Üretim ve seçici transduce İlköğretim Oligodendrosit Öncü Hücreler için Lentivirüste kullanımı için İn Vitro Myelinasyon Tahliller

Bu prosedürün genel amacı, oligodendrosit öncü hücrelerini veya OPC'leri viral olarak manipüle etmek, ilgilenilen proteinleri aşırı eksprese etmektir. CNS Miyelinasyon Ulusu'nun in vitro çalışması için, bu ilk olarak bir lentiviral vektörün klonlanmasıyla gerçekleştirilir. Sonraki adımlar, lentivirüsü üretmek ve deney için en uygun viral konsantrasyonu belirlemektir.

Bunu takiben, diseke edilmiş ve kültürlenmiş OPC'ler lentivirüs ile transdüksiyona tabi tutulur. Son adım, transdüksiyona uğrayan OPC'leri DRG'den diseke edilen kültürlenmiş nöronlar üzerine tohumlamaktır. Sonuç olarak, miyelinizan kokültürler, western blot analizi ile miyelin protein ekspresyonu açısından değerlendirilir ve immün boyama ile miyelinli aksonal segmentlerin oluşumu için görselleştirilir.

Bu tekniğin farmakolojik araçlar gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, lentiviral yaklaşımın, istediğimiz hücre tipinde vahşi tip veya mutant proteinleri seçici olarak aşırı eksprese etmemize izin vermesidir, bu durumda oligodendrositler Hazırlık aşamasında, transfeksiyon gününün sabahı metin protokolünde açıklandığı gibi gerekli 2K yedi ödünç vektörü klonlar, 25 mililitre besiyeri içeren bir T 1 75 şişesinde 32 milyon HEK 2 93 T hücresi hazırlayın. Kritik olarak, bu hücreler transfeksiyondan önce sıkışmalıdır, bu nedenle gerekirse onları daha erken plakalayın. 50 mililitrelik bir Falcon tüpünde, tablo bir'de detaylandırıldığı gibi T 1 75 şişe transfeksiyonu için bir ana karışım hazırlayın, DMEM girdabını ısıtmak için DNA ekleyin, ardından erken çökelmeyi önlemek için en son steril PEI ekleyin.

Tüpü üç veya dört kez ters çevirerek iyice karıştırın, ardından karışımı tezgahta yaklaşık 15 dakika inkübe edin. Hücreler üzerindeki ortamı değiştirin ve ardından transfeksiyon karışımını ekleyin. DROPWISE, ortamı hücrelerin üzerinde nazikçe karıştırın ve ardından hücreleri gece boyunca inkübe edin.

Ertesi gün. GFP ekspresyonu floresan mikroskobu ile kontrol edilebilir. Transfeksiyondan 48 saat sonra, ilk viral süpernatan partisini toplayın ve hücrelere 25 mililitre taze ortam ekleyin.

Viral süpernatanı dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 1.140 G'de santrifüjleyin. Viral süpernatanı hücre kalıntısı peleti olmadan yeni bir tüpe aktarın ve dört santigrat derecede saklayın. Ertesi gün, transfeksiyondan 72 saat sonra, hücre kalıntılarını çıkarmak ve ilk temizlenmiş viral süpernatan partisi ile bir araya getirmek için son viral süpernatan santrifüj partisini toplayın.

Daha sonra viral süpernatanı 90 dakika boyunca 170.000 Gs'de ultra santrifüjleyerek virüsü konsantre edin. Dört santigrat derecede. Ultra santrifüjü boşaltın ve süpernatanı dökün, 30 mililitrelik tüpün dibinde görünmeyen çökelmiş PEI ve virüsten oluşan bir damat bırakın.

Bu işlemi tekrarlayın. Her bir ultrasantrifüj tüpünde virüsü yeniden askıya almak için virüsü konsantre etmek için tüm viral süpernatları aynı 30 mililitrelik tüplerde gruplar halinde santrifüjlemek. 500 mikrolitre Sato ortamı ekleyin ve tüpü filmle kaplayın.

Ardından tüpü 30 saniye boyunca girdap haline getirin ve peleti bir pipet ucuyla mekanik olarak yerinden çıkarın. Peletin Sato ortamına tamamen asılı kaldığından emin olmak için bu girdap yerinden çıkma döngüsünü yaklaşık altı kez tekrarlayın. Şimdi Sato'daki tüm askıya alınmış virüsü yeni bir mikro tüpte toplayın.

Havuzlanmış süpernatanı bir dakika boyunca maksimum hızda kısa bir süre döndürün. PEI'yi peletlemek için, daha sonra virüsü içeren süpernatanı toplayın ve çözeltiyi sarmak için bir şırınga kullanarak 0.45 mikronluk bir filtreden geçirerek filtreleyin. Sedia'daki saflaştırılmış virüsü 2050 ve 100 mikrolitrelik hacimlere ayıklayın ve hepsini eksi 80 santigrat derecede saklayın.

Bu protokol için primer oligodendrosit öncü hücrelerine sahip olun. Aşağıdaki büyüme faktörlerini içeren 10 mililitre sedia ile 10 santimetrelik plakalarda kültürlenen OPC'ler, C-N-T-F-P-D-G-F-N, NT üç ve hücreler için% 8 Karbondioksit altında 24 saat kültürlenmiş olmalıdır. Ortamı aspire etmekle başlayın ve tamamen çıkarın.

Ardından, büyüme faktörleri ile aynı ortamdan 10 mililitre ile değiştirin. OPC'lerinizi lentivirüs ile enfekte edin, gerekli miktarda virüsü ortama damla damla ekleyerek ilgilenilen proteini ifade edin. Ayrıca ayrı bir OPC plakasında, sadece GFP'yi ifade eden kontrol lentivirüsünü medya kültürüne, hücrelere 48 saat daha karıştırın.

Daha sonra, kültürlenmiş GRG nöronlarına tohumlamak için OPC'leri plakalardan toplayın. İlk olarak, her plakayı sekiz mililitre EBSS ile iki kez durulayın. Dokuz mililitre ılık EBSS ile bir mililitre tripsin EDTA %0.05 oluşturun.

Her plakaya beş mililitre seyreltilmiş tripsin ekleyin. 37 santigrat derecede iki dakikaya kadar inkübe edin. EBSS'ye beş mililitre% 30 FBS ekleyerek tripsini nötralize edin.

Sonra 10 mililitrelik bir pipet kullanarak. OPC'leri plaka yüzeyinden yıkayın. Tüm hücreleri toplamak için plakayı her seferinde çeyrek tur çevirin.

Hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Hücreleri oda sıcaklığında 180 Gs'de 15 dakika santrifüjleyin. Hücre peletini büyüme faktörleri olmadan bir mililitre ılık saddo ortamında askıya alın ve hücreleri sayın.

Daha sonra, 22 milimetrelik kapak kızakları üzerinde kültürlenen DRG nöronlarını, ortamı plakalarından tamamen aspire ederek hazırlayın. Daha sonra her bir kapak kızağına damla damla 200.000 OPC'yi nazikçe tohumlayın. Tohumlama hacmi, örtü fişi başına 200 mikrolitreden az olmalıdır.

Plakayı hareket ettirmeden hücrelerin yerleşmesine izin verin 10 dakika sonra, her bir kuyucuğun üzerine bir mililitre ılık su serpin. Şimdi kalan kardeş OPC'leri tekrar oynatın. Büyüme faktörleri içeren omed ile, daha sonra ilgilenilen proteinin ekspresyonunu doğrulamak için kullanılabilirler.

Hücre dışı sinyalle ilgili kinaz etiketli bir bayrak. Lentivirüs üretim kısıtlaması için bir yapı kullanıldı: OPC'lerde kullanılacak optimum virüs seyreltmesini belirlemek için paketleme yapısını ve aksesuar yapısını doğrulamak için enzimler kullanıldı. IR bir lentivirüs, HEK 2 93 T hücrelerinde HEK 2 93 T hücrelerine bir dizi viral seyreltme ile titre edildi.

İlgilenilen genin ekspresyon seviyeleri zamanla artmıştır. Daha sonra, saflaştırılmış OPC'ler, transgen ekspresyonunu sağlamak için en az iki gün boyunca enfekte edildi ve kültürlendi. Kardeş OPC'lerde FLAG ve GFP seviyeleri doğrulandı.

OPC'ler daha sonra DRG nöronlarına oturtuldu. OPC'ler daha sonra oligodendrositlere farklılaştı ve batılılar tarafından değerlendirildiği gibi miyelin proteinlerini eksprese etmeye başladılar. MBP boyama aksonları ile görüntülenen bazı olgun oligodendrositler miyelinli, akson yoğunluklarının dikkate alındığından emin olmak için nörofilament veya beta üç tübülin ile boyandı.

Miyelinasyon seviyelerini analiz ederken, OPC'leri tohumladıktan sonra, kültür için önemlidir. Kardeş APC'ler. Bu şekilde, ilgilenilen protein veya ilgilenilen protein üzerindeki etiket, bu ifade, ko-kültürde doğrulanamıyorsa, kardeş APC'lerde doğrulanabilir.