Name: T-hücre reseptörleri Eksizyon Circles Eşzamanlı Niceleme (TREC) ve K-silme Rekombinasyon Eksizyon Circles (KRECs) Gerçek zamanlı PCR ile (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 14 s
Description: Keşfedin TREC ve KREC eşzamanlı niceleme yöntemini gerçek zamanlı PCR kullanarak timus ve kemik iliği çıktısını değerlendirmek için. Bu teknik immünoloji araştırmalarında değerli bir araçtır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarların teşekkür hakkı yok.

<ol><li>Douek, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+thymic+function+with+age+and+during+the+treatment+of+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Changes in thymic function with age and during the treatment of HIV infection.</a> Nature. 396 (6712), 690-695 (1998).</li>
<li>Zelm, M. C., Szczepanski, T., van der Burg, M., van Dongen, J. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+history+of+B+lymphocytes+reveals+homeostatic+proliferation+and+extensive+antigen-induced+B+cell+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Replication history of B lymphocytes reveals homeostatic proliferation and extensive antigen-induced B cell expansion.</a> J. Exp. Med. 204 (3), 645-655 (2007).</li>
<li>Fronkova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-cell+reconstitution+after+allogeneic+SCT+impairs+minimal+residual+disease+monitoring+in+children+with+ALL%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">B-cell reconstitution after allogeneic SCT impairs minimal residual disease monitoring in children with ALL.</a> Bone Marrow Transplant. 42 (3), 187-196 (2008).</li>
<li>Sottini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+quantification+of+recent+thymic+T-cell+and+bone+marrow+B-cell+emigrants+in+patients+with+primary+immunodeficiency+undergone+to+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous quantification of recent thymic T-cell and bone marrow B-cell emigrants in patients with primary immunodeficiency undergone to stem cell transplantation.</a> Clin. Immunol. 136 (2), 217-227 (2010).</li>
<li>Serana, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymic+and+bone+marrow+output+in+patients+with+common+variable+immunodeficiency%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymic and bone marrow output in patients with common variable immunodeficiency.</a> J. Clin. Immunol. 31 (4), 540-549 (2011).</li>
<li>Zanotti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposite+effects+of+interferon-%CE%B2+on+new+B+and+T+cell+release+from+production+sites+in+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Opposite effects of interferon-β on new B and T cell release from production sites in sclerosis.</a> J. Neuroimmunol. 240-241, 147-150 (2011).</li>
<li>Zanotti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+accumulation+of+newly+produced+T+and+B+lymphocytes+in+natalizumab-treated+multiple+sclerosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Peripheral accumulation of newly produced T and B lymphocytes in natalizumab-treated multiple sclerosis patients.</a> Clin. Immunol. 145 (1), 19-26 (2012).</li>
<li>Sottini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-existing+T-+and+B-cell+defects+in+one+progressive+multifocal+leukoencephalopathy+patient%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Pre-existing T- and B-cell defects in one progressive multifocal leukoencephalopathy patient.</a> PLoS One. 7, e34493(2012).</li>
<li>Quiros-Roldan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+combined+antiretroviral+therapy+on+B-+and+T-cell+release+from+production+sites+in+long-term+treated+HIV-1%2B+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Effects of combined antiretroviral therapy on B- and T-cell release from production sites in long-term treated HIV-1+ patients.</a> J. Transl. Med. 10, 94(2012).</li>
<li>Mensen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+TREC+and+KREC+quantification+for+the+monitoring+of+early+T-+and+B-cell+neogenesis+in+adult+patients+after+allogeneic+hematopoietic+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Utilization of TREC and KREC quantification for the monitoring of early T- and B-cell neogenesis in adult patients after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation.</a> J. Transl. Med. 11, 188(2013).</li>
<li>Serana, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+different+extent+of+B+and+T+cell+immune+reconstitution+after+hematopoietic+stem+cell+transplantation+and+enzyme+replacement+therapies+in+SCID+patients+with+adenosine+deaminase+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The different extent of B and T cell immune reconstitution after hematopoietic stem cell transplantation and enzyme replacement therapies in SCID patients with adenosine deaminase deficiency.</a> J. Immunol. 185 (12), 7713-7722 (2010).</li>
<li>Borte, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+screening+for+severe+primary+immunodeficiency+diseases+using+high-throughput+triplex+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Neonatal screening for severe primary immunodeficiency diseases using high-throughput triplex real-time PCR.</a> Blood. 119 (11), 2552-2555 (2012).</li>
<li>Baker, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementing+routine+testing+for+severe+combined+immunodeficiency+within+Wisconsin%27s+newborn+screening+program%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Health+Rep%22%5BJournal%5D)">Implementing routine testing for severe combined immunodeficiency within Wisconsin's newborn screening program.</a> Public Health Rep. 125 (2), 88-95 (2010).</li>
<li>Lorenzi, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+thymic+function+directly+from+peripheral+blood%3A+a+validated+modification+to+an+established+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Meth%22%5BJournal%5D)">Determination of thymic function directly from peripheral blood: a validated modification to an established method.</a> J. Immunol. Meth. 339 (2), 185-194 (2008).</li>
<li>De Boer, R. J., Perelson, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+T+lymphocyte+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Theor.+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantifying T lymphocyte turnover.</a> J. Theor. Biol. 327, 45-87 (2013).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

TREC ve KREC nicelemesi, bazı uyarıların dikkate alınması koşuluyla, son timik ve kemik iliği çıktısının iyi bir tahmini olarak kabul edilebilir. Standart eğri kullanan mutlak bir niceleme yöntemi, gerçek zamanlı PCR reaksiyon plakasında daha fazla reaktif ve daha fazla alan gerektirse de, bilinmeyen numune miktarları, bilinen miktarlarda başlangıç malzemesi üzerine inşa edilen standart eğrilerden enterpolasyon yapıldığından, son derece doğru nicel sonuçlar sağlar. Ayrıca, bu yöntem düşük miktardaki hedefleri tespit etme...

T-hücresi reseptör eksizyon daire (TREC) ve K-silme rekombinasyon eksizyon daire (KRECs), genomik bir DNA yeniden birleştirme işlemi sırasında T ve sırasıyla A, B-hücreleri, bir oranda kesilmiş küçük daireselleşmiş DNA elemanları vardır giden Bir çok çeşitlendirilmiş T- repertuarına ve B-hücre reseptörleri oluşumu. Onlar hiçbir işlevi var, ama onlar kararlı ve taklit edilemeyen, çünkü onlar, böylece sadece iki kızı hücrelerin birinde ısrar, her hücre bölünmesinde sonra sulandırılır. Bu nedenle, periferik kandaki düzeylerinin timus, kemik iliği çıkışı bir tahmini olarak kabul edilebilir. TREC tahlil ölçüde timik çıktı kapsamını değerlendirmek için son 15 yılda kullanılmış olsa da, başlangıçta geliştirilen 1 Krec deneyi, B-hücresi çoğalmasını ve sağlık ve hastalık B-hücresi homeostasisin katkılarını, 2 ölçmek için ancak son zamanlarda kemik m marker olarak önerilmiştirçıktı ok. 3,4 Burada, biz TREC ve KRECs hem eşzamanlı ölçümü için geliştirilen yöntem açıklanmaktadır. 4 Bu kombine yöntem ile, gerçek zamanlı PCR ile DNA miktar ile ilişkili değişkenlik TREC, KRECs ve T-hücresi reseptörü alfa sabit fragmanlarını ihtiva eden bir üç-uç plazmid seyreltilmesi ile elde edilen eşsiz bir standart eğri kullanımı (TCRAC) ile ortadan kaldırılır 1: 1 oranında bir 1 geni. Bu TREC ve Krec kopya sayısında daha doğru bir değerlendirme sağlar. Ayrıca, aynı reaksiyonda iki hedef aynı anda miktar reaktif maliyet azalmasını sağlar. Önerilen TREC / Krec tahlil Şiddetli kombine immün yetmezlik (SCID), 4 Ortak Değişken İmmün Yetmezlik, 5 otoimmün hastalıklar, 6-8 ve HIV enfeksiyonu olan çocuklarda veya yetişkinlerde T- kapsamını ve B-hücresi neo-üretim ölçmek için yararlı olabilir . 9 Ayrıca, için kullanılabilirHastalar Krec kantifikasyonunu kullanılarak tespit edilebilir agamaglobülinemı SCID hastalarda altta yatan genetik bozukluklara rağmen TREC testi kullanılarak tanınan, çünkü Sonunda. 6-8 hematopoetik kök hücre nakli, 10 enzim replasmanı, 11 ve antiviral 9 veya bağışıklık tedaviler sonrasında bağışıklık ayilmanizi, ve , TREC / Krec deneyi de doğan tarama programlarına immün yetersizlikler tespit etmek için de kullanılabilir. Bu durumda, 12, test kan lekelenir küçük noktalar ekstre DNA üzerinde yapıldığında ve filtre kağıdı üzerinde kurutuldu gerekir, son derece hassas ve spesifik olmalıdır Hedef hastalıklar yanı sıra, oldukça üretilebilir ve maliyet-etkin bir. Wisconsin introduc ilk olunca test Krec miktar giriş rutin 2008 yılından bu yana ABD (WI, MA, CA) bazı bölgelerinde yapılmıştır immün için yenidoğan tarama, performanslarını artırmak gerekironun doğum tarama programında TREC e analizi. 13

<table><tbody><tr><td>Histopak-1077</td><td>Sigma Aldrich SRL</td><td>10771-500 ML</td><td>yoğunluk gradyan ayırma yöntemi</td></tr><tr><td>QIAamp DNA Kan Mini Kiti (250)</td><td>QIAGEN</td><td>51106</td><td>DNA ekstraksiyonu</td></tr><tr><td>Modifiye edilmemiş DNA Oligonükleotidler HPSF 0.01 mmol</td><td>Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reaktifleri S.r.l&nbsp;</td><td></td><td>Liyofilize ürünü 100 pmol/&mikro'ya yeniden süspanse edin; l</td></tr><tr><td>AmpliTaq DNA Polimeraz: 10x Tampon II ve 25 mM MgCl 2</td><td></td> <td>GeneAmp</td> dNTP Karışımı (100 mM) Uygulamalı Biyosistemler / Yaşam N8080156Teknolojileri <td></td>dahil</tr> <tr><td></td><td></td><td>N8080261</td><td></td></tr><tr><td>TOPO TA Klonlama Kiti Subklonlama için</td><td>Invitrojen / Yaşam Teknolojileri</td><td>K4500-01</td><td></td></tr><tr><td>XL1-Blue Alt Klonlama Sınıfı Yetkin Hücreler</td><td>Stratagene</td><td>200130</td><td></td></tr><tr><td>PureYield Plazmid Miniprep Sistemi</td><td>Promega</td><td>A1223</td><td></td></tr><tr><td>SpeI 500U</td><td>New England Biolabs</td><td>R0133S</td><td></td></tr><tr><td>HindIII-HF 10.000 U</td><td>New England Biolabs</td><td>R3104S</td><td></td></tr><tr><td>PureYield Plazmid Midiprep Sistemi</td><td>Promega</td><td>A2492</td><td></td></tr><tr><td>XhoI 5.000 U</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>TRIS Utrapure</td><td>Sigma Aldrich SRL</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich SRL</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>TE tamponu (1 mM TRIS ve 0.1 mM EDTA)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td><td>Uygulamalı Biyosistemler/Yaşam Teknolojileri</td><td>4364338</td><td></td></tr><tr><td>Çift etiketli problar HPLC 0.01 mmol</td><td>Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reaktifleri S.r.l&nbsp;</td><td></td><td>Liyofilize ürünü 100 pmol/&mikro'ya yeniden süspanse edin; l</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000c spektrofotometre</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Uygulamalı Biyosistemler 2720 Termal Döngüleyici</td><td>Uygulamalı Biyosistemler/Yaşam Teknolojileri</td><td>4359659</td><td></td></tr><tr><td>Hızlı 7500 Gerçek Zamanlı PCR sistemi</td><td>Uygulamalı Biyosistemler/Yaşam Teknolojileri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS Dizi Algılama Yazılımı 1.4</td><td>Uygulamalı Biyosistemler/Yaşam Teknolojileri</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

t-hücre reseptörleri eksizyon circles eşzamanlı niceleme (trec) ve k-silme rekombinasyon eksizyon circles (krecs) gerçek zamanlı pcr ile

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles (TRECs) and K-Deleting Recombination Excision Circles (KRECs) by Real-time PCR

T hücresi reseptör eksizyon çemberleri (TREC'ler) ve K silici rekombinasyon eksizyon çemberleri (KREC'ler), T ve B hücresi reseptörlerini oluşturan rekombinasyon işlemi sırasında oluşan dairesel DNA elemanlarıdır. TREC'ler ve KREC'ler çoğalamadıkları için, her hücre bölünmesinden sonra seyreltilirler ve bu nedenle hücrede kalırlar. Periferik kandaki miktarları, timik ve kemik iliği çıkışının bir tahmini olarak düşünülebilir. İyi bilinen ve yaygın olarak kullanılan TREC testini KREC testinin değiştirilmiş bir versiyonuyla birleştirerek, hem yeni üretilen T hem de B lenfositlerinin tek bir testte kantifikasyonuna izin veren çift yönlü kantitatif gerçek zamanlı bir PCR geliştirdik. TREC'lerin ve KREC'lerin sayısı, referans gen olarak görev yapan bir T hücresi reseptörü alfa sabit geninin bir parçası ile birlikte bir bakteri plazmidinde klonlanan TREC ve KREC sinyal eklemlerinin seri olarak seyreltilmesiyle hazırlanan standart bir eğri kullanılarak elde edilir. Sonuçlar TREC ve KREC sayısı / 106 hücre veya ml kan başına rapor edilir. Bu DNA fragmanlarının miktar tayininin, hem çocuklarda hem de yetişkinlerde kemik iliği naklini takiben immün sulandırmanın izlenmesi, immün eksikliklerin daha iyi karakterizasyonu veya belirli immünomodülatör ilaç aktivitesinin daha iyi anlaşılması için yararlı olduğu kanıtlanmıştır.

Tahlil 87 sağlıklı kontrol temsili örneklemde gerçekleştirilmiştir: 42 çocuk 0 yaş - 17 (erkek / kadın: 25/17) ve 24 yaş 45 yetişkin - 60 (erkek / kadın: 29/16). Sonuçlar hesaplandı TREC 10 6 PBMC başına KRECs ve daha sonra kan ml'si başına TREC ve KRECs olarak elde edildi. - 4 yıl TREC sayısı nedeniyle 0-3 çok keskin bir şekilde, özellikle de timus involüsyon, 4 yaşla birlikte azalmaktadır. Kadınlarda erkeklere göre daha hızla azalır, çünkü erişkinlerde, TREC sayısı da...

Burada, T hücresi reseptör eksizyon çemberlerinin (TREC'ler) ve K-silme rekombinasyon eksizyon çemberlerinin (KREC'ler) eşzamanlı niceliklemesi için bir yöntem açıklıyoruz. TREC/KREC testi, timik ve kemik iliği çıkışının belirteci olarak kullanılabilir.

T-hücre reseptörleri Eksizyon Circles Eşzamanlı Niceleme (TREC) ve K-silme Rekombinasyon Eksizyon Circles (KRECs) Gerçek zamanlı PCR ile

T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, hem T hücresi reseptör eksizyon halkalarını hem de REX ve K silme rekombinasyon eksizyon çemberlerini veya düzeltmelerini tek bir testte ölçerek timik ve kemik iliği çıktısını tahmin etmektir. Bu, DNA amplifikasyonundan sonra üç hedef arasında bire bir oranı korumak için ilk olarak TRX düzeltmelerinin DNA dizisinin parçalarını ve tek bir kopya referans genini içeren üçlü bir ekleme plazmidinin oluşturulmasıyla elde edilir. Daha sonra, üçlü insert plazmidin seri dilüsyonları gerçekleştirilerek standart bir eğri oluşturulur, bu da üç hedef dizinin gerçek zamanlı PCR ile mutlak nicelleştirilmesine izin verir.Son olarak, tres ve çatlakların mutlak nicelleştirilmesine yol açan gerçek zamanlı bir PCR testi çalıştırılır. Bildirilen sonuçlar, sağlıklı çocuklarda ve yetişkinlerde timik ve kemik iliği çıkışının yaş ve cinsiyete bağlı değişimini göstermektedir. Bu yöntem için ilk olarak, genellikle alınan kan miktarının yetişkinlere kıyasla az olduğunu göz önünde bulundurarak, yenidoğanlarda veya bebeklerde hem kemik iliğini hem de timik çıktıyı analiz etmemiz gerektiğinde aklımıza geldi.Bu nedenle, numune hazırlama ve reaktif maliyetlerini optimize etmek için iki izleme ve düzeltme miktar tayini yöntemini tek bir tahlilde birleştirmeye karar verdik. Bu tekniğin anlamı, primer ve edinilmiş bağışıklık yetmezliklerinin teşhisine kadar uzanır, ancak yöntem aynı zamanda TMB hücrelerinin kaybını içeren tüm hastalıklarda ve kemik iliği naklini takiben yeni sulandırmayı incelemek için de kullanılabilir. Ayrıca, esas olarak lenfosit homeostazını içeren temel araştırmalara da uygulanabilir.Bunun ana avantajı, üçlü bir fazlalık kullanarak sadece tek bir standart kürlemeye ihtiyaç duyulması ve böylece deneysel değişkenliği azaltmasıdır. Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan kişiler, üçlü insert plazmid hazırlığı için gereken uzun prosedür veya standart eğri hazırlığı ile ilgili sorunlar nedeniyle mücadele edebilir. Başlamak için, standart bir yoğunluk gradyan ayırma yöntemi kullanılarak EDTA tüplerine toplanan genç ve sağlıklı bir deneğin periferik kanı gibi, TRX'e sahip olma olasılığı çok yüksek hücreler ve PCR ile tespit edilebilen çatlaklar içeren bir numune alın.Metin protokolüne göre hücrelerden DNA'yı çıkardıktan sonra periferik kan mononükleer hücrelerini ayırın, Rex sinyalini, eklem Rex sinyal eklemini ve TCR alfa sabit gen fragmanlarını amplifiye etmek için Fort TRX REX ve TCR alfa sabit genine özgü primerleri kullanın. Trax sinyal ekleminin PCR ürününü PCR 2.1 topo vektörünün TA alıcı bölgesine yerleştirin ve plazmid DNA'yı XL bir mavi kimyasal olarak yetkin hücreleri ısı şoku ile dönüştürmek için kullanın, beta laktaz tamamlayıcılığını kaybetmiş ampisilin dirençli beyaz kolonileri yeni bir ana tabağa izole edin ve trek fragmanını içeren kolonileri tanımlamak için PCR kullanın. Trek pozitif kolonilerden birini büyüttükten ve DNA'yı izole ettikten sonra, plazmidi ve TCR alfa sabit geni amplifiye edilmiş ürünü sindirmek için SP birini kullanın ve TCR alfa sabit gen fragmanını plazmide bağlayın.Doğru parçayı yerleştirmek için dönüşümü, koloni seçimini ve genişlemesini ve DNA izolasyonunu tekrarlayın, plazmidi ve doğru PCR fragmanını sindirmek için SP yerine arka üçünü kullanın ve DNA'yı bağlamak ve izole etmek için işlemi tekrarlayın. Üç ekin dizileri doğrulandıktan sonra, koloniyi genişletin ve standart bir eğri hazırlamak için metin protokolüne göre MIDI hazırlığı ile plazmit DNA'yı saflaştırın. Burada gösterildiği gibi plazmitin kütlesini ve konsantrasyonunu hesapladıktan sonra, plazmidin bir alikotunu çözün ve DNA'nın doğrusallaştırılmış alikotu ile iki mikrogramı doğrusallaştırmak için bir tane gösterin.C bir V bir, C iki V iki eşittir formülünü kullanın. Burada gösterildiği gibi serinin ilk standart eğri noktasını hazırlamak için gereken seyreltme hacmini hesaplamak için, kalan standart eğri noktalarını elde etmek için bir ila 10 seyreltme serisi hazırlayın. Plazmid seyreltmesini kullanıma kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın Numuneleri gerçek zamanlı PCR için hazırlamak için, biri Rex ve çatlaklar için diğeri TCR alfa sabiti için olmak üzere iki ayrı tüp ile aşağıdaki şekilde analiz edilecek her numune için en az iki kopya içeren bir PCR plakası düzenleyin.İhtiyaç duyulan toplam kuyu sayısı için ana karışımları hazırlayın. Plakanın kuyucuklarına 20 mikrolitre ekleyin. Daha sonra, periferik kan mononükleer hücrelerinden veya P BMC'lerden ekstrakte edilen beş mikrolitre genomik DNA ekleyin.Reaksiyon plakasını kapatmak için optik bir yapışkan kapak kullanmadan önce şablonsuz kontrol kuyularına beş mikrolitre su ekleyin. Daha sonra plazmit DNA standart eğrisi seyreltmesini çözün ve en yüksek seyreltmeyi hazırlayın. Yalnızca A'dan H'ye kadar olan sıralar ve bir ila dört arasındaki sütunlar arasında bulunan kuyuları ortaya çıkarın.Ve kısa bir girdaptan sonra, her bir seyreltme noktasından beş mikrolitre ekleyin. Kuyucukların dibinde kabarcık olmadığından ve reaktiflerin dibe çöktüğünden emin olun. Testi aşağıdaki protokolle çalıştırmak için gerçek zamanlı bir PCR sistemi kullanın.İki dakika boyunca 50 santigrat derece ve 10 dakika boyunca 95 santigrat derecede ilk ısıtma, ardından 15 saniye boyunca 95 santigrat derecede 45 döngü denatürasyon. Ve kombine bir astar probu e diz çökme ve bir dakika boyunca 60 santigrat derecede uzama. Gerçek zamanlı PCR verilerini analiz etmek için, kaydedilen sonuç dosyasını yazılımda açın ve pencerenin üst kısmındaki sonuçlar sekmesine tıklayın.Analiz menüsüne tıklayın ve analiz ayarlarını seçin. Eşik döngüsü için tüm dedektörleri ve otomatik CT'yi seçerek yazılımın eşiği otomatik olarak belirlemesine izin verin. Yazılımın varsayılan olarak arka plan eleme için otomatik taban çizgisini ayarlamasına izin verin.Amplifikasyon grafiği adlı sekmeye tıklayın ve pencerenin en sağında, ilgili açılır menüdeki üç dedektörden birini seçin. Pencerenin alt kısmında manuel olarak bir eşik ayarlamak için manuel CT'yi seçin'in hemen altında, fareyi tablonun ilgili hücrelerinin üzerine tıklayıp sürükleyerek amplifikasyon grafiklerini göstermek için seçilen dedektörün standart eğri seyreltme noktalarına karşılık gelen kuyucukları seçin. Eşiği manuel olarak ayarlamak için kırmızı eşik çizgisini yukarı ve aşağı sürükleyin ve ardından sonuçları yeniden analiz etmek için analiz et'i tıklatın.Eşiğin ayarlanmasının sonuçları nasıl etkilediğini kontrol etmek için rapor sekmesini seçin ve ilgili standart eğri seyreltme noktalarının elde edilen CT'sini görün. Amplifikasyon grafiği sekmesinde en uygun yerleşimi elde etmek için eşiği hareket ettirirken, eşiğin arka plan gürültüsünün yeterince üzerinde, ancak plato fazının altında bir üstel amplifikasyon bölgesinde olduğunu doğrulayın. Amplifikasyon grafiği logaritmik ölçekte gösterilmiyorsa, grafik ayarlarını geri çağırmak için çizime sağ tıklayın ve çalıştırma sonrası Y ais ayarını günlük olarak ayarlayın.Grafiğin doğrusal kısmında eşiği yarıya kadar ayarlayın ve amplifikasyon eğrilerini yaklaşık olarak birbirine paralel olarak gözlemleyin. CT sonuçlarını görmek için rapor sekmesine tıklayın. Eşik yerleşiminin, her standart eğrinin iki kopyasının hassasiyetini en üst düzeye çıkaran sonuçlar ürettiğinden emin olun.Seyreltme noktaları. Eşiğin, rapor sekmesi altındaki standart eğri seyreltme noktalarının uç büyüklük sıralarını en iyi yansıtan noktaya yerleştirilip yerleştirilmediğini kontrol edin. Standart eğrinin kuyucuklarına karşılık gelen hücreleri seçmek için fareyi pencerenin alt kısmındaki tabloda tekrar sürükleyin Tüm dedektörler için, üç hedefin elde edilen CT'sinin aynı seyreltme noktalarında çok benzer olduğunu doğrulayın.Örneğin, fark, 0,5 CT'den fazla olmamak üzere, gerekirse eşikleri yeniden ayarlayın ve pencerenin alt kısmındaki rapor sekmesinin altında tekrar kontrol edin. NTC kuyularını seçin ve NTC kuyularında belirsiz bir CT'ye karşılık gelen herhangi bir amplifikasyon olmadığını kontrol edin. Standart eğri sekmesini seçin ve çizim penceresinin sağında, açılır menüden dedektörleri seçin ve rapor edilen standart eğri eğiminin eksi 3,55 ile eksi 3,32 arasında olup olmadığına bakın, bu da %91 ila %100'lük PCR verimliliklerine karşılık gelir Eğimin ve kesişim noktasının hemen altındaki değerini kontrol ederek belirleme katsayısının veya R karenin 0,998'den yüksek olduğundan emin olun.Rapor sekmesine tıklayın ve grafiğin altındaki tablonun ilgili hücrelerinde, pozitif kontrolün BT'sinin, bilinen aynı pozitif kontroldeki önceki tahlillerin sonuçlarıyla tutarlı olduğunu doğrulayın. Dosya menüsüne tıklayın, kaydedin ve ardından tüm kuyucukların miktarlarını virgülle ayrılmış değerler içeren bir metin dosyasında dışa aktarmak için bir CSV dosyasına aktarın. Son olarak, CSV dosyasını bir elektronik tablo yazılımına aktarın ve aşağıdaki formülü uygun şekilde ayarlayarak altı PBM'ye 10 başına parça veya düzeltme sayısını hesaplayın.Bu videoda açıklanan tahlil, 87 Sağlıklı Kontrolden oluşan temsili bir örnek üzerinde gerçekleştirildi. Sıfır ila 17 yaş arası 42 çocuk ve 24 ila 60 yaş arası 45 yetişkin. Burada gösterildiği gibi, yetişkinlerde timik evrim nedeniyle yaşla birlikte sıfır ila üç ila dört yıl arasında trekking sayısı keskin bir şekilde azalmıştır.Yürüyüş sayısı aynı zamanda cinsiyete de bağlıdır, çünkü erkeklerde kadınlardan daha hızlı azalır ve bu da uygun referans aralıklarını belirleme yeteneğini etkileyebilir. Bununla birlikte, bu grafikler, çatlak sayısının, sadece çocuklarda T TREX'lerde görülen paterne benzer şekilde yaşla birlikte azaldığını göstermektedir. Yetişkinlerde ise, kemik iliği çıktısı yaşam boyunca oldukça stabildir ve cinsiyete bağlı değildir.Insert plazmit preparasyonundaki üçlü yaklaşık iki veya üç hafta gerektirir, ancak bundan sonra depolanan plazmit tahsisleri üç yıl sürecektir. Tekniğin geri kalan kısmı, uygun şekilde yapılırsa sadece dört ila beş saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, DNA çapraz kontaminasyonunu önlemek için plazmid ile ilgili tüm manipülasyonları özel bir alanda gerçekleştirmek çok önemlidir.Geliştirildikten sonra sonuçları analiz ederken standart tüpün stabilitesini doğrulamak da önemlidir. Bu teknik, klinik immünoloji veya hematoloji alanındaki araştırmacılara, kemik iliği transplantasyonunu takiben immün rekonstrüksiyonun sonucunu izlemek veya sadece lenfosit homeostazını incelemek için primer immün yetmezliklerin tanımlanması için gelişmiş bir araç sağlamıştır. Bu videoyu izledikten sonra, plazmidde üçlünün nasıl elde edileceğini, standart eğrinin nasıl hazırlanacağını, gerçek zamanlı PCR deneyinin nasıl çalıştırılacağını ve traks ve çatlakların tekrarlanabilir mutlak bir miktar tayinini elde etmek için gerekli hesaplamaları nasıl yapacağınızı iyi anlamış olmalısınız.

simultaneous-quantification-t-cell-receptor-excision-circles-trecs-k

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Dolayısıyla, bu işe dahil olan proteinlerin mekansal ve zamansal davranışlarını incelemek için önemli sinyal anlamak için; plazma zarının içinde ya da hücre içi konumlara ya proteinlerin kompartımanlara büyük ölçüde sinyal sonuçlarını etkileyebilecek bir düzenleyici mekanizmadır. Burada T hücrelerinde sinyal iletimi çalışmak üzere bir TIRF mikroskopi tabanlı sistemi tanımlamak, ama genel olarak uygulanabilir.

Gerçek zamanlı, TCR Eşzamanlı Görüntüleme ve İlişkili Sinyal Proteinler için TIRF Mikroskopi Tekniği

Biz DNA glikozilaz ve hücre nükleer lizatları AP endonükleaz faaliyetlerinin kantitatif, gerçek zamanlı ölçümü için bir metodu tanımlar. Tahlil kinetik analiz mükellef DNA Onarım faaliyet oranları verir ve doku ve tümör lizatları veya saflaştırılmış proteinler ile DNA tamir aktivitesinin ölçümü için uyarlanabilir.

Lezyon özgü Moleküler Beacon kullanılması Hücre lizatları ve Base Eksizyon Onarımı Faaliyet kantitatif, gerçek zamanlı Analizi

Sentetik Maya Genom projesi, Sc2.0'ın tasarımcı kromozomları, varlık/yokluk uç noktasına sahip PCRTagging adı verilen PCR tabanlı bir genotipleme testi kullanılarak doğal muadillerinden ayırt edilebilir. Burada, PCRTag genotiplemesi için yüksek verimli bir gerçek zamanlı PCR tespit yöntemini açıklıyoruz.

qPCRTag Analizi - A Yüksek Verimli, Sc2.0 Genotiplendirme için Real Time PCR Testi

Bu el yazması, işlevselleştirilmiş düzlemsel destekli lipid çift tabakası ile temas halinde olan bir T hücresinin immünolojik sinapsı içinde meydana gelirken, T hücresi antijen reseptörü (TCR) ile antijenik peptit yüklü MHC molekülleri arasındaki bağlanma dinamiklerini ölçmek için (tek moleküllü) Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) tabanlı testlerin nasıl yapılacağını açıklar.

TCR-pMHC Bağlama Ölçüm<em&gt; In Situ</em&gt; Bir FRET tabanlı Mikroskopi Assay kullanılarak

Geçerli protokol birleştiren tek hücre insan TCR alpha ve beta zinciri sıralama ile eşleştirilmiş retroviral vektörler vitro ve in vivo TCR ifade ile uyumlu nesil aerodinamik.

Tek hücre TCR yalıtım ve üretme-in Vitro için Retroviral Vektörler ve In Vivo ifade insan TCRs aerodinamik

Bu el yazması, aynı anda yukarı akış ve aşağı akış vektör-konakçı bağlantı DNA'sını analiz edebilen çift yönlü bir entegrasyon alanı tahlilinin deneysel prosedürünü ve yazılım analizini anlatmaktadır. Çift yönlü PCR ürünleri, herhangi bir aşağı akım sıralama platformu için kullanılabilir. Ortaya çıkan veriler, entegre DNA hedeflerinin yüksek verimli, niceliksel bir karşılaştırması için kullanışlıdır.

Çift Yönlü Retroviral Entegrasyon Sitesi PCR Metodolojisi ve Kantitatif Veri Analizi İş Akışı

Burada, eski için bir iletişim kuralı mevcut antijen spesifik CD8 vivo nitel tespiti+ T hücreleri. Analiz tek hücre süspansiyonlar organları veya küçük miktarda kan ile mümkündür. Çok çeşitli çalışmalar sitotoksik T hücre yanıt (aşı ve kanser immünoterapi çalışmaları) analizini gerektirir.

Anti-vektör ve Anti transgene özel CD8 eşzamanlı miktar+ T hücreleri MHC ile ben Tetramer sonrasi hipererjik bir Viral vektör ile boyama

Burada, tek bir subtelomere bir MS2 sıra etiketi içeren kanser hücre klonlar oluşturmak için bir protokol mevcut. Bu yaklaşım MS2 GFP sistemde güvenerek, endojen tutanaklar, telomeric tekrar içeren RNA (canlı hücreler içinde tek bir telomer üzerinden ifade TERRA) görselleştirme sağlar.

Canlı hücreler içinde tek bir telomer üzerinden ifade Telomeric tekrar içeren RNA TERRA görselleştirmek için kanser hücre klonlar nesil

Burada kantitatif PCR (qPCR) kullanılarak saptanan epigenetik imzalar ile bağışıklık hücresi kimliğini ve saflığını belirlemenin sağlam bir yöntemini tanımlıyoruz. Belirli bir lokustaki DNA demethylation belirli bir hücre tipi için benzersiz bir tanımlayıcı olarak hizmet verir ve CD8+ veya Th17 T hücrelerinin tanımlanmasına olanak tanır.

Epigenetik Tabanlı Kantitatif PCR Kullanarak Bağışıklık Hücre Kimliğinin ve Saflığın Belirlenmesi

Mevcut protokol, kan örnekleri ve bağırsak biyopsilerinden DNA izolasyonu, yeni nesil sıralama için TCRβ ve IGH PCR kütüphanelerinin üretimi, bir NGS çalışmasının performansı ve temel veri analizi için bir yöntem tanımlamaktadır.

Yeni Nesil Dizileme Kullanılarak T ve B Hücre Reseptörü İmmün Repertuar Analizi

Keşfedin TREC ve KREC eşzamanlı niceleme yöntemini gerçek zamanlı PCR kullanarak timus ve kemik iliği çıktısını değerlendirmek için. Bu teknik immünoloji araştırmalarında değerli bir araçtır.

T-hücre reseptörleri Eksizyon Circles Eşzamanlı Niceleme (TREC) ve K-silme Rekombinasyon Eksizyon Circles (KRECs) Gerçek zamanlı PCR ile (Video) | JoVE Journal

T-hücre reseptörleri Eksizyon Circles Eşzamanlı Niceleme (TREC) ve K-silme Rekombinasyon Eksizyon Circles (KRECs) Gerçek zamanlı PCR ile

Daha fazla video keşfet