PeakForce Kantitatif Nanomekanik Gayrimenkul Eşleme Kullanma Kırmızı Işık fotoreseptör Atomik Kuvvet Mikroskobu

Bu prosedürün genel amacı, atomik kuvvet mikroskobu kullanarak fotoreseptör proteinlerinin yüksek çözünürlüklü görüntülerini toplamaktır. Bu, önce fotoreseptörün bir örneğinin elde edilmesi ve seyreltilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, protein örneğini yaklaşık 30 saniye boyunca taze bölünmüş ve temiz bir mika yüzeyine uygulamaktır.

Daha sonra MICA, bağlanmamış ve gevşek bir şekilde bağlanmış molekülleri çıkarmak için tampon ile durulanır. Daha sonra numune, uygun bir prob ile donatılmış bir sıvı hücreye bağlanır. Bu düzenek tarayıcıya yüklenir.

Sıvı hücreyi tampon solüsyonu ile doldurduktan sonra, ucu numune ile birleştirin ve taramaya başlayın. Sonuçta, tepe kuvvetini içeren atomik kuvvet mikroskobu. Kantitatif nano mekanik özellik haritalaması, numune yüzeyindeki tek fotoreseptör proteininin görüntülerini toplamak için kullanılır.

Tepe kuvveti q ve m'yi içeren atomik kuvvet mikroskobu, biyolojik olarak aktif makromoleküllerin işlevini belirleyen önemli yapısal ve kimyasal özelliklerin neler olduğu gibi moleküler biyoloji alanındaki temel soruları cevaplayabilir. Bu tekniğin NMR ve X-ışını kristalografisi gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, bozulmamış proteinlerin ve diğer biyolojik makromoleküllerin yüksek çözünürlüklü görüntülerinin biyolojik olarak ilgili bir ortamda elde edilebilmesidir. Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler, probun ve çözeltinin ayarlanması, bazıları oldukça karmaşık olan birden fazla adım gerektirdiğinden mücadele eder.

Peak force q ve m ve otomatik yazılım ile bu adımların birçoğu daha basit hale getirildi, böylece süreci yeni kullanıcılar ve lisans öğrencileri için çok daha kolay hale getirdi. Bu prosedürü göstermek, araştırma laboratuvarımdan üç lisans öğrencisi, Marie Kroger, Blair Sorenson ve Jessica Thomas olacak. Bu öğrenciler önümüzdeki yıl mikrobiyoloji, kimya mühendisliği ve kimya alanlarında lisansüstü eğitim alacaklardır.

Bu öğelerin belirli bir sırada etkinleştirilmesi gerekir. Önce bilgisayar, sonra denetleyici ve son olarak fiber optik ışık. Mikroskobun bir FM ve LF fm okuması gerekir.

Kamera, yazılımdaki bir FM optik kafasının üzerinde ortalanmalıdır. Aşağıdakiler seçilmelidir. Deney kategorisi mekanik özelliklerdir.

Deney grubu kantitatif nano mekanik haritalamadır ve deney sıvıdaki en yüksek kuvvet q ve m'dir. Ayarlar doğru seçildiğinde, deney yüklenebilir ve ayarlanabilir. Kamera odağı önce Z objektifi kullanılarak ayarlanmalı, ardından sahneyi konumlandırmak için rota kontrolleri kullanılmalıdır, amaç, yeni bölünmüş mika ile örnek diskleri manipüle etmek için A FM kafa açıklığını sahne yüzeyinin bir milimetre önüne yerleştirmektir.

Sıvı hücresini bozulmamış temizlenmiş parçalardan monte etmekle başlayın. İlk olarak, hortum adaptörünü temiz sıvı hücreleri üzerindeki bağlantı noktasına takın. Daha sonra düz uçlu cımbızları çok nazikçe kullanarak, O-ringi sıvı hücresi üzerindeki girintisine bastırın.

Prob tutma klipsinin ardından, yayı hafifçe bastırın ve oluktan çevirin. Aynı cımbızı kullanarak, probu kavrayın ve ucu hücrenin merkezine bakacak şekilde oluğun içine kaydırın. Ardından klipsi kullanarak probu sabitleyin.

Bir sonraki adım, A üzerindeki kelepçeyi kontrol etmektir FM.It tamamen geri çekilmelidir. Düzeneği, numunenin üzerine aşağı bakacak şekilde yerleştirin. Stabilizasyon için düzeneği A FM'nin saplamalarına takın.

Kelepçeyi indirin. O-ringi incelemek için, O-ring görünene kadar mikroskop üzerindeki aşağı düğmesine basın. Destek diski ile sıvı hücresi arasında sıkıca sıkıştırılmalıdır.

Sıvı hücresi, kaba ayar düğmesi kullanılarak odağa getirilebilir. Ardından, XY ayarını kullanarak prob ucuna odaklanın. Metalik bir altın üçgen gibi görünüyor.

Şimdi aşağı pizo kolunu kullanarak, ucu s'ye yaklaştırınample yüzey, odağı uçlara, yansımaya ayarlayın ve bu yansımaya göre konsolların konumunu izleyin. Şu anda, yakından hizalanmalı, ancak tamamen örtüşmemelidirler. Şimdi şırıngayı hazırlayın.

Bir mililitre tampon çözeltisi ile doldurun ve adaptörü takın. Ardından şırıngayı ejeksiyon hortumuna takın ve pistonu tamamen uzatın. Ardından, hazneyi doldurmak için bir adaptör kullanarak hortumu sıvı hücresine takın, haznenin merkezi dolana kadar pistona hafifçe bastırın.

Sıvı hücresinden mikroskoba herhangi bir hava kabarcığı veya dökülme olmamalıdır. Ardından şırıngayı haznenin üzerinde iyi desteklenen bir konuma yerleştirin. Ardından, kamera beslemesini ve XY çeviri düğmelerini kullanın.

Lazeri ekranda bulmak için dağınık kırmızı bir nokta olarak görünmelidir. Bulunduktan sonra, proba taşımak için lazer kontrollerini kullanın. Şimdi son olarak, mikroskoptaki toplam sinyal dört ile altı arasında maksimize olana kadar lazer ve ayna kontrollerini ayarlayın, kadran diyotunu ayarlayın.

Ardından, mikroskoptaki değerler mümkün olduğunca sıfıra yakın olana kadar dikey ve yatay sapmaları ayarlamak için tarama kafasındaki düğmeleri kullanın. Devam etmeden önce uygun satın alma seçeneklerini seçtiğinizden emin olun. Satır başına örnek penceresinde tarama hızını yaklaşık bir hertz olarak ayarlayın.

256 girin. Tarama yardımı otomatik kontrolü için. Tarama yardımı için bireysel seçin, otomatik Z limiti seçin, kapalı.

Z sınırı 500 nanometre olmalı ve tarama boyutu bir mikron olmalıdır. Ayarlar doğru bir şekilde ayarlandıktan sonra probu ölçün. Prob ucu yüzeye yaklaşırken Z pazo voltaj değişimini gözlemleyin.

Uç aralığın dışına çıkarsa, geri çekilir ve tekrar yaklaşırsa, prob ucunun değiştirilmesi gerekebilir. Bu işe yaramazsa, uç devreye girdiğinde, alım pencerelerinin her birinde çizgiler görünmelidir ve bu çizgiler bir görüntü oluşturacaktır. Mika görüntülerini sürekli olarak yakalamaya başlayın.

MICA® yüzeyinin hem düz hem de temiz olduğundan emin olmak için yavaşça yakınlaştırın. Soğutulmuş görüntüleme tampon çözeltisi ile dört odacıklı bir Petri kabı hazırlayın. Her odanın en az beş mililitreye ihtiyacı vardır.

Seyreltilmiş proteinden bir alikot almadan önce, mikro pipetle hafifçe karıştırın. Daha sonra 200 mikrolitrelik bir alikot alın ve seyreltilmiş proteini MICA® yüzeyine uygulayın. Çözeltinin yüzeyde kalması için yaklaşık 30 saniye bekleyin.

Daha sonra disk tutucuları kullanarak, diski eğmeden kaldırın ve hemen ilk tampon çözeltisi havuzuna daldırın. Bir saniye boyunca diskin tezgaha paralel kaldığından emin olun. Durulama adımı sırasında numuneyi Petri kabına paralel tutmak çok önemlidir.

Bu yumuşak, esnek moleküller, güçlü sulu çözelti akımları ile yüzeyde bozulabilir. Ardından, diski havuz başına bir saniye boyunca diğer üç havuzun her birine kısa bir süre daldırın. Ardından diski kuru ve tozsuz bir beze aktarın.

Fazla nemin beze geçmesine izin verin, ancak diskin tamamen kurumasına izin vermeyin. Bezin s'ye dokunmasına izin vermeyin.ample'yi disk tutucularla kumaştan dikkatlice çıkarın ve s'yi A FM tarayıcıya yerleştirin. Sıvı hücresini numunenin üzerine yerleştirin ve kurulum ve görüntülemeye devam edin.

Prob için tüm parametrelerden sonra, yay boyutu ve uç yarıçapı uygun şekilde ayarlanır. Probu görüntüleme yaparken olduğu gibi ölçün. Micah, uç yüzeye yaklaşırken ZP azo'yu gözlemle.

Görüntü çekerken, tarayıcının en az iki ardışık geçiş için aynı alanı görüntülemesine izin verin. Her görüntüyü kaydetmek için sürekli yakalamayı kullanın. Görüntü boyutunu ve konumunu istediğiniz gibi ayarlayın.

Otomatik yazılım, belirli bir görüntü boyutu için tarama parametrelerini ayarlamayı bitirdiğinde. Para cezası vermek için yazılımı kapatın. Görüntünün odağını ayarlayın: tarama hızını, Z sınırını, satır sayısını ve ayar noktasını manuel olarak ayarlayın.

Görüntü çok netlenmezse, orijinal başlangıç konumuna dönmek için yazılımı tekrar açın. Bir proteini yakınlaştırırken, görüntünün çözünürlüğünü artırmak için tarama hızını azaltın ve satır sayısını orantılı olarak artırın. Sonra. Görüntüleri analiz ederken, önce düzleştir simgesine tıklayarak görüntüyü düzleştirin.

Sıfırıncı sırayı seçin ve işlemi gerçekleştirin. Bazen uygun şekilde düz görüntüler elde etmek için düz bir uyum kullanmak gerekir. Düz sığdır simgesini seçin ve görüntüdeki düz bir alan üzerinde bir düzlem çizmek için imleci kullanın.

Düz uyumu gerçekleştirin ve işlemi gerektiği kadar tekrarlayın. Ardından, proteinin boyutlarını ölçmek için kesit sekmesini seçin. İmleçle analiz edilecek molekül veya alanın üzerine bir çizgi çizin.

Bu işlemi birden fazla alanda tekrarlayın. Bir kaplama isteniyorsa, ışığa adapte olmuş durumunda bir fotoreseptör proteini için bir FM kullanılarak herhangi bir sayıda biyolojik molekül incelenebilir, taze bölünmüş bir mika substratı, protein emilimi için uygun bir düz yüzeydir. Tek fotoreseptör protein dimerleri, tepe kuvveti QNM modu kullanılarak gözlemlenebilirdi.

Oklar, tek tek dimerleri gösterir ve yıldız işareti, görüntü analiz yazılımı kullanan bir protein agregasını belirtir. Proteinlerin kesitleri, görüntü düzleştirildikten sonra ölçülebilir. XY verileri yükseklik ölçümleri ile ilişkilidir.

Bunlar çeşitli hesaplamalar için kullanılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, biyolojik olarak ilgili bir ortamda bir yüzeydeki proteinlerin yüksek çözünürlüklü görüntülerini toplamak için bir A FM deneyi kurabilmelisiniz. En yüksek kuvveti kullanma q ve m Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik yaklaşık üç ila dört saat içinde gerçekleştirilebilir.

Bu nedenle, tepe kuvveti q ve m, aletli analiz, biyokimya ve modern fizik gibi laboratuvar derslerine kayıtlı lisans öğrencilerine tanıtmak için uygun bir atomik kuvvet mikroskobu şeklidir. Geliştirilmesinden sonra, bu yöntem, taramalı prob mikroskobu alanındaki araştırmacıların, biyolojik olarak ilgili ortamlardaki proteinler, nükleik asitler ve hatta canlı hücreler gibi biyolojik molekülleri keşfetmeleri için bir yol açmıştır.