilmesi, entegre edilmeyen Sendai virüsü (SeV) vektörü aracılığıyla dermal fibroblastların yeniden programlanması kullanılarak gerçekleştirilmiştir. HiPS hücre bakımı ve klonal genişleme, rekombinant insan lamınin 521 (LN-521) matrisi ve Esansiyel E8 (E8) Ortamı ile kseno içermeyen ve kimyasal olarak tanımlanmış kültür koşulları kullanılarak gerçekleştirildi.

Laminin 521 Matrisini Kullanarak İnsan Tarafından Oluşturulan Pluripotent Kök Hücrelerin Entegrasyon Serbest Türevi

Burada, bir besleyici ve Xeno-ücretsiz durumda insan pluripotent kök hücrelerinden hemogenik endotelyum tam olarak oluşturmak için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem hastalık modelleme ve terapötik bileşikler için tarama geniş uygulamalara sahip olacaktır.

Bir besleyici içinde ınsan pluripotent kök hücrelerinden hemogenik endotelyum farklılaşma-ve Xeno-ücretsiz tanımlı koşul

Keşfedin yetişkin dermal fibroblastları lentiviral yöntemle yeniden programlayarak faktör içermeyen hiPSC'ler elde etme ve bunları klinik kullanıma uygun GMP koşullarına dönüştürme yöntemini.

Türetilmesi ve Karakterizasyonu bir Transgen ücretsiz İnsan Kaynaklı Pluripotent Tanımlı Klinik dereceli Koşullar içine Hücre Hattı ve Dönüşüm Kök (Video) | JoVE Journal

Türetilmesi ve Karakterizasyonu bir Transgen ücretsiz İnsan Kaynaklı Pluripotent Tanımlı Klinik dereceli Koşullar içine Hücre Hattı ve Dönüşüm Kök

Daha fazla video keşfet