Türetilmesi ve Karakterizasyonu bir Transgen ücretsiz İnsan Kaynaklı Pluripotent Tanımlı Klinik dereceli Koşullar içine Hücre Hattı ve Dönüşüm Kök

Aşağıdaki deneyin genel amacı, lentiviral bazlı yeniden programlanmış faktörsüz insan kaynaklı pluripotent kök hücreleri türetmek ve bu hücreleri varsayılan klinik sınıf koşullara dönüştürmektir. Bu, ilk olarak yetişkin dermal insan fibroblastlarının tek bir ex büyük lentiviral kök hücre kaseti veya kök araba ile HI PSC'lere yeniden programlanmasıyla gerçekleştirilir. Daha sonra, yeniden programlanmış HI PSC'ler, tam eksizyon ve kök arabanın konakçı genomundan çıkarılması için adeno Cree purr virüsüne maruz bırakılır.

Daha sonra besleyici serbest HI PSC'lerden genomik DNA ekstraksiyonu ve ardından agel analizi, uygun kök araba eksizyonunu doğrular. Son olarak, faktör üç H IPC'leri, tam olarak tanımlanmış kseno içermeyen koşullara yavaş bir dönüştürme metodolojisi ile varsayılan GMP sınıfı koşullara dönüştürülür. Sonuç olarak, insan yetişkin dermal fibroblastlarının viral temelli yeniden programlanması ve H IPC'lerin klinik sınıf koşullara tam olarak dönüştürülmesi, yetişkin insan hücrelerinin yeniden programlanması ve klinik olarak ilgili koşullara dönüştürülmesi için bu metodolojinin geniş uygulanabilirliğinin altını çizmektedir.

Bu tekniğin etkileri, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin klinik uygulamalarına kadar uzanır, çünkü bunlar tamamen faktörsüzdür ve klinik sınıf koşullara dönüştürülür, bu da onları insan terapötikleriyle uyumlu hale getirir. Bu yöntemin görsel gösterimi kritiktir, çünkü faktör üç ve klinik derece insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin çözülmeye başlaması için izlenmesi gereken ana karmaşık ve spesifik prosedürler nedeniyle yeniden programlama, eksizyon ve klinik derece dönüşüm adımlarının öğrenilmesi zordur. Yetişkin dermal insan fibroblastları veya HAF'ler iki dakika boyunca 37 santigrat derece su banyosunda.

Şişenin üst kısmını suya batırmamaya dikkat edin. Hücreleri yeniden süspanse etmek ve DMSO'yu damla damla bir şekilde seyreltmek için bir mililitrelik hücre bulamacını 15 mililitrelik bir kronik şişeye yerleştirin. Yavaşça dört mililitre önceden ısıtılmış huff medium ekleyin, menekşeyi 10 dakikalık oda sıcaklığında 200 kez G santrifüjleyin.

Sonra sup, nacent ve reus'u aspire edin. Hücreleri mililitrede 100.000 hücreye kadar orta kısımda,% 0.2 jelatin ila altı oyuklu bir plaka prekoluğuna süspanse edin. İki mililitre hücre süspansiyonu ekleyin, ardından bir saniyeye iki mililitre süspansiyon ekleyin.

Enfeksiyon veya MOI'nin çokluğunu ölçmek için kullanılmak üzere, hücreleri gece boyunca 37 santigrat derece ve nemlendirilmiş bir odada% 5 karbondioksitte inkübe etmeden önce eşit şekilde dağıtmak için plakayı yan yana ve ileri geri sallayın. 24 saat sonra, hücreleri saydıktan sonra, hücreler iki kez çözülür, sekiz transdüksiyon birimini veya eşdeğer lentiviral konsantrenin S'sini ortalayın ve bir kez 10'a seyreltmek için huff ortamı kullanın mililitre başına sekiz mikrogram transfeksiyon reaktifi ile desteklenmiş yarım ortam kullanılarak mililitre başına sekiz Ts'ye. Hücreleri 10 kat enfeksiyon oranında transdüksiyon yapın.

Dönüştürücü kuyucukları eşit şekilde karıştırın ve lentiviral transdüksiyondan yaklaşık 24 saat sonra gece boyunca inkübe edin. Huff ortamını çıkarın ve standart insan pluripotent kök hücre veya PSC ortamı ile değiştirin. Altı günde iki ila altıncı günlerde ortamı günlük olarak iki% 0.2 Jelatin kaplı 10 santimetre tabak plakasına 1.5 ila 1.75 kez 10 kez kompleman bileşen faktörü bir veya CF'den türetilen altı fare embriyonik fibroblastına

Yeniden programlanmış fibroblastların altı oyuklu bir plakasının bir kuyucuğuna oda sıcaklığında geziler ekleyin. Hücreleri nazikçe kaldırdı ve taze insan PSC orta plakası ile 100 kez G'yi döndürdü, tüm hücreleri iki adet 10 santimetre CFI meth plakası üzerinde bir ila 16 oranında döndürdü. Agregaları saat yönünde spiral bir hareketle dağıtın ve ortamı değiştirmeden önce yaklaşık 48 saat inkübe edin.

Üç ila dört hafta sonra, tipik ESC benzeri morfolojiye sahip sekiz ila 10 ayrı spesifik koloni parçasını seçmek için 21 gauge iğne kullanın ve genişlemeden sonra bunları CFI MFS'nin ayrı kuyularına alt klonlayın. Ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi kök araba entegrasyon bölgesini doğruladıktan sonra embriyo gövdesi oluşumu ve işaretleyici ekspresyon analizi ile hücrelerin pluripotent olduğunu onaylayın. Önce eski insan PSC ortamını toplam üç mililitre standart PSC ortamına aspire ederek tüketim sapı arabası.

45 mikrolitre konsantre adeno Cree pur veya mililitre transfeksiyon ajanı başına sekiz mikrogram içeren virüs. Daha sonra hücrelere ekleyin ve inkübasyondan sonra 24 saat inkübe edin, viral supinat aspire edilir, hücreleri iki kez yıkamak için insan PSC ortamını indükler. Daha sonra HPSC ortamını mililitre saf misin başına iki mikrogram ekleyin ve beş gün sonra günlük olarak değiştirin, kalan kolonileri alt klonlayın ve videoda daha önce açıklandığı gibi genişletin.

Daha sonra, bir şişe pre Eloqua bazal membran matrisini buz üzerinde çözdürün ve soğuk bazal ortamı bir ila 30 arasında bir nihai konsantrasyona seyreltin. Altı oyuklu bir plakanın istenen sayıda oyuğu kaplamak için oyuk başına bir mililitre kullanın ve plakayı bir saat oda sıcaklığında bekletin. Daha sonra 18 gauge bir iğne kullanarak, daha önce mes ile kaplanmış bir kuyudan en az 20 ila 30 koloniyi çapraz taramadan geçirin.

Canlandırıcı mes ve hücrelerin plakadan transferini azaltmaya özen gösterin. Bir saatlik inkübasyondan sonra, matrisi kaplanmış kuyudan 200 mikrolitrelik bir pipetle aspire edin. Kolonilerin parçalarını eski plakadan nazikçe kazıyarak çıkarın ve bunları biri matris kaplı bir plakada olmak üzere üç mililitre yeni birleştirilmiş ortama dikkatlice yerleştirin.

48 saat inkübe ettikten sonra, eksize edilen ve besleyiciden arındırılmış dönüştürülmüş HI PSC'ler %80 co akıcılığına ulaştığında ortamı günlük olarak değiştirin. Kök araba lentivirüsünün eksojen entegrasyonları için spesifik olan burada gösterilen primerleri kullanarak genomik DNA'yı çıkarmak için ticari bir DNA ekstraksiyon kiti kullanın. Eksize edilen HI PSC'leri GMP derece koşullarına geçirmek için uygun eksizyon için DNA'yı PCR ile analiz edin.

HPSC kombine ortam, bir ve klinik sınıf GMP uyumlu orta veya birleşik orta iki, 80 ila 20 ön ısıtma ila 37 santigrat derece oranında karıştırın. Eski birleşik ortamı hücrelerden aspire edin ve üç mililitre yeni ılık ortam çözeltisi ile değiştirin. Ortamı üç gün boyunca her gün değiştirin, metin protokolüne göre geçin, dördüncü günde uygun koloni boyutunu ve yoğunluğunu korumak için, ortamı 50: 50 ılık kombine ortam karışımı ile değiştirin, bir ve iki üç gün boyunca inkübe edin.

Ortamı yedinci günde günlük olarak değiştirerek, sırasıyla bir ve iki ısıtılmış kombine ortamların 20 ila 80 oranına geçin ve üç gün boyunca günlük olarak değiştirin. 10. günde, ılık,% 100 birleşik orta ikiye geçin ve günlük olarak değiştirin. Hücreler artık tamamen tanımlanmış kseno içermeyen ortamdadır.

Daha sonra, altı oyuklu bir plakanın bir kuyusunu kaplamak için tanımlanmış bir kseno içermeyen substrat kullandıktan sonra, kseno içermeyen ortamı, bir x kaya içeren taze ortamla bir birleşme hücresi kuyusuyla değiştirin. Bir saat inkübe ettikten sonra, hücreleri mekanik olarak taze hazırlanmış hücrelere dönüştürmek için 18 gauge bir iğne kullanın. Hücreleri metin protokolüne göre karakterize etmeden önce maksimum bağlanmaya izin vermek için hücrelerin iki gün boyunca rahatsız edilmeden kuluçkaya yatırılmasına izin verin.

Bu şekil, bir mes tabakası üzerinde kök araba yaklaşımı ile yeniden programlandıktan sonra, önceden eksize edilmiş üç farklı H-I-P-S-C hattının temsili bir resmini göstermektedir, burada gösterilen, eksizyon sonrası ters transkripsiyon PCR jeli, kök arabaya endojen olan belirli bir diziye özgü bir amplikon bandının olmaması ile kanıtlandığı gibi, kök araba lentivirüsünden tamamen arındırılmış belirli bir alt klonu göstermektedir. Bu şekilde, kseno içeren bir matris üzerinde pre-con dönüştürülmüş IPC'ler ve sentetik matris üzerinde tüketim sonrası kseno içermeyen GMP sınıfı H IPC'ler, SOX iki, OCT dört ve nanog dahil olmak üzere standart pluripotens ile ilişkili faktörlerin kantitasyonu gösterilmiştir. QPCR kullanımı burada gösterilmiştir.

Son olarak, burada görüldüğü gibi, pre-con dönüştürülmüş ve post dönüştürülmüş HI PSC'ler, insan dışı antijenlerin göstergesi olan sialik asit ve glikol nöronik asit için akış sitometrisi yoluyla test edildi. Bu videoyu izledikten sonra, insan yetişkin dermal fibroblastlarının stemco yeniden programlama virüsü ile nasıl yeniden programlanacağını, virüsün genomdan nasıl çıkarılacağını ve daha sonra bu HI PSC'lerin insan terapötikleriyle tamamen uyumlu klinik sınıf koşullara nasıl dönüştürüleceğini iyi anlamalısınız. Üçüncü nesil bir antiviral vektör olan staca ile çalışmanın son derece tehlikeli ve önlem alabileceğini unutmayın.

Bu prosedür uygulanırken böyle uygun bir KKD ve VSL iki artı doku kültürü odası kullanılmalıdır.