T-hücre reseptörleri Eksizyon Circles Eşzamanlı Niceleme (TREC) ve K-silme Rekombinasyon Eksizyon Circles (KRECs) Gerçek zamanlı PCR ile

Aşağıdaki deneyin genel amacı, hem T hücresi reseptör eksizyon halkalarını hem de REX ve K silme rekombinasyon eksizyon çemberlerini veya düzeltmelerini tek bir testte ölçerek timik ve kemik iliği çıktısını tahmin etmektir. Bu, DNA amplifikasyonundan sonra üç hedef arasında bire bir oranı korumak için ilk olarak TRX düzeltmelerinin DNA dizisinin parçalarını ve tek bir kopya referans genini içeren üçlü bir ekleme plazmidinin oluşturulmasıyla elde edilir. Daha sonra, üçlü insert plazmidin seri dilüsyonları gerçekleştirilerek standart bir eğri oluşturulur, bu da üç hedef dizinin gerçek zamanlı PCR ile mutlak nicelleştirilmesine izin verir.

Son olarak, tres ve çatlakların mutlak nicelleştirilmesine yol açan gerçek zamanlı bir PCR testi çalıştırılır. Bildirilen sonuçlar, sağlıklı çocuklarda ve yetişkinlerde timik ve kemik iliği çıkışının yaş ve cinsiyete bağlı değişimini göstermektedir. Bu yöntem için ilk olarak, genellikle alınan kan miktarının yetişkinlere kıyasla az olduğunu göz önünde bulundurarak, yenidoğanlarda veya bebeklerde hem kemik iliğini hem de timik çıktıyı analiz etmemiz gerektiğinde aklımıza geldi.

Bu nedenle, numune hazırlama ve reaktif maliyetlerini optimize etmek için iki izleme ve düzeltme miktar tayini yöntemini tek bir tahlilde birleştirmeye karar verdik. Bu tekniğin anlamı, primer ve edinilmiş bağışıklık yetmezliklerinin teşhisine kadar uzanır, ancak yöntem aynı zamanda TMB hücrelerinin kaybını içeren tüm hastalıklarda ve kemik iliği naklini takiben yeni sulandırmayı incelemek için de kullanılabilir. Ayrıca, esas olarak lenfosit homeostazını içeren temel araştırmalara da uygulanabilir.

Bunun ana avantajı, üçlü bir fazlalık kullanarak sadece tek bir standart kürlemeye ihtiyaç duyulması ve böylece deneysel değişkenliği azaltmasıdır. Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan kişiler, üçlü insert plazmid hazırlığı için gereken uzun prosedür veya standart eğri hazırlığı ile ilgili sorunlar nedeniyle mücadele edebilir. Başlamak için, standart bir yoğunluk gradyan ayırma yöntemi kullanılarak EDTA tüplerine toplanan genç ve sağlıklı bir deneğin periferik kanı gibi, TRX'e sahip olma olasılığı çok yüksek hücreler ve PCR ile tespit edilebilen çatlaklar içeren bir numune alın.

Metin protokolüne göre hücrelerden DNA'yı çıkardıktan sonra periferik kan mononükleer hücrelerini ayırın, Rex sinyalini, eklem Rex sinyal eklemini ve TCR alfa sabit gen fragmanlarını amplifiye etmek için Fort TRX REX ve TCR alfa sabit genine özgü primerleri kullanın. Trax sinyal ekleminin PCR ürününü PCR 2.1 topo vektörünün TA alıcı bölgesine yerleştirin ve plazmid DNA'yı XL bir mavi kimyasal olarak yetkin hücreleri ısı şoku ile dönüştürmek için kullanın, beta laktaz tamamlayıcılığını kaybetmiş ampisilin dirençli beyaz kolonileri yeni bir ana tabağa izole edin ve trek fragmanını içeren kolonileri tanımlamak için PCR kullanın. Trek pozitif kolonilerden birini büyüttükten ve DNA'yı izole ettikten sonra, plazmidi ve TCR alfa sabit geni amplifiye edilmiş ürünü sindirmek için SP birini kullanın ve TCR alfa sabit gen fragmanını plazmide bağlayın.

Doğru parçayı yerleştirmek için dönüşümü, koloni seçimini ve genişlemesini ve DNA izolasyonunu tekrarlayın, plazmidi ve doğru PCR fragmanını sindirmek için SP yerine arka üçünü kullanın ve DNA'yı bağlamak ve izole etmek için işlemi tekrarlayın. Üç ekin dizileri doğrulandıktan sonra, koloniyi genişletin ve standart bir eğri hazırlamak için metin protokolüne göre MIDI hazırlığı ile plazmit DNA'yı saflaştırın. Burada gösterildiği gibi plazmitin kütlesini ve konsantrasyonunu hesapladıktan sonra, plazmidin bir alikotunu çözün ve DNA'nın doğrusallaştırılmış alikotu ile iki mikrogramı doğrusallaştırmak için bir tane gösterin.

C bir V bir, C iki V iki eşittir formülünü kullanın. Burada gösterildiği gibi serinin ilk standart eğri noktasını hazırlamak için gereken seyreltme hacmini hesaplamak için, kalan standart eğri noktalarını elde etmek için bir ila 10 seyreltme serisi hazırlayın. Plazmid seyreltmesini kullanıma kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın Numuneleri gerçek zamanlı PCR için hazırlamak için, biri Rex ve çatlaklar için diğeri TCR alfa sabiti için olmak üzere iki ayrı tüp ile aşağıdaki şekilde analiz edilecek her numune için en az iki kopya içeren bir PCR plakası düzenleyin.

İhtiyaç duyulan toplam kuyu sayısı için ana karışımları hazırlayın. Plakanın kuyucuklarına 20 mikrolitre ekleyin. Daha sonra, periferik kan mononükleer hücrelerinden veya P BMC'lerden ekstrakte edilen beş mikrolitre genomik DNA ekleyin.

Reaksiyon plakasını kapatmak için optik bir yapışkan kapak kullanmadan önce şablonsuz kontrol kuyularına beş mikrolitre su ekleyin. Daha sonra plazmit DNA standart eğrisi seyreltmesini çözün ve en yüksek seyreltmeyi hazırlayın. Yalnızca A'dan H'ye kadar olan sıralar ve bir ila dört arasındaki sütunlar arasında bulunan kuyuları ortaya çıkarın.

Ve kısa bir girdaptan sonra, her bir seyreltme noktasından beş mikrolitre ekleyin. Kuyucukların dibinde kabarcık olmadığından ve reaktiflerin dibe çöktüğünden emin olun. Testi aşağıdaki protokolle çalıştırmak için gerçek zamanlı bir PCR sistemi kullanın.

İki dakika boyunca 50 santigrat derece ve 10 dakika boyunca 95 santigrat derecede ilk ısıtma, ardından 15 saniye boyunca 95 santigrat derecede 45 döngü denatürasyon. Ve kombine bir astar probu e diz çökme ve bir dakika boyunca 60 santigrat derecede uzama. Gerçek zamanlı PCR verilerini analiz etmek için, kaydedilen sonuç dosyasını yazılımda açın ve pencerenin üst kısmındaki sonuçlar sekmesine tıklayın.

Analiz menüsüne tıklayın ve analiz ayarlarını seçin. Eşik döngüsü için tüm dedektörleri ve otomatik CT'yi seçerek yazılımın eşiği otomatik olarak belirlemesine izin verin. Yazılımın varsayılan olarak arka plan eleme için otomatik taban çizgisini ayarlamasına izin verin.

Amplifikasyon grafiği adlı sekmeye tıklayın ve pencerenin en sağında, ilgili açılır menüdeki üç dedektörden birini seçin. Pencerenin alt kısmında manuel olarak bir eşik ayarlamak için manuel CT'yi seçin'in hemen altında, fareyi tablonun ilgili hücrelerinin üzerine tıklayıp sürükleyerek amplifikasyon grafiklerini göstermek için seçilen dedektörün standart eğri seyreltme noktalarına karşılık gelen kuyucukları seçin. Eşiği manuel olarak ayarlamak için kırmızı eşik çizgisini yukarı ve aşağı sürükleyin ve ardından sonuçları yeniden analiz etmek için analiz et'i tıklatın.

Eşiğin ayarlanmasının sonuçları nasıl etkilediğini kontrol etmek için rapor sekmesini seçin ve ilgili standart eğri seyreltme noktalarının elde edilen CT'sini görün. Amplifikasyon grafiği sekmesinde en uygun yerleşimi elde etmek için eşiği hareket ettirirken, eşiğin arka plan gürültüsünün yeterince üzerinde, ancak plato fazının altında bir üstel amplifikasyon bölgesinde olduğunu doğrulayın. Amplifikasyon grafiği logaritmik ölçekte gösterilmiyorsa, grafik ayarlarını geri çağırmak için çizime sağ tıklayın ve çalıştırma sonrası Y ais ayarını günlük olarak ayarlayın.

Grafiğin doğrusal kısmında eşiği yarıya kadar ayarlayın ve amplifikasyon eğrilerini yaklaşık olarak birbirine paralel olarak gözlemleyin. CT sonuçlarını görmek için rapor sekmesine tıklayın. Eşik yerleşiminin, her standart eğrinin iki kopyasının hassasiyetini en üst düzeye çıkaran sonuçlar ürettiğinden emin olun.

Seyreltme noktaları. Eşiğin, rapor sekmesi altındaki standart eğri seyreltme noktalarının uç büyüklük sıralarını en iyi yansıtan noktaya yerleştirilip yerleştirilmediğini kontrol edin. Standart eğrinin kuyucuklarına karşılık gelen hücreleri seçmek için fareyi pencerenin alt kısmındaki tabloda tekrar sürükleyin Tüm dedektörler için, üç hedefin elde edilen CT'sinin aynı seyreltme noktalarında çok benzer olduğunu doğrulayın.

Örneğin, fark, 0,5 CT'den fazla olmamak üzere, gerekirse eşikleri yeniden ayarlayın ve pencerenin alt kısmındaki rapor sekmesinin altında tekrar kontrol edin. NTC kuyularını seçin ve NTC kuyularında belirsiz bir CT'ye karşılık gelen herhangi bir amplifikasyon olmadığını kontrol edin. Standart eğri sekmesini seçin ve çizim penceresinin sağında, açılır menüden dedektörleri seçin ve rapor edilen standart eğri eğiminin eksi 3,55 ile eksi 3,32 arasında olup olmadığına bakın, bu da %91 ila %100'lük PCR verimliliklerine karşılık gelir Eğimin ve kesişim noktasının hemen altındaki değerini kontrol ederek belirleme katsayısının veya R karenin 0,998'den yüksek olduğundan emin olun.

Rapor sekmesine tıklayın ve grafiğin altındaki tablonun ilgili hücrelerinde, pozitif kontrolün BT'sinin, bilinen aynı pozitif kontroldeki önceki tahlillerin sonuçlarıyla tutarlı olduğunu doğrulayın. Dosya menüsüne tıklayın, kaydedin ve ardından tüm kuyucukların miktarlarını virgülle ayrılmış değerler içeren bir metin dosyasında dışa aktarmak için bir CSV dosyasına aktarın. Son olarak, CSV dosyasını bir elektronik tablo yazılımına aktarın ve aşağıdaki formülü uygun şekilde ayarlayarak altı PBM'ye 10 başına parça veya düzeltme sayısını hesaplayın.

Bu videoda açıklanan tahlil, 87 Sağlıklı Kontrolden oluşan temsili bir örnek üzerinde gerçekleştirildi. Sıfır ila 17 yaş arası 42 çocuk ve 24 ila 60 yaş arası 45 yetişkin. Burada gösterildiği gibi, yetişkinlerde timik evrim nedeniyle yaşla birlikte sıfır ila üç ila dört yıl arasında trekking sayısı keskin bir şekilde azalmıştır.

Yürüyüş sayısı aynı zamanda cinsiyete de bağlıdır, çünkü erkeklerde kadınlardan daha hızlı azalır ve bu da uygun referans aralıklarını belirleme yeteneğini etkileyebilir. Bununla birlikte, bu grafikler, çatlak sayısının, sadece çocuklarda T TREX'lerde görülen paterne benzer şekilde yaşla birlikte azaldığını göstermektedir. Yetişkinlerde ise, kemik iliği çıktısı yaşam boyunca oldukça stabildir ve cinsiyete bağlı değildir.

Insert plazmit preparasyonundaki üçlü yaklaşık iki veya üç hafta gerektirir, ancak bundan sonra depolanan plazmit tahsisleri üç yıl sürecektir. Tekniğin geri kalan kısmı, uygun şekilde yapılırsa sadece dört ila beş saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, DNA çapraz kontaminasyonunu önlemek için plazmid ile ilgili tüm manipülasyonları özel bir alanda gerçekleştirmek çok önemlidir.

Geliştirildikten sonra sonuçları analiz ederken standart tüpün stabilitesini doğrulamak da önemlidir. Bu teknik, klinik immünoloji veya hematoloji alanındaki araştırmacılara, kemik iliği transplantasyonunu takiben immün rekonstrüksiyonun sonucunu izlemek veya sadece lenfosit homeostazını incelemek için primer immün yetmezliklerin tanımlanması için gelişmiş bir araç sağlamıştır. Bu videoyu izledikten sonra, plazmidde üçlünün nasıl elde edileceğini, standart eğrinin nasıl hazırlanacağını, gerçek zamanlı PCR deneyinin nasıl çalıştırılacağını ve traks ve çatlakların tekrarlanabilir mutlak bir miktar tayinini elde etmek için gerekli hesaplamaları nasıl yapacağınızı iyi anlamış olmalısınız.