Swimbladder Enjeksiyon ile Larva Zebra balığı Mukozal Candidiazis Modelleme

Bu prosedürün genel amacı, genç zebra balığı kullanılarak mukozal kandidiyazisi modellemektir. Bu, önce canlı albicans'ı içeren bir solüsyonun bir mikroiğneye yüklenmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda, maya hücrelerinin belirli bir hacmi genç bir zebra balığının yüzme kesesine enjekte edilir.

Daha sonra, balıklar homojen bir aşı için taranır ve istenen süre boyunca kuluçkaya yatırılır. Son adımda, patojenin zebra balığı bağışıklık sistemi ile dinamik etkileşimini takip etmek için konfokal mikroskopi kullanılır. Ek olarak, daha yüksek çözünürlüklü konfokal görüntüler elde etmek için yüzme kesesi mikros diseke edilebilir.

Burada sunduğumuz yöntem, mantar immünolojisinin yanı sıra mikrobiyolojinin temel sorularını yanıtlar, örneğin mantar patojenine ve mukozal yüzeylerdeki kandidal işaretlere karşı başarısız bir bağışıklık tepkisine yol açan olayların kesin sırası nedir. Prosedüre başlamadan önce, 33 santigrat derece inkübatörde% 2 aros içeren bir enjeksiyon kabını ısıtın. 30 dakika sonra, 25 mililitrelik bir pipet kullanarak 100 mililitre E üç ortam artı PTU'yu dördüncü gün zebra balığından çıkarın, döllenme sonrası zebra balığı, balıkların hiçbirini aspire etmemeye dikkat edin ve mililitre başına dört miligramlık iki mililitre ekleyin.

Trica metan sülfonat, hayvanları uyuşturmak için ortama stok yapar. 15 dakika sonra, şişirilmiş yüzme keseleri olan balıkları tanımlamak için bir diseksiyon mikroskobu kullanın ve 30 zebra balığını önceden ısıtılmış enjeksiyon kabına aktarmak için plastik bir transfer pipeti kullanın. Fazla ortamı çıkarın, ardından tabağı belirli bir açıyla tutun ve dikey olarak hizalanmış 10 satırdan oluşan üç sıra yapmak için bir boro silikat kılcalına süper yapıştırılmış 0,012 inç çapında bir olta kullanın Balıkların her biri bir sonraki adımda 1,5 kez 10 ila yedinci CFU'luk bir konsantrasyonda taze hazırlanmış deniz albicans tüpünü iyice girdaplayın.

Ve sonra maya çözeltisinin üç mikrolitresini EC kırpılmış mikroiğneye yükleyin. Darbe süresini uygun ayara getirin. Ardından, mikro iğne ile balığın başı arasında 20 derecelik bir açıya ulaşmak için enjeksiyon kabını döndürün ve yüzme kesesinin arkasına doğru hedefleyin.

Şimdi mikroiğneyi yüzme kesesine itin, iğnenin deliğinin lümende olduğundan emin olun ve su birikintisine bastırın. Hangi balığın enjekte edildiğini doğrulamak nispeten kolaydır, çünkü bolus hava kabarcığının yerini alır ve yüzme kesesinin arkası daha sonra medya ile doldurulur, fenol kırmızısının bolusla birlikte enjeksiyonu başarılı bir enjeksiyonun görselleştirilmesini daha da kolaylaştırabilir. 30 balığın tümünü enjekte ettikten sonra, tabağı E üç besiyeri ile doldurun ve ardından balığı geri kazanım kabına boşaltın.

10 hayvanı bir mililitre E üç besiyeri içeren 1.7 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve balığı 200 mikrolitre trica ile ötenazi yapın. Daha sonra, her hayvan için, bir mikro slayt üzerinde bir santimetre aralıklarla bir kare içinde dört damla vakumlu yağ yerleştirin ve karenin ortasına iki damla taze hazırlanmış,% 2 düşük erime ekleyin. Daha sonra, bir balığı diseksiyon mikroskobu altında ayrı bir cam slayta yerleştirin ve hayvanın kalbinin atmayı bıraktığını doğrulayın ve fazla suyu çıkarın.

Şimdi kafayı sabit bir pozisyonda tutmak için bir çift ince cımbız ve ön bağırsağı aşağı çekmek için başka bir cımbız kullanın. Yüzme kesesini pnömatik kanaldan alın, sindirim sisteminden ayırın ve agro katılaşmadan önce hazırlanan mikro slaytlardan birinin ortasına yerleştirin. Son olarak, vakum yağına ve agaroza temas edene kadar hafifçe aşağı iterek dokunun üzerine bir örtü kaydırın ve hasattan sonraki 10 dakika içinde yüzme kesesini görüntüleyin.

Dört nanolitre deniz albicansını, yedincinin 10'unun bir ila 1.5 katı oranında enjekte etmek. Mililitre başına CFU, balık başına 10 ila 50 maya hücresi aralığıyla sonuçlanan en tutarlı verileri verir. Aşının 15 ila 25 maya hücresine daraltılması, daha sıkı bir fenotip ve yanıt verir.

Nötrofiller, farelerde ve insanlarda kandidiyazise karşı dirençte önemli bir rol oynar ve zebra balığı yüzme kesesinin canlı albikanlarla enfeksiyonu, nötrofillerin hızlı ve sürekli bir şekilde toplanmasına yol açar. Bu, ısı öldürücü maya hücreleri enjekte edildiğinde meydana gelmez. Filamentler, maya hücrelerinin enjeksiyonundan sonra hızla gelişir ve enjeksiyondan sonraki ilk 24 saat boyunca filamentli büyüme devam eder, daha sonra bu sayı azalmaya başlar, tek tek balıkları non-invaziv olarak takip etme yeteneği, bu boylamsal çalışmaları mümkün kılar ve hastalık ilerlemesi ve konakçı yanıtlarındaki bireyden bireye farklılıkları vurgular.

Fare görüntülemede pratik olmayan deneysel bir protokol olan immün veya epitel hücrelerinin c albicans ile etkileşimleri burada sunulan modelde nispeten kolaydır. Bununla birlikte, yüzme kesesinin az önce gösterildiği gibi diseke edilmesi, görüntülemenin kalitesini önemli ölçüde artırır. Bu, özellikle floresanın her yerde ifade edildiği transgenik balık çizgilerini görselleştirirken kullanışlıdır ve alfa Catine sitrin balık çizgisinden disseke edilmiş bir yüzme kesesinin bu görüntülerinde gözlemlendiği gibi çevredeki dokuda yabancı floresan vardır.

Bu prosedürü takiben. Morf teknolojisi veya kimyasal inhibisyon tedavisi gibi diğer yöntemler, mukozal kandidiyazda belirli bir bağışıklık hücresinin veya sinyal yolunun rolü nedir gibi soruları cevaplamak için kullanılabilir.