Name: Üretim ve seçici transduce İlköğretim Oligodendrosit Öncü Hücreler için Lentivirüste kullanımı için İn Vitro Myelinasyon Tahliller (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Öğrenin lentiviral transdüksiyon yöntemiyle oligodendrosit öncü hücrelerde protein aşırı ekspresyonunu in vitro miyelinasyon çalışmaları için nasıl gerçekleştirilir. Bu teknik, merkezi sinir sistemi miyelinasyon süreçlerini anlamak için güçlü bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Avustralya Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi (NHMRC bursu #454330'dan JX'e, proje hibesi #628761 SM'ye ve APP1058647'den JX'e), Multipl Skleroz Araştırma Avustralya (MSRA #12070'ten JX'e), Melbourne Üniversitesi Araştırma Hibe Destek Programı ve JX'e Melbourne Araştırma CI Bursu'nun yanı sıra HP ve AF'ye Avustralya Yüksek Lisans Bursları tarafından desteklenmiştir. Operasyonel Altyapı Şemasını kabul etmek isteriz. Yenilik, Sanayi ve Bölgesel Kalkınma Departmanı, Victoria Avustralya.

<ol><li>Baumann, N., Pham-Dinh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+oligodendrocyte+and+myelin+in+the+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system.</a> Physiol Rev. 81 (2), 871-927 (2001).</li>
<li>Watkins, T. A., Emery, B., Mulinyawe, S., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+stages+of+myelination+regulated+by+gamma-secretase+and+astrocytes+in+a+rapidly+myelinating+CNS+coculture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Distinct stages of myelination regulated by gamma-secretase and astrocytes in a rapidly myelinating CNS coculture system.</a> Neuron. 60 (4), 555-569 (2008).</li>
<li>Lee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MDGAs+interact+selectively+with+neuroligin-2+but+not+other+neuroligins+to+regulate+inhibitory+synapse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">MDGAs interact selectively with neuroligin-2 but not other neuroligins to regulate inhibitory synapse development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (1), 336-341 (2013).</li>
<li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BDNF+exerts+contrasting+effects+on+peripheral+myelination+of+NGF-dependent+and+BDNF-dependent+DRG+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">BDNF exerts contrasting effects on peripheral myelination of NGF-dependent and BDNF-dependent DRG neurons.</a> J Neurosci. 29 (13), 4016-4022 (2009).</li>
<li>Chan, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NGF+controls+axonal+receptivity+to+myelination+by+Schwann+cells+or+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes.</a> Neuron. 43 (2), 183-191 (2004).</li>
<li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-Derived+Neurotrophic+Factor+Promotes+Central+Nervous+System+Myelination+via+a+Direct+Effect+upon+Oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosignals%22%5BJournal%5D)">Brain-Derived Neurotrophic Factor Promotes Central Nervous System Myelination via a Direct Effect upon Oligodendrocytes.</a> Neurosignals. 18 (3), 186-202 (2010).</li>
<li>Lundgaard, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuregulin+and+BDNF+induce+a+switch+to+NMDA+receptor-dependent+myelination+by+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Neuregulin and BDNF induce a switch to NMDA receptor-dependent myelination by oligodendrocytes.</a> PLoS Biology. 11 (12), e1001743(2013).</li>
<li>Kleitman, N., W, P. M., Bunge, R. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKleitman%2C+N+%22Tissue+culture+methodes+for+the+study+of+myelination%22">Tissue culture methodes for the study of myelination</a>. , MIT Press. Cambridge, MA. (1991).</li>
<li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+signal-regulated+kinase+1%2F2+signaling+promotes+oligodendrocyte+myelination+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Extracellular signal-regulated kinase 1/2 signaling promotes oligodendrocyte myelination in vitro.</a> J Neurochem. 122 (6), 1167-1180 (2012).</li>
<li>Wong, A. W., Xiao, J., Kemper, D., Kilpatrick, T. J., Murray, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendroglial+expression+of+TrkB+independently+regulates+myelination+and+progenitor+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Oligodendroglial expression of TrkB independently regulates myelination and progenitor cell proliferation.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (11), 4947-4957 (2013).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning%2C+Characterization+and+Expression+of+miR-15a-3p+and+miR-15b-3p+in+Dairy+Cattle%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Probes%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning, Characterization and Expression of miR-15a-3p and miR-15b-3p in Dairy Cattle.</a> Molecular and Cellular Probes. , (2014).</li>
<li>Emery, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+gene+regulatory+factor+is+a+critical+transcriptional+regulator+required+for+CNS+myelination%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Myelin gene regulatory factor is a critical transcriptional regulator required for CNS myelination.</a> Cell. 138 (1), 172-185 (2009).</li>
<li>Murai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+receptor+TLX+stimulates+hippocampal+neurogenesis+and+enhances+learning+and+memory+in+a+transgenic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Nuclear receptor TLX stimulates hippocampal neurogenesis and enhances learning and memory in a transgenic mouse model.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (25), 9115-9120 (2014).</li>
</ol>

Yazarlar bu araştırma ile ilgili herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Aksonların myelinizasyonuna omurgalıların merkezi ve çevresel sinir sistemlerinde optimal fonksiyonu için önemli bir işlemdir. miyelinli akson nesil ve bakım ve hücre dışı matriks proteinleri (Schwann hücreleri veya oligodendrositler itibaren) moleküler nöronal arasındaki etkileşimleri, glial içeren bir karmaşık ve koordineli bir süreçtir. Bu protokolün önemi ve uygulanabilirliği karışık ko-kültür ayarları içinde belirli bir hücre tipinde proteinlerin manipülasyonu izin vermesidir. Birden fazla hücre tipleri, belirli pr...

Aksonların myelinizasyonuna hem merkezi hem periferik sinir sisteminde aksiyon potansiyeli hızlı ve etkin iletimi için çok önemlidir. İhtisas hücreler, Schwann hücreleri, merkezi sinir sisteminde periferik sinir sistemi ve oligodendrositler olarak, etrafında sarın ve miyelin de ensheathe aksonlar, etkin bir sinir yalıtım ve saltatory iletimini 1 kolaylaştırılması. miyelinasyon işlemi, retinal ganglion nöronlarının 2, mühendislik nanolifler 3 ya da Schwann hücrelerinin 4 veya oligodendrosit 5-7 ya da birlikte kültürlenmiş Dorsal kök ganglion nöronlarının kullanılarak in vitro incelenebilir. in vitro miyelinasyon tahlil sinir sistemi miyelinasyonun eğitim için kurulmuş bir modeldir ve in vivo 5-8 miyelinasyona sırasında meydana temel süreçlerin birçok çoğaltır. Tahlil C OPC ile dorsal kök ganglion (DRG) nöronların saflaştırılmış popülasyonlarının kokültürü, (içerirNS myelinasyon) veya Schwann hücreleri (PNS miyelinasyona için). Belirli koşullar altında bu myelinating hücrelerin in vivo mevcut miyelin spesifik proteinlerin aynı tamamlayıcısı ifade plazma zarı yalıtım sipariş ultra yapısal doğrulanmış, çok katmanlı levha DRG aksonlar ensheathe. in vitro olarak merkezi sinir sistemi miyelin okuyan en yaygın olarak kullanılan hücre modeli başarılı bir şekilde bu nörotrofinlerin gibi dış faktörler, in vitro 5,6 CNS miyelinasyon üzerinde uyguladığı etkilerini incelemek için kullanılmıştır DRG nöronlarının ve OPC, ko-kültürler bir. Bu gibi büyüme faktörlerinin veya küçük molekül farmakolojik inhibitörleri olarak, dış faktörlerin yaygın DRG&#39;ye OPC kokültürünün modeli 7,9 ile miyelinasyon yolaklarını rolünü incelemek için kullanılmıştır. Ancak, nöronlar ve oligodendrositlerin hem de içeren karma ko-kültür ortamlarında, resmen mümkün kaldığını büyüme faktörleri veya phar yamacological inhibitörleri DRG nöronlar ve oligodendrosit (OL) hem üzerine etkileri sarf olabilirdi. Bu, özellikle proteinler DRG&#39;lerin sadece ifade veya oligodendroglia bu ikili hücre sistemini kullanarak miyelinasyona üzerine uyguladığı bu rolleri incelemek için yeteneği sunuyor. Tümden oligodendroglial sinyalizasyon yolunun doğrudan, in vitro miyelinasyon deneyi için DRG nöronlarının üzerine konmadan önce, yanı sıra, yabani tip ve mutant proteinlerin her ikisini fazla sentezleyen bir zarif bir yolu olduğu kanıtlanmıştır miyelinasyon, OPC lentiviral transdüksiyon düzenleyen olduğunu doğrulamak için oligodendrositler tarafından kurucu olarak ifade proteinlerin demonte ifadesi olarak. Böylece bu yaklaşım, özellikle sorguya ve miyelinasyonun 9,10 çalışmak için oligodendrositler içinde sinyal yolları işlemek için bir cadde sunuyor. Bu yazıda, biz bir lentiviral aracılığıyla seçici oligodendrositlerin ilgi bir protein aşın geliştirdik yöntemleri raporin vitro miyelinasyonun incelemek için yaklaşım. teknikler ilgi alanı dahilindeki geni içeren sentezleme vektörlerinin üretimi ile başlar, daha sonra daha sonra pENTR vektörü (pENTR L1-L2 pENTR4IRES2GFP) klonlanır bir vahşi tipli, yapısal olarak aktif bir veya baskın negatif formunda olsun. (Ilgili geni içeren) Bu vektör, CMV yükselticisi verici (pENTR L4-R1, pENTR-pDNOR CMV) ve 2K7 Lentivector CMV promotörünü içeren bir 2K7 vektör yapılandırmak için söz konusu genin bir üretilmesi için bir enzim reaksiyonu birleştirilir ensefalomiyokarditis ve GFP (Şekil 1). PMD2.G virüs kılıfının ve pBR8.91 virüs paketi ile birlikte, bu ağ klonlanmış 2K7 yapısı daha sonra OPC nakletmek için kullanılabilir lentivirüs oluşturmak için HEK293T hücrelerine ko-transfekte edilirler. Lentivirüs ile enfekte sonra OPC ilgi protein yüksek düzeyde ifade. Bu OPC sonra DRG nöron kültürleri üzerine ekilmiş ve etkisi ifadesi olduğunu edilebiliristenen proteinin yüksek düzeyde sorguya olabilir miyelinasyona üzerinde uygular. ko-kültürler Western blot analizi ile miyelin protein ifadesi için değerlendirilir ve immünositokimya miyelinli aksonal segmentlerin oluşumu için görünür hale getirilir.

<table><tbody><tr><td>2K7 lentivektör&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Dr Suter9</sup</td></tr> <tr><td>>5-Floro-2 & prime; -deoksiüridin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503-100mg</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Keçi anti-fare IgG</td><td>Jackson İmmünoresearch</td><td>115545205</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 keçi anti-tavşan IgG (H + L)</td> <td>Life Technologies</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 keçi anti-fare IgG (H + L)</td> <td>Life Teknolojiler</td><td>A11005</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 keçi tavşan önleyici IgG (H + L)</td> <td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A11012</td><td></td></tr><tr><td>Ampisilin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9518-5G</td><td></td></tr><tr><td>B27 - NeuroCul SM1 Nöronal Takviyesi</td><td>Kök Hücre Teknolojileri&nbsp;</td><td>5711</td><td></td></tr><tr><td>BDNF (İnsan)</td><td>Peprotech</td><td>PT450021000</td><td></td></tr><tr><td>Biotin (d-Biotin)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>Bradford Reaktifi</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B6916-500ML&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4161</td><td></td></tr><tr><td>Kloramfenikol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378-100G</td><td></td></tr><tr><td>CNTF</td><td>Peprotech</td><td>450-13020</td><td></td></tr><tr><td>DAKO floresan montaj ortamı</td><td>DAKO</td><td>S302380-2</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, yüksek glikoz, piruvat, glutamin yok</td><td>DNase</td><td></td> 10313039 <td>Yaşam</td>Teknolojileri</tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025-375KU</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, kalsiyum, magnezyum</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>14040182</td><td></td></tr><tr><td>EBSS</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>14155063</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>NEB</td><td>R3101</td><td></td></tr><tr><td>Promotör ve ilgilenilen</td><td></td><td></td> gen için giriş vektörleri <td>Protokollere göre oluşturun 1-2</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12003C</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6886-50MG</td><td></td></tr><tr><td>Glikoz (D-glikoz)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Kimyasal Kaynağı</td><td>GL010-500M Stok</td><td>çözümlerine bakın</td></tr><tr><td>Keçi Anti-Fare IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115005003</td><td></td></tr><tr><td>Keçi Anti-Fare IgM&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115005020</td><td></td></tr><tr><td>Keçi Anti-Sıçan IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>112005167</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Igepal</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I3021-100ML&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>İnsülin&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I6634&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kanamisin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60615</td><td></td></tr><tr><td>Laminin&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>23017015</td><td></td></tr><tr><td>LB Medium</td><td></td><td></td><td>Stok çözümlerine bakın</td></tr><tr><td>LB-Agar</td><td></td><td></td><td>Stok çözümlerine bakın</td></tr><tr><td>L-Sistein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-7477</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz'in L-15 Orta</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11415064</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1626</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin- 200 mM (100x) sıvı</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>LR Klonaz II Plus enzim</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>12538-120</td><td></td></tr><tr><td>MEM, NEAA, Glutamin yok</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>10370088</td><td></td></tr><tr><td>Fare ve alfa; &beta; III Tübülin&nbsp;</td><td>Promega</td><td>G7121</td><td></td></tr><tr><td>Fare ve alfa; MBP (monoklonal)</td><td>Millipore</td><td>MAB381</td><td></td></tr><tr><td>Na piruvat ve nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>NAC</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8199</td><td></td></tr><tr><td>NcoI-HF</td><td>NEB</td><td>R3193S</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 4</td><td>NEB</td><td>B7004S</td><td></td></tr><tr><td>Nörobazal ortam</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>NGF (fare)</td><td>Alomone Labs</td><td>N-100</td><td></td></tr><tr><td>NT-3</td><td>Peprotech</td><td>&nbsp; 450-03</td><td></td></tr><tr><td>O1 antikoru - Fare anti-O1</td><td>Millipore</td><td>MAB344</td><td>O1 hibridoma hücreleri mevcut değilse alternatif</td></tr><tr><td>O1 hibridoma hücreleri</td><td></td><td></td> O4 antikorunun <td>immünopanning için kullanılacak anti-O1 antikoru içeren şartlandırılmış ortam</td></tr><tr><td>- Fare anti-O4</td><td>Millipore</td><td>MAB345</td><td>O4 hibridoma hücreleri mevcut değilse alternatif</td></tr><tr><td>O4 hibridoma hücreleri</td><td></td><td></td><td>İmmünopanasyon için kullanılacak anti-O4 antikoru içeren şartlandırılmış ortam</td></tr><tr><td>Yetkili hücreler</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A10460</td><td></td></tr><tr><td>Tek Atış Stbl yetkili hücreler</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>C7373-03</td><td></td></tr><tr><td>Papain Süspansiyon</td><td>Worthington/Cooper</td><td>LS003126</td><td></td></tr><tr><td>pBR8.91</td><td></td><td></td><td>Dr Denham'dan nazik hediye 10</td></tr><tr><td>PDGF-AA (İnsan)</td><td>Peprotech</td><td>PT10013A500&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-streptomisin 100x çözeltisi</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>pENTRY4IRES2GFP</td><td>Invitrogen</td><td>11818-010&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-lizin</td><td>Sigma</td><td>P6407-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenimin (PEI)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>408727-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-ornitin&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>P3655</td><td></td></tr><tr><td>Progesteron&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>Proteaz inhibitör tableti (Komple mini)</td> <td>Roche</td><td>11836153001</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaz K</td><td></td><td></td><td>Klonaz enzimi Putresin ile birlikte verilir</td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-5780</td><td></td></tr><tr><td>Tavşan ve alfa; nörofilament</td><td>Millipore</td><td>AB1987 ve nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tavşan ve alfa; MBP (poliklonal)</td> <td>Millipore</td><td>AB980</td><td></td></tr><tr><td>Ran2 hibridoma hücreleri</td><td>ATCC</td><td>TIB-119</td><td>İmmünopanning için kullanılacak anti-Ran2 antikoru içeren şartlandırılmış ortam</td></tr><tr><td>Sıçan anti CD140A / PDGFRa antikoru</td><td>BD Pharmingen</td><td>558774</td><td></td></tr><tr><td>SacII</td><td>NEB</td><td>R0157</td><td></td></tr><tr><td>SOC ortamı</td><td></td><td></td><td>Yetkili bakterilerle</td></tr> <tr><td>birlikte verilirSodyum selenit ve nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>Spe I</td><td>NEB</td><td>R0133S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligaz</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligaz Tamponu</td><td>NEB</td><td>B0202S</td><td></td></tr><tr><td>TE tamponu pH8</td><td></td><td></td><td>Stok çözeltilerine bakın</td></tr><tr><td>TNE lizis tamponu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>İz Elementler B</td><td>Cellgro&nbsp;</td><td>99-175-CI</td><td></td></tr><tr><td>Transferrin (apo-Transferrin insan)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284 & nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9201-1G</td><td></td></tr><tr><td>Tavuk Yumurtasından Tripsin İnhibitörü Beyaz</td><td>Roche</td><td>10109878001</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA (1x), fenol kırmızısı (% 0.05)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Konjuge Griffonia Simplicifolia Lektin BSL-1</td><td>Vektör laboratuvarları&nbsp;</td><td>L-1100</td><td></td></tr><tr><td>Üridin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3003-5G</td><td></td></tr></tbody></table>

Üretim ve seçici transduce İlköğretim oligodendrosit Öncü hücreler için lentivirüste kullanımı için İn vitro myelinasyon tahliller

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Miyelinasyon nöronlar ve glial hücreleri oluşturan miyelin iki içeren karmaşık bir süreçtir, periferal sinir sisteminin (PNS), merkezi sinir sisteminde (CNS) oligodendrositler ve Schwann hücreleri. Biz bir in vitro miyelinasyon deneyi, in vitro MSS miyelinasyonun eğitim için kurulmuş bir modeli kullanın. Bunu yapmak için, ön-madde oligodendrosit hücreleri (OPC) Myelinating ko-kültürler oluşturmak üzere saflaştırılmış primer, kemirgen Dorsal kök ganglion (DRG) nöronlarının ilave edilir. Oligodendrositler tarafından ifade belirli proteinler miyelinasyona üzerine uygulamayın spesifik rolleri sorgulamak için biz seçici DRG nöronlar üzerine numaralı seribaşı önce yabani türü, yapısal olarak aktif veya dominant negatif proteinlerini aşın lentivirüs kullanarak OPC transduce protokolleri geliştirmiştir. Bu bize özellikle miyelinasyonun düzenleyen bu oligodendroglial proteinlerin rollerini sorgulamak için izin verir. protokolleri de ot çalışmaya uygulanabilirher hücre tipi, böylece bu tip bir sinyal ve dengeleme mekanizmaları arasında hedef çalışma için oligodendrositler gibi arzu edilen bir hücre tipi ile ifade edilen proteinlerin, seçici manipülasyonuna olanak veren bir yaklaşım sağlar. Sonuç olarak, lentiviral enfekte OPC ile in vitro miyelinasyon tahlil birleştirerek miyelinasyona yer alan moleküler mekanizmaların analizi için stratejik bir araç sağlar.

FLAG-etiketli hücre dışı sinyal ile ilişkili kinaz 1 (Flag-ERK1) enzim 2K7 yapıları ve virüs üretimi için gerekli olan ambalaj ve aksesuar yapılar, her iki dahil olmak üzere kullanılan yapıların, bir restriksiyon dijest ile doğrulanır lentivirüs üretimi için kullanılan yapı (Şekil 3) . <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52179/52179fig3highres.jpg"> Şekil 3: DNA yapısı doğrulama. Lentivirüs üretimi için gerekli...

Burada, oligodendrosit öncü hücrelerini, merkezi sinir sistemi miyelinasyonunun in vitro modeli aracılığıyla oligodendrositlerdeki rollerini spesifik olarak sorgulamak amacıyla, ilgilenilen proteinleri aşırı eksprese etmek üzere viral olarak manipüle etmek için esnek ve stratejik bir temel sunan protokoller sunuyoruz.

Üretim ve seçici transduce İlköğretim Oligodendrosit Öncü Hücreler için Lentivirüste kullanımı için İn Vitro Myelinasyon Tahliller

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and ...

Bu prosedürün genel amacı, oligodendrosit öncü hücrelerini veya OPC'leri viral olarak manipüle etmek, ilgilenilen proteinleri aşırı eksprese etmektir. CNS Miyelinasyon Ulusu'nun in vitro çalışması için, bu ilk olarak bir lentiviral vektörün klonlanmasıyla gerçekleştirilir. Sonraki adımlar, lentivirüsü üretmek ve deney için en uygun viral konsantrasyonu belirlemektir.Bunu takiben, diseke edilmiş ve kültürlenmiş OPC'ler lentivirüs ile transdüksiyona tabi tutulur. Son adım, transdüksiyona uğrayan OPC'leri DRG'den diseke edilen kültürlenmiş nöronlar üzerine tohumlamaktır. Sonuç olarak, miyelinizan kokültürler, western blot analizi ile miyelin protein ekspresyonu açısından değerlendirilir ve immün boyama ile miyelinli aksonal segmentlerin oluşumu için görselleştirilir.Bu tekniğin farmakolojik araçlar gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, lentiviral yaklaşımın, istediğimiz hücre tipinde vahşi tip veya mutant proteinleri seçici olarak aşırı eksprese etmemize izin vermesidir, bu durumda oligodendrositler Hazırlık aşamasında, transfeksiyon gününün sabahı metin protokolünde açıklandığı gibi gerekli 2K yedi ödünç vektörü klonlar, 25 mililitre besiyeri içeren bir T 1 75 şişesinde 32 milyon HEK 2 93 T hücresi hazırlayın. Kritik olarak, bu hücreler transfeksiyondan önce sıkışmalıdır, bu nedenle gerekirse onları daha erken plakalayın. 50 mililitrelik bir Falcon tüpünde, tablo bir'de detaylandırıldığı gibi T 1 75 şişe transfeksiyonu için bir ana karışım hazırlayın, DMEM girdabını ısıtmak için DNA ekleyin, ardından erken çökelmeyi önlemek için en son steril PEI ekleyin.Tüpü üç veya dört kez ters çevirerek iyice karıştırın, ardından karışımı tezgahta yaklaşık 15 dakika inkübe edin. Hücreler üzerindeki ortamı değiştirin ve ardından transfeksiyon karışımını ekleyin. DROPWISE, ortamı hücrelerin üzerinde nazikçe karıştırın ve ardından hücreleri gece boyunca inkübe edin.Ertesi gün. GFP ekspresyonu floresan mikroskobu ile kontrol edilebilir. Transfeksiyondan 48 saat sonra, ilk viral süpernatan partisini toplayın ve hücrelere 25 mililitre taze ortam ekleyin.Viral süpernatanı dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 1.140 G'de santrifüjleyin. Viral süpernatanı hücre kalıntısı peleti olmadan yeni bir tüpe aktarın ve dört santigrat derecede saklayın. Ertesi gün, transfeksiyondan 72 saat sonra, hücre kalıntılarını çıkarmak ve ilk temizlenmiş viral süpernatan partisi ile bir araya getirmek için son viral süpernatan santrifüj partisini toplayın.Daha sonra viral süpernatanı 90 dakika boyunca 170.000 Gs'de ultra santrifüjleyerek virüsü konsantre edin. Dört santigrat derecede. Ultra santrifüjü boşaltın ve süpernatanı dökün, 30 mililitrelik tüpün dibinde görünmeyen çökelmiş PEI ve virüsten oluşan bir damat bırakın.Bu işlemi tekrarlayın. Her bir ultrasantrifüj tüpünde virüsü yeniden askıya almak için virüsü konsantre etmek için tüm viral süpernatları aynı 30 mililitrelik tüplerde gruplar halinde santrifüjlemek. 500 mikrolitre Sato ortamı ekleyin ve tüpü filmle kaplayın.Ardından tüpü 30 saniye boyunca girdap haline getirin ve peleti bir pipet ucuyla mekanik olarak yerinden çıkarın. Peletin Sato ortamına tamamen asılı kaldığından emin olmak için bu girdap yerinden çıkma döngüsünü yaklaşık altı kez tekrarlayın. Şimdi Sato'daki tüm askıya alınmış virüsü yeni bir mikro tüpte toplayın.Havuzlanmış süpernatanı bir dakika boyunca maksimum hızda kısa bir süre döndürün. PEI'yi peletlemek için, daha sonra virüsü içeren süpernatanı toplayın ve çözeltiyi sarmak için bir şırınga kullanarak 0.45 mikronluk bir filtreden geçirerek filtreleyin. Sedia'daki saflaştırılmış virüsü 2050 ve 100 mikrolitrelik hacimlere ayıklayın ve hepsini eksi 80 santigrat derecede saklayın.Bu protokol için primer oligodendrosit öncü hücrelerine sahip olun. Aşağıdaki büyüme faktörlerini içeren 10 mililitre sedia ile 10 santimetrelik plakalarda kültürlenen OPC'ler, C-N-T-F-P-D-G-F-N, NT üç ve hücreler için% 8 Karbondioksit altında 24 saat kültürlenmiş olmalıdır. Ortamı aspire etmekle başlayın ve tamamen çıkarın.Ardından, büyüme faktörleri ile aynı ortamdan 10 mililitre ile değiştirin. OPC'lerinizi lentivirüs ile enfekte edin, gerekli miktarda virüsü ortama damla damla ekleyerek ilgilenilen proteini ifade edin. Ayrıca ayrı bir OPC plakasında, sadece GFP'yi ifade eden kontrol lentivirüsünü medya kültürüne, hücrelere 48 saat daha karıştırın.Daha sonra, kültürlenmiş GRG nöronlarına tohumlamak için OPC'leri plakalardan toplayın. İlk olarak, her plakayı sekiz mililitre EBSS ile iki kez durulayın. Dokuz mililitre ılık EBSS ile bir mililitre tripsin EDTA %0.05 oluşturun.Her plakaya beş mililitre seyreltilmiş tripsin ekleyin. 37 santigrat derecede iki dakikaya kadar inkübe edin. EBSS'ye beş mililitre% 30 FBS ekleyerek tripsini nötralize edin.Sonra 10 mililitrelik bir pipet kullanarak. OPC'leri plaka yüzeyinden yıkayın. Tüm hücreleri toplamak için plakayı her seferinde çeyrek tur çevirin.Hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Hücreleri oda sıcaklığında 180 Gs'de 15 dakika santrifüjleyin. Hücre peletini büyüme faktörleri olmadan bir mililitre ılık saddo ortamında askıya alın ve hücreleri sayın.Daha sonra, 22 milimetrelik kapak kızakları üzerinde kültürlenen DRG nöronlarını, ortamı plakalarından tamamen aspire ederek hazırlayın. Daha sonra her bir kapak kızağına damla damla 200.000 OPC'yi nazikçe tohumlayın. Tohumlama hacmi, örtü fişi başına 200 mikrolitreden az olmalıdır.Plakayı hareket ettirmeden hücrelerin yerleşmesine izin verin 10 dakika sonra, her bir kuyucuğun üzerine bir mililitre ılık su serpin. Şimdi kalan kardeş OPC'leri tekrar oynatın. Büyüme faktörleri içeren omed ile, daha sonra ilgilenilen proteinin ekspresyonunu doğrulamak için kullanılabilirler.Hücre dışı sinyalle ilgili kinaz etiketli bir bayrak. Lentivirüs üretim kısıtlaması için bir yapı kullanıldı: OPC'lerde kullanılacak optimum virüs seyreltmesini belirlemek için paketleme yapısını ve aksesuar yapısını doğrulamak için enzimler kullanıldı. IR bir lentivirüs, HEK 2 93 T hücrelerinde HEK 2 93 T hücrelerine bir dizi viral seyreltme ile titre edildi.İlgilenilen genin ekspresyon seviyeleri zamanla artmıştır. Daha sonra, saflaştırılmış OPC'ler, transgen ekspresyonunu sağlamak için en az iki gün boyunca enfekte edildi ve kültürlendi. Kardeş OPC'lerde FLAG ve GFP seviyeleri doğrulandı.OPC'ler daha sonra DRG nöronlarına oturtuldu. OPC'ler daha sonra oligodendrositlere farklılaştı ve batılılar tarafından değerlendirildiği gibi miyelin proteinlerini eksprese etmeye başladılar. MBP boyama aksonları ile görüntülenen bazı olgun oligodendrositler miyelinli, akson yoğunluklarının dikkate alındığından emin olmak için nörofilament veya beta üç tübülin ile boyandı.Miyelinasyon seviyelerini analiz ederken, OPC'leri tohumladıktan sonra, kültür için önemlidir. Kardeş APC'ler. Bu şekilde, ilgilenilen protein veya ilgilenilen protein üzerindeki etiket, bu ifade, ko-kültürde doğrulanamıyorsa, kardeş APC'lerde doğrulanabilir.

production-use-lentivirus-to-selectively-transduce-primary

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Biz küçük bir molekül tabanlı oligodendrosit öncü hücreler (OPC) içine fare embriyonik kök hücreleri farklılaşma için protokol açıklar. Bu protokol, 30 gün farklılaşma, yüksek verimlilik ile Olig2 + NG2 + OPC üretir. Ayrıca, aksiyon potansiyelleri ateş "spike" OPC oluşturmak için bir yöntem açıklanmaktadır.

Embriyonik Kök Hücreler farklılaşma oligodendrosit Öncüleri

Lentiviral aracılı demonte sırasında Ex vivo İnsan Hematopoetik Kök Hücre Eritropoiesis

Bu protokolü biz üretim, saflaştırma ve lentiviral vektörlerin titrasyonu açıklar. Biz primer kültürlerinde nöronlar ve astrositlerde lentiviral vektör aracılıklı gen aktarımının bir örnek oluşturmaktadır. Bizim yöntemleri diğer hücre türleri için de geçerli...

Merkezi sinir sisteminin transducing Hücreleri için lentiviral Vektörler Üretimi

Video, oligodendrosit öncü hücrelerini (OPC'ler) oligodendrositlere farklılaştırmak ve dorsal kök ganglion (DRG) nöronları ile bir ko-kültürde miyelinasyonu indüklemek için bir protokolü göstermektedir. OPC'ler, miyelinasyonu düzenleyen bir sinyal proteinini kodlayan lentiviral vektörlerle dönüştürülür. Dönüştürülen OPC'ler, oligodendrositlere farklılaşmayı ve sinyal proteini kaynaklı miyelinasyonu değerlendirmek için DRG nöronları ile birlikte kültürlenir.

Oligodendrosit Öncü Hücreleri için İn Vitro Transdüksiyonla İndüklenen Miyelinasyon Testi

Oligodendrositler, merkezi sinir sisteminin miyelinli hücreleridir. Bu protokol, öncülleri olan oligodendrosit progenitör hücrelerinin sıçan kortekslerinden izolasyonu ve kültürü için bir yöntemin yanı sıra, deneysel faktörlere yanıt olarak in vitro oligodendrogenezi değerlendirmek için hızlı ve güvenilir bir kantitatif yöntemi tanımlar.

Sıçan oligodendrosit Progenitör Kültürler hazırlanması ve Oligodendrogenesis Niceleme Çift kızılötesi Floresan Tarama kullanma

Birincil fare oligodendrocytes, immunomagnetic izolasyonu vitro kültür için hücreleri hızlı ve spesifik yalıtım sağlar açıklar.

Fare birincil Oligodendrocytes hızlı ve spesifik Immunomagnetic izolasyonu

DNA epigenome temsil düzenleme güçlü bir tedavi yaklaşımı hedef. Bu iletişim kuralı üretim, arıtma ve toplama tüm-içinde-bir lentiviral vektörlerin İnsan İndüklenmiş pluripotent kök hücre (hiPSC)'epigenome düzenleme uygulamaları için CRISPR-dCas9-DNMT3A transgene yataklık açıklar-nöronlar türetilmiş.

Pluripotent kök hücre kaynaklı hastalık modelleri lentiviral vektör platformu için Epigenome düzenleme araçları verimli bir şekilde teslim insan içine indüklenen

Nöronal öncülerin in vitro lentiviral mühendisliğine dayanarak, vahşi tip beyinleri ve "test" ve "kontrol" türevlerinin eş-transplantasyonu, bu yöntem, neokortikal in vivo gen kontrolünde doğru modelleme sağlar basit ve ekonomik bir şekilde nöron morfoloji.

In vivo Nöromimarlık çalışmaları için tasarlanan nöronal öncülerin intraventriküler nakli

Nörodejenerasyonda nöron-glial etkileşimler yetersiz araç ve yöntemler nedeniyle iyi anlaşılamamıştır. Burada, insan pluripotent kök hücrelerinden indüklenmiş nöronlar, oligodendrosit öncü hücreleri ve oligodendrositler elde etmek için optimize edilmiş protokolleri açıklıyoruz ve Alzheimer hastalığında hücre tipine özgü katkıları anlamada bu yöntemlerin değerlerine örnekler sunuyoruz.

Nöron-Oligodendrosit Etkileşimlerini Modellemek için Pluripotent Kök Hücrelerden İnsan Nöronlarının ve Oligodendrositlerin Üretilmesi

Düşük maliyetli katyonik polimer polietilenimin (PEI) kullanarak, H9 insan embriyonik kök hücrelerinde (hESC'ler) shRNA'ların kararlı ekspresyonu için lentiviral parçacıklar ürettik ve geçici olarak dönüştürülmüş H9 türevi nöral progenitör hücreler (NPC'ler) yüksek verimlilikte.

Lentiviral Aracılı shRNA'ların Düşük Maliyetli Katyonik Polimer Polietilenimin (PEI) Kullanılarak hESC'lere ve NPC'lere Verilmesi

Öğrenin lentiviral transdüksiyon yöntemiyle oligodendrosit öncü hücrelerde protein aşırı ekspresyonunu in vitro miyelinasyon çalışmaları için nasıl gerçekleştirilir. Bu teknik, merkezi sinir sistemi miyelinasyon süreçlerini anlamak için güçlü bir araç sunar.

Üretim ve seçici transduce İlköğretim Oligodendrosit Öncü Hücreler için Lentivirüste kullanımı için İn Vitro Myelinasyon Tahliller (Video) | JoVE Journal

Üretim ve seçici transduce İlköğretim Oligodendrosit Öncü Hücreler için Lentivirüste kullanımı için İn Vitro Myelinasyon Tahliller

Daha fazla video keşfet