Name: Swimbladder Enjeksiyon ile Larva Zebra balığı Mukozal Candidiazis Modelleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: Öğrenin, Candida albicans ile genç zebra balığı yüzme kesesine enjeksiyon yaparak mukozal kandidiyaz modellemesi. Konfokal mikroskopi ile patojen-bağışıklık etkileşimlerini gerçek zamanlı görüntüleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar cömertçe α-katenin sağlamak için Dr. Le Trinh ve Dr. Tobin teşekkür: sitrin balık hattı ve Bill Jackman bize onun laboratuarında filme yapmak için izin için. Yazarlar fon kaynaklarını Ulusal Sağlık Enstitüleri (Hibeler 5P20RR016463, 8P20GM103423 ve R15AI094406) ve USDA kabul (Proje # ME0-H-1-00517-13). Bu yazının ana Tarım ve Ormancılık Deney İstasyonu yayın sayısı 3371 olarak yayınlanmıştır.

NOT: Tüm Zebra balığı bakım protokolleri ve deneyler Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) protokolü A2012-11-03 altında NIH kurallarına uygun olarak yapıldı. 4 Gün Post Döllenme 1. Zebra balığı Yetiştirme <ol><li> Başka bir video 34 &#39;de gösterildiği gibi, ilk 3 saat sonra döllenme içinde, AB zebrafish veya başka bir transjenik çizgiler toplayın. </li><li> (0.17 mM KCI, 0.33 mM CaCl2, 0,33 mM MgCl2, 2 mM HEPES, pH 6.8, 5 mM NaCl) metilen mavisi ile (0.3 ug / ml nihai E3 ortam 150 ml içeren 15 cm&#39;lik bir petri tabaklarında 120 yumurta inkübe 12/12 açık / koyu fotoperiyodun ile 33 ° C inkübatör konsantrasyon). </li><li> E3 + propiltiyourasil&#39;i (1-fenil-2-tioüre, 10 ug / ml nihai konsantrasyon) ile 6 saat sonra ortam yerine ve ölü yumurta çıkarın. </li><li> 2 gün sonra, taze E3 + propiltiyourasil&#39;i Ortamı alışverişi, 33 ° C&#39;de 4 gün boyunca inkübe edilir. </li></ol> 2. içindejection mikro-iğne hazırlanması <ol><li> Aşağıdaki ayarlarla bir iğne çektirmenin kullanarak bir mikro-iğne içine; borosilikat kılcal (ID 0.69 mm OD 1.2 mm) çekin (550 Heat, 0 çekin, 130 Velocity 110 Saat). NOT: Ayarlar filamanın değişecektir (Şekil 1) benzer şekilli mikro-iğneler elde etmek filament ve yeni bir filaman takıldığında yeniden ayarlanması gerekir. </li><li> 0.4 um filtreden fosfat tamponlu salin 3 ul mikro-iğne ile doldurun (; 137 mM NaCI; 2.7 mM KCI, PBS, 10 mM, Na 2 HPO 4; 1,8 mM KH 2 PO 4, 7.4 pH) 20 ul Microloader pipet kullanılarak ucu. </li><li> Bir basınçlı enjeksiyon sistemine bağlı bir micromanipulator bir mikropipet tutucu mikro-iğne ayarlayın. 30 PSI enjeksiyon basıncını ve 30 msn de darbe süresini ayarlayın. </li><li> Iğne 1/5 su içinde olana kadar damıtılmış su ile bir petri kabı kullanarak, mikro iğne düşük. Mikro-iğne, wi Klipsu seviyesinin hemen altında ince cımbız th. Sudan mikro-iğne getir ve bir bolus görünene kadar pedalına birkaç kez itin. </li><li> Çeşidi bir damla bir daldırma yağı ile katmanlı bir hemositometrede mikro-iğne düşürerek bolus çapını ölçün. İstenilen hacim elde etmek için darbe süresi ayarlayın (Tablo 1). </li><li> Yağda stabil kalır (bolus hacmini artırır eğer basıncı düşürmek ve Kapsül hacmi azalırsa backpressure artırmak) için bolus için backpressure ayarlayın. Her mikro-iğne darbe süresini kaydedin. </li><li> Bir Microloader pipet kullanarak aspire mikro-iğne PBS çıkarın ve enjektör geri yerleştirerek ve sürekli darbe anahtarı çevirerek sol-over PBS sınırdışı. Her mikro-iğne Rezervasyon. </li></ol> 3. Candida Hazırlık <ol><li> Streak Candida albicans kodon-optimize dTomato, GFP, BFP, EOS veya Far ile transformeBir maya peptine dekstroz (YPD) agar (10 g / L maya ekstresi, 20 g / L pepton üzerine steril ahşap takoz kullanılarak donmuş stoktan (-80 ° C hazır% 25 gliserol), kırmızı, 20 g / L dekstroz , 20 g / L ağar; otoklava Petri kapları içinde 25 ml boşaltılmıştır) ve 30 ° C de bir gece boyunca inkübe edilir. </li><li> Steril bir ahşap takoz kullanılarak bir koloni almak ve YPD bir sıvı (10 g / L maya ekstresi, 20 g / L pepton, 20 g / L dekstroz, 5 ml kadar inoküle, Otoklavdan geçirilen ve aseptik 16 x 150 mm cam kültürü, 5 ml bölünebilir borular). </li><li> 60 rpm&#39;de bir silindir tambur içinde 30 ° C&#39;de gece boyunca inkübe edin. </li><li> C. 1 ml toplayın 1.7 ml steril santrifüj tüpü içine albicans kültürü ve transferi. </li><li> Sn bir çift için 5.000 xg&#39;de santrifüj. Süpernatant boşaltın ve iyice steril PBS, girdap 1 ml ekleyin. Iki kez bu işlemi tekrarlayın. </li><li> Steril PBS içinde 1000: 1 ml stok 1 seyreltilmesi ile bir hemositometre kullanılarak kolonileri sayın. </li></ol> 4. Zebra balığı EnjekteSwimbladder <ol><li> Bir 33 ° C kuluçka makinesi içinde, 30 dakika için bir enjeksiyon çanak (% 2 agaroz) ısıtın. </li><li> İstenen zaman, herhangi bir zebrafish aspire olmadan 25 mi pipet kullanılarak enjekte balık içeren 15 cm Petri için E3 + propiltiyourasil&#39;i, 150 ml, 100 çıkarın. </li><li> Geri kalan, 50 ml ortam (nihai konsantrasyon 200 mg / ml) bir 4 mg / ml tampon tricaine metan sülfonat stok (TR) 2 ml ekleyerek zebrabalıkları dpf 4 anestezisi ve 15 dakika boyunca bekleyin. </li><li> Bir mikroskop altında, şişirilmiş bir statik taşıma ile balık seçin. Balık aynı zamanda MPO nötrofil dağıtımı, homojen fenotip için o anda taranabilir: GFP çizgi mikroskop diseksiyon bir Epifloresans kullanarak. </li><li> C seyreltin orijinal konsantrasyon albicans stok 1.5 x 10 7 koloni PBS ml (cfu / ml) oluşturan üniteler için (adım 3.8). </li><li> Plastik bir transfer borusu kullanılarak enjeksiyon çanak üzerine 30 zebrafish aktarıntte ve aşırı ortamı çıkarın. </li><li> Bir balıkçı tel aracı (0.012 inç çaplı olta borosilikat kılcal içine süper yapıştırılmış) kullanarak, dikey enjeksiyon çanak tutarak 10 balık, 3 çizgiler yapmak ve dikey balık yönlendirmek. </li><li> Fazla ortamı çıkarın. </li><li> İyice 1.5 x 10 7 cfu ile tüp vorteks / mL C albicans arasından seçilir. </li><li> C 3 ul bir mikro-iğne doldurun albicans, yeni bir Microloader pipet kullanarak ve uygun ayara darbe süresini ayarlamak (adım 2.9 bakınız). </li><li> Swimbladder (Şekil 3A) arkasına doğru amaçlayan, mikro-iğne ve balık kafası arasındaki 20 ° lik bir açı yapmak için enjeksiyon çanak döndürün. </li><li> , Statik taşıma içine mikro-iğne itin iğne deliği lümen olduğundan emin yapma, ve bir kez pedalına basın. </li><li> Her balık için tekrarlayın ve E3 bir çanak sel bir kurtarma çanak (25 ml E3 + PTU) transferd kurtarma çanak içine boşalma. </li><li> Enjeksiyon çanak başka 30 balık aktarın. </li><li> İyice ile dolu yeni bir mikro-iğne ile enjeksiyon tekrarlayın C vortekslendi albicans arasından seçilir. </li><li> Gerekirse kirlenmesini önlemek ve ayrı bir kurtarma çanak (adım 4.10) aktarmak için farklı bir enjeksiyon çanak kullanarak, PBS kontrol enjekte edilerek bitirin. </li></ol> 5. İstenilen İnokulum için Balık tarama <ol><li> Çözülene kadar mikrodalga ve 37 ° C&#39;ye kadar soğutularak kaynatma, E3 40 ml 0.4% agaroz çözeltisi (LMA) düşük eriyik 160 mg ekleyerek, düşük erime sıcaklığı olan agaroz için 40 mi hazırlayın. Bir kez soğutulduğunda TR (nihai konsantrasyon 200 mg / ml) 400 ul ekle. </li><li> (25 mL, E3 + propiltiyourasil&#39;i, nihai konsantrasyon 200 mg / ml içine TR sadece 1 ml ile adım 4.3) de anlatıldığı gibi, 30 dakika sonrası nekahattan sonra, balık uyuşturan. </li><li> Bir kilo tekne LMA 2 ml (mümkün olduğunca az medya ile) Transfer 30 balık. </li><li> Aspire ayrı bir transfer pipeti ile balık ve sadece 10 x 6 merkez kuyu kullanılarak, 96 çukurlu bir görüntüleme plaka içine LMA&#39;nın 1 damla balık plaka. </li><li> Ekranın tüm balık görüntüleme plakasına yüklenir kadar tekrarlayın. </li><li> Ortam, 5 dakika boyunca oda sıcaklığında katılaşmaya edelim. </li><li> Onlar cam alt ile temas halinde emin, kendi tarafında balık yerleştirin. </li><li> Bir ters Epifloresans / konfokal mikroskop ve uygun filtre üzerinde 20X objektif kullanılarak, C sayısını kaydetmek Her balığın statik taşıma albicans maya hücreleri. </li><li> , Statik taşıma 15-25 maya hücreleri ile balık (veya arzu edilen inokulum) Select ötenazi seçili olmayan balık (E3 TR 800 ug / ml) tarafından E3 + propiltiyourasil&#39;i 50 ml derin Petri kabı seçilen balık dönüş görüntüleme plaka seçilen kuyulara E3 3 damla ekleyerek ve plastik transfer pipet ile balık aspire. </li><li> İstenen süre için 33 ° C&#39;de inkübe edin. </li></ol> 6. Balık Sonrası tarama Görüntüleme <ol><li> İstediğiniz anda, görüntü balık içeren derin Petri kabı E3 + PTU medya 50 ml 25 kaldırın. </li><li> (25 mi, E3 + propiltiyourasil&#39;i kalan, nihai konsantrasyon 200 mg / ml içine TR sadece 1 ml ile adım 4.3) de anlatıldığı gibi balık anestezi uygulayın. </li><li> Uygun bir şekilde 96 oyuklu görüntüleme levhasının ve yerine balık Plate (5,3-5,7 adım). </li><li> Uygun lazerler ve emisyon filtreleri kullanarak konfokal mikroskobu ile görüntü. İlk diferansiyel girişim kontrast (DIC) kapsamında 4X objektif kullanarak balık odaklama ve 2 mikro saniye / piksel hızı ve 1024 x 600 piksel en boy oranı ile tarama modunda konfokal lazerler ile 20X objektif kullanarak ilgi bölgenin görüntülerini elde. 3 kare Kalman filtresi modunu uygulayarak, 1 mikron adım boyutu ile Z-yığınlar edinin. </li><li> 50 ml E3 + PTU veya individua içine derin bir Petri kabı dönl kuyuları (24 bölümlü kültür çanağı, 3 mi E3 + PTU) ile 33 ° C&#39;de inkübe edin. </li></ol> 7. swimbladder Dissecting <ol><li> Yüksek vakum yağ ile bir 10 ml şırınga doldurun. </li><li> % 2&#39;lik bir LMA (agaroz E3 8 ml düşük erime 160 mg adım 5.3) hazırlayın. </li><li> İstediğiniz anda, balık (adım 5.2) uyuşturan. </li><li> Transferi 10 E3, 1 ml ile 1.7 ml santrifüj tüpüne balık ve santrifüj tüpüne 4 mg / ml &#39;Tricaine (nihai konsantrasyon 800 mg / ml) 200 ul ilave edildi ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edilerek euthanize. </li><li> Bir mikroslayd (75 x 25 mm, Şekil 2) 1 cm arayla, bir meydanda vakum gres 4 damla koyarak bir görüntüleme cam slayt hazırlayın. </li><li> Meydanın ortasında% 2 LMA 2 damla yerleştirin. </li><li> Bir mikroskop altında ayrı bir cam slayt bir balık yerleştirin ve kalp atışlarımı durduğundan emin olun, aşırı su çıkarmak. </li><lİnce cımbız kullanarak i&gt; sol cımbız ile sabit bir pozisyonda kafa korumak ve doğru cımbız (Şekil 4A) ile ön gut aşağı çekerek swimbladder teşrih. </li><li> Sindirim sisteminden ayıran, sol cımbız ile pnömatik kanal tarafından swimbladder Pick up ve katılaşır önce% 2 LMA merkezine yerleştirin. </li><li> Görüntüleme cam slayt üstüne bir kapak kayma (18 x 18 mm) yerleştirin ve vakum gres yanı sıra, LMA (Şekil 2) dokunana kadar itin. </li><li> Diseksiyon 10 dakika içinde Resim aşama 6.4&#39;te tarif edildiği gibi. Adımı tekrarlayın 7,7-7,11 diğer balık. </li></ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Swimbladder mikroenjeksiyon hastalığı modeli Gelişmeler ve sınırlamaları Burada sunulan model Gratacap et al mukozal kandidiyaz daldırma modelinin bir uzantısıdır (2013).; Bu kontrollü bir enfeksiyon zaman avantaj, yüksek ölçüde tekrarlanabilir enfeksiyon dozu ve bu nedenle geliştirilmiş verimlilik ekler. Biz burada non-invaziv ayrıntılı olarak enfeksiyon dinamikleri zamansal belgeleri yanı sıra statik taşıma yüksek çözünürlük ex vivo görüntüleme izin yeni yöntemler g...

Mukozal enfeksiyonlar, patojenlerin sistemik ortama erişmesine izin veren epitel bariyerinin hasarı nedeniyle hayatı tehdit eden kan dolaşımı enfeksiyonlarına yol açabilir1,2. Ek olarak, mukozal enfeksiyonlar dışarıdan içerildiğinde bile önemli immünopatolojiye neden olabilir3-5. Kommensal tek hücreli mantar Candida albicans, popülasyonun çoğunda ağız boşluğunda ve diğer mukozal bölgelerdebulunur 6-9. Normalde doğuştan gelen ve adaptif immün yanıtlar tarafından içerilmesine rağmen, doğuştan gelen immün kusurlar ve tıbbi müdahaleler ciddi mukozal kandidiyazise yol açabilir. Epitel bariyerine yapılan saldırı, vulvo-vajinal kandidiyazis durumunda olduğu gibi, immünopatolojinin yanı sıra hayatı tehdit eden yaygın hastalık riskinin artmasına neden olur, ayrıca C. albicans kolonizasyonu akciğer immün homeostazı ile ilişkilendirilmiştir10,11. Yaygın kandidiyazis şu anda yoğun bakım ünitelerinde dördüncü en sık görülen kan dolaşımı enfeksiyonudur12 ve %40'a varan mortalitesi onu önemli bir endişe kaynağı haline getirmektedir. Otoimmün hastalıklar, kanser veya organ nakli olan hastalar için immünomodülatör tedavilerdeki artış nedeniyle, bu patojen ile mukozal immün kompartman arasındaki etkileşimi anlamak zorunludur.
Mukozal düzeyde C. albicans hücre etkileşimleri ile ilgili hücre biyolojik ilerlemelerinin çoğu in vitro13-15 ve murin modelleri16-18'den gelmektedir. Bu yaklaşımların her ikisinin de belirgin avantajları vardır, ancak sağlam bir konakta canlı hücreleri yüksek çözünürlükte görüntüleme yeteneği, enfeksiyonun zamansal ve mekansal karakterizasyonunu sınırlamıştır. Bu çalışmalar için, patojen, doğuştan gelen bağışıklık ve epitel hücrelerinin etkileşiminin sağlam bir omurgalı konakçıda görselleştirilebildiği bir in vivo modele ihtiyaç vardır.
Zebra balığı, esas olarak şeffaflığı ve genetik manipülasyona elverişliliği nedeniyle insan hastalıklarının anlaşılması için paha biçilmez bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Hücre ve organ gelişimi, gelişmekte olan timus19'daki T hücresi davranışı veya hücre içi mikobakteriler vefagositler 20-22 arasındaki savaş gibi yeni bağışıklık hücresi davranışlarının tanımlanmasına yol açan mükemmel ayrıntılarla görüntülenmiştir. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, zebra balıklarında bağırsak mikrop-konak etkileşimlerini tanımlamış ve bağırsak yolunun mikrobiyal kolonizasyonunun konak bağırsak fizyolojisini ve diğer enfeksiyonlara direnci etkilediğini göstermiştir23,24. Ayrıca, bağırsak epiteli yoluyla enfeksiyon çeşitli patojenler için tanımlanmıştır.
Bağırsak yolunun aksine, yüzme kesesi daha izole ve tamamlayıcı bir mukozal modeli temsil eder. Bu organ, gelişmekte olan bağırsak tüpünün bir uzantısıdır ve karaciğer ve pankreasın önünde oluşur25,26. Yüzey aktif madde, mukus ve antimikrobiyal peptitlerüretir 27,28 ve anatomik olarak ve ontogenetik olarak bu organ, memeli akciğerinin29,30 bir homologu olarak kabul edilir. Pnömatik kanal zebra balığında bağırsağa bağlı kaldığından, bu, daldırma enfeksiyonunun doğal olarak meydana gelmesine izin verir. Dikkat çekici bir şekilde, Candida türleriyle balıkların bilinen tek doğal olarak meydana gelen enfeksiyonları, yüzme kesesindeki C. albicans enfeksiyonlarıdır31. Yakın zamanda, C. albicans'ın yüzme kesesini enfekte ettiği deneysel bir daldırma enfeksiyon modelini tanımladık ve bu enfeksiyonun C. albicans-epitel etkileşiminin bazı ayırt edici özelliklerini in vitro32,33 olarak özetlediğini bulduk. 
Burada sunulan yöntemde, orijinal daldırma enfeksiyon modeli, C. albicans'ın döllenmeden 4 gün sonra (dpf) zebra balığının yüzme kesesine doğrudan enjekte edilmesiyle geliştirilmiştir. Bu, enfeksiyonun hassas zamansal kontrolünün yanı sıra yüksek oranda tekrarlanabilir bir aşılamaya izin verir. Zebra balığı modelinin çok yönlülüğü ile birlikte ayrıntılı intravital görüntülemeye izin verir. Bu yöntemle neler yapılabileceğine bir örnek olarak, C. albicans büyümesinin mekansal-zamansal dinamiklerini ve enfeksiyon bölgesine nötrofil alımını sunuyoruz. Zebra balığı yüzme kesesi dokusunun intravitalal olarak görüntülenmesi zor olduğundan, floresan sinyalini ve mikroskobik çözünürlüğü iyileştiren hızlı bir yüzme kesesi diseksiyon tekniği de sunuyoruz. Bu yöntemler, mantar, immünolojik ve su ürünleri araştırmaları için araç kutusunu genişletmenin yanı sıra, mukozal yüzeylerin diğer mantar, bakteriyel veya viral enfeksiyonlarını modellemek için çevrilebilecek yeni bir enfeksiyon yolunu tanımlar.

<table><tbody><tr><td>1.7 ml tüpler</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>Derin Petri kapları</td><td>Fisher Scientific</td><td>89107-632</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipetleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>Maya Özü</td><td>VWR Scientific</td><td>90000-726</td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>VWR Scientific</td><td>90000-264</td><td></td></tr><tr><td>Dekstroz</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>VWR Scientific</td><td>90000-760</td><td></td></tr><tr><td>İnce cımbız (Dumont Dumoxel #5)</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>Ahşap dübeller</td><td>VWR Scientific</td><td>10805-018</td><td></td></tr><tr><td>Düşük erime agaroz</td><td>VWR Scientific</td><td>12001-722</td><td></td></tr><tr><td>Alevli Kahverengi mikropipet çektirme</td><td>Sutter Aletleri</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Borosilikat kılcal</td><td>Sutter Aletleri</td><td>BF120-69-10</td><td></td></tr><tr><td>MPPI-3 enjeksiyon sistemi</td><td>Uygulamalı Bilimsel Enstrümantasyon</td><td>MPPI-3</td><td></td></tr><tr><td>Geri basınç ünitesi</td><td>Uygulamalı Bilimsel Enstrümantasyon</td><td>BPU</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipet tutucu kiti</td><td>Uygulamalı Bilimsel Enstrümantasyon</td><td>MPIP</td><td></td></tr><tr><td>Ayak pedalı</td><td>Uygulamalı Bilimsel Enstrümantasyon</td><td>FSW</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipülatör</td><td>Uygulamalı Bilimsel Enstrümantasyon</td><td>MM33</td><td></td></tr><tr><td>Manyetik taban</td><td>Uygulamalı Bilimsel Enstrümantasyon</td><td>Manyetik Taban</td><td></td></tr><tr><td>Trikain metan sülfonat</td><td>Western Chemical Inc.</td><td>MS-222</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon mikroskobu</td><td>Olympus</td><td>SZ61 üst SZX-ILLB2-100 baz</td><td></td></tr><tr><td>Konfokal mikroskop</td><td>Olympus</td><td>IX-81, FV-1000 lazer taramalı konfokal sistemli</td><td></td></tr><tr><td>20X mikroskop objektifi</td><td>Olympus</td><td>UPlanSApo 20x/0.75</td><td></td></tr><tr><td>Makaralı tambur</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>TC-7</td><td></td></tr><tr><td>Microloader pipet uçları</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>Cam kültür tüpleri (16 x 150 mm)</td><td>VWR Scientific</td><td>60825-435</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR Scientific</td><td>BDH4534-500GP</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>VWR Scientific</td><td>BDH4532-500GP</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>VWR Scientific</td><td>BDH0246-500GP</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (Corning)</td><td>VWR Scientific</td><td>BDH4520-500GP</td><td></td></tr><tr><td>Çocuk kili (Play-Doh)</td><td>Hasbro</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher Scientific</td><td>C69-500</td><td></td></tr><tr><td>Metilen mavisi</td><td>VWR Scientific</td><td>VW6276-0</td><td></td></tr><tr><td>PTU</td><td>Sigma</td><td>P7629-10G</td><td></td></tr><tr><td>Petri kapları</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Hemositometre ( Hausser bilimsel)</td><td>VWR Scientific</td><td>15170-172</td><td></td></tr><tr><td>Tip A daldırma yağı</td><td>Mavi Mermer Ürünleri</td><td>51935</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genie</td><td>VWR Scientific</td><td>14216-184</td><td></td></tr><tr><td>Agaroz (Lonza)</td><td>VWR Scientific</td><td>12001-870</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4 </td><td>Fisher Scientific</td><td>S374-500</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>P285-500</td><td></td></tr><tr><td>Olta teli</td><td>Stren</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu görüntüleme plakası (Sensoplate)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655892</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek vakum gresi (Dow Corning)</td><td>VWR Scientific</td><td>59344-055</td><td></td></tr><tr><td>Mikro kaydırak (25 x 75 mm)</td><td>VWR Scientific</td><td>48300-025</td><td></td></tr><tr><td>Kapak fişleri (18 x 18 mm), No 1.5</td><td>VWR Scientific</td><td>48366-045</td><td></td></tr><tr><td>15 cm Petri kabı (Olympus plastikleri)</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-106</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol (EMD kimyasalları)</td><td>VWR Scientific</td><td>EMGX0185-5</td><td></td></tr><tr><td>24 oyuklu kültür kabı (Olympus plastikleri)</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-107</td><td></td></tr><tr><td>Ağırlık tekneler (8.9 cm)</td><td>VWR Scientific</td><td>89106-766</td><td></td></tr></tbody></table>

swimbladder enjeksiyon ile larva zebra balığı mukozal candidiazis modelleme

Modeling Mucosal Candidiasis in Larval Zebrafish by Swimbladder Injection

Mukozal patojenlere karşı savunma Erken bir epitel bariyer ve doğuştan gelen bağışıklık hücreleri, hem oluşur. Her iki immunocompetency ve bunların interkom, enfeksiyonlara karşı korunması için çok önemlidir. Bir patojen ile epitel ve doğuştan gelen bağışıklık hücreleri etkileşimleri en karmaşık davranış zaman ve mekan içinde izlerken vivo, incelenmiştir. Ancak, mevcut modeller mukozal düzeyinde patojenler ile savaş kolay uzay-zamansal görüntüleme için izin vermez. Burada geliştirilen model çocuk zebrabalıkları statik taşıma içine mantar patojeni, Candida albicans, doğrudan enjeksiyon sureti ile bir mukozal infeksiyonu oluşturur. Ortaya çıkan enfeksiyon mukozal hastalık gelişimi boyunca epitel ve doğuştan gelen bağışıklık hücre davranışının yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlar. Bu yöntemin çok yönlülük ph yol açan bağışıklık olaylar ayrıntılı dizisini prob konağın sorgulama için izin veriragocyte işe özel hücre tipleri ve koruma moleküler yolların rollerini incelemek ve. Buna ek olarak, immün bir fonksiyonu olarak patojen davranışı floresan protein ifade C ile eş zamanlı olarak görüntülenebilir albicans arasından seçilir. Konak-patojen etkileşimi artmış uzaysal çözünürlüğü açıklanan hızlı swimbladder diseksiyon tekniği kullanılarak da mümkündür. Burada anlatılan mukozal enfeksiyonu modeli mukozal kandidiazis çalışma için değerli bir araç yapma, basit ve son derece tekrarlanabilir. Bu sistem, aynı zamanda, normal epitel yüzeyleri boyunca enfekte mikobakteriyel bakteriyel veya viral mikropların gibi diğer mukozal patojenlerin geniş çapta çevrilebilir olabilir.

Posterior statik taşıma içinde Mikroenjeksiyon Burada sunulan deneysel yöntem C tutarlı bir doz enjeksiyon açıklar zebrabalıkları dpf 4 statik taşıma albicans maya hücreleri. Daldırma modeli ile Önceki iş önerdiği C swimbladder immün yanıt Candida albicans, memeli mukozal kandidiyazis 32 benzerdir. Burada daha basit, tekrarlanabilir ve hızlı bir modifiye enfeksiyon yöntemi göstermektedir; zebrabalıkları bir kaç yüz enjekte edilmiş ve bir kaç saat i...

İn vivo patojen ve immün savunmanın mukozal düzeydeki uzaysal-zamansal etkileşimleri, mevcut omurgalı konakçılarında kolayca görüntülenemez. Burada sunulan yöntem, genç zebra balığının yüzme kesesini bir enfeksiyon bölgesi olarak kullanarak canlı omurgalılarda mukozal kandidiyazisi incelemek için çok yönlü bir platformu tanımlamaktadır.

Swimbladder Enjeksiyon ile Larva Zebra balığı Mukozal Candidiazis Modelleme

Early defense against mucosal pathogens consists of both an epithelial barrier and innate immune cells. The immunocompetency of both, and their ...

Bu prosedürün genel amacı, genç zebra balığı kullanılarak mukozal kandidiyazisi modellemektir. Bu, önce canlı albicans'ı içeren bir solüsyonun bir mikroiğneye yüklenmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda, maya hücrelerinin belirli bir hacmi genç bir zebra balığının yüzme kesesine enjekte edilir.Daha sonra, balıklar homojen bir aşı için taranır ve istenen süre boyunca kuluçkaya yatırılır. Son adımda, patojenin zebra balığı bağışıklık sistemi ile dinamik etkileşimini takip etmek için konfokal mikroskopi kullanılır. Ek olarak, daha yüksek çözünürlüklü konfokal görüntüler elde etmek için yüzme kesesi mikros diseke edilebilir.Burada sunduğumuz yöntem, mantar immünolojisinin yanı sıra mikrobiyolojinin temel sorularını yanıtlar, örneğin mantar patojenine ve mukozal yüzeylerdeki kandidal işaretlere karşı başarısız bir bağışıklık tepkisine yol açan olayların kesin sırası nedir. Prosedüre başlamadan önce, 33 santigrat derece inkübatörde% 2 aros içeren bir enjeksiyon kabını ısıtın. 30 dakika sonra, 25 mililitrelik bir pipet kullanarak 100 mililitre E üç ortam artı PTU'yu dördüncü gün zebra balığından çıkarın, döllenme sonrası zebra balığı, balıkların hiçbirini aspire etmemeye dikkat edin ve mililitre başına dört miligramlık iki mililitre ekleyin.Trica metan sülfonat, hayvanları uyuşturmak için ortama stok yapar. 15 dakika sonra, şişirilmiş yüzme keseleri olan balıkları tanımlamak için bir diseksiyon mikroskobu kullanın ve 30 zebra balığını önceden ısıtılmış enjeksiyon kabına aktarmak için plastik bir transfer pipeti kullanın. Fazla ortamı çıkarın, ardından tabağı belirli bir açıyla tutun ve dikey olarak hizalanmış 10 satırdan oluşan üç sıra yapmak için bir boro silikat kılcalına süper yapıştırılmış 0,012 inç çapında bir olta kullanın Balıkların her biri bir sonraki adımda 1,5 kez 10 ila yedinci CFU'luk bir konsantrasyonda taze hazırlanmış deniz albicans tüpünü iyice girdaplayın.Ve sonra maya çözeltisinin üç mikrolitresini EC kırpılmış mikroiğneye yükleyin. Darbe süresini uygun ayara getirin. Ardından, mikro iğne ile balığın başı arasında 20 derecelik bir açıya ulaşmak için enjeksiyon kabını döndürün ve yüzme kesesinin arkasına doğru hedefleyin.Şimdi mikroiğneyi yüzme kesesine itin, iğnenin deliğinin lümende olduğundan emin olun ve su birikintisine bastırın. Hangi balığın enjekte edildiğini doğrulamak nispeten kolaydır, çünkü bolus hava kabarcığının yerini alır ve yüzme kesesinin arkası daha sonra medya ile doldurulur, fenol kırmızısının bolusla birlikte enjeksiyonu başarılı bir enjeksiyonun görselleştirilmesini daha da kolaylaştırabilir. 30 balığın tümünü enjekte ettikten sonra, tabağı E üç besiyeri ile doldurun ve ardından balığı geri kazanım kabına boşaltın.10 hayvanı bir mililitre E üç besiyeri içeren 1.7 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve balığı 200 mikrolitre trica ile ötenazi yapın. Daha sonra, her hayvan için, bir mikro slayt üzerinde bir santimetre aralıklarla bir kare içinde dört damla vakumlu yağ yerleştirin ve karenin ortasına iki damla taze hazırlanmış,% 2 düşük erime ekleyin. Daha sonra, bir balığı diseksiyon mikroskobu altında ayrı bir cam slayta yerleştirin ve hayvanın kalbinin atmayı bıraktığını doğrulayın ve fazla suyu çıkarın.Şimdi kafayı sabit bir pozisyonda tutmak için bir çift ince cımbız ve ön bağırsağı aşağı çekmek için başka bir cımbız kullanın. Yüzme kesesini pnömatik kanaldan alın, sindirim sisteminden ayırın ve agro katılaşmadan önce hazırlanan mikro slaytlardan birinin ortasına yerleştirin. Son olarak, vakum yağına ve agaroza temas edene kadar hafifçe aşağı iterek dokunun üzerine bir örtü kaydırın ve hasattan sonraki 10 dakika içinde yüzme kesesini görüntüleyin.Dört nanolitre deniz albicansını, yedincinin 10'unun bir ila 1.5 katı oranında enjekte etmek. Mililitre başına CFU, balık başına 10 ila 50 maya hücresi aralığıyla sonuçlanan en tutarlı verileri verir. Aşının 15 ila 25 maya hücresine daraltılması, daha sıkı bir fenotip ve yanıt verir.Nötrofiller, farelerde ve insanlarda kandidiyazise karşı dirençte önemli bir rol oynar ve zebra balığı yüzme kesesinin canlı albikanlarla enfeksiyonu, nötrofillerin hızlı ve sürekli bir şekilde toplanmasına yol açar. Bu, ısı öldürücü maya hücreleri enjekte edildiğinde meydana gelmez. Filamentler, maya hücrelerinin enjeksiyonundan sonra hızla gelişir ve enjeksiyondan sonraki ilk 24 saat boyunca filamentli büyüme devam eder, daha sonra bu sayı azalmaya başlar, tek tek balıkları non-invaziv olarak takip etme yeteneği, bu boylamsal çalışmaları mümkün kılar ve hastalık ilerlemesi ve konakçı yanıtlarındaki bireyden bireye farklılıkları vurgular.Fare görüntülemede pratik olmayan deneysel bir protokol olan immün veya epitel hücrelerinin c albicans ile etkileşimleri burada sunulan modelde nispeten kolaydır. Bununla birlikte, yüzme kesesinin az önce gösterildiği gibi diseke edilmesi, görüntülemenin kalitesini önemli ölçüde artırır. Bu, özellikle floresanın her yerde ifade edildiği transgenik balık çizgilerini görselleştirirken kullanışlıdır ve alfa Catine sitrin balık çizgisinden disseke edilmiş bir yüzme kesesinin bu görüntülerinde gözlemlendiği gibi çevredeki dokuda yabancı floresan vardır.Bu prosedürü takiben. Morf teknolojisi veya kimyasal inhibisyon tedavisi gibi diğer yöntemler, mukozal kandidiyazda belirli bir bağışıklık hücresinin veya sinyal yolunun rolü nedir gibi soruları cevaplamak için kullanılabilir.

modeling-mucosal-candidiasis-larval-zebrafish-swimbladder

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Zebra balığı hızla gelişmesi, küçük boyutu ve şeffaflık enfeksiyon doğal immün kontrolü çalışması için çok büyük avantajları...

Zebra balığı Larva yılında Dissemine Kandidiyazis non-invaziv Görüntüleme

Kaynak: Li, J. ve diğerleri. Clostridioides difficile için Larva Zebra Balığı Enfeksiyon Modelinin Geliştirilmesi. J. Vis. Uzm. (2020)Bu video, floresan etiketli Clostridioides difficile'nin anestezi uygulanmış bir zebra balığı larvasının bağırsak lümenine mikroenjeksiyon bazlı dağıtımını göstermektedir. Larva hazırlama, bakteri enjeksiyonu ve bağırsaktaki bakteri lokalizasyonunun floresan mikroskobu tabanlı doğrulanması ile ilgili adımları özetlemektedir.

Mikroenjeksiyon Kullanılarak Zebra Balığı Larvasının Bağırsak Lümenine Bakterilerin Lokalize Verilmesi

Kaynak: Flores, E. ve diğerleri. Zebrafish larvalarında gıda kaynaklı enfeksiyonlar için protozoan paramecium caudatum aracı olarak kullanılması. J. Vis. Exp. (2019).Bu video, zebrafish larvalarında floresan E. coli enfekte paramecia ile beslenerek gıda kaynaklı bakteriyel bağırsak enfeksiyonu modeli oluşturma yöntemini göstermektedir.

Zebrafish larvalarında Bağırsak Enfeksiyonunun Gıda Kaynaklı Bakterilerle Modellenmesi

Kaynak: Li, J. ve diğerleri.  Clostridioides difficile için larva zebrafish enfeksiyonu modelinin geliştirilmesi. J. Vis. Exp. (2020).Bu video, anestezi edilmiş zebrafish larvasının agarozda immobilize edilip izleyici yönlendirmeli iğne kullanılarak patojenik bir bakteriyle oral enjekte edildiği mikrogavaj prosedürünü gösteriyor. İnvaziv olmayan teslimat, doğal enfeksiyonu taklit eder ve bakteriyel çoğalması, toksin salınımı ve bağırsak epitel hasarının analizini mümkün kılar.

Mikrogavaj kullanarak Zebrafish larva enfeksiyonu modelinin geliştirilmesi

İnsan influenza A virüsü için sistemik ve lokalize zebra balığı enfeksiyon modelleri gösterilmiştir. Sistemik bir enfeksiyon modeli kullanarak, zebra balığı antiviral ilaçları taramak için kullanılabilir. Lokalize bir enfeksiyon modeli kullanarak, zebra balığı konakçı bağışıklık hücresi tepkilerini karakterize etmek için kullanılabilir.

İnsan İnfluenza A Virüs Enfeksiyonları Zebra balığı Modeller Kullanılarak Antiviral İlaçlar Ekran ve Host Bağışıklık Hücre Yanıtları karakterize etmek

Bu iletişim kuralı, fluorescently etiketli T. cruzi şeffaf Zebra balığı larva enjekte ve parazit hareketliliği hafif levha Floresans mikroskobu kullanılarak vivo gözlendi.

Kuruluş, larva Zebra balığı bir hayvan modeli araştırmak Trypanosoma cruzi hareketliliği In Vivo olarak

Burada, içinde bir yetişkin zebra balığı kendi doğal patojen Mycobacterium marinumkullanarak bir iletişim kuralı modeli insan tüberküloz için mevcut. Ayıklanan DNA ve RNA gelen virüslü zebra balığı iç organlarının balıklar ve ana bilgisayarın bağışıklık yanıtı qPCR ile toplam Mikobakteriyel yükler ortaya çıkarmak için kullanılabilir.

Tüberküloz Mycobacterium marinum enfekte yetişkin zebra balığı içinde modelleme

Bu da çalışmanın bir zebra balığı embriyo modeli içinde vivo görselleştirme ve enfeksiyonu floresans mikroskobu göre zaman içinde biomaterial ilgili intravital analizi için açıklar. Bu model içinde vivo biomaterial ilişkili enfeksiyonların çalışmak için fare modelleri gibi memeli hayvan modelleri tamamlayan gelecek vaat eden bir sistemdir.

Bir zebra balığı embriyo Model In Vivo görselleştirme ve Staphylococcus aureus Intravital analiz Biomaterial ilişkili enfeksiyon

Burada, makrofaj-soy hücrelerine ilaç dağıtımını hedeflemek amacıyla ilaç yüklü lipozomların ve bunların mikroenjeksiyonunun larva zebra balığına sentezini anlatıyoruz.

Uyuşturucu Yüklü Lipozomenjekte ederek Larva Zebra balığı Makrofajlarına Yönelik İlaçların Hedeflenmesi

Burada mikroenjeksiyon ve noninvaziv mikrogavaj ile floresan olarak etiketlenmiş anaerobik C. difficile ile zebra balığı larvaları enfekte etmek için güvenli ve etkili bir yöntemdir.

Clostridioides difficile için Larva Zebrabalığı Enfeksiyon Modeli nin Geliştirilmesi

Bu protokol, ortaya çıkan nöroinflamatuar yanıtı ve nörotoksisiteyi incelemek için bir zebra balığı larva modelinde beyin ventriküler bölgesine lipopolisakkaritin mikroenjeksiyonunu göstermektedir.

Nöroinflamasyon ve Nörotoksisiteyi Değerlendirmek için Larva Zebra Balıklarına Lipopolisakkaritin Beyin Ventriküler Mikroenjeksiyonları

Öğrenin, Candida albicans ile genç zebra balığı yüzme kesesine enjeksiyon yaparak mukozal kandidiyaz modellemesi. Konfokal mikroskopi ile patojen-bağışıklık etkileşimlerini gerçek zamanlı görüntüleyin.

Swimbladder Enjeksiyon ile Larva Zebra balığı Mukozal Candidiazis Modelleme

Daha fazla video keşfet