Makrofaj Fagositoz ve Aktin Polimerizasyon Değerlendirme Yüksek Verimli Florimetrik Tekniği

Aşağıdaki deneyin genel amacı, fagositik süreçteki değişiklikleri ölçmek veya agonistlerin veya antagonistlerin eklenmesini takiben polimerizasyonda hareket etmektir. Bu, fagositik hücrelere floresan etiketli parçacıklar eklenerek ve fagositozun gerçekleşmesi için yeterli zaman tanınarak elde edilir. Fagositozu durdurmak için ikinci bir adım olarak, hücreler içselleştirilmemiş partiküllerin floresansını söndürmek için triam mavisi ile muamele edilir, yıkanır ve daha sonra paraaldehit ile sabitlenir.

Sıradaki boyama ve nicelleştirmedir. Hücrelerin ve partiküllerin, DPI veya aktin ile sürdürülen hücrelerin floresan tespitini kolaylaştırmak için, sonuçlar, floro metrik analizine dayalı olarak yeşil kırmızı floresan ile mavi arasında bir oran ile ölçüldüğü üzere tedavinin fagositoz ve aktin polimerizasyonu üzerindeki etkisini göstermektedir. Florometrik tekniğin mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, fagositozun değerlendirilmesi için yüksek verimli ve uygun maliyetli bir yöntem olmasıdır.

Minimum numune manipülasyonuna ve hücre başına floresan yoğunluğunun hızlı bir şekilde ölçülmesine izin verir. Bu yöntem, immünoloji ve hücre biyolojisi alanında, bu patojen klirensinin ne kadar etkili ve ne kadar hızlı olduğu gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Fagositoz sırasında değişen aksiyon polimerizasyonu ve agonistler veya antagonistler tarafından nasıl modüle edilen fagositoz veya akson polimerizasyonu.

Prosedür plakasına başlamak için, berrak veya siyah bir tabana sahip 96 oyuklu bir plakadaki Murin J 7 74 hücre hattından gelen makrofajlar, plakaya adion sağlamak için yapışma hücrelerini bir ila iki saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe eder. Daha sonra istenen agonistleri veya antagonistleri veya araç kontrolünü 50 mikrolitre PBS veya takviye edilmiş ortamda iki x konsantrasyonda hücrelere ekleyin ve istenen bir süre boyunca inkübe edin. Bu adımda, floresan parçacıklarının ve etiketlerin işleme, yıkama ve inkübasyon sırasında her zaman ışıktan korunduğundan emin olun.

Foto ağartmayı önlemek için, floresan etiketli dextra boncuklar gibi partikülleri süspansiyon halinde kullanmak için orex stok solüsyonunu bir dakika boyunca kullanın. Daha sonra, floresan parçacıklarına eşit miktarda opsonize edici reaktif ekleyin ve bir dakika daha kuvvetlice girdap yapın. Daha sonra, karışımı bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin, inkübasyon santrifüjünü takiben parçacıklar beş dakika idi.

500 kez G. Aşırı opsonizing reaktif içeren S süpernatanı çıkarın. Bundan sonra, parçacıkları 100 mikrolitre PBS ile yıkayın. Peletleri yeniden süspanse etmek için numuneyi girdaplayın ve beş dakika boyunca 500 ila kez santrifüjleyin G. Bağlanmamış antikorun uygun optimizasyonunu ve çıkarılmasını sağlamak için bu adımları iki kez daha tekrarlayın.

İyonize parçacıkların çalışma çözeltisini hazırlamak için, parçacıkları beş mililitre ortamda yeniden süspanse edin. Daha sonra tekrar kullanana kadar ışıktan uzakta saklayın. Şimdi parçacıkların çalışma çözeltisini steril bir reaktif rezervuarına yerleştirin.

önce hazırlanan hücrelere mililitre başına 15 nanogramlık bir nihai konsantrasyona 50 mikrolitre opsonize partikülü ekleyin ve fagositozun standart hücre kültürü koşullarında gerçekleşmesine izin verin. Sürekli fagositoz yöntemi için, floresan parçacıklarının kuyunun dibine ulaşması ve hücrelerle temas etmesi için 30 dakika ila bir saat bekleyin. Bir zaman rotası deneyi yapıyorsanız, farklı zaman aralıklarında bakteri ekleyin ve tüm reaksiyon plakasını aynı anda durdurun.

Yapışma hücreleri için işlem hızını arttırmak için, sinameki çıkarın ve trian inkübasyonunu takiben içselleştirilmemiş bakterilerin floresansını söndürmek için PBS ile 50 mikrolitre seyreltilmiş triam mavisi ekleyin. Kalan trian'ı çıkarmak için plakayı PBS ile iki kez yıkayın. Daha sonra, hücreleri 50 mikrolitre% 4 paraldehit ile sabitleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.

Ardından plakayı PBS ile yıkayın. Tüm sıvıyı çıkarın ve 50 mikrolitre DPI ekleyin Beş dakikalık boyamadan sonra, plakayı PBS ile iki kez yıkayın. Daha sonra, her oyuğa 50 mikrolitre PBS ekleyin ve paraaldehit fiksasyonunu takiben fagositozu kaydedin.

Plakayı her yıkama için kuyucuk başına 100 mikrolitre PBS ile iki kez yıkayın. Daha sonra hücrelere nüfuz etmek için PBS'de 50 mikrolitre% 0.1 Triton X 100 ekleyin ve oda sıcaklığında üç ila beş dakika inkübe edin. Ardından, %0.1 Triton X'i PBS ile iki kez yıkayın.

Ardından, etiketin spesifik olmayan şekilde bağlanmasını önlemek için hücreleri 20 dakika boyunca %1 BSA ile bloke edin. Şimdi beş mililitre PBS'ye 100 mikrolitre metanol stok çözeltisi ekleyerek Çubuk domine boyasının çalışma çözeltisini hazırlayın. Engellemenin ardından BSA solüsyonunu hemen çıkarın.

Her oyuğa 50 mikrolitre rumin foid ve çalışma solüsyonu ekleyin ve hücreleri karanlıkta 20 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Fagositozu ölçmek için, plakayı bir floresan plaka okuyucusuna yerleştirin 488 nanometre dalga boyunda bir uyarma filtresi ve 518 nanometre dalga boyunda bir emisyon filtresi kullanarak yeşil floresan ve 355 nanometre dalga boyunda bir uyarma filtresi kullanarak mavi floresan ve 460 nanometre dalga boyunda bir emisyon filtresi kullanın. Bir floresan plaka okuyucu kullanarak aktin polimerizasyonunu ölçmek için, 584 nanometre dalga boyunda bir uyarma filtresi ve 620 nanometre dalga boyunda bir emisyon filtresi ve mavi floresan aracılığıyla kırmızı floresan kaydedin.

355 nanometre dalga boyunda yangın ve uyarma filtresi ve 460 nanometre dalga boyunda emisyon filtresi. Daha sonra, yeşil veya kırmızı floresanın toplam RFU'sunu, partikül etiketine veya yüksek plaka nedeniyle fagositik ve aktin kantitasyonuna bağlı olarak mavi floresan okumasına bölün. Varyansı ölçmek için, gözlemlenen eğilimleri en iyi şekilde göstermek ve daha güvenilir istatistiksel analizi kolaylaştırmak için göreceli indeksleri kullanın.

Bu görüntü, inhibitör ilavesini takiben aktin polimerizasyonundaki değişiklikleri göstermektedir. Bunlar psödopodia oluşumudur ve işte zar fırfırlamasındaki değişiklikler. Bu görüntüde, hücrelerin 60 dakika boyunca 20'ye bir boncuk / hücre oranında fitzy konjuge X boncuklarını içselleştirmesine izin verildi.

Daha sonra hücreler, paraldehit ile sabitlenmiş, aseton ile geçirgen olan ve F aktin için leke olan trian ve PBS ile yıkanacaktır Çubuk domin, F loin ve dpi kullanılarak, opsonize ve oksitlenmemiş parçacıkların sürekli fagositozu oldukça karşılaştırılabilir. J 7 74 hücrelerinin dextra boncukları içselleştirdiği yer. İlginç bir şekilde, fagositozu takiben aktin polimerizasyonu artar, daha sonraki zaman noktalarında yavaşlarken, unop partiküllerinin içselleştirilmesini takiben aktin polimerizasyonu, dextra partikülleri kullanan fagositik yöntemlerin hiçbirini artırmaz, hücre canlılığında değişikliklere neden olur Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, uygun şekilde gerçekleştirilirse, bir seferde birden fazla plaka ile bir ila iki saat içinde yapılabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, fagositoz ve diğer hücresel süreçleri analiz etmek için verimli, uygun maliyetli, yüksek verimli bir yöntem olarak Flor metrik analizinin nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.