Name: PeakForce Kantitatif Nanomekanik Gayrimenkul Eşleme Kullanma Kırmızı Işık fotoreseptör Atomik Kuvvet Mikroskobu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 13 s
Description: Keşfedin fotoreseptör proteinlerinin yapısını PeakForce Kantitatif Nanomekanik Eşleme ile atomik kuvvet mikroskobu kullanarak inceleme yöntemini. Bu teknik biyolojik olarak uygun ortamda yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

NSF-MR program (CHE: 1229103) yeni kontrol elektroniği, yazılım, sıvı hücreleri ve bir çift AFM / STM montajı için gerekli diğer ekipmanların satın finansman için kabul edilmektedir. Biz AFM enstrümantasyon, eğitim ve görüntüleme ile yardım Chicago NSF-MRSEC programının Üniversitesi (DMR-0820054) de ortak tesisler kabul ve enstrüman süre Malzeme Araştırma Olanakları Ağı (DMR-0820054) hazır. Biz özellikle bizim kampüs için gerekli enstrümantasyon getirdi NSF-MR teklifin finansmanı önce öğrencilerimizi ağırlamak için Dr Qiti Guo, Dr Justin Jureller ve Prof Ka Yee Lee teşekkür ederim. Sarf malzemeleri için yaz araştırma öğrenci ve öğretim burslarını yanı sıra destek sağladı Northeastern Illinois Üniversitesi&#39;nde verilir: (P031C110157 ID) Biz Başlık III KÖK hibe fon yny. Son olarak, biz devam enstrümantal destek ve r için izin Bruker-Nano, Inc kabulPeakForce QNM mekanizmasını gösteren bir arsa eproduce ve otomatik yazılım açıklamak için kelime ScanAsyst kullanımı.

1. Bilgisayar ve Mikroskop Kurma <ol><li> N 2 silindir vanasını açın ve hava masa yüzen ve seviye sağlamak için kolları ayarlayın. </li><li> Bu sırayla bilgisayar, kontrolör ve fiber optik ışık açın. </li><li> AFM / LFM moduna tarayıcıyı ayarlayın ve AFM başının üzerinde kamera ortalamak. </li><li> Açık yazılım. Seç deneme kategori &quot;Nanomekanik Özellikleri&quot;, deney grubu altında &quot;Niceliksel Nanomekanik Haritalama&quot; ve deney altındaki &quot;Sıvı içinde PeakForce QNM&quot;. Yük Deney ve ardından Kur&#39;u tıklatın. </li><li> Sahnenin yüzeyini görmek için Z objektif kullanarak kamerayı odaklanın. / Aşağı kaba kadar kullanılması piezos yaklaşık 1 mm AFM kafası açıklığı yüzeyinin altına sahne taşımak. </li></ol> Mika Yüzey 2. Hazırlık <ol><li> Temiz bir örnek desteği disk (15 mm çapında, 0.8 mm kalınlıkta) bir yüzü üzerine bir yapışkan basın. Mika V-4 itinyapıştırıcı üzerine sınıf disk (25 x 25 x 26 mm) sıkıca bağlı kadar. </li><li> Tamamen hava kabarcıkları ile yapıştırılır sağlanması mika üzerine şeffaf bir bantla bir parça sürün. Eşit bir şekilde tutunmaya bir taraftan mika kapalı bandını çıkarın. Mika düz sigortalamak için gerekirse tekrarlayın. </li><li> Grip, destek diski, dairesel cımbız (Disk tutucular) bir çift ile temiz mika yan, ve tarayıcı üzerine yerleştirin. Mika AFM kafa deliğin seviyesinin altında olması gerekir. </li></ol> 3. Sıvı Hücre Montaj ve Mika Yüzey Görüntüleme <ol><li> Sıvı hücre, O-ring, şırınga adaptörü, hortum adaptörü, ve% 100 etanol fırlatma hortumu durulayın. DI suyla akışkan hücre durulayın. Tüm parçaları hava tamamen kurumasını bekleyin. </li><li> Temiz sıvı hücre üzerindeki portuna hortum adaptörü itin. Yavaşça yassı başlı cımbız kullanarak sıvı hücre merkezi girinti içine O-ring basın. </li><li> Prob tutucu klip üzerinde hafifçe yayı basın ve Groov uzak çevirmekBahşiş için e. </li><li> Yassı başlı cımbız ile uzak ucundan uzun sonuna probu kavrayın. Hücrenin merkezine bakan ucu ile oluk içine sonda yerleştirin. Yayı itin ve (Şekil 1B) tespit etmek için sonda üzerinde tutma klibi ayarlayın. </li><li> Tam olarak (Şekil 1C) geri çekilir sağlamak için AFM kelepçeyi edin. </li><li> Sıvısı hücre, O-ring yerleştirin ve mika numune üstüne aşağı bakacak sınayın. Sıvısı hücre AFM Çıtçıt üzerine dinlenmeye bırakın. Sahnede sıvı hücreyi dengelemek için kelepçe indirin. Görsel muayene sıkıca destek disk ve sıvı hücre arasındaki sıkıştırılmış O-ring gösterene kadar mikroskop aşağı düğmesine basın. </li><li> Monitörü izlerken, ekranın üzerindeki sıvı hücrenin üst görselleştirmek için kaba ayar düğmesini odaklanır. </li><li> X / Y ayar düğmeleri ve Z objektif kullanarak ucu açık bir görüntü kalmayıncaya kadar mikroskop taşıyın. Ucu app olacakbir metalik, altın üçgen gibi kulak. Mikroskop altındaki piezo kolu ile numune yüzeyine yakın ucu hareket ettirin. Ucunun yansıması odaklanın. Onun yansıması ilişki içinde gerçek konsol takip edin. Bu aşamada, yakından uyumlu, ancak tamamen üst üste olmasına izin verilmemelidir. </li><li> 1 ml steril bir şırınga şırınga adaptörü takın. Şırınga adaptör için çıkarma hortumun bir ucunu ve tampon çözeltisi kap içindeki hortumun diğer ucuna yerleştirin. Tamamen şırınga pistonu uzatmak. </li><li> Sıvı hücre üzerinde hortum adaptörü hortumunu takın. Sıvı tamamen merkezi odasını doldurana kadar pistonu hafifçe bastırın. Hava kabarcıkları vardır sigortalamak için hücreyi kontrol edin. Mikroskop üzerine sıvı hücreden dışarı dökülüp hiçbir sıvı olduğunu görmek için kontrol edin. Yükseltilmiş bir katı destek üzerinde şırınga. </li><li> Ekranda lazeri (dağınık kırmızı nokta) bulmak için kamera beslemesini ve X / Y çeviri düğmeleri kullanın. Lazer cam hareketini kullanarak,ent kontrol düğmeleri, ucuna lazer taşıyın. </li><li> (6 - değeri = 4) mikroskop görüntülenen toplam sinyali en üst düzeye kadar ince lazer ve ayna kontrolleri ayarlayın. </li><li> (± 0.1) mümkün olduğunca sıfıra yakın mikroskop görüntülenen dikey ve yatay deplasmanlar düşürmek için sol arka tarafında düğmeleri ve tarama kafasının sol üst tarafında kullanarak kadranda diyot açısını ayarlayın. </li><li> Yazılımında, satın alma seçenekleri seçin. Asgari seçin yüksekliği (iz ve Muvazzaf), pik kuvveti hata ve deformasyon at. Diğer seçenekler bağımlı kullanıcı ve deneye tarafından istenen belirli bilgilere dayanarak uygun olabilir. </li><li> Her edinim pencerede RT Plane Fit &quot;satırını&quot; seçeneğini seçin. Yüksekliği pencerelerde OT Düzlem Fit &quot;hiçbiri&quot; seçeneğini seçin. Zaten bitmiş değilse X ve Y, sıfıra ofset ve tarama açısı ayarlayın. </li><li> 1 Hz, 256 hat başına numune, ScanAsyst oto kontrol için tarama hızını ayarlamakbirey ve kapalı olarak ScanAsyst otomatik Z sınırı. 500 nm Z sınırı değiştirebilirsiniz. 1 um tarama boyutunu ayarlayın. </li><li> Meşgul tıklayın. Bu noktada, uç yüzeyi yaklaşır. Ucu yaklaşırken, ekranın sol alt köşesinde Z piezo voltaj değişimini gözlemlemek. Ucu aralığının dışına çıkarsa, ucu ve yeniden bir yaklaşım çekilme. Bu başarısız olursa, ucu başarılı bir yaklaşım olması için değiştirilmesi gerekebilir. Ucu devreye girdikten sonra, satırları bir görüntü oluşturacaktır edinim pencerelerin her görünmeye başlayacak. </li><li> 1 x 1 mikron de mika fotoğraf çekmek ve mika yüzey temiz ve düz olmasını sağlamak için yavaş yavaş yakınlaştırın. Göründükleri gibi görüntüleri kaydetmek için sürekli yakalama tıklayın. Büyüt ve istediğiniz gibi yüzeyi etrafında hareket ettirin. </li></ol> 4. Protein Biriktirme ve Görüntüleme için Numune Hazırlama <ol><li> Saflaştırılmış protein örneği 38 Edinme ve buz üzerinde tutmak. Bir Dondurucuda ise, üzerinde örnek çözülme5 dakika boyunca buz. </li><li> / Ml buzdolabında kullanarak görüntüleme tampon çözeltisi 0.0010 mg protein sulandırmak. Burada kullanılan görüntü tamponu 15 mM Tris-HCI (pH = 8.0), 150 mM NaCI ve 15 mM MgCI2 olduğunu. </li><li> 4 odacığı (100 x 15 mm) buzdolabında görüntüleme tampon solüsyonu ile Petri doldurun. Solüsyonun en azından her biri 5 mi oda doldurun. Yavaşça mikropipetöre sabit şekilde bağlı olan ucu ile seyreltilmiş protein çözeltisi karıştırılır. </li><li> Hazırlanmamış mika yüzeyine seyreltilmiş protein çözeltisinin 200 ul uygulayın. 30 saniye sonra, dairesel cımbız (Disk tutucular) ile protein / mika yüzey pick up. Bench için örnek paralel tutun. </li><li> Örnek tutarken örnek Petri kabı havza paralel olmasını sağlama hemen petri kabının (adım 4.2) birinci kadran içinde bulunan tampon çözeltisi içinde örnek bırakın. 1 saniye sonra, örnek çıkarın. </li><li> Havzasına örnek paralel tutmaya devamPetri kabı, kalan üç çeyrek daire için adımı 4.5 tekrarlayın. </li><li> Aşırı nem emmek ve mikroskop sahneye diski aktarmak için kuru tozsuz bir bez üzerine diski yerleştirin. Bezle gerçek yüzeyine dokunmayın. Örnek kurumasına izin vermeyin. </li><li> 3.16 - Tekrar 3.6 adımları. </li></ol> Mika 5. Görüntüleme Proteinler <ol><li> Ekranın sol tarafında onay parametreleri kutusuna tıklayın. Bahar boyutu ve uç yarıçapı ucu kullanılan dayalı ayarlanması gerekir. </li><li> Meşgul tıklayın. Benzer şekilde, mika görüntüleme işlemi (aşama 3.17) için, uç yaklaşırken z piezo pencere izleyin. </li><li> Izleyen en az iki geçiş için görüntü Tarayıcıyı aynı alanı izin verin. Toplanan her görüntüyü kurtarmak için sürekli yakalama tıklayın. </li><li> Yeni bir bölgeye tarayıcıyı hareket ve / veya istediğiniz gibi görüntü boyutunu değiştirmek. </li><li> Otomatik yazılım ayarlama bittikten sonratarama parametreleri belirli bir görüntü boyutu için, yazılımı kapatın. </li><li> Elle ince ayar için görüntünün odağını tarama hızı, z sınırı, satır sayısını, ve gerilimini ayarlamak. Görüntü çok odak dışı olursa, özgün başlangıç ​​konumunu geri geri yazılım açın. Bir protein yakınlaştırma sırasında bir görüntünün çözünürlüğünü artırmak için, tarama hızı azaltmak ve orantılı hatlarının sayısını artırmak. </li><li> Deneyden sonra,% 100 etanol ile sıvı haznesini temizlemek DI H2O ile yıkayın Sıvı hücre tamamen kurumasını bekleyin. </li><li> Ham veri görüntüleri işlemek için veri yazılımını açın. İlk olarak, düzleştirmek ikonuna tıklayarak görüntüyü düzleştirmek. Sipariş inci Zero seçin ve yürütmek tıklayın. Görüntüye bağlı olarak, uygun bir şekilde uygun düzlem düz görüntü elde etmek için gerekli olabilir. Bu durumda, düzlem uyum simgesini seçin ve imleci kullanarak görüntünün düz bir alanda bir uçak çizin. Yürütmek tıklayın. Gerektiği kadar tekrarlayın </li><li> Selvb kesit sekme proteinin boyutların ölçülmesi. Imleç ile bir çizgi analiz edilmesi molekülü veya alan üzerinde hareket çizin. Birden fazla alanlar için tekrarlayın ve yazılım bir bindirme oluşturur. Resmi veya diğer yazılım ve çizim programlarına uyumlu bir formatta resim oluşturmak için kullanılan verileri. </li></ol>

<ol><li>Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+Force+Microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Atomic Force Microscope.</a> Phys. Rev. Lett. 56, Available from: 
 
 <a target="_blank" href="http://dx.doi.org/10.1103/PhysRevLett.56.930">http://dx.doi.org/10.1103/PhysRevLett.56.930</a> 930-933 (1986).</li>
<li>Sonnenfeld, R., Hansma, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic-Resolution+Microscopy+in+Water+Science%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Atomic-Resolution Microscopy in Water Science.</a> 232, 211-213 (1986).</li>
<li>Nikiforov, M. P., Darling, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concurrent+Quantitative+Conductivity+and+Mechanical+Properties+Measurements+of+Organic+Photovoltaic+Materials+using+AFM%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Concurrent Quantitative Conductivity and Mechanical Properties Measurements of Organic Photovoltaic Materials using AFM.</a> J. Vis. Exp. 71, (2013).</li>
<li>Bahatyrova, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Native+Architechure+of+a+Photosynthetic+Membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Native Architechure of a Photosynthetic Membrane.</a> Nature. 430, 1058-1061 (2004).</li>
<li>Sturgis, J. N., Tucker, J. D., Olsen, J. D., Hunter, C. N., Niederman, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+Force+Microscopy+Studies+of+Native+Photosynthetic+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">Atomic Force Microscopy Studies of Native Photosynthetic Membranes.</a> Biochem. 48, 3679-3698 (2009).</li>
<li>Pelling, A. E., Li, Y., Shi, W., Gimzewski, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+visualization+and+characterization+of+Myxococcus+xanthus+cells+with+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Nanoscale visualization and characterization of Myxococcus xanthus cells with atomic force microscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 102, 6484-6489 (2005).</li>
<li>Viani, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+Protein-Protein+Interactions+in+Real-Time%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%3A+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Probing Protein-Protein Interactions in Real-Time.</a> Nature: Structural Biology. 7, 644-648 (2000).</li>
<li>Hook, F., Kasemo, B., Grunze, M., Zauscher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Biological+Surface+Science%2C+Challenges+and+Recent+Advances%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Quantitative Biological Surface Science, Challenges and Recent Advances.</a> ACS Nano. 2, 2428-2436 (2008).</li>
<li>Thomas, G., Burnham, N. A., Camesano, T. A., Wen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+the+Mechanical+Properties+of+Living+Cells+Using+Atomic+Force+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy.</a> J. Vis. Exp. (76), (2013).</li>
<li>Murphy, P. J. M., Shannon, M., Goertz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+Recombinant+DNA+and+Protein+Complexes+Using+Atomic+Force+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy.</a> J. Vis. Exp. (53), (2011).</li>
<li>Poggi, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+Probe+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Scanning Probe Microscopy.</a> Anal. Chem. 76, 3429-3444 (2004).</li>
<li>Rico, F., Su, C., Scheuring, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+Mapping+of+Single+Membrane+Proteins+at+Submolecular+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Mechanical Mapping of Single Membrane Proteins at Submolecular Resolution.</a> Nano Letters. 11, 3983-3986 (2012).</li>
<li>Foster, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+State+of+Microscopy+for+2012%5BTitle%5D)+AND+%22Amer.+Lab%22%5BJournal%5D)">The State of Microscopy for 2012.</a> Amer. Lab. 43, 4-6 (2011).</li>
<li>Guzman, H. V., Perrino, A. P., Garcia, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peak+Forces+in+High-Resolution+Imaging+of+Soft+Matter+in+Liquid%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Peak Forces in High-Resolution Imaging of Soft Matter in Liquid.</a> ACS Nano. 7, 3198-3204 (2013).</li>
<li>Kaemmer, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+to+Bruker%E2%80%99s+ScanAsyst+and+PeakForce+Tapping+AFM+Technology%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Introduction to Bruker’s ScanAsyst and PeakForce Tapping AFM Technology.</a> , (2011).</li>
<li>Dufrêne, Y. F., Martinez-Martin, D., Medalsy, I., Alsteens, D., Muller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparametric+imaging+of+biological+systems+by+force-distance+curve-based+AFM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Multiparametric imaging of biological systems by force-distance curve-based AFM.</a> Nature Methods. 10, 847-854 (2013).</li>
<li>Pfreundschuh, M., Martinez-Martin, D., Mulvihill, E., Wegmann, S., Muller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparametric+high-resolution+imaging+of+native+proteins+by+force-distance+curve%E2%80%93based+AFM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Multiparametric high-resolution imaging of native proteins by force-distance curve–based AFM.</a> Nature Protocols. 9, 1113-1130 (2014).</li>
<li>Pfreundschuh, M., Alsteens, D., Hilbert, M., Steinmetz, M. O., Muller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localizing+Chemical+Groups+while+Imaging+Single+Native+Proteins+by+High-Resolution+Atomic+Force+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Localizing Chemical Groups while Imaging Single Native Proteins by High-Resolution Atomic Force Microscopy.</a> Nano Letters. 14, 2957-2964 (2014).</li>
<li>Berquanda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+Force+Microscopy+Imaging+of+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Today%22%5BJournal%5D)">Atomic Force Microscopy Imaging of Living Cells.</a> Microscopy Today. 18, 8-14 (2010).</li>
<li>Heua, C., Berquand, A., Elie-Cailleb, C., Nicoda, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glyphosate-induced+Stiffening+of+HaCaT+Keratinocytes%2C+a+Peak+Force+Tapping+Study+on+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Glyphosate-induced Stiffening of HaCaT Keratinocytes, a Peak Force Tapping Study on Living Cells.</a> J. Struc. Biol. 178, 1-7 (2012).</li>
<li>Picas, L., Rico, F., Deforet, M., Scheuring, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+Mechanical+Heterogeneity+of+the+Erythrocyte+Membrane+Reveals+Hallmarks+of+Membrane+Stability%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Structural and Mechanical Heterogeneity of the Erythrocyte Membrane Reveals Hallmarks of Membrane Stability.</a> ACS Nano. 7, 1054-1063 (2013).</li>
<li>Tobias, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+Probe+Microscopy+of+Bacterial+Red-Light%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+1465%2C+doi%3A10.1557%2Fopl.2012.1006%22%5BJournal%5D)">Scanning Probe Microscopy of Bacterial Red-Light.</a> Proc. 1465, doi:10.1557/opl.2012.1006. , (2012).</li>
<li>Sorenson, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Domain+Structure+of+a+Unique+Bacterial+Red+Light+Photoreceptor+as+Revealed+by+Atomic+Force+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Mater.+Res.+Soc.+Symp.+Proc%22%5BJournal%5D)">Domain Structure of a Unique Bacterial Red Light Photoreceptor as Revealed by Atomic Force Microscopy.</a> Mater. Res. Soc. Symp. Proc. 1652, (2013).</li>
<li>Rockwell, N. C., Lagarias, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+phytochrome%3A+a+picture+is+worth+a+thousand+spectra%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The structure of phytochrome: a picture is worth a thousand spectra.</a> Plant Cell. 18, 4-14 (2006).</li>
<li>Rockwell, N. C., Shang, L., Martin, S. S., Lagarias, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+classes+of+red%2Ffar-red+photochemistry+within+the+phytochrome+superfamily%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Distinct classes of red/far-red photochemistry within the phytochrome superfamily.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 6123-6127 (2009).</li>
<li>Noack, S., Michael, N., Rosen, R., Lamparter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+conformational+changes+of+Agrobacterium+phytochrome+Agp1+during+chromophore+assembly+and+photoconversion%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">Protein conformational changes of Agrobacterium phytochrome Agp1 during chromophore assembly and photoconversion.</a> Biochem. 46, 4164-4176 (2007).</li>
<li>Noack, S., Lamparter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+modulation+of+histidine-kinase+activity+in+bacterial+phytochromes+monitored+by+size+exclusion+chromatography%2C+crosslinking%2C+and+limited+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+of+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Light modulation of histidine-kinase activity in bacterial phytochromes monitored by size exclusion chromatography, crosslinking, and limited proteolysis.</a> Methods of Enzymology. 423, 203-221 (2007).</li>
<li>Rockwell, N. C., Su, Y. S., Lagarias, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phytochrome+structure+and+signaling+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Phytochrome structure and signaling mechanisms.</a> Annual Review Plant Biology. 57, 837-856 (2006).</li>
<li>Bhoo, S. H., Davis, S. J., Walker, J., Karniol, B., Vierstra, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophytochromes+Are+Photochromic+Histidine+Kinases+Using+a+Biliverdin+Chromophore%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bacteriophytochromes Are Photochromic Histidine Kinases Using a Biliverdin Chromophore.</a> Nature. 414, 776-779 (2001).</li>
<li>Takala, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+amplification+and+transduction+in+phytochrome+photosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Signal amplification and transduction in phytochrome photosensors.</a> Nature. 509, 245-248 (2014).</li>
<li>Filonov, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+Near-Infared+Fluorescent+Protein+for+in+vivo+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotech%22%5BJournal%5D)">Stable Near-Infared Fluorescent Protein for in vivo Imaging.</a> Nature Biotech. 29, 757-761 (2011).</li>
<li>Samma, A. A., Johnson, C. K., Song, S., Alvarez, S., Zimmer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+Origin+of+Fluorescence+in+Bacteriophytochrome+Infrared+Fluorescent+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">On the Origin of Fluorescence in Bacteriophytochrome Infrared Fluorescent Proteins.</a> J. Phys. Chem. B. 114, 15362-15369 (2011).</li>
<li>Lehtivuori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+Properties+of+the+Chromophore-Binding+Domain+of+Bacteriophytochrome+from+Deinococcus+radiodurans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Fluorescence Properties of the Chromophore-Binding Domain of Bacteriophytochrome from Deinococcus radiodurans.</a> J. Phys. Chem. B. 117, 11049-11057 (2013).</li>
<li>Toh, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+Reactions+of+Bacteriophytochrome+Observed+with+Ultrafast+Mid-Infrared+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+A%22%5BJournal%5D)">Primary Reactions of Bacteriophytochrome Observed with Ultrafast Mid-Infrared Spectroscopy.</a> J. Phys. Chem. A. 115, 3778-3786 (2011).</li>
<li>Auldridge, M. E., Satyshur, K. A., Anstrom, D. M., Forest, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-guided+engineering+enhances+a+phytochrome-based+infrared+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Structure-guided engineering enhances a phytochrome-based infrared fluorescent protein.</a> J. Biol. Chem. 287, 7000-7009 (2012).</li>
<li>Toh, K. C., Stojkovic, E. A., van Stokkum, I. H., Moffat, K., Kennis, J. T. Proton-transfer and hydrogen-bond interactions determine fluorescence quantum yield and photochemical efficiency of bacteriophytochrome. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aToh%2C+KC+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22">Proc. Natl. Acad. Sci. U S A</a>. 107, 9170-9175 (2010).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Pymol+Molecular+Graphic+System+v.1.5.0.1%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The Pymol Molecular Graphic System v.1.5.0.1.</a> , Schrodinger, LLC. Forthcoming.</li>
<li>Yang, X., Stojkovic, E. A., Kuk, J., Crystal Moffat, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((structure+of+the+chromophore+binding+domain+of+an+unusual+bacteriophytochrome%2C+RpBphP3%2C+reveals+residues+that+modulate+photoconversion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">structure of the chromophore binding domain of an unusual bacteriophytochrome, RpBphP3, reveals residues that modulate photoconversion.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 12571-12576 (2007).</li>
<li>Yang, X., Kuk, J., Moffat, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+Pseudomonas+aeruginosa+bacteriophytochrome%3A+photoconversion+and+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of Pseudomonas aeruginosa bacteriophytochrome: photoconversion and signal transduction.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 14715-14720 (2008).</li>
<li>Woitowich, N. K., Garrido, C., Ozarowski, W., Stojkovic, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preliminary+X-ray+Crystallographic+and+Structural+Analyses+of+a+Bacteriophytochrome+from+Stigmatella+aurantiaca%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Preliminary X-ray Crystallographic and Structural Analyses of a Bacteriophytochrome from Stigmatella aurantiaca.</a> The FASEB Journal. 25, 928(2011).</li>
<li>Wagner, J. R., Zhang, J., Brunzelle, J. S., Vierstra, R. D., Forest, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+structure+of+Deinococcus+bacteriophytochrome+yields+new+insights+into+phytochrome+architecture+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">High resolution structure of Deinococcus bacteriophytochrome yields new insights into phytochrome architecture and evolution.</a> J. Biol. Chem. 282, 12298-12309 (2007).</li>
<li>Wagner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+analysis+of+Deinococcus+radiodurans+bacteriophytochrome+reveals+key+amino+acids+necessary+for+the+photochromicity+and+proton+exchange+cycle+of+phytochromes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Mutational analysis of Deinococcus radiodurans bacteriophytochrome reveals key amino acids necessary for the photochromicity and proton exchange cycle of phytochromes.</a> J. Biol. Chem. 283, 12212-12226 (2008).</li>
</ol>

Rekabet eden finansal çıkarlar veya çıkar çatışmaları yoktur.

AFM fizyolojik ilgili koşullarda proteinler ve diğer biyolojik makromoleküllerin görüntüleme tamamen yetenekli bir tarama prob mikroskop yöntemidir. X-ışını kristalografisi ve NMR ile karşılaştırıldığında, AFM biri sınırlama aynı çözünürlüğü, özellikle yanal çözünürlük elde etmek için onun yeteneksizliği. Herhangi bir yüzey üzerinde bir molekül analiz etmek için kullanıldığında, AFM veriler incelendiğinde, molekülün görüntü yüzeyinin etki ve sonda da göz önüne alınmalıdır. Elde edilen görüntünün üzerine sondanın etkisi ...

Atomik kuvvet mikroskopisi (AFM) 1986 yılında buluşun (Şekil 1) bu yana yüzeyleri, ince filmlerin ve tek moleküllerin yapısal ve mekanik özelliklerin belirlenmesi için çok önemli bir araç haline gelmiştir. 1-3 sıvı hücreyi kullanarak, bu yöntemin fizyolojik olarak ilgili olan bir ortamda biyolojik makromoleküllerin çalışmaları ve hatta canlı hücrelerde özellikle faydalı olur. AFM geleneksel iletişim modu AFM, çünkü yumuşak bir malzeme veya yüzeyine gevşek bağlı molekülleri görüntülenmesinde kullanılmıştır 4-10 dokunulduğunda mod nedeniyle tipik olarak uygun değildir yanal kuvvetlerin neden zarar dirsek tarafından numune üzerinde uygulanan. 11 dokunulduğunda mod AFM ölçüde ucu aralıklı yüzeyine dokunmayın etmektense sürekli temas ederek bu güçleri azaltır. Bu modda, konsol veya yüzeye normal olarak rezonans frekansına yakın bir döndürülür. Benzer AFM modu başvurma, topografya analxy (uzaklık) bir fonksiyonu olarak z-piezo hareketini taslak haline getirilmesi suretiyle yzed. Konsol dinamikleri ya da rezonans yanında oldukça kararsız olabilir; Bu nedenle, bir &quot;kararlı durum&quot; durumun dışına otomatikleştirmek için çok zorlu. Özellikle, bu dinamikleri örnek özellikleri ve tarama çevre hem de bağlıdır. Sert bir (er) yüzeyine adsorbe edilmiş yumuşak bir molekül için, molekül için bir iyi ayarlanmış geri besleme döngüsü yüzeyi geri besleme dalgalanmasına yol açabilir. Fazla akışkan Operasyonu konsolun ayarlama zorlaştırmaktadır. Sıcaklık veya sıvı düzeylerindeki değişiklikler set noktası, kazançlar ve diğer görüntüleme parametrelerin sürekli ayarlaması gerekir. Bu ayarlamalar, çok zaman tüketici ve kullanıcılar için zor olma eğilimindedir. Tepe Kuvvetleri Kantitatif Nanomekanik İşletme Haritalama (PF-QNM), mod AFM dokunarak gibi, aralıklı örnek (Şekil 2) başvurarak yanal etkileşimleri önler. 12-15 &lt;/ Sup&gt; Ancak, PF-QNM olmayan rezonans modu ve dokunarak modu AFM çok daha düşük frekanslarda çalışır. Bu çekme modu AFM, sıvı varlığında şiddetlenir özellikle de ayarlama zorlukları ortadan kaldırır. PF-QNM ile, görsel temas her noktada bir kuvvet yanıt eğrisi alınarak toplanır. ScanAsyst yazılım ilavesi ile, tarama parametrelerinin 15 ayar otomatik olabilir ve yüksek çözünürlüklü görüntü bile deneyimsiz kullanıcılar tarafından birkaç dakika içinde elde. Kullanıcı AFM daha aşina olduktan sonra, otomatik parametrelerden herhangi veya tüm görüntü kalitesi elle ince ayar yapmak için deneye izin herhangi bir zamanda devre dışı bırakılmış olabilir. Kuruluşundan bu yana, PF-QNM. Altmoleküler düzeyinde bakteriorodopsin, bir membran proteini ve diğer yerli proteinleri Haritayı uygulanmıştır bakteriyorodopsin için 16-18 protein esneklik ve X-ray kristalografik yapıları arasında doğrudan bir ilişki vardır. 12 PF -QNM yüksek çözünürlüklü canlı hücreler araştırmak için kullanılmıştır. Hücre bütünlüğü ve fonksiyonu için kritik olan eritrosit membran içerisindeki yapı ve mekanik arasındaki 19,20 Dahası, PF-QNM veri açıklığa kavuşturmaktadır önemli bağlantılar. 21 Biz 22 bacteriophytochromes (BphPs) denilen kırmızı ışık fotoreseptör yapısını incelemek için AFM, 23 de dahil olmak üzere, tarama prob mikroskobu (SPM) yöntemlerini kullanmışlardır. 24,25 Onlar kovalent bir sinyal-efektör modülüne böyle bağlantılı bir ışık algılama modülü oluşur histidin kinaz (HK) gibi. 26 ışık algılama modülü genellikle yapısal değişikliklere sinyal-efektör modülü ulaşan ve tüm protein küresel bir dönüşüm yol açan bir dizi, bir fotonun emilimi üzerine yapısal dönüşüme uğrar bir bilin kromofor içeren . Bu dönüşüm dayanarak 24,27-29, iki farklı ışık emici ler vardırBphPs, kırmızı ve uzak-kırmızı ışık emici devletin öngörmesi, Pr ve PFR olarak belirtilir. Pr en BphPs için, termal olarak kararlı, karanlığa adapte edilmiş halidir. Pr / Pfr Fotoçevrim moleküler temeli bütünüyle bağlı olarak, bu proteinlerin sınırlı yapısal bilgisine anlaşılamamıştır 28. D. Bir yapının haricinde radiodurans bu proteinlerin 30 bütün yayınlamış X-ışını kristalografik yapısı, karanlığa adapte edilmiş halde ve efektör yoksundur. Daha sonra, dokunulmamış BphPs etkin Nükleer Manyetik Rezonans (NMR) ile araştırılmıştır için çok büyük olan ve X-ışını kristalografisi için (özellikle ışık uyarlanmış halde) da bütün halinde kristalize etmek oldukça zordur. BphPs yakın kızılötesi floresan protein belirteçleri olarak tasarlanmış edilmiştir (IFP) &#39;ın., Bu proteinlerin 31 Yapısal karakterizasyon etkili IFP tasarım yardım daha fazla olabilir. 32-36 Bu makalenin odak için bir prosedür sunmaktırPF-QNM yoluyla sıvı hücre AFM kullanılarak BphPs görüntüleme. Bir yöntem olup, fotosentetik bakteri R&#39;nin bacteriophytochrome RpBphP3, (P3) ışık adapte devlet çalışmalarla ortaya konmuştur palustris. Burada sunulan AFM prosedür proteinlerin görüntüleme için uygun ve basit bir yaklaşım hem de diğer biyolojik makro moleküller olduğunu. Bu yöntemle, tek tek moleküllerin yapısal detayları bir üst düzey bilim ders laboratuvar oturumu benzer zaman, kısa bir süre içinde tahsil edilebilir. Kesitlerini ölçmek ve daha boyutlu analiz tamamlayarak, deneysel veri yararlı hesaplama modelleri ile mukayese edilebilir. 37-42

<table><tbody><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>O4997-100</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Acros Organics</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Acros Organics</td><td>7791-18-6</td><td></td></tr><tr><td>Çok Modlu 8 AFM</td><td>Bruker-Nano</td><td>492-008-011</td><td>Nanoscope V denetleyici ve J tarayıcı ile donatılmış</td></tr><tr>Probe <td>Bruker-Nano</td><td>SNL-10</td><td>, ScanAsyst-Fluid+</td><td></td></tr><tr><td>Kılavuz Çekme Modu Akışkan Hücresi</td><td>Bruker-Nano</td><td>MTFML</td><td></td></tr><tr><td>Mika V-4 Sınıf</td><td>SPI malzemeleri</td><td>1150503 25</td><td>x 25 x .26 mm</td></tr><tr><td>Örnek destek diski</td><td>nanoSurf</td><td>BT02236</td><td></td></tr><tr><td>Petri kabı</td><td>Plasta-Medic, Inc.</td><td></td><td>100 mm x 15 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>mikropipetleyiciler</td><td>Denville Scientific</td><td>XL 3000i</td><td></td></tr><tr><td>RpBphP3</td><td></td><td></td><td>Alıntı yapılan referanslara göre hazırlanmıştır</td></tr><tr><td>Nanoscope yazılımı</td><td>Bruker-Nano</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiber Optik Işık</td><td>Dijital Aletler A.Ş.</td><td>F0-50</td><td></td></tr><tr><td>Pelco AFM Disk Tutucu</td><td>Ted Pella Inc</td><td>1668</td><td>12 mm</td></tr><tr><td>1 ml şırınga</td><td>McKesson</td><td>102-ST1C</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf tüpleri</td><td>Denville Scientific</td><td>C2171</td><td></td></tr><tr><td>Pymol Moleküler Grafik Sistemi v.1.5.0.1</td><td>Schrödinger, LLC</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

peakforce kantitatif nanomekanik gayrimenkul eşleme kullanma kırmızı işık fotoreseptör atomik kuvvet mikroskobu

Atomic Force Microscopy of Red-Light Photoreceptors Using PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping

Atomik kuvvet mikroskopisi (AFM), bir yüzeyin bir güç yanıtı araştırmak için bir konsol bağlı bir piramit şeklinde bir uca kullanır. Ucunun çökme görüntü topografisine dönüştürülebilen bir lazer ve bölümlere ayrılmış detektör tarafından ~ 10 pN ölçülebilir. Genlik modülasyonu veya &quot;dokunarak modu&quot; AFM bir görüntü üretmek için rezonans frekansında titreşen ise yüzeyi ile aralıklı temas probu içerir. Bir sıvı hücre ile birlikte kullanılan, dokunarak modu AFM gibi fizyolojik ilgili koşullarda proteinler gibi biyolojik makromoleküllerin görüntüleme sağlar. Dokunulduğunda mod AFM probu ve deneyimsiz kullanıcılar için zor olabilir tarama parametreleri çok sayıda sık ayarlamaları manuel ayar gerektirir. Yüksek kaliteli görüntüler elde etmek için, bu ayarlamalar çok zaman tüketir. PeakForce Kantitatif Nanomekanik İşletme Haritalama (PF-QNM) bir kuvvet yanıtlayanların ölçerek bir görüntü oluştururnumune ile temas her noktada için tek başlarına eğrisi. ScanAsyst yazılım ile, PF-QNM otomatik olabilir. Bu yazılım otomatik olarak belirli bir örnek için ayar noktası, sürücü frekansı, tarama hızı, kazanç, ve diğer önemli tarama parametreleri ayarlar. Sadece bu süreç kırılgan sondaları ve örnekleri hem koruyor, önemli ölçüde yüksek çözünürlüklü görüntüleri elde etmek için gerekli süreyi azaltır. PF-QNM sıvı AFM görüntüleme için uyumludur; Bu nedenle, biyolojik olarak ilgili malzemeleri görüntülenmesi için geniş bir uygulama alanına sahiptir. Bu çalışmada sunulan yöntem, fotosentez R. gelen bir bakteriyel kırmızı ışık fotoreseptör, RpBphP3 (P3) görüntüler elde PF-QNM uygulanmasını açıklar onun ışık adapte devlet palustris. Bu yöntem kullanılarak, bireysel protein P3 dimerleri ve dimerlerin agrega bir görüntüleme tampon varlığında bir mika yüzeye gözlenmiştir. Uygun yüzey ayarlamalar ve / veya çözelti konsantrasyonu Bu yöntemle,genel olarak diğer ilgili biyolojik makromoleküller ve yumuşak malzemeler için uygulanabilir.

Hafif uyarlanmış halde bir fotoreseptör protein, P3, temsili AFM görsel, Şekil 3 ve 4'te sunulmaktadır. Bir taze kırılmış mika alt-tabaka (Şekil 3A) protein adsorpsiyonu için uygun, düz bir yüzeydir. Bir negatif kontrol olarak, temiz mika bir görüntü toplama çeşitli nedenlerle önemlidir. İlk olarak, sıvı hücre temiz temin edilmiş olup, önceki deneylerden elde edilen herhangi bir kalıntı malzemeler yüzey kirletecektir. İkinci olarak, bu sonda kalitesini test eder. Prob k...

Atomik kuvvet mikroskobu (AFM) kullanarak bir protein fotoreseptörünün yapısını araştırmak için bir yöntem bu yazıda açıklanmıştır. PeakForce Kantitatif Nanomekanik Özellik Haritalama (PF-QNM), mika yüzeyindeki bozulmamış protein dimerlerini ortaya çıkarır.

PeakForce Kantitatif Nanomekanik Gayrimenkul Eşleme Kullanma Kırmızı Işık fotoreseptör Atomik Kuvvet Mikroskobu

Atomic force microscopy (AFM) uses a pyramidal tip attached to a cantilever to probe the force response of a surface. The deflections of the tip can be ...

Bu prosedürün genel amacı, atomik kuvvet mikroskobu kullanarak fotoreseptör proteinlerinin yüksek çözünürlüklü görüntülerini toplamaktır. Bu, önce fotoreseptörün bir örneğinin elde edilmesi ve seyreltilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, protein örneğini yaklaşık 30 saniye boyunca taze bölünmüş ve temiz bir mika yüzeyine uygulamaktır.Daha sonra MICA, bağlanmamış ve gevşek bir şekilde bağlanmış molekülleri çıkarmak için tampon ile durulanır. Daha sonra numune, uygun bir prob ile donatılmış bir sıvı hücreye bağlanır. Bu düzenek tarayıcıya yüklenir.Sıvı hücreyi tampon solüsyonu ile doldurduktan sonra, ucu numune ile birleştirin ve taramaya başlayın. Sonuçta, tepe kuvvetini içeren atomik kuvvet mikroskobu. Kantitatif nano mekanik özellik haritalaması, numune yüzeyindeki tek fotoreseptör proteininin görüntülerini toplamak için kullanılır.Tepe kuvveti q ve m'yi içeren atomik kuvvet mikroskobu, biyolojik olarak aktif makromoleküllerin işlevini belirleyen önemli yapısal ve kimyasal özelliklerin neler olduğu gibi moleküler biyoloji alanındaki temel soruları cevaplayabilir. Bu tekniğin NMR ve X-ışını kristalografisi gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, bozulmamış proteinlerin ve diğer biyolojik makromoleküllerin yüksek çözünürlüklü görüntülerinin biyolojik olarak ilgili bir ortamda elde edilebilmesidir. Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler, probun ve çözeltinin ayarlanması, bazıları oldukça karmaşık olan birden fazla adım gerektirdiğinden mücadele eder.Peak force q ve m ve otomatik yazılım ile bu adımların birçoğu daha basit hale getirildi, böylece süreci yeni kullanıcılar ve lisans öğrencileri için çok daha kolay hale getirdi. Bu prosedürü göstermek, araştırma laboratuvarımdan üç lisans öğrencisi, Marie Kroger, Blair Sorenson ve Jessica Thomas olacak. Bu öğrenciler önümüzdeki yıl mikrobiyoloji, kimya mühendisliği ve kimya alanlarında lisansüstü eğitim alacaklardır.Bu öğelerin belirli bir sırada etkinleştirilmesi gerekir. Önce bilgisayar, sonra denetleyici ve son olarak fiber optik ışık. Mikroskobun bir FM ve LF fm okuması gerekir.Kamera, yazılımdaki bir FM optik kafasının üzerinde ortalanmalıdır. Aşağıdakiler seçilmelidir. Deney kategorisi mekanik özelliklerdir.Deney grubu kantitatif nano mekanik haritalamadır ve deney sıvıdaki en yüksek kuvvet q ve m'dir. Ayarlar doğru seçildiğinde, deney yüklenebilir ve ayarlanabilir. Kamera odağı önce Z objektifi kullanılarak ayarlanmalı, ardından sahneyi konumlandırmak için rota kontrolleri kullanılmalıdır, amaç, yeni bölünmüş mika ile örnek diskleri manipüle etmek için A FM kafa açıklığını sahne yüzeyinin bir milimetre önüne yerleştirmektir.Sıvı hücresini bozulmamış temizlenmiş parçalardan monte etmekle başlayın. İlk olarak, hortum adaptörünü temiz sıvı hücreleri üzerindeki bağlantı noktasına takın. Daha sonra düz uçlu cımbızları çok nazikçe kullanarak, O-ringi sıvı hücresi üzerindeki girintisine bastırın.Prob tutma klipsinin ardından, yayı hafifçe bastırın ve oluktan çevirin. Aynı cımbızı kullanarak, probu kavrayın ve ucu hücrenin merkezine bakacak şekilde oluğun içine kaydırın. Ardından klipsi kullanarak probu sabitleyin.Bir sonraki adım, A üzerindeki kelepçeyi kontrol etmektir FM.It tamamen geri çekilmelidir. Düzeneği, numunenin üzerine aşağı bakacak şekilde yerleştirin. Stabilizasyon için düzeneği A FM'nin saplamalarına takın.Kelepçeyi indirin. O-ringi incelemek için, O-ring görünene kadar mikroskop üzerindeki aşağı düğmesine basın. Destek diski ile sıvı hücresi arasında sıkıca sıkıştırılmalıdır.Sıvı hücresi, kaba ayar düğmesi kullanılarak odağa getirilebilir. Ardından, XY ayarını kullanarak prob ucuna odaklanın. Metalik bir altın üçgen gibi görünüyor.Şimdi aşağı pizo kolunu kullanarak, ucu s'ye yaklaştırınample yüzey, odağı uçlara, yansımaya ayarlayın ve bu yansımaya göre konsolların konumunu izleyin. Şu anda, yakından hizalanmalı, ancak tamamen örtüşmemelidirler. Şimdi şırıngayı hazırlayın.Bir mililitre tampon çözeltisi ile doldurun ve adaptörü takın. Ardından şırıngayı ejeksiyon hortumuna takın ve pistonu tamamen uzatın. Ardından, hazneyi doldurmak için bir adaptör kullanarak hortumu sıvı hücresine takın, haznenin merkezi dolana kadar pistona hafifçe bastırın.Sıvı hücresinden mikroskoba herhangi bir hava kabarcığı veya dökülme olmamalıdır. Ardından şırıngayı haznenin üzerinde iyi desteklenen bir konuma yerleştirin. Ardından, kamera beslemesini ve XY çeviri düğmelerini kullanın.Lazeri ekranda bulmak için dağınık kırmızı bir nokta olarak görünmelidir. Bulunduktan sonra, proba taşımak için lazer kontrollerini kullanın. Şimdi son olarak, mikroskoptaki toplam sinyal dört ile altı arasında maksimize olana kadar lazer ve ayna kontrollerini ayarlayın, kadran diyotunu ayarlayın.Ardından, mikroskoptaki değerler mümkün olduğunca sıfıra yakın olana kadar dikey ve yatay sapmaları ayarlamak için tarama kafasındaki düğmeleri kullanın. Devam etmeden önce uygun satın alma seçeneklerini seçtiğinizden emin olun. Satır başına örnek penceresinde tarama hızını yaklaşık bir hertz olarak ayarlayın.256 girin. Tarama yardımı otomatik kontrolü için. Tarama yardımı için bireysel seçin, otomatik Z limiti seçin, kapalı.Z sınırı 500 nanometre olmalı ve tarama boyutu bir mikron olmalıdır. Ayarlar doğru bir şekilde ayarlandıktan sonra probu ölçün. Prob ucu yüzeye yaklaşırken Z pazo voltaj değişimini gözlemleyin.Uç aralığın dışına çıkarsa, geri çekilir ve tekrar yaklaşırsa, prob ucunun değiştirilmesi gerekebilir. Bu işe yaramazsa, uç devreye girdiğinde, alım pencerelerinin her birinde çizgiler görünmelidir ve bu çizgiler bir görüntü oluşturacaktır. Mika görüntülerini sürekli olarak yakalamaya başlayın.MICA® yüzeyinin hem düz hem de temiz olduğundan emin olmak için yavaşça yakınlaştırın. Soğutulmuş görüntüleme tampon çözeltisi ile dört odacıklı bir Petri kabı hazırlayın. Her odanın en az beş mililitreye ihtiyacı vardır.Seyreltilmiş proteinden bir alikot almadan önce, mikro pipetle hafifçe karıştırın. Daha sonra 200 mikrolitrelik bir alikot alın ve seyreltilmiş proteini MICA® yüzeyine uygulayın. Çözeltinin yüzeyde kalması için yaklaşık 30 saniye bekleyin.Daha sonra disk tutucuları kullanarak, diski eğmeden kaldırın ve hemen ilk tampon çözeltisi havuzuna daldırın. Bir saniye boyunca diskin tezgaha paralel kaldığından emin olun. Durulama adımı sırasında numuneyi Petri kabına paralel tutmak çok önemlidir.Bu yumuşak, esnek moleküller, güçlü sulu çözelti akımları ile yüzeyde bozulabilir. Ardından, diski havuz başına bir saniye boyunca diğer üç havuzun her birine kısa bir süre daldırın. Ardından diski kuru ve tozsuz bir beze aktarın.Fazla nemin beze geçmesine izin verin, ancak diskin tamamen kurumasına izin vermeyin. Bezin s'ye dokunmasına izin vermeyin.ample'yi disk tutucularla kumaştan dikkatlice çıkarın ve s'yi A FM tarayıcıya yerleştirin. Sıvı hücresini numunenin üzerine yerleştirin ve kurulum ve görüntülemeye devam edin.Prob için tüm parametrelerden sonra, yay boyutu ve uç yarıçapı uygun şekilde ayarlanır. Probu görüntüleme yaparken olduğu gibi ölçün. Micah, uç yüzeye yaklaşırken ZP azo'yu gözlemle.Görüntü çekerken, tarayıcının en az iki ardışık geçiş için aynı alanı görüntülemesine izin verin. Her görüntüyü kaydetmek için sürekli yakalamayı kullanın. Görüntü boyutunu ve konumunu istediğiniz gibi ayarlayın.Otomatik yazılım, belirli bir görüntü boyutu için tarama parametrelerini ayarlamayı bitirdiğinde. Para cezası vermek için yazılımı kapatın. Görüntünün odağını ayarlayın: tarama hızını, Z sınırını, satır sayısını ve ayar noktasını manuel olarak ayarlayın.Görüntü çok netlenmezse, orijinal başlangıç konumuna dönmek için yazılımı tekrar açın. Bir proteini yakınlaştırırken, görüntünün çözünürlüğünü artırmak için tarama hızını azaltın ve satır sayısını orantılı olarak artırın. Sonra. Görüntüleri analiz ederken, önce düzleştir simgesine tıklayarak görüntüyü düzleştirin.Sıfırıncı sırayı seçin ve işlemi gerçekleştirin. Bazen uygun şekilde düz görüntüler elde etmek için düz bir uyum kullanmak gerekir. Düz sığdır simgesini seçin ve görüntüdeki düz bir alan üzerinde bir düzlem çizmek için imleci kullanın.Düz uyumu gerçekleştirin ve işlemi gerektiği kadar tekrarlayın. Ardından, proteinin boyutlarını ölçmek için kesit sekmesini seçin. İmleçle analiz edilecek molekül veya alanın üzerine bir çizgi çizin.Bu işlemi birden fazla alanda tekrarlayın. Bir kaplama isteniyorsa, ışığa adapte olmuş durumunda bir fotoreseptör proteini için bir FM kullanılarak herhangi bir sayıda biyolojik molekül incelenebilir, taze bölünmüş bir mika substratı, protein emilimi için uygun bir düz yüzeydir. Tek fotoreseptör protein dimerleri, tepe kuvveti QNM modu kullanılarak gözlemlenebilirdi.Oklar, tek tek dimerleri gösterir ve yıldız işareti, görüntü analiz yazılımı kullanan bir protein agregasını belirtir. Proteinlerin kesitleri, görüntü düzleştirildikten sonra ölçülebilir. XY verileri yükseklik ölçümleri ile ilişkilidir.Bunlar çeşitli hesaplamalar için kullanılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, biyolojik olarak ilgili bir ortamda bir yüzeydeki proteinlerin yüksek çözünürlüklü görüntülerini toplamak için bir A FM deneyi kurabilmelisiniz. En yüksek kuvveti kullanma q ve m Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik yaklaşık üç ila dört saat içinde gerçekleştirilebilir.Bu nedenle, tepe kuvveti q ve m, aletli analiz, biyokimya ve modern fizik gibi laboratuvar derslerine kayıtlı lisans öğrencilerine tanıtmak için uygun bir atomik kuvvet mikroskobu şeklidir. Geliştirilmesinden sonra, bu yöntem, taramalı prob mikroskobu alanındaki araştırmacıların, biyolojik olarak ilgili ortamlardaki proteinler, nükleik asitler ve hatta canlı hücreler gibi biyolojik molekülleri keşfetmeleri için bir yol açmıştır.

atomic-force-microscopy-red-light-photoreceptors-using-peakforce

Research

JoVE Journal

Engineering

Mühendislik

Kaynak: Kulkarni, M. et al. Fare retinasının koni fotoreseptörü akson terminallerinde Ca2+ dinamiği. J. Vis. Uzm. (2015)Bu video, transgenik bir fare retinasının koni fotoreseptörlerindeki kalsiyum dinamiklerini izlemek için iki foton mikroskobunun kullanımını göstermektedir. Arka plan aydınlatması ve ışık stimülasyonu altında kalsiyum seviyelerini ölçmek için retina dilimleri hazırlama, FRET tabanlı kalsiyum biyosensörlerini görüntüleme ve floresan değişikliklerini analiz etme adımlarını ana...

Fare Retina Koni Fotoreseptörlerinde Kalsiyum Dinamiğini İzlemek için İki Foton Mikroskobu

Tek bir T lenfositinde kuvvet regülasyonlu tek reseptör-ligand bağlanma kinetiğini ve kalsiyum sinyalinin gerçek zamanlı görüntülemesini aynı anda ölçmek için bir teknik açıklıyoruz.

Floresan biyomembran Kuvvet Probe: Tek Hücre üzerinde Reseptör-ligand Kinetiklerinin Eşzamanlı kantitasyonu ve Bağlama kaynaklı Hücre içi Sinyal

Son zamanlarda, hücre içi kuvvetin proteine özgü çözünürlüğünü sağlayan bir dizi FRET tabanlı kuvvet biyosensörü geliştirilmiştir. Bu protokolde, nükleoskeleton-hücre iskeleti (LINC) kompleksi proteini Nesprin-2G'nin bağlayıcısı için tasarlanan bu sensörlerden birinin, nükleer LINC kompleksi üzerindeki aktomiyosin kuvvetlerini ölçmek için nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz.

Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) -force biyosensörlerin kullanılması için Protokol Nükleer LINC Kompleksi karşısında Mekanik Kuvvetleri Ölçmek için

Biz ayrıntılı yordamlar ve mekanik özellikleri ve mekanik unfolding yollar tek protein moleküllerinin bir Atomik kuvvet mikroskobu kullanarak ölçmek için stratejileri açıklar. Ayrıca seçim ve bloklama iyi tek protein molekülü kayıtları için bir başvuru olarak temsilcisi sonuçları göster.

Kuvvet spektroskopisi bir Atomik kuvvet mikroskobu kullanılarak tek Protein moleküllerinin

Burada, bir protokol Förster rezonans eşzamanlı kullanımı için protein yük ve floresan kurtarma kuvvet duyarlı ölçüm etkinleştirme protein dynamics ölçmek için photobleaching sonra ölçmek için enerji transferi tabanlı gerilim sensörler mevcut canlı hücreler içinde protein dinamiği.

Kuvvet duyarlı Protein Dynamics floresan teknikleri bir arada kullanarak canlı hücrelerdeki ölçümü

Burada, prosesif miyosin-5 motorları üzerinde ultra hızlı kuvvet kelepçesi deneyleri gerçekleştirmek için kapsamlı bir protokol sunulmaktadır ve bu, diğer proses motor sınıflarının çalışmasına kolayca genişletilebilir. Protokol, deney cihazının kurulumundan numune hazırlama, veri toplama ve analize kadar gerekli tüm adımları detaylandırır.

İşlemsel Miyosinlerin Mekanoenzimatik Özelliklerinin Ultra Hızlı Kuvvet-Kelepçe Spektroskopisi ile Diseksiyonu

Burada, izole embriyonik zebra balığı hücrelerinin hücre içi mekanik özelliklerini optik bir tuzakla doğrudan kuvvet ölçümü ile üç boyutlu hapsetmede araştırmak için bir protokol sunuyoruz.

Optik Cımbız Kullanarak Hapsetmede Hücre Altı Mekaniğinin Doğrudan Kuvvet Ölçümleri

Burada, mikrotübül demetlerini in vitro olarak yeniden yapılandırmak ve eşzamanlı optik yakalama ve toplam iç yansıma floresan mikroskobu kullanarak içlerinde uygulanan kuvvetleri doğrudan ölçmek için bir protokol sunuyoruz. Bu tahlil, aktif mikrotübül ağları içindeki protein toplulukları tarafından üretilen kuvvetlerin ve yer değiştirmelerin nano ölçekte ölçülmesine izin verir.

Yeniden yapılandırılmış aktif mikrotübül demetleri içindeki kuvvetleri doğrudan ölçme

Burada, kuvvete duyarlı biyomoleküller üzerinde maksimum 1.2 kHz hızında nanomekanik ölçümler yapan yüksek hızlı bir manyetik cımbız kurulumunu açıklıyoruz. DNA saç tokalarına ve SNARE komplekslerine model sistemler olarak uygulanmasını tanıtıyoruz, ancak mekanobiyolojik olaylarda yer alan diğer moleküllere de uygulanabilecektir.

Kuvvete duyarlı elemanlarda nanomekanik ölçümler için yüksek hızlı manyetik cımbız

Burada, görüntüleme parametrelerini optimize ettiğimiz, sistem sınırlarını belirlediğimiz ve üç noktalı yıldız DNA motifi montajını görüntülemedeki potansiyel iyileştirmeleri araştırdığımız fototermal kapalı rezonans dokunma (PORT) ile biyomoleküler etkileşimleri gözlemlemek için görüntüleme protokolünü gösteriyoruz.

Fototermal Rezonans Kılavuz Çekme Kullanılarak DNA Üç Köşeli Yıldız Motifi Kendi Kendine Montajın Yüksek Hızlı Atomik Kuvvet Mikroskobu Görüntülemesi

Keşfedin fotoreseptör proteinlerinin yapısını PeakForce Kantitatif Nanomekanik Eşleme ile atomik kuvvet mikroskobu kullanarak inceleme yöntemini. Bu teknik biyolojik olarak uygun ortamda yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlar.

PeakForce Kantitatif Nanomekanik Gayrimenkul Eşleme Kullanma Kırmızı Işık fotoreseptör Atomik Kuvvet Mikroskobu

Daha fazla video keşfet