Robotik Microcontact Baskı (R-μCP) kullanarak Karmaşık Kültürü Substratlar ve Sıralı nükleofilik Giren Fabricating
October 31st, 2014
Biyolojik ligandların mikro ölçekli modelleriyle işlevselleştirilmiş hücre kültürü substratları, doku mühendisliği alanında çok büyük bir faydaya sahiptir. Burada, biyolojik ligandların mekansal olarak hassas ve bölgeye özgü immobilizasyonunu sağlayan ortogonal kimyalar sunan çoklu, mikro desenli poli (etilen glikol) fırçalarla doku kültürü substratlarının çok yönlü ve otomatik üretimini gösteriyoruz.
Aşağıdaki deneyin genel amacı, biyolojik ligandların uzamsal olarak hassas ve bölgeye özgü immobilizasyonunu sağlayan ortogonal kimyalar sunan çoklu mikro desenli PEG fırçaları ile doku kültürü substratları oluşturmaktır. Bu, altın kaplı alt tabakalar üzerine robotik bir mikro temas baskısı ile bir TRP başlatıcısı olan acan tiyol biriktirme dizileri ile elde edilir. İkinci adım SI olarak, mikro desenli alt tabakalar üzerinde bir TRP gerçekleştirilir ve bu da terminal brom gruplarına sahip PEG fırçaları oluşturur.
Daha sonra, terminal brom grupları, uygun şekilde hazırlanmış biyolojik ligandların IM mobilizasyonuna izin vermek için bir veya iki kimyasal reaktif grupla işlevselleştirilir. Daha sonra ikinci bir kimyasal grup ile işlevsel hale getirmek için tüm süreç tekrarlanır. Sonuçlar, 10 mikron hassasiyetle üst üste bindirilmiş iki ortogonal olarak işlevselleştirilmiş PEG fırçasının mikrodizilerini göstermektedir.
Bu, reaktif grupların floresan molekülleri ile konjugasyonunu takiben özel görüntü analiz yazılımı kullanılarak doğrulanır. Bu tekniğin manuel mikro temaslı baskı gibi yöntemlere göre ana avantajı, robotik mikro temaslı baskının birden fazla baskı adımını mikron hassasiyetle üst üste bindirebilmesi ve aynı zamanda maksimum esneklik ve alt tabaka tasarımı sağlamasıdır. Bu yöntemin sağladığı doğruluk, ardışık nükleofilik ikame reaksiyonları ile birleştiğinde, daha sonra mikron ölçeğinde sülfatın zamansal ve mekansal kontrolünü uygulayabilen çoklu biyolojik ligandlarla işlevselleştirilmiş doku kültürü substratları üretmemize izin verir.
S-I-A-T-R-P'den önce, altın kaplamalı bir kapak sürgüsü A-P-D-M-S damgası ile desenlendirilmiş olmalıdır. Bu nispeten yaygın prosedür bir metin protokolünde açıklanmıştır. Vakumu serbest bırakarak patentli kapak sürgüsünü robottan çıkararak başlayın.
Daha sonra 50 mililitrelik sch uzunluğundaki bir şişeye aktarın, şişeyi kapatın ve negatif 30 PSI vakum uygulayın. Daha sonra, bir şırınga kullanarak şişeye 5.5 mililitre A TRP reaksiyon karışımı ekleyin ve ardından yine şırınga yoluyla suya 0.5 mililitre L sodyum askorbat ekleyin. Reaksiyonun renginin açık yeşilden koyu kahverengiye değiştiğini gözlemleyin.
Reaksiyonun inert gaz altında 16 saat devam etmesine izin verin. Reaksiyon tamamlandığında, kapak sürgüsünü çıkarın ve etanol, ardından su ve ardından tekrar etanol ile durulayın. Sonra nitrojen ile nazikçe kurulayın.
Aşılı P-E-G-M-E-M-A fırçalarının mikrodizisi çıplak gözle görülebilmelidir. Azad'ın P-E-G-M-E-M-A zincirlerini işlevsel hale getirmek için bu değişiklikleri ayrıntılı olarak ortaya çıkarmak için mikroskopi kullanın. Desen kapağı slaytını 20 mililitrelik bir cam reaksiyon şişesine aktarın ve 100 milimolar sodyum azid içeren altı mililitre DMF ekleyin.
Reaksiyonun 37 santigrat derecede 24 saat sürmesine izin verin. Ertesi gün, patent kapak sürgüsünü etanol ile durulayın ve kalan brom işlevselleştirilmiş P-E-G-M-E-M-A zincirlerini yatıştırmak için hafif bir nitrojen akışı altında kurutun. Mikro desen kapak sürgüsünü 20 mililitrelik bir cam reaksiyon şişesine aktarın ve 100 milimolar etanol amin ve 300 milimolar trietil amin içeren altı mililitre DMSO ekleyin.
Bu reaksiyonun ertesi gün 40 santigrat derecede 24 saat devam etmesine izin verin. Desen kapak sürgüsünü etanol ile durulayın ve bir nitrojen akışı altında nazikçe kurulayın. Bir sonraki adım, ikinci bir PDMS damgası kullanarak ve ardından damgalamayı takiben robot mikro temaslı baskıyı tekrarlamaktır.
İkinci mikro dizi PEG fırçasının grafiğini çizmek için tekrar SI A TRP kullanın. Ardından, ikinci mikro dizi olan P-E-G-M-E-A zincirlerini asetilenin işlevselleştirilmesinin zamanı geldi: Francois. Mikro desenli kapak.
DMF'de altı mililitre 100 mililer molar propag amin ile 20 mililitrelik bir cam reaksiyon şişesine kaydırın. Reaksiyonun 24 saat devam etmesine izin verin. Ertesi gün oda sıcaklığında, patent kapak sürgüsünü etanol ile durulayın ve hafif bir nitrojen akışı altında kurutun.
Patent kapak lamı daha sonra biyotin elasyonu için hazırdır. Mikro patent kapak sürgüsünü 20 mililitrelik bir cam reaksiyon şişesine yerleştirerek başlayın. İlk olarak, biyotin asetilen sonlandırılmış zincirleri yedi.
Reaksiyon şişesine azid PEG dört biyotin konjugatı ile altı mililitre bakır sülfat ekleyin, ardından 1.2 mililitre 0.15 ekleyin. Reaksiyonu başlatmak için sudaki milimolar rbic asit, reaksiyonu nitrojen ile 10 saniye boyunca köpürtün. Daha sonra şişeyi paraform ile kapatın ve reaksiyonun 24 saat sürmesine izin verin.
Ertesi gün oda sıcaklığında, kapak sürgüsünü suyla durulayın ve 12 kuyulu bir polistiren kaba aktarın. Daha sonra oda sıcaklığında DPBS'de eşek serumu ile bir saat sonra, biyotin ile ellenmiş gruplarda strep DEIN 5 46 konjugatı ile mililitrede iki mikrogramda DPBS boyasında boyayın, iki saat sonra oda sıcaklığında iki saat boyunca boyayın. Kapak sürgüsünü DPBS'de yumuşak bitki örtüsü ile beş kez durulayın.
Tobi ITIN, azi sonlandırılmış zincirleri yedi. Kapak fişini altı kuyulu bir polistiren plakanın kuyusuna koyun ve 20 mikromolar D-B-C-O-P-G dört biyotin içeren iki mililitre DPBS uygulayın. Daha sonra kapak slaytını 24 saat sonra oda sıcaklığında 24 saat inkübe edin.
Kapak sürgüsünü dörtten önceki gibi durulayın ve streptavidin 4 88 ile boyayın. DPBS'de mililitre başına iki mikrogramda eşlenik. İki saat sonra.
Kapak sürgüsünü tekrar durulayın, ardından mikroskopi ile görüntüleyin. Bu robot mikro kontak baskı protokolünü kullanma. Terminal alkin gruplarına sahip doğru desenli bir PEG fırçası ANN UI dizisi, terminal azi gruplarına sahip daha büyük PEG fırçası ANN UI'nin ayrı bir dizisi içinde modellendi.
Azid ve alkin gruplarının mekansal dağılımı, floresan probların tıklama kimyası ve streptavidin bağlanması kullanılarak görüntülendi. Her iki floresan kanalının üst üste binmesi, damgaların nasıl örtüşmediğini gösterir. Hizalamanın doğruluğu, SCAR'ın sınırlarında olan 10 mikronun altında hesaplandı.
Baskıyı yapmak için kullanılan bir sistem. Bu videoyu izledikten sonra, birden fazla peg fırça dizisini üst üste bindirmek için robotik mikro temaslı baskı kullanarak özel doku kültürü alt tabakalarının nasıl oluşturulacağını iyi anlamış olmalısınız. Ortogonal kimyalar ile işlevselleştirilmiştir.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu çalışma, mikro desenli poli(etilen glikol) (PEG) fırçaları olan doku kültürü yüzeylerinin otomatik üretimini göstermektedir. Bu fırçalar, biyolojik ligandların mekansal olarak hassas ve yerleşik immobilizasyonunu kolaylaştıran ortogonal kimyasallar sunmaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Doku Mühendisliği
- Biyomalzemeler
- Mikrofabrikasyon
Arka Plan
- Hücre kültürü yüzeyleri, doku mühendisliği uygulamaları için esastır.
- Mikro desenleme, ligand sunumunda hassas kontrol sağlar.
- PEG fırçaları, fonksiyonelleştirme için çok yönlü malzemelerdir.
- Ortogonal kimyasallar, karmaşık yüzey modifikasyonlarını sağlar.
Çalışmanın Amacı
- Birden fazla mikro desenli PEG fırçaları olan doku kültürü yüzeyleri oluşturmak.
- Biyolojik ligandların yerleşik immobilizasyonunu sağlamak.
- Üretim sürecinin otomasyonunu göstermek.
Kullanılan Yöntemler
- Altın kaplı yüzeyler üzerinde acan tiyolün robotik mikro temas baskısı.
- PEG fırçaları oluşturmak için ardışık yüzeyden başlatılan atom transfer radikal polimerizasyonu (SI-ATRP).
- Terminal brom gruplarının reaktif kimyasal gruplarla fonksiyonelleştirilmesi.
- Çift fonksiyonellik elde etmek için işlemin tekrarlanması.
Ana Sonuçlar
- İki ortogonal olarak fonksiyonelleştirilmiş PEG fırçalı mikro dizilerin başarılı oluşturulması.
- 10 mikron hassasiyetinde üst üste getirme doğruluğunun sağlanması.
- Yüzey fonksiyonelleştirilmesinde çok yönlülüğün gösterilmesi.
- Yerleşik ligand immobilizasyonunun mekansal olarak hassas bir şekilde sağlanması.
Sonuçlar
- Yöntem, doku mühendisliğinde karmaşık yüzey modifikasyonlarına izin vermektedir.
- Otomatik süreçler, tekrarlanabilirliği ve verimliliği artırmaktadır.
- Çeşitli biyolojik araştırma alanlarında potansiyel uygulamalar.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Robotic microcontact printing (R-µCP) with sequential nucleophilic substitution enables the fabrication of culture substrates with highly ordered, micron-scale patterns of orthogonally functionalized PEG brushes. This precision supports spatially controlled ligand immobilization, directly impacting early discovery and target validation workflows in tissue engineering and advanced cell models. The method's reproducibility and alignment accuracy address critical needs for predictive confidence and translational continuity in biopharma R&D portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cell-matrix interactions with spatially defined ligand presentation.
- Supports mechanistic de-risking by allowing precise control of microenvironmental cues.
- Facilitates functional target validation through site-specific immobilization of biological ligands.
Screening & Assay Development
- Prepares standardized, reproducible substrates for downstream cell-based assays.
- Delivers quantitative, spatially resolved outputs for compound or ligand screening.
- Enables scalable and reusable platform design for high-content screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro substrate architecture with in vivo tissue microenvironments for disease-relevant modeling.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling complex tissue engineering.
- Provides predictive de-risking for biomaterial and cell therapy development pipelines.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates at the interface of early discovery, assay development, and translational research, enabling seamless progression from hypothesis testing to preclinical model validation.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis-driven studies of cell behavior in engineered microenvironments.
- Screening: Provides reproducible, quantitative readouts for comparing ligand or compound effects.
- Analytics: Supports high-resolution imaging and quantitative analysis of spatial patterning and ligand immobilization.
- Translational Research: Bridges in vitro and in vivo relevance by mimicking tissue-specific architectures.
- Enterprise Reuse: Offers a modular, adaptable platform for diverse R&D programs requiring spatially controlled substrates.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell-based assays.
- Operational Value: Delivers high reproducibility, micron-scale alignment, and flexible substrate design.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling robust early-stage data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of tissue engineering and cell therapy assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in surface chemistry, robotics, and microfabrication techniques.
- Demands access to robotic microcontact printing instrumentation and imaging analytics.
- Necessitates cross-team standardization for reproducibility and data comparability.
- Adaptation may be needed for different cell types or ligand chemistries.
- Micron-scale alignment is limited by the precision of robotic and imaging systems.
