Name: Robotik Microcontact Baskı (R-μCP) kullanarak Karmaşık Kültürü Substratlar ve Sıralı nükleofilik Giren Fabricating (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Keşfedin, robotik mikro temas baskısı ile çoklu PEG fırçalı doku kültürü substratları oluşturmayı. Bu yöntem, biyolojik ligandların uzamsal olarak hassas immobilizasyonunu sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, GTK, TK ve JDM için finansman, Wisconsin Keşif Enstitüsü ve Wisconsin Mezunlar Araştırma Vakfı tarafından sağlanmıştır.

1. Yaratma Elastomerik Pullar <ol style="margin-left: 40px;"><li> PDMS damgası en silikon ustaları oluşturmak için, bilgisayar destekli tasarım yazılımı kullanılarak PhotoMask metraj desenleri. <ol><li> 300 mikron iç çapı (ID) ve 1,200 mikron merkez-merkez aralığı ile 600 mikron OD ile annuli 20 x 20 dizi olarak ilk desen tasarlayın. </li><li> 600 mikron kimliği ve 1200 mikron merkez-merkez aralığı ile 900 mikron OD ile annuli 20 x 20 dizi olarak ikinci desen tasarlayın. </li><li> Ayrıca, 45 ° açıyla 1,200 mikron merkez-merkez köşe desen aralıklı her dizi tasarım dört köşe 1 x 1 mm 2 kare referans işaretlerini yerleştirin. </li><li> Mikroakışkan dökümhane ile başka bir yerde, 15 veya işbirliği detaylı olarak, standart litografi teknikleri kullanarak bir 300 um özelliği derinliğe ilişkilendirerek, 1 boy oranları: 1 Bu deneyde kullanılmak üzere silikon ustaları imal. Not: Özellik daha düşük 100 um alt-tabaka yüzeyi ile temas etmeden önce pul anormal deformasyonuna neden olan vuruş derinlikleri. NOT: Bu protokol, özel ekipman ve yaratmak için temiz odalar gerektiren Fotorezist tarif desenleri, zaten elde silikon ustaları sahip başlar. Bu desenli ustaları oluşturmak için bir fabrikatör veya çekirdek tesisi ile danışmak en iyisidir. </li></ol></li><li> Silanize silikon ustaları (tridekafluoro-1,1,2,2-tetrahydroocty) triklorosilan buharı ile inkübasyon O / N. NOT: Silan buharı son derece toksik ve sadece kimyasal davlumbaz ele alınmalıdır. </li><li> PDMS nin önceden polimer ve 60 ° C'de bir petri kabı O / N olarak silanize edilmiş silikon ustaların üstüne sertleştirme maddesi PDMS: 1 oranında, bir 10 sertleştirme ile silikon ustaların ters kopyaları oluşturun. </li><li> Silikon ustalardan PDMS pulları kaldırmak ve akrilonitril bütadien stiren damgalar (ABS) arkaları veya diğer herhangi bir sert malzeme bağtutkal kullanarak s. Not: seçim malzemenin şeffaf veya biyolojik olarak uyumlu olmak zorunda değildir. Bununla birlikte, PDMS daha robotik kalıp ve yüksek sağlamlığa sahip olan bir arayüz için düz bir yüzeyin sağlanması gerekir. </li></ol> 2. hazırlanması Coverslides <ol style="margin-left: 40px;"><li> Durulama mikroskop coverslides (24 mm x 50 mm # 1) hafif bir azot akımı altında, etanol ile durulanır ve kurutulur edilmeden önce 1 dakika süre ile, aseton içinde, toluen, metanol ve sonikasyon. NOT: Sadece bir kimyasal davlumbaz toluen ve aseton tutun. </li><li> Odaklanmış bir elektron ışını buharlaştırıcı kullanılarak 18.0 nm altın (Au), ardından ~ 3.5 mil titanyum (Ti) ile kaplayın coverslides. NOT: Bu prosedür silikon ve polistiren altın dahil kaplı yüzeylerde çeşitli uyumludur. Bu yerinde oluşturmak mümkün olsa da, altın kaplanmış alt tabakalar aynı zamanda ticari tedarikçilerden yoluyla ulaşılabilir. NOT: yüzeylerde Au tabakalar olması gerekirken, Ti tabakalar, en az 3 mil kalınlığında olmalıdırı en az 5 nm kalınlığında ve son alt-tabakanın 16,17 doğru optik özelliklerine bağlı olarak kalınlığı 1 mm tüm yol arasında olabilir. Yüzeyleri imalatı için optik açık olması gerekli değildir; Bununla birlikte, imal edilen alt-tabakaların mikroskopik analizi kolaylaştırır. </li><li> Kullanımdan hemen önce yumuşak azot altında etanol ve kuru ile altın kaplı coverslides durulayın. </li></ol> 3. R-μCP dış çevresinin <ol style="margin-left: 40px;"><li> Seçici uyumlu mafsallı robot kolu (SCARA) sistemi ile R-μCP önce, sistemin yazılımını kullanarak robotik araç efektörler ve beraberindeki çift kamera sistemleri kalibre. NOT: Bu aletler Şekil 1'de resmedilmiştir. </li></ol><img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52186/52186fig1highres.jpg"> Şekil 1. R μCP Sistemi ve Robotik Kol İşleme. (A) tüm takım ve demirbaşlar ile R-μCP sisteminin Büyük ölçekli görünümü, (a) vakumla mandren, (b) reaktif banyo, (c) aşağı bakan kamera, (d) damga yuvalama fikstür, (e) robotik aracı. (B) Robotik kol takım resmeden (f) elmas uçlu dağlama aracı ve (g) pnömatik emme aracı (h) ABS destekli PDMS damga tutarak. <ol start="2" style="margin-left: 40px;"><li> Elle 600 mikron ID ve 900 mikron OD halkasal bölge damga yuvalama fikstür aşağı yüz çıkıntılı bir PDMS damga yerleştirin. Elle Şekil 1A görüntülenen vakum aynası, üstüne taze temizlenmiş altın kaplamalı coverslide yerleştirin ve bağlı laboratuar vakum kullanarak hareketsiz. </li><li> Robot denetimleri kullanarak, Şekil 2A gibi, altın kaplı coverslide merkez noktasının üzerinde aşağı bakan kamera hizalayın. NOT: Bu nokta başlangıçta görsel muayene ile tanımlanabilir ve büyük hassasiyet gerektirmez, PDMS damga çok larg olduğu gibialtın kaplı slayt daha er. </li><li> Dört başvuru etch robot kolu talimat "X" boyutları ile bir kare köşelerinde işaretleri robot koluna bağlı elmas uçlu aşındırma aracını kullanarak altın kaplı coverslide merkezli 3.8 mm 3.8 mm. (Şekil 2B'de tasvir; OTOMATİK SÜRECİ) NOT: Bu dört referans işaretleri aşağı bakan kamera bir görsel çerçevesinde olmasını sağlar. </li><li> Robotların pnömatik emme takım kullanarak, pick-up ve PDMS Şekil 2C olarak damga yuvalama fikstür üzerinde 1 mm damga basılı tutun. (OTOMATİK SÜRECİ) </li><li> Damganın kare referans işaretleri görselleştirmek ve damgası ortalama X, Y belirlemek için kamera yazılımı ile 10 kez onları tanımlamak, ve açısal merkezinden ofset, Şekil 2D ve E resimde yukarı bakan kamera ve LED aydınlatma halkası kullanılması robot takım ekseni. (OTOMATİK SÜRECİ) </li><li> Olduğu gibi NOT: Bir iç hesaplama tam hizalamak için robotik sistemin yazılımı tarafından gerçekleştirilir damga ve geleceğin R-μCP adımlarla Coverslip X, Y, merkezi yerleri ve açısal uzaklıklar. </li><li> Şekil 2F'de de gösterildiği gibi 3.8)) alkantiyol bir ATRP inisiyatör, ω-mercaptoundecyl bromoizobutirat (etanol içinde 2 mM bir banyoda damga yerleştirin. (OTOMATİK SÜRECİ) </li><li> Alkantiyol çözeltiden damga çıkarın ve Şekil 2G olarak etanolün buharlaştırılması 0.48 bar (5 psi) basınçlandı azot akımı üzerine yerleştirin. 1 dakika sonra, azot akışı basınç üniform bir kuruluğa gelene sağlamak için 1.03 bar (15 psi) kadar arttırmaktadır. (OTOMATİK SÜRECİ) NOT: Eksik kurutma desen sadakat tamamen veya kısmen kaybına neden olur. </li><li> Kurutma işleminden sonra, altın kaplamalı slayt hesaplanan merkez pozisyonu üzerindeki pul taşımak ve Şekil 2H'de gösterildiği gibi Z eksenine motor gücünü izlerken 100 um artışlarla indirin. NOT: Bu Z-ekseni motoru yaşadığı ve robot rehberlik yazılımında görüntülenen tork iletilir. (OTOMATİK SÜRECİ) </li><li> 79.2 kPa önceden belirlenmiş bir basınç elde edildikten sonra damga düşürücü durdurmak, ve 15 saniye için altın kaplı sürgü ile temas sağlamak. (OTOMATİK SÜRECİ) NOT: basınç değerleri burada mevcut damga tasarım ve özellik yüksekliği için optimize edilmiştir. Damga tasarım deneme ve yanılma süreci bu doğrultuda özellikle boy oranı yüksek pul, ayarlamak için, değiştirilir. </li><li> Yavaşça altın kaplamalı slayt damga kaldırmak ve geri damga yuvalama fikstür damgası yer. (OTOMATİK SÜRECİ) </li></ol> Micropatterned Coverslides ilgili PEGMEMA 4. SI-ATRP <ol style="margin-left: 40px;"><li> Vakum basıncı micropatterned coverslide tutarak serbest bırakın ve bir 50 ml'lik bir Schlenk şişesine aktarın. Mühür ve degas savurma bir vakum pompası kullanılarak şişeyi. </li><li> Ekleme makromonomer PEGMEMA (208.75 mmol), su (34.4 mi), metanol (43.8 mi), bakır (II) bromür (1 mmol) ve 2 ', 2-bipiridin (3 mmol) ihtiva eden ATRP Reaksiyon karışımı 5.5 mi Schlenk şişesi. </li><li> Reaksiyonu başlatmak için su içinde L-sodyum askorbat (454,3 mM) 0.5 ml ilave edilir, ve atıl gaz altında, oda sıcaklığında 16 saat süre ile devam etmesini sağlar. NOT: Şekil 3A-B'de gösterildiği gibi, L-sodyum askorbat ilave edildikten sonra, tepkime rengi koyu kahverengiye doğru açık yeşil yönelecektir. NOT: Reaksiyon 16 saat ötesine devam edebilirsiniz, ancak önemli ölçüde PEG fırçaların uzunluğunu artırmak olmayacaktır. </li></ol><imgalt src='"/' files ftp_upload></imgalt> SI-ATRP Şekil 3. başlatılması. (A) reaksiyonu ve L-sodyum askorbat ilave edildikten sonra (B), müteakip bir renk değişikliğiyle başlatılması. SI ATRP prosedür takip edilerek micropatterned coverslide yüzeyinin (C) mikroskop görüntüsü. Ölçek çubuğu 1 mm. <ol start="4" style="margin-left: 40px;"><li> Schenk şişeden micropatterned coverslide çıkarın ve hafif bir azot akımı altında, etanol, su, ve etanol ve kuru ile durulayın. Not: SI-ATRP sonra, yüzey değişiklikleri gözle görünür olmalıdır ve Şekil 3C'de olduğu gibi, bir mikroskop altında görüntülenmiş ve analiz edilebilir. Not: Bu, bu alt-tabakaların immunostain ihtiyacını ortadan kaldıran şekilde deneme hassas test etmek için basit bir yöntemdir. </li></ol> Micropatterned PEGMEMA Chains 5. Azit Functionalization <ol style="margin-left: 40px;"><li> 20 ml'lik bir cam bir tepkime cam şişesinde micropatterned coverslide yerleştirin. </li><li> N, 6 ml ilave edilir, reaksiyon şişesine, 100 mM sodyum azit ihtiva eden N-dimetilformamid (DMF). 24 saat boyunca 37 ° C 'de bu reaksiyon koruyun. NOT: Sadece bir kimyasal davlumbaz DMF taşıyınız. Sodyum azid tartıp dikkatli olun. </li><li> Tamamlandıktan sonra, reaksiyon şişesinden micropatterned coverslide çıkarmak ve bir azot akımı altında, sonra da etanol, su ve kuru ile durulayın. </li></ol> Brom Fonksiyonlu PEGMEMA Chains 6. Pasivasyon <ol style="margin-left: 40px;"><li> 20 ml'lik bir cam reaksiyon şişelerine Micropatterned coverslide yerleştirin. </li><li> 100 mM etanolamin ve reaksiyon şişesine, 300 mM trietilamin ihtiva eden, dimetil sülfoksit (DMSO) ve 6 ml ilave edilir. 24 saat süre ile, 40 ° C'de, bu reaksiyonu tutun. NOT: Sadece bir kimyasal davlumbaz DMSO, etanolamin ve trietilamini tutun. </li><li> Tamamlandığında micropatterned coversl kaldırmakReaksiyon şişesinden ide, bir azot akımı altında, sonra da etanol, su ve kuru ile durulayın. </li></ol> İç anulus 7. R-μCP ve PEGMEMA SI-ATRP'si <ol style="margin-left: 40px;"><li> Küçük özellikleri ile halkasal bölge önceden micropatterned anülleri içine yerleştirilir şekilde 300 mikron ID ve 600 mikron OD çıkıntılı anülleri, bir PDMS damga ikame, 3.12 - Daha önce Adımlar 3.2 ve 3.6 de açıklandığı gibi R-μCP adımları uygulayın. NOT: Bu damga basıncı eşik 132,0 kPa. Daha önce de belirtildiği gibi, bu basınç ayarlarının en düşük mühür özellikleri bu deneyde kullanılmak üzere optimize edilmiştir. </li><li> 4.4 - aşamalarında daha önce 4.1 de açıklandığı gibi SI-ATRP'si adımları uygulayın. </li></ol> Micropatterned PEGMEMA Chains 8. Asetilen Functionalization <ol style="margin-left: 40px;"><li> 20 ml'lik bir cam bir tepkime cam şişesinde micropatterned coverslide yerleştirin. </li><li> DMSO mM 100 ihtiva eden 6 ml ekleyinReaksiyon şişesine propargilamin. 24 saat boyunca oda sıcaklığında bu reaksiyona koruyun. NOT: Sadece bir kimyasal davlumbaz DMSO ve propargilamin tutun. </li><li> Tamamlandıktan sonra, reaksiyon şişesinden micropatterned coverslide çıkarmak ve bir azot akımı altında, sonra da etanol, su ve kuru ile durulayın. </li></ol> 9. Bakır-katalize "Click" Asetilen biyotinlenmesi PEGMEMA Zincirler Sonlandırıldı <ol style="margin-left: 40px;"><li> 20 ml'lik bir cam bir tepkime cam şişesinde micropatterned coverslide yerleştirin. </li><li> Bakır sülfat (15 mM) / tris [(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il) metil] amin (TBTA, 30 mM) içinde 6 ml (ekleme 1: 1 h / h su Reaksiyon şişesine 562 uM azit-PEG 4 -Biotin konjugat ihtiva / DMF). Reaksiyonu başlatmak için bu karışıma su içinde L-askorbik asit (0.15 mM) ve 1.2 ml ilave edilir. </li><li> 10 sn için, reaksiyon çözeltisi içinden kabarcık olarak, azot, Parafilm ile şişenin kapatılması, ve oda sıcaklığında 24 saat boyunca reaksiyona girer. </li><li> Completio üzerineN, reaksiyon şişesinden micropatterned coverslide kaldırmak, su ile yıkayın ve bir 12-yuvalı polistiren tabağa koyun. </li></ol> Biyotinilat Asetilen Grupların 10. Immunofluorescent Algılama <ol style="margin-left: 40px;"><li> Oda sıcaklığında 1 saat boyunca DPBS (% 3 eşek serumu) micropatterned coverslide bloke eder. Oda sıcaklığında 2 saat boyunca HAA içinde Streptavidin-546 konjugatı (2 ug / ml) (PBS içerisinde% 3 eşek serumu) ile biyotinile asetilen grupları için leke. </li><li> Hafifçe çalkalama ile 10 dakika boyunca micropatterned coverslide DPBS ile 5 kez yıkayın. Not: Bu adım tamamlandıktan sonra, Şekil 4B, sürgünün bir görüntüsünü göstermektedir. </li></ol> 11. Bakır-free "Click" Azide'da biyotinlenmesi PEGMEMA Zincirler Sonlandırıldı NOT: Arzu edildiği takdirde, bu alt-tabaka tadilat aşaması, hücre kültürü esnasında in situ gerçekleştirilebilir. <ol style="margin-left: 40px;"><li> 12-çukurlu, s micropatterned coverslide boşolystyrene çanak aşağıdaki HAA durular. </li><li> 20 uM DBCO-PEG 4 -biotin ihtiva HAA (ya da hücre kültür ortamı) olarak 2 ml ilave edilir, ve bu reaksiyon oda sıcaklığında 24 saat boyunca devam etmesine izin vermek (ya da bir inkübatör içinde 37 ° C'de). </li><li> DPBS (ya da sadece bir ortam değişikliği yapılması) ile tamamlandıktan sonra, micropatterned coverslide 5 kez çalkalayın. </li></ol> Biyotinilat Azit Grupların 12. Immunofluorescent Algılama <ol style="margin-left: 40px;"><li> Oda sıcaklığında 2 saat boyunca 2 ml DPBS içinde Streptavidin-488 konjugatı (2 ug / ml) (% 3 eşek serumu) ile biyotinile azid grupları için leke. </li><li> Hafifçe çalkalama ile 10 dakika boyunca micropatterned coverslide DPBS içinde 5 kez yıkayın. </li><li> Resim konfokal floresan mikroskobu kullanılarak coverslide Micropatterned. Bu adım tamamlandıktan sonra Şekil 4A-C sürgünün görüntüleri yer almaktadır. NOT: doku kültürü deneyleri için alt tabakalar kullanırken, bölümleri 10 ve bu protokolün 12 atlayın. İstenen açıda sonraişlevsellik e, bir azot akımı altında% 100 etanol ve kurutulması her iki tarafa da durulama işlenmiş coverslide sterilize edin. Steril bir biyolojik güvenlik kabini için slayt aktarın ve hücre tohumlama ve kültürü ile geçmeden önce PBS ile beş kez slayt durulayın. </li></ol>

<ol><li>Senaratne, W., Andruzzi, L., Ober, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-Assembled+Monolayers+and+Polymer+Brushes+in+Biotechnology%3A+Current+Applications+and+Future+Perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Self-Assembled Monolayers and Polymer Brushes in Biotechnology: Current Applications and Future Perspectives.</a> Biomacromolecules. 6 (5), 2427-2448 (2005).</li>
<li>Hucknall, A., Kim, D. -H., Rangarajan, S., Hill, R. T., Reichert, W. M., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+Fabrication+of+Antibody+Microarrays+on+Nonfouling+Polymer+Brushes+with+Femtomolar+Sensitivity+for+Protein+Analytes+in+Serum+and+Blood%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Simple Fabrication of Antibody Microarrays on Nonfouling Polymer Brushes with Femtomolar Sensitivity for Protein Analytes in Serum and Blood.</a> Advanced Materials. 21 (19), 1968-1971 (2009).</li>
<li>Hucknall, A., Rangarajan, S., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Pursuit+of+Zero%3A+Polymer+Brushes+that+Resist+the+Adsorption+of+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">In Pursuit of Zero: Polymer Brushes that Resist the Adsorption of Proteins.</a> Advanced Materials. 21 (23), 2441-2446 (2009).</li>
<li>Rozkiewicz, D. I., Jańczewski, D., Verboom, W., Ravoo, B. J., Reinhoudt, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click%E2%80%9D+Chemistry+by+Microcontact+Printing%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Click” Chemistry by Microcontact Printing.</a> Angewandte Chemie International Edition. 45 (32), 5292-5296 (2006).</li>
<li>Jewett, J. C., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cu-free+click+cycloaddition+reactions+in+chemical+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cu-free click cycloaddition reactions in chemical biology.</a> Chemical Society Reviews. 39 (4), 1272-1279 (2010).</li>
<li>Sha, J., Lippmann, E. S., McNulty, J., Ma, Y., Ashton, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+Nucleophilic+Substitutions+Permit+Orthogonal+Click+Functionalization+of+Multicomponent+PEG+Brushes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Sequential Nucleophilic Substitutions Permit Orthogonal Click Functionalization of Multicomponent PEG Brushes.</a> Biomacromolecules. 14 (9), 3294-3303 (2013).</li>
<li>Tugulu, S., Silacci, P., Stergiopulos, N., Klok, H. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RGD%E2%80%94Functionalized+polymer+brushes+as+substrates+for+the+integrin+specific+adhesion+of+human+umbilical+vein+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">RGD—Functionalized polymer brushes as substrates for the integrin specific adhesion of human umbilical vein endothelial cells.</a> Biomaterials. 28 (16), 2536-2546 (2007).</li>
<li>Ashton, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+Screening+of+Gene+Function+in+Stem+Cells+Using+Clonal+Microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">High-Throughput Screening of Gene Function in Stem Cells Using Clonal Microarrays.</a> Stem Cells. 25 (11), 2928-2935 (2007).</li>
<li>Koepsel, J. T., Murphy, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned+Self-Assembled+Monolayers%3A+Efficient%2C+Chemically+Defined+Tools+for+Cell+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Patterned Self-Assembled Monolayers: Efficient, Chemically Defined Tools for Cell Biology.</a> ChemBioChem. 13 (12), 1717-1724 (2012).</li>
<li>Mrksich, M., Dike, L. E., Tien, J., Ingber, D. E., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+microcontact+printing+to+pattern+the+attachment+of+mammalian+cells+to+self-assembled+monolayers+of+alkanethiolates+on+transparent+films+of+gold+and+silver%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Using microcontact printing to pattern the attachment of mammalian cells to self-assembled monolayers of alkanethiolates on transparent films of gold and silver.</a> Experimental cell research. 235 (2), 305-313 (1997).</li>
<li>Ma, H., Hyun, J., Stiller, P., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-Fouling%E2%80%9D+Oligo%28ethylene+glycol%29-+Functionalized+Polymer+Brushes+Synthesized+by+Surface-Initiated+Atom+Transfer+Radical+Polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Non-Fouling” Oligo(ethylene glycol)- Functionalized Polymer Brushes Synthesized by Surface-Initiated Atom Transfer Radical Polymerization.</a> Advanced Materials. 16 (4), 338-341 (2004).</li>
<li>Bou Chakra, E., Hannes, B., Dilosquer, G., Mansfield, D. C., Cabrera, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+instrument+for+automated+microcontact+printing+with+stamp+load+adjustment%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">A new instrument for automated microcontact printing with stamp load adjustment.</a> Review of Scientific Instruments. 79 (6), (2008).</li>
<li>Trinkle, C. A., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-precision+microcontact+printing+of+interchangeable+stamps+using+an+integrated+kinematic+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">High-precision microcontact printing of interchangeable stamps using an integrated kinematic coupling.</a> Lab on a Chip. 11 (3), 455(2011).</li>
<li>McNulty, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-precision+robotic+microcontact+printing+%28R-%CE%BCCP%29+utilizing+a+vision+guided+selectively+compliant+articulated+robotic+arm%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">High-precision robotic microcontact printing (R-μCP) utilizing a vision guided selectively compliant articulated robotic arm.</a> Lab on a Chip. , (2014).</li>
<li>Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography+for+micro-+and+nanoscalepatterning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Soft lithography for micro- and nanoscalepatterning.</a> Nature Protocols. 5 (3), 491-502 (2010).</li>
<li>Nam, Y., Chang, J. C., Wheeler, B. C., Brewer, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold-Coated+Microelectrode+Array+With+Thiol+Linked+Self-Assembled+Monolayers+for+Engineering+Neuronal+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Gold-Coated Microelectrode Array With Thiol Linked Self-Assembled Monolayers for Engineering Neuronal Cultures.</a> IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 51 (1), 158-165 (2004).</li>
<li>Ma, H., Wells, M., Beebe, T. P., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface-Initiated+Atom+Transfer+Radical+Polymerization+of+Oligo%28ethylene+glycol%29+Methyl+Methacrylate+from+a+Mixed+Self-Assembled+Monolayer+on+Gold%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Functional+Materials%22%5BJournal%5D)">Surface-Initiated Atom Transfer Radical Polymerization of Oligo(ethylene glycol) Methyl Methacrylate from a Mixed Self-Assembled Monolayer on Gold.</a> Advanced Functional Materials. 16 (5), 640-648 (2006).</li>
<li>Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stem-cell+niche+as+an+entity+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The stem-cell niche as an entity of action.</a> Nature. 441 (7097), (2006).</li>
<li>Codelli, J. A., Baskin, J. M., Agard, N. J., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second-Generation+Difluorinated+Cyclooctynes+for+Copper-Free+Click+Chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Second-Generation Difluorinated Cyclooctynes for Copper-Free Click Chemistry.</a> Journal of the American Chemical Society. 130 (34), 11486-11493 (2008).</li>
<li>Debets, M. F., van Berkel, S. S., Schoffelen, S., Rutjes, F. P. J. T., van Hest, J. C. M., van Delft, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aza-dibenzocyclooctynes+for+fast+and+efficient+enzyme+PEGylation+via+copper-free+%283%2B2%29+cycloaddition%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Aza-dibenzocyclooctynes for fast and efficient enzyme PEGylation via copper-free (3+2) cycloaddition.</a> Chemical Communications. 46 (1), 97(2010).</li>
<li>DeForest, C. A., Polizzotti, B. D., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+click+reactions+for+synthesizing+and+patterning+three-dimensional+cell+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Sequential click reactions for synthesizing and patterning three-dimensional cell microenvironments.</a> Nature Materials. 8 (8), 659-664 (2009).</li>
<li>Roth, E. A., Xu, T., Das, M., Gregory, C., Hickman, J. J., Boland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inkjet+printing+for+high-throughput+cell+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Inkjet printing for high-throughput cell patterning.</a> Biomaterials. 25 (17), 3707-3715 (2004).</li>
<li>Xu, T., Zhao, W., Zhu, J. M., Albanna, M. Z., Yoo, J. J., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Biomaterials.</a> Biomaterials. 34 (1), 130-139 (2013).</li>
<li>Brouzes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+microfluidic+technology+for+single-cell+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (34), 14195-14200 (2009).</li>
<li>Meitl, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+printing+by+kinetic+control+of+adhesion+to+an+elastomeric+stamp%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Transfer printing by kinetic control of adhesion to an elastomeric stamp.</a> Nature Materials. 5 (1), 33-38 (2005).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden herhangi bir mali çıkarları olmadığını beyan ederler.

Doku mühendisliği için ideal bir alt-tabakalar Biyolojik Tabanlı Akıllı ve böylece doğal dokuların içinde bulunan kritik bir biyolojik olarak aktif ligandlann uzamsal dağılımını özetlemek olacaktır. Ayrıca, ligandların zamansal ayarlamaları ve yönlendirilmiş doku morfojenezini izin vermek için sunulan ve mekansal olarak hücre akıbetinde indüksiyon sınırlandırıldığı uzamsal desen etkinleştirmeniz dinamik özelliklere sahip olacaktır. Bu gibi maddelerin imalatı yüzeylerde karmaşık ve son derece düzenli yönlerde birden fazl...

Aynı anda doğal olmayan kirlenme özellikleri korurken kovalent bağlı biyokimyasal ligandlar görüntülemek için PEG-aşılı yüzeylerin yeteneği, onları kültürü yüzeylerin 1,2,3 mühendislik özel mikro ortamlar için ideal bir seçimdir. Ligand konjüge PEG fırça tarafından aracılık biyospesifik etkileşimlerin tek hücre fenotipleri in vivo doku mikroçevrelerde kompleksi içinde bulunan biyokimyasal işaretlerin etkilerinin indirgeyici analizi sağlar. Ayrıca, biyo-dik bir &quot;klik&quot; kimyaları da yerel konformasyonun 4-6&#39;da sunulmuştur, böylece ligand yönsel hareketsiz kılınmasını temin etmek için kullanılabilir. Böylece, PEG mikro mekansal desenlendirme fırçalar hareketsiz biyokimyasal ipuçları 6,7 ile uyarılan hücre sinyallerini araştırmak için in vitro nişler tasarımcısı oluşturmak için çok yönlü bir araçtır. Biyokimyasal cu mekansal kalıplarını üretmek için ortak bir yöntemes PEG konjuge alkanetiollerin desenleri ile microcontact baskı (μCP) altın kaplı yüzeylerde gerektirir. Daha sonra, PEG-açillenmiş alkanetiollerin micropatterned kendinden düzenlenen tek tabakaları (SAMs), sadece alt-tabaka 8,9 olmayan desenli bölgelere, biyokimyasal moleküllerin, örneğin, protein fiziksel adsorpsiyon kısıtlar. Bununla birlikte, bu teknikle üretilen SAMs uzun vadeli hücre kültür ortamında oksidasyona duyarlı olan. Böylece, SAMs alkantiyol μCP&#39;d genellikle daha fazla bölgenin olmayan kirlenme istikrarı 10 arttırmak için yüzey başlatılan atom transfer radikal polimerizasyonu (SI-ATRP) kullanılarak PEG polimer fırçalar ile aşılanmış. Özellikle, μCP alkantiyol polimerizasyon başlatıcı, poli SI-ATRP (etilen glikol) metil eter metakrilat (PEGMEMA) monomerlerin ve ardından altın kaplı yüzeylerde ω-meraptoundecyl bromoizobutirat micropatterned uzun süreli, istikrarlı, ve non yüzeyleri oluşturur kirlenme PEG fırçalar. Ayrıca, bu<html> bundan başka çeşitli kimyasal kısımların 11 sağlamak için modifiye edilmiş olma yeteneğine sahiptir. Bu özellik, Sha et yararlanarak. ark. dik &quot;tık&quot; kimyaları sunulması çok bileşenli PEGMEMA fırçalar ile kültür substratları mühendisi için bir yöntem geliştirdi. Bu yöntemde, bunlar sıralı sodyum azid, etanolamin serpiştirilmiş μCP / SI ATRP bir dizi aşama kullanmak, ve birden fazla hareketsizleştirilmiş ligand 6 mikro desen gösteren kültür tabakaları oluşturmak için nükleofilik sübstitüsyonu propargilamin. Yeni kültür sübstratları mühendislikten geçirilmesi için indirin μCP ile bağlantılı olarak, kimyasallar kullanıldığında potansiyel büyük olsa da, çok sayıda μCP aşamalar, tek bir alt-tabaka üzerinde düzenlenebilir hangi kesinlik ve doğruluğu sınırlıdır. Hassasiyet ve doğruluk yüksek düzeyde tekrarlanabilir bu çok yönlü teknikler kullanılarak in vitro nişler kompleksi üretimi için gerekli olacaktır. e_content &quot;&gt; Bu sınırlama çözmek için, bazı otomatik ve yarı-otomatik μCP sistemleri al.. Çakra ve diğ. üretilen özel pulları bir ray sistemi üzerindeki izlenerek ve altın-kaplı slaytlar konformal temas ettirildiği bir μCP sistemi geliştirilmiştir Bir bilgisayar kontrollü pnömatik aktüatör. Bununla birlikte, bu yöntem, özel damga tasarımlar hassas imalat gerektirir ve çok μCP 12 adım yaparken elde doğruluğunda bir rapor ile birlikte 10 mikron hassas bildirir. Daha yeni olarak, entegre bir kinematik bağlantı sistemini kullanan bir metodu rapor, tek bir desen kullanarak 1 um altında hassas, ama nedeniyle 13 kalıp kalıp damga özelliklerin hassas kontrol eksikliği doğru birden çok desen hizaya koyamadık. Ayrıca, önceki yöntemlerin her ikisi de desenlendirme adımları arasında sabit kalmasını tabakayı gerektirir , böylece önemli ölçüde olabilir yüzey modifikasyonu kimyaları çeşitliliğini sınırlayıcıkullandı. Damga tasarım ve üretim maksimal esneklik verirken Burada, birden çok μCP adımların doğru ve kesin bir uyum otomatik R-μCP sistem yetenekli açıklar. Ayrıca, desenli yüzeyler defalarca böylece sıralı nükleofilik değiştirmelerin dahil olmak üzere çeşitli substrat modifikasyonu kimyaları, kullanımına izin veren, stampings arasındaki sistemden kaldırılabilir. Bu tür kimyasallar kullanıldığında mühendislik Yüzeyleri hem de bize 6,14 ve diğerleri 7 tarafından önceden hücre kültürü için kullanılmıştır. Böylece, karmaşık ve micropatterned biyokimyasal ipuçları ile kültürü yüzeylerin ölçeklenebilir üretimi için bir yöntem geliştirmek için Ar-μCP ve sıralı nükleofilik sübstitüsyon reaksiyonları birleşti.

<table><tbody><tr><td>SCARA&nbsp;</td><td>Epson</td><td>LS3-401ST</td><td>İstenirse artırılmış hassasiyete sahip üst düzey modeller mevcuttur.&nbsp;</td></tr><tr><td>(Tridekafloro-1,1,2,2-tetrahidrooktil)triklorosilan</td><td>Gelest</td><td>SIT8174.0</td><td>DİKKAT, Yalnızca kimyasal davlumbazda kullanılmalıdır. Gofretleri silanize ederken, tüm silan buharlaşana kadar kimse davlumbaza girmemelidir.</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silikon Elastomer Kiti</td><td>Ellsworth Yapıştırıcı Co</td><td>NC9020938</td><td>Kullanmadan önce çözeltileri vakuma maruz bırakarak kabaca gazdan arındırın. Kit 182 gibi alternatif kitler kabul edilebilir.</td></tr><tr><td>24 mm x 50 mm # 1 Kapak Cam Slaytları</td><td>Fisher Scientific</td><td>48393106</td><td>Bunlar, ihtiyaca göre değişen boyutlarda bir dizi tedarikçiden satın alınabilir.</td></tr><tr><td>CHA-600 Telemark Elektron Işını Evaporatörü</td><td>Telemark</td><td>SEC-600-RAP</td><td>Özel eğitim gerektirir.</td></tr><tr><td>EPSON LS3 SCARA</td><td>EPSON</td><td>LS3-401ST</td><td></td></tr> <tr><td>& omega; -mertkaptoundesil bromoizobutirat</td><td>Prochimia</td><td>FT 015-m11-0.2</td><td>-20 ° C'de saklayın. Diğer ATRP başlatıcıları bu R-&mu olarak kullanılabilir; CP platformu tüm mikro modelleme modalitelerine uygulanabilir.</td></tr><tr><td>Schlenk Tüp Şişesi 50 ml</td><td>Synthware</td><td>60003-078</td><td>Diyaframlı kauçuk tıpalar gerektirir.</td></tr><tr><td>Poli (etilen glikol) metil eter metakrilat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>447943</td><td>MEHQ ve BHT içermeyen hazır inhibitörler içeren gönderilir.</td></tr><tr><td>Metanol (Sertifikalı ACS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-4</td><td>DİKKAT, yalnızca kimyasal çeker ocakta tutun.</td></tr><tr><td>Bakır(II) Bromür</td><td>Sigma Aldrich</td><td>437867</td><td>DİKKAT, cerrahi maske ile maruziyeti sınırlayın.</td></tr><tr><td>2,2'-Bipiridin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D216305</td><td>DİKKAT, cerrahi maske ile maruziyeti sınırlayın.</td></tr><tr><td>Sodyum L-Askorbat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4034</td><td></td></tr><tr><td>20 ml Borosilikat Cam Sintilasyon Şişeleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-340-4E</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Azide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2002</td><td>DİKKAT, cerrahi maske ile maruziyeti sınırlayın.</td></tr><tr><td>N,N-dimetiformamid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>227056</td><td>DİKKAT, yalnızca kimyasal çeker ocakta tutun.</td></tr><tr><td>Ethanolamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>398136</td><td>DİKKAT, yalnızca kimyasal çeker ocakta tutun.</td></tr><tr><td>Trietilamin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T0886</td><td>DİKKAT, yalnızca kimyasal çeker ocakta tutun.</td></tr><tr><td>Dimetilsülfoksit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>276855</td><td>DİKKAT, yalnızca kimyasal çeker ocakta tutun.</td></tr><tr><td>Propargylamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P50900</td><td>DİKKAT, yalnızca kimyasal çeker ocakta tutun.</td></tr><tr><td>200 Proof Ethanol</td><td>Wisconsin Üniversitesi Malzeme Dağıtım Hizmetleri</td><td>2292</td><td>DİKKAT, yalnızca kimyasal davlumbazda tutun.</td></tr><tr><td>Azide-PEG3-Biotin</td><td>ClickChemistryTools</td><td>AZ104-100</td><td>DMF</td></tr><tr><td>Bakır (II) Sülfat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1297</td><td>DİKKAT, cerrahi maske ile maruziyeti sınırlayın.</td></tr><tr><td>Tris [(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il) metil] amin (TBTA)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>678937</td><td></td></tr><tr><td>L-Askorbik Asit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7506</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponu Salin</td><td>Invitrogen</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Eşek Serumu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9663</td><td>Eşek serumu ile kontamine olmuş maddeler biyolojik olarak tehlikeli madde olarak kabul edilir ve buna göre imha edilmelidir. Çeşitli diğer bileşikler (örneğin BSA) mevcuttur ve bu amaca hizmet eder.</td></tr><tr><td>12 Kuyulu Polistiren Plaka</td><td>Thermo Scientifit - NUNC</td><td>07-200-81</td><td>Plakalar, farklı boyutlara sahip bir dizi tedarikçiden satın alınabilir.</td></tr><tr><td>DBCO-PEG4-Biotin</td><td>Clickchemistytools</td><td>A105P4-10</td><td>DMF</td></tr><tr><td>Streptavidin, Alexa Fluor 488 Konjuge</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>S-11223</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Streptavidin, Alexa Fluor 546 Konjuge</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>S-11225</td><td>PBS'de Çözündürülmüş</td></tr><tr><td>Nikon A1-R Konfokal Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>Nikon Eclipse Ti, A1R</td><td>İşlevselleştirilmiş mikro desenli substratları görüntülemek için bir epifloresan mikroskop yeterlidir.</td></tr></tbody></table>

robotik microcontact baskı (r-μcp) kullanarak karmaşık kültürü substratlar ve sıralı nükleofilik giren fabricating

Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing (R-&#181;CP) and Sequential Nucleophilic Substitution

Doku mühendisliğinde, kültürde doku morfolojisinin ve hücre kaderinin mekansal kontrolünün mikron ölçeğinde sergilenmesi arzu edilir. Aşılı poli (etilen glikol) (PEG) fırçaları sunan kültür substratları, mikro ölçekli, kirlenmeyen ve hücre yapışmasına dirençli bölgelerin yanı sıra hücrelerin kovalent olarak bağlı ligandlarla biyospesifik etkileşimlere katıldığı bölgeler oluşturarak bu görevi başarmak için kullanılabilir. Bu tür substratları kullanarak karmaşık dokuları tasarlamak için, diferansiyel biyoaktiviteler sağlamak için işlevselleştirilmiş ve in vivo nişleri taklit eden mikro ölçekli oryantasyonlarda hizalanmış çoklu PEG fırçalarını sırayla modellemek gerekecektir. Mikrokontakt baskı (μCP), bu tür aşılı PEG fırçalarını modellemek için çok yönlü bir tekniktir, ancak manuel μCP, mikro ölçekli hassasiyetle gerçekleştirilemez. Bu nedenle, ortogonal 'tıklama' kimyaları sunan karmaşık, mikro ölçekli ve son derece düzenli PEG fırça desenlerine sahip kültür substratlarını üretmek için robotik mikro temas baskı (R-μCP) destekli bir yöntem geliştirmek için gelişmiş robotları yumuşak litografi teknikleri ve yeni ortaya çıkan yüzey kimyası reaksiyonlarıyla birleştirdik. Burada, bu tür alt tabakaları üretmek için iş akışını ayrıntılı olarak açıklıyoruz.

Manuel hizalama μCP tekniklerinin kullanılması dik işlevselleştirüerek PEG-aşılı fırçaları Dizilerle kültür substratları mühendisi kimyaları önceki çalışmalarında 6 kanıtlanmıştır "tıklayın". Bununla birlikte, bu desen yönlendirme minimum kontrol sağlar ve genellikle fonksiyonalize alanlarında örtüşme ile sonuçlanır. Burada, yeni bir Ar-μCP sistemi bu sınırlamanın üstesinden gelmek için kullanılır ve onun yetenek için doğru model 300 mikron ID ve 600 mikron OD 600 mikron ile PEG fırça annuli ayrı bir dizi içi...

Biyolojik ligandların mikro ölçekli modelleriyle işlevselleştirilmiş hücre kültürü substratları, doku mühendisliği alanında çok büyük bir faydaya sahiptir. Burada, biyolojik ligandların mekansal olarak hassas ve bölgeye özgü immobilizasyonunu sağlayan ortogonal kimyalar sunan çoklu, mikro desenli poli (etilen glikol) fırçalarla doku kültürü substratlarının çok yönlü ve otomatik üretimini gösteriyoruz.

Robotik Microcontact Baskı (R-μCP) kullanarak Karmaşık Kültürü Substratlar ve Sıralı nükleofilik Giren Fabricating

In tissue engineering, it is desirable to exhibit spatial control of tissue morphology and cell fate in culture on the micron scale. Culture substrates ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, biyolojik ligandların uzamsal olarak hassas ve bölgeye özgü immobilizasyonunu sağlayan ortogonal kimyalar sunan çoklu mikro desenli PEG fırçaları ile doku kültürü substratları oluşturmaktır. Bu, altın kaplı alt tabakalar üzerine robotik bir mikro temas baskısı ile bir TRP başlatıcısı olan acan tiyol biriktirme dizileri ile elde edilir. İkinci adım SI olarak, mikro desenli alt tabakalar üzerinde bir TRP gerçekleştirilir ve bu da terminal brom gruplarına sahip PEG fırçaları oluşturur.Daha sonra, terminal brom grupları, uygun şekilde hazırlanmış biyolojik ligandların IM mobilizasyonuna izin vermek için bir veya iki kimyasal reaktif grupla işlevselleştirilir. Daha sonra ikinci bir kimyasal grup ile işlevsel hale getirmek için tüm süreç tekrarlanır. Sonuçlar, 10 mikron hassasiyetle üst üste bindirilmiş iki ortogonal olarak işlevselleştirilmiş PEG fırçasının mikrodizilerini göstermektedir.Bu, reaktif grupların floresan molekülleri ile konjugasyonunu takiben özel görüntü analiz yazılımı kullanılarak doğrulanır. Bu tekniğin manuel mikro temaslı baskı gibi yöntemlere göre ana avantajı, robotik mikro temaslı baskının birden fazla baskı adımını mikron hassasiyetle üst üste bindirebilmesi ve aynı zamanda maksimum esneklik ve alt tabaka tasarımı sağlamasıdır. Bu yöntemin sağladığı doğruluk, ardışık nükleofilik ikame reaksiyonları ile birleştiğinde, daha sonra mikron ölçeğinde sülfatın zamansal ve mekansal kontrolünü uygulayabilen çoklu biyolojik ligandlarla işlevselleştirilmiş doku kültürü substratları üretmemize izin verir.S-I-A-T-R-P'den önce, altın kaplamalı bir kapak sürgüsü A-P-D-M-S damgası ile desenlendirilmiş olmalıdır. Bu nispeten yaygın prosedür bir metin protokolünde açıklanmıştır. Vakumu serbest bırakarak patentli kapak sürgüsünü robottan çıkararak başlayın.Daha sonra 50 mililitrelik sch uzunluğundaki bir şişeye aktarın, şişeyi kapatın ve negatif 30 PSI vakum uygulayın. Daha sonra, bir şırınga kullanarak şişeye 5.5 mililitre A TRP reaksiyon karışımı ekleyin ve ardından yine şırınga yoluyla suya 0.5 mililitre L sodyum askorbat ekleyin. Reaksiyonun renginin açık yeşilden koyu kahverengiye değiştiğini gözlemleyin.Reaksiyonun inert gaz altında 16 saat devam etmesine izin verin. Reaksiyon tamamlandığında, kapak sürgüsünü çıkarın ve etanol, ardından su ve ardından tekrar etanol ile durulayın. Sonra nitrojen ile nazikçe kurulayın.Aşılı P-E-G-M-E-M-A fırçalarının mikrodizisi çıplak gözle görülebilmelidir. Azad'ın P-E-G-M-E-M-A zincirlerini işlevsel hale getirmek için bu değişiklikleri ayrıntılı olarak ortaya çıkarmak için mikroskopi kullanın. Desen kapağı slaytını 20 mililitrelik bir cam reaksiyon şişesine aktarın ve 100 milimolar sodyum azid içeren altı mililitre DMF ekleyin.Reaksiyonun 37 santigrat derecede 24 saat sürmesine izin verin. Ertesi gün, patent kapak sürgüsünü etanol ile durulayın ve kalan brom işlevselleştirilmiş P-E-G-M-E-M-A zincirlerini yatıştırmak için hafif bir nitrojen akışı altında kurutun. Mikro desen kapak sürgüsünü 20 mililitrelik bir cam reaksiyon şişesine aktarın ve 100 milimolar etanol amin ve 300 milimolar trietil amin içeren altı mililitre DMSO ekleyin.Bu reaksiyonun ertesi gün 40 santigrat derecede 24 saat devam etmesine izin verin. Desen kapak sürgüsünü etanol ile durulayın ve bir nitrojen akışı altında nazikçe kurulayın. Bir sonraki adım, ikinci bir PDMS damgası kullanarak ve ardından damgalamayı takiben robot mikro temaslı baskıyı tekrarlamaktır.İkinci mikro dizi PEG fırçasının grafiğini çizmek için tekrar SI A TRP kullanın. Ardından, ikinci mikro dizi olan P-E-G-M-E-A zincirlerini asetilenin işlevselleştirilmesinin zamanı geldi: Francois. Mikro desenli kapak.DMF'de altı mililitre 100 mililer molar propag amin ile 20 mililitrelik bir cam reaksiyon şişesine kaydırın. Reaksiyonun 24 saat devam etmesine izin verin. Ertesi gün oda sıcaklığında, patent kapak sürgüsünü etanol ile durulayın ve hafif bir nitrojen akışı altında kurutun.Patent kapak lamı daha sonra biyotin elasyonu için hazırdır. Mikro patent kapak sürgüsünü 20 mililitrelik bir cam reaksiyon şişesine yerleştirerek başlayın. İlk olarak, biyotin asetilen sonlandırılmış zincirleri yedi.Reaksiyon şişesine azid PEG dört biyotin konjugatı ile altı mililitre bakır sülfat ekleyin, ardından 1.2 mililitre 0.15 ekleyin. Reaksiyonu başlatmak için sudaki milimolar rbic asit, reaksiyonu nitrojen ile 10 saniye boyunca köpürtün. Daha sonra şişeyi paraform ile kapatın ve reaksiyonun 24 saat sürmesine izin verin.Ertesi gün oda sıcaklığında, kapak sürgüsünü suyla durulayın ve 12 kuyulu bir polistiren kaba aktarın. Daha sonra oda sıcaklığında DPBS'de eşek serumu ile bir saat sonra, biyotin ile ellenmiş gruplarda strep DEIN 5 46 konjugatı ile mililitrede iki mikrogramda DPBS boyasında boyayın, iki saat sonra oda sıcaklığında iki saat boyunca boyayın. Kapak sürgüsünü DPBS'de yumuşak bitki örtüsü ile beş kez durulayın.Tobi ITIN, azi sonlandırılmış zincirleri yedi. Kapak fişini altı kuyulu bir polistiren plakanın kuyusuna koyun ve 20 mikromolar D-B-C-O-P-G dört biyotin içeren iki mililitre DPBS uygulayın. Daha sonra kapak slaytını 24 saat sonra oda sıcaklığında 24 saat inkübe edin.Kapak sürgüsünü dörtten önceki gibi durulayın ve streptavidin 4 88 ile boyayın. DPBS'de mililitre başına iki mikrogramda eşlenik. İki saat sonra.Kapak sürgüsünü tekrar durulayın, ardından mikroskopi ile görüntüleyin. Bu robot mikro kontak baskı protokolünü kullanma. Terminal alkin gruplarına sahip doğru desenli bir PEG fırçası ANN UI dizisi, terminal azi gruplarına sahip daha büyük PEG fırçası ANN UI'nin ayrı bir dizisi içinde modellendi.Azid ve alkin gruplarının mekansal dağılımı, floresan probların tıklama kimyası ve streptavidin bağlanması kullanılarak görüntülendi. Her iki floresan kanalının üst üste binmesi, damgaların nasıl örtüşmediğini gösterir. Hizalamanın doğruluğu, SCAR'ın sınırlarında olan 10 mikronun altında hesaplandı.Baskıyı yapmak için kullanılan bir sistem. Bu videoyu izledikten sonra, birden fazla peg fırça dizisini üst üste bindirmek için robotik mikro temaslı baskı kullanarak özel doku kültürü alt tabakalarının nasıl oluşturulacağını iyi anlamış olmalısınız. Ortogonal kimyalar ile işlevselleştirilmiştir.

fabricating-complex-culture-substrates-using-robotic-microcontact

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bir çip üzerinde fotopolimerizasyon tekniği kullanılarak bir polimer mikro oluşumu açıklaması. Atomik kuvvet mikroskobu, temas açısı ölçümleri, X-ışını fotoelektron spektroskopisi ve uçuş ikincil iyon kütle spektrometresi ve hücre bağlanma testinin zaman kullanarak yüksek aktarım yüzey karakterizasyonu da açıklanmıştır.

Biyomalzemelerin Yüksek Verimli Discovery için Polimer Mikroarray&#39;ler

Bu makale, yüksek bir verim yöntemi antijen sunan hücreler üzerinde belirli reseptörlerine yönelik olarak kullanım için polianhidrid Nanopartiküllerin yüzeyine oligosaccharidler ve ekin sentezi için sunulmuştur.

Polianhidrid Nanopartiküller Yüksek throughput Karbonhidrat sentezi ve işlevsel

Bakteri ve Archaea yılında CRISPR / Cas sistemleri aracılık adaptif bağışıklık. Birçok Cas proteinlerin uzunluğu değişen crRNA öncüllerinin hareket endoribonucleases olarak hareket etmek önerilmektedir. Burada Cas endonuclease aktivitesinin biyokimyasal analiz için önceden crRNA yüzeyler oluşturmak için üç farklı yaklaşımlar sergiler.

CRISPR / Cas Sistemleri Endonükleazlar için Substrat Üretimi

Sıvı işleme robotlar üzerinde modüler bir klon DNA derleme yöntemi kullanılarak modüler DNA "aygıt" derleme gerçekleştirmek için otomatik bir iş akışı burada anlatılan. Protokol bir sezgisel yazılım aracı kullanarak iki sıvı taşıma platformları göstermek Kombinatorik DNA aygıt kitaplığı oluşturma için sıvı işleyicisi picklists üretmek için kullanır.

Robot sıvı işleme derleme modüler DNA cihazların otomatik

Biz bir basit tekniğinde gen uzunluğunda DNA moleküllerinin immobilizasyon için boş hücre gen ifade deneyler biochips üzerinde gerçekleştirmek için kullanılan bir yüzey üzerinde açıklayınız.

Genlerin Multistep Strand deplasman litografi kullanarak işlevsel yüzey immobilizasyon

Bu makalede, yerinde üretilen nükleik asit mikrodizilerinin sentezi ve uygulamalarındaki yeni gelişmeleri sunmakta ve tartışıyoruz. Özellikle, DNA sentezi protokollerinin RNA'ya nasıl genişletilebileceğini ve mikrodizilerin geri alınabilir nükleik asit kitaplıkları oluşturmak için nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz.

Yüksek Yoğunluklu DNA ve RNA mikrodizileri - Fotolitografik Sentez, Hibridizasyon ve Büyük Nükleik Asit Kütüphanelerinin Hazırlanması

Burada, dna origami şekillerini kılavuz şablonlar olarak kullanarak substratlarda ayrık ve doğru inorganik nanoyapılar oluşturmak için bir protokol açıklıyoruz. Yöntem şeffaf bir substrat (safir) üzerinde plazmonik altın papyon şeklinde antenler oluşturarak gösterilmiştir.

Algılama Uygulamaları için İnorganik Yapıların DNA Origami Aracılı Substrat Nanodesenleme

Çalışma, sentetik gen parçalarından protein tarama kampanyaları için klonlama yapmadan veya canlı hücreler kullanmadan büyük (μg-mg) miktarlarda DNA oluşturmak için bir protokol tanımlamaktadır. Minimal şablon enzimmatik olarak sindirilir ve daireselleştirilir ve daha sonra izotermal yuvarlanan daire amplifikasyonu kullanılarak yükseltilir. Hücresiz ifade reaksiyonları, teşvik edilmemiş ürünle gerçekleştirilebilir.

Hücresiz Sistemler Kullanarak Protein Prototipleme için Minimal, Doğrusal Şablonların Amplifikasyonu için Hızlı, Enzymatik Yöntemler

İyi karakterize edilmiş genetik parçalar, yeni genetik devrelerin tasarımı için gereklidir. Burada, genetik parçaları hızlı bir şekilde karakterize etmek için uygun maliyetli, yüksek verimli bir yöntem açıklıyoruz. Yöntemimiz, hücresiz lizatları, klonlamayı önlemek için lineer DNA'yı ve verimi artırmak ve reaksiyon hacimlerini azaltmak için akustik sıvı işlemeyi birleştirerek maliyeti ve zamanı azaltır.

Genetik Parçaların Hücresiz Sistemlerle Hızlı Karakterizasyonu

Mikrometre ölçeğinde 3D baskı, nöronal hücre kültürleri için polimerik cihazların hızlı prototiplenmesini sağlar. Bir prensip kanıtı olarak, nöronlar arasındaki yapısal bağlantılar, nörit büyümesini etkileyen bariyerler ve kanallar oluşturularak kısıtlanırken, bu tür manipülasyonun işlevsel sonuçları hücre dışı elektrofizyoloji tarafından gözlemlendi.

Mikro Ölçekli Nöronal Hücre Kültürü Cihazlarının İki Foton Polimerizasyonu 3D Baskısı

Keşfedin, robotik mikro temas baskısı ile çoklu PEG fırçalı doku kültürü substratları oluşturmayı. Bu yöntem, biyolojik ligandların uzamsal olarak hassas immobilizasyonunu sağlar.

Robotik Microcontact Baskı (R-μCP) kullanarak Karmaşık Kültürü Substratlar ve Sıralı nükleofilik Giren Fabricating

Daha fazla video keşfet