Kanatlı Üretim Örneklerden Bakteriyel Topluluklar Nitel ve Nicel Değerlendirme Karma DNA Ekstraksiyon Yöntemi
10 Aralık 2014
Çevresel kümes hayvanı üretim örnekleriyle kullanılmak üzere yeni bir yarı otomatik hibrit DNA ekstraksiyon yöntemi geliştirildi ve toplam bakteri topluluklarının nicel ve nitel tahminleri açısından ortak bir mekanik ve enzimatik ekstraksiyon yöntemine göre iyileştirmeler gösterdi.
Aşağıdaki deneyin genel amacı, mekanik DNA homojenizasyonunu PCR inhibitörü uzaklaştırması ve kanatlı üretim sürekliliği boyunca çevresel numunelere altın standart ve somatik ekstraksiyon yöntemini birleştiren yeni bir DNA ekstraksiyon tekniği geliştirmektir. Bu, önce bir çevresel numunenin, karmaşık çevresel numuneleri etkili bir şekilde homojenize etmek için bir boncuk karışımı içeren mikro santrifüj tüplerine bölünmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, bakteri hücrelerinden ve çevresel matristen nükleik asitleri verimli bir şekilde serbest bırakmak için tüpleri yüksek güçlü bir homojenizatöre yerleştirmektir.
Daha sonra homojenat, PCR inhibisyon bağlama fazı yoluyla altın standart enzimatik DNA ekstraksiyon yöntemi için başlangıç materyali olarak kullanılır. Son adım, kullanıcıya bir dizi alt uygulamaya uygun ekstrakte edilmiş DNA numuneleri sağlamak için numuneleri bir DNA ekstraksiyon robotik iş istasyonuna yerleştirmektir, sonuçta alüminyum MiSeq platformu kullanılarak kantitatif PCR ve mikrobiyom analizi, bu yeni hibrit yöntemin, mekanik veya enzimatik ekstraksiyon yöntemiyle numune işlemeye kıyasla toplam bakteri topluluklarının kalitatif ve kantitatif değerlendirmelerinin en iyi kombinasyonunu sağladığını göstermek için kullanılmıştır yalnız. Bu yöntem, kümes hayvanı üretim sürekliliği boyunca mikrobiyal toplulukların analizine ilişkin içgörü sağlar, ancak benzer şekilde karmaşık çevresel örnekler içeren domuz sığırları veya mahsul üretimi gibi diğer tarımsal sistemlere de uygulanabilir.
Bugün bu prosedürü gösteren, laboratuvarımdaki bir öğrenci olan Kaitlyn Griffin olacak. Deneye başlamak için bir su banyosunu 95 santigrat dereceye ayarlayın. Daha sonra, toplam bir gram oda sıcaklığı, toprak veya dışkı materyalini numuneler arasında iki mililitrelik bir lizing matrisi ET tüpü değiştirme eldivenine analiz etmek için 0.33 gramlık üç kopyayı tartın.
Bir numune tüpüne 825 mikrolitre sodyum fosfat tamponu ve 275 mikrolitre ön lizis çözeltisi veya PLS ekleyin. Daha sonra numuneleri 15 saniye vorteksleyin, tüpleri karıştırdıktan sonra 14.000 G'de beş dakika santrifüjleyin. Süpernatanı boşaltın ve 700 mikrolitre tampon A SL ekleyin. Ardından tüpü beş saniye boyunca girdaplayın.
Kontaminasyonu önlemek için her seferinde bir tüp açın. Ardından, numuneleri hızlı hazırlama 10 cihazına yerleştirmeden önce konik tüpte toplam hacmin %24'u kadar bir üst boşluk olduğundan emin olun. Numuneleri 40 saniye boyunca saniyede altı metre hızla homojenize edin.
Hızlı hazırlama 24 ile homojenizasyondan sonra girdaplama arasındaki farka dikkat edin. Numuneyi beş dakika boyunca 14.000 Gs'de santrifüjleyin. Süpernatanı, steril iki mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne, ek bir 700 mikrolitre SL tamponunda yeniden homojenize etmek ve santrifüjlemek için lizling matrisi ET tüpünde kalan numuneye aktarın.
Önceki ayarları kullanarak, açılmamalarını sağlamak için numune tüplerinin üzerine plastik kilitleme klipsleri yerleştirin ve süpernatanları 95 santigrat derece su banyosunda beş dakika inkübe edin. Ardından, basıncı boşaltmak için her bir mikro santrifüj tüpünü açın, tüpleri tekrar kapatın ve 15 saniye boyunca girdap haline getirin. Numuneleri bir dakika boyunca 14.000 GS'de santrifüjleyin.
Santrifüjlemeden sonra, 1.2 mililitre süpernatanı steril iki mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Ardından, tırnağı içeren blister ambalajı doğrudan açık mikro santrifüj tüpünün üzerine yerleştirin ve tırnağı blister ambalajdan yavaşça tüpün içine itin. İnhibit X sekmesi ile tüp arasındaki teması önlemek için, her numuneye bir inhibit X sekmesi ekleyin.
Daha sonra, numuneler homojen bir şekilde kirli beyaz bir sıvıya dönene kadar tüpleri girdaplayın. Numuneleri oda sıcaklığında bir dakika boyunca inkübe edin ve tüplerin dibinde kalan parçacıklardan kaçınarak beş dakika boyunca 14.000 peynirde santrifüjleyin. Tüm sıvıyı steril 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın.
Daha sonra tüpleri beş dakika boyunca tam hızda santrifüjleyin. Otomatik DNA saflaştırmasına başlamadan önce, iş istasyonunun uygun miktarda filtre ucu ve tampon içerdiğinden emin olun. Daha sonra, rotor adaptörlerine ellucian tüpleri ve filtre tüpleri ekleyin ve rotor adaptörünün orta yuvasına her numuneden 400 mikrolitre ekleyin.
Rotor adaptörlerini iş istasyonu santrifüjüne yerleştirin ve tüm mikro santrifüj tüp kapaklarının rotor adaptörüne düzgün şekilde sabitlendiğinden emin olun. Proteinaz K çözeltisini steril bir 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne ekleyin ve iş istasyonundaki A yuvasına yerleştirin. İş istasyonunun çalkalayıcı bölümüne iki mililitrelik güvenli kilitli mikro santrifüj tüpü ekleyin ve numune tüplerinin kapaklarının güvenli bir şekilde yerleştirildiğinden emin olun.
İş istasyonundaki dokunmatik ekranı kullanarak, DNA dışkı insan dışkısı patojen tespit protokolünü seçin ve iş istasyonunun doğru şekilde yüklendiğinden emin olmak için sonraki ekranları okuyun. Tüm kontrol ekranları geçildikten sonra, protokolü çalıştırmak için başlat'ı seçin. Ardından numuneleri rotor adaptörlerinden çıkarın.
Santrifüj buharlaştırma tabanlı bir sistem kullanarak tek bir numune için üç tekrarlanan saflaştırmayı birleştirin. Numuneyi tris EDTA tamponu ile 100 mikrolitrelik son hacme yeniden elüte edin. Son olarak, numuneleri kapatın ve aşağı akış analizi için ihtiyaç duyulana kadar eksi 20 santigrat dereceye yerleştirin.
Bu grafik, mekanik yöntemin dışkı ve çöp örnekleri için genel olarak en yüksek toplam bakteriyel normalleştirilmiş gen bolluğu tahminlerini tutarlı bir şekilde sağladığını göstermektedir. Enzimatik yöntem tüm durumlarda en düşük tahminlere sahipti. Yeni hibrit ekstraksiyon yöntemi, kalitatif ve kantitatif toplam bakteri topluluğu tahminlerinin en iyi kombinasyonunu üretti.
Test edilen üç ekstraksiyon yönteminden. Artık bu yeni, yarı otomatik hibrit DNA ekstraksiyon yönteminin nasıl gerçekleştirileceğini daha iyi anlamalı ve karmaşık çevresel örneklerden mikrobiyal toplulukların kalitatif ve kantitatif değerlendirmesinde faydasını görmelisiniz.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Çevresel kümes hayvanı üretim örnekleri için yeni bir yarı otomatik hibrit DNA ekstraksiyon yöntemi geliştirildi. Bu yöntem, geleneksel ekstraksiyon yöntemlerine kıyasla toplam bakteri topluluklarının hem nicel hem de nitel tahminlerinde iyileştirmeler gösterdi.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Mikrobiyoloji
- Çevre Bilimi
- Biyoteknoloji
Arka Plan
- DNA ekstraksiyonu, mikrobiyal toplulukların analizi için kritik öneme sahiptir.
- Geleneksel yöntemler genellikle karmaşık çevresel örneklerle mücadele eder.
- Ekstraksiyon tekniklerinin geliştirilmesi, sonraki uygulamaları artırabilir.
- Bu çalışma, kümes hayvanı üretim ortamlarına odaklanmaktadır.
Çalışmanın Amacı
- Bir hibrit DNA ekstraksiyon tekniği geliştirmek.
- Mekanik homojenizasyonu enzimatik ekstraksiyonla birleştirmek.
- Kümes hayvanı üretimindeki mikrobiyal toplulukların analizini geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Çevresel örnekler boncuk kullanılarak homojenize edildi.
- Nükleik asit salınımı için yüksek güçlü bir homojenizatör kullanıldı.
- Homojenat, altın standart enzimatik yöntem kullanılarak işlendi.
- DNA örneklerinin ekstraksiyonu için bir robotik iş istasyonu kullanıldı.
Ana Sonuçlar
- Hibrit yöntem, nitel ve nicel olarak üstün sonuçlar sağladı.
- Tek başına mekanik ve enzimatik ekstraksiyon yöntemlerinin her ikisini de geride bıraktı.
- Sonuçlar, nicel PCR ve mikrobiyoma analizi kullanılarak doğrulandı.
- Yöntem, karmaşık örneklere sahip diğer tarımsal sistemler için de uygulanabilir.
Sonuçlar
- Yeni hibrit yöntem, çevresel örneklerden DNA ekstraksiyonunu geliştirir.
- Kümes hayvanı üretimindeki mikrobiyal topluklar hakkında değerli bilgiler sunar.
- Bu teknik, diğer tarımsal bağlamlar için adapte edilebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Robust DNA extraction from complex environmental samples is critical for accurate microbiome profiling and quantitative bacterial community assessment in agricultural R&D. The hybrid extraction method enhances both qualitative and quantitative outputs, supporting higher predictive confidence in microbial community analyses. This capability is strategically relevant for biopharma teams developing or validating disease-relevant models and translational biomarkers in animal health and production systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables comprehensive interrogation of microbial community structure in complex matrices.
- Improves detection of Gram-positive bacteria, reducing biological ambiguity in target validation.
- Supports functional assessment of microbial contributions to host phenotypes.
- Facilitates portfolio triage by providing reliable community composition data.
Screening & Assay Development
- Delivers high-quality DNA suitable for quantitative PCR and microbiome sequencing workflows.
- Standardizes extraction across diverse sample types, improving assay reproducibility.
- Enhances throughput and reduces manual error via semi-automation.
- Enables reliable downstream screening of microbial or host-microbe interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns microbial community assessment with disease-relevant animal models.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation in agricultural and animal health research.
- Improves risk-adjusted advancement decisions by providing robust quantitative and qualitative data.
- Facilitates biomarker discovery and validation in complex environmental contexts.
Pipeline & Workflow Integration
This hybrid extraction method fits at the interface of sample preparation and downstream molecular analysis, bridging early discovery and preclinical research in agricultural and animal health pipelines.
- Discovery Biology: Provides reliable DNA extraction for hypothesis testing and microbial pathway clarification.
- Screening: Ensures assay readiness and reproducibility for quantitative and qualitative microbial analyses.
- Analytics: Supports quantitative PCR and microbiome sequencing outputs for comparative studies.
- Translational Research: Enables robust microbial community profiling in disease-relevant animal models.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, semi-automated workflow adaptable to various complex environmental samples.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in microbial community studies.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable DNA extraction across sample types.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling high-quality data generation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of animal health and agricultural R&D programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology and environmental sample handling.
- Needs access to high-powered homogenizers and automated DNA extraction workstations.
- Demands cross-team standardization for protocol adoption and data comparability.
- Adaptable to various environmental matrices with similar complexity to poultry production samples.
- Potential limitations include initial equipment investment and protocol optimization for new sample types.
