Name: Makrofaj Fagositoz ve Aktin Polimerizasyon Değerlendirme Yüksek Verimli Florimetrik Tekniği (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Öğrenin makrofaj fagositoz ve aktin polimerizasyon değerlendirmesi için yüksek verimli florimetrik teknik. Bu yöntem, immünoloji ve hücre biyolojisi araştırmalarında hızlı ve maliyet etkin niceliksel analiz sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar aşağıdaki finansman kaynaklarına teşekkür eder: RO1 DA 12104, RO1 DA 022935, RO1 DA031202, K05DA033881, P50 DA 011806, 1R01DA034582 (S.R.'ye) ve F31 DA026264-01A1, T32 DA07097 (J.N.'ye).

NOT: daha önce yayınlanan çalışma 12 kullanılan Bu protokol, fagositoz ve aktin polimerizasyonu miktar gibi birden fazla uygulama için de kullanılabilir. protokol değişikliği çeşitli kendisini ödünç, ve Tablo 1 hücre tipleri ve parçacıklar başarıyla geçmiş çalışmalarda kullanılan. Fagositoz veya aktin polimerizasyonu ölçümü için bu protokolün standart kullanımı Şekil 1'de gösterilmiştir. <img alt="Diyagram 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/52195/52195diagram1.jpg" width="600"> Şema 1:. Hücreler, kaplama muamele edilmiş ve yapışmaya bırakılmış sonra Şeması fagositoz aktin polimerizasyonu ve miktar tayini için flüorometrik tahlil yeşil floresan (FITC) ile etiketlenir parçacıklar fagositosis için hücrelere ilave edilir. Reaksiyon trypan veya antibi tarafından durdurulurotik yıkama (olmayan içsel parçacıkları elimine etmek için) ve tespit% 4 paraformaldehit ile gerçekleştirilir. Hücreler, daha sonra kırmızı floresan aktin etiket (rodamin falloidin) ve mavi floresan-etiketi (DAPI) ile boyanır. Fagositoz aktin polimerizasyonu ve endeksler yeşil / mavi (FITC / DAPI) ya da kırmızı / mavi (rodamin / DAPI) floresansın nispi floresan birimlerinin oranı olarak ölçülür. 1. Kaplama ve Tedavisi Hücreler NOT: Başlamadan önce, plaka düzeni aşağıdaki kontrolleri en az 4 teknik tekrarlı tedaviler çalışan düşünün, ve şunlardır: sadece ve parçacık hücreleri sadece (tek başına ya da DAPI rodamin yalnız ile, lekesiz). <ol><li> Kontaminasyondan örnekleri korumak amacıyla, steril hücre kültürü kaputu 1-4 adımda reaktiflerin tamamı ilave yürütmek için. </li><li> (Kuyu başına), 50 ul 1-5 x 10 4 hücre 96 oyuklu bir plaka içerisinde Plaka makrofajlar (sıçangil J 774 hücre çizgisi) ve önceden ısıtılmış medya desteklenmiştir. Bu yöntem için ideal plakaları okuyucu özelliklerine bağlı olarak, şeffaf veya siyah dipleri siyah 96-kuyu plakalar vardır. <ol><li> (Fagositosis için canlı bakteri kullanılmıyorsa) takviye edilmiş bir ortam için, tamamlayıcı çağlayanının bir girişimi engellemek için FBS,% 10 ısı ve% 1 penisilin / streptomisin kullanın. Ile yapışmayan hücreler 1-2 yapışma saat ve yapışkan olmayan hücreler için izin verirse, 500 x g'de 10 dakika için hücreler ile plaka aşağı doğru döndürün. </li></ol></li><li> 100 ul (1 x) bir son hacim için 50 ul 2x konsantrasyonda (takviye edilmiş ortam içinde, daha tercihen PBS içinde yeniden süspansiyon haline getirilmiş ya da) istenilen agonistleri / antagonistleri ya da araç kontrolü ekleyin ve bir zaman arzu edilen bir miktarda inkübe edilir. Çok kanallı pipet ve reaktif rezervuarları hızlı işleme kolaylaştıracaktır. </li></ol> Floresan Parçacıkların 2. Opsonizasyon ftp_upload / 52.195 / 52195table1.jpg "width =" 500 "/&gt; Tablo 1: Test edilen hücre tipleri ve fluorometrik olarak analiz floresan parçacıkların olmadığı, fagositoz ve aktin polimerizasyon Tablo 1 hücre tiplerinin kombinasyonu (hücre hatları ve primer hücreler) göstermektedir grup florometrik yöntemi ile kullanılan bildirildi.. Vahşi tip hücreler tarafından fagositoz ve aktin polimerizasyonu şu an dışında, aynı zamanda, bir GFP (yeşil flüoresan protein) ifade eden transfekte edilmiş hücreler tarafından fagositoz incelenmesi için, bu parçacıkların bir kısmı kullanmışlardır. . Floresan haberci ihtiva eden plasmidler ile transfekte edilmiş hücrelerin floresans da DAPI Tablo Efsaneye ek olarak hücresel marker olarak kullanılabilir: A - aktin polimerizasyonu; P - fagositoz; PT - GFP tarafından fagositoz transfekte hücreleri etiketli; OPDex - dekstran boncuk opsonize; HKOP - Isı opsonize öldürülen. <ol><li> Floresan parçacıkların olmadığı ve etiketler her zaman ışıktan korunduğu, dur sağlamakışıkla ağartma önlemek için, hem de inkübasyon sırasında işleme, yıkama ing <ol><li> Üreticinin teknik özelliklerini kullanarak,: (E. coli K-12 suşu E2861) kuru parçacıklar için, floresan ısı öldürülmüş opsonize (HKOP) bakterileri dışarı tartın. 10 Herhalde kitle hesapları yapmak için özen: 1-20: 1 bakteri: hücre oranı (ya da en azından 10: 1 oranı - yaygın fagositoz miktarının kullanılır) 13,14. Parçacıkların sayısı üreticisi tarafından sağlanan veya 1 mg / ml stok çözeltisi seri dilüsyonları couting ile tespit edilebilir. </li><li> 50 ul PBS içinde tekrar süspansiyon ve en yüksek ayarda 1 dakika vorteksleyin. Doğru vorteks (burada ve protokol boyunca) parçacıklar opsonitasyonunu etkinliğini etkileyebilecek bir araya eğilimi gibi olun. </li><li> Süspansiyon içinde olan zerrelerin gibi floresan etiketli dekstran boncuk (Dex boncuklar) için, 1 dakika vorteksleyin, stok çözeltisi, birim d boncuk konsantrasyonuna süspansiyon ya da bağlı olarak 50 ul alır1 boncuk: boncuk etermine montaj 10 kolaylaştırmak için hücre oranı. </li></ol></li><li> Parçacıklara opsonizasyon reaktif eşit hacimde eklenir ve güçlü bir şekilde bir dakika girdap. </li><li> 1 saat boyunca 37 ° C'de bir reaktif opsonizasyon sahip partiküller inkübe edin. </li><li> İnkübasyondan sonra 500 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj parçacıkları ve fazla opsonizasyon reaktifi ihtiva eden üstte yüzen çıkarın. 100 ul PBS ilave edilmesiyle parçacıklar yıkanır, girdap 500 x g'de 5 dakika boyunca pelet ve santrifüjatın tekrar süspansiyon. <ol><li> Uygun opsonizasyonunu ve bağlanmamış antikor kaldırılmasını sağlamak için bu adımları iki kez tekrarlayın. </li></ol></li><li> (Bir 96-delikli plaka için yeterli) ortam 5 ml bunları yeniden süspanse edilmesi suretiyle opsonize parçacıkların çalışma çözeltisi hazırlayın ve hücrelere ilave edilene kadar ışıktan uzakta depolamak. </li></ol> 3. Fagositoz <ol><li> Steril reaktif rezervuar içindeki parçacıkların çalışma çözeltisi yerleştirin. Buradan, 50 ekleyin56 (50 ng / ml'lik bir son konsantrasyon için) aşama 1 'de hazırlanan hücrelere opsonize parçacıkların L ve fagositoz standart hücre kültür koşullarında oluşmasına izin verir. Bu yöntem (Şema 2) kullanılarak değerlendirilebilir fagositoz iki yöntem aşağıda görüntülenmiştir. </li></ol><img alt="Diyagram 2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/52195/52195diagram2.jpg" width="600"> Şema 2:. Onlar yavaş yavaş iyi altındaki hücreleri ulaşmak gibi sürekli karşı senkronize fagositoz karşılaştırılması Sürekli fagositoz zamanla parçacıkların sürekli içselleşmesini gösterir. Bir tezat senkronizasyon adımı (santrifüj) hücre ile partikül temas artırılması ve hücreler tarafından derhal içselleştirilmesi lider, dibine çöker parçacıkları zorlar. Senkronize fagositoz daha hızlı bir bölümünü içselleştiren hızlı bir süreçtirparçacık temas: artmış hücre nedeniyle icles. <ol><li><ol><li> Bakteri kuyunun dibine ulaşmak ve elde etmek için yavaş yavaş dibe batar ve hücreler ile temas, izin daha uzun zaman dilimlerini kullanmak gibi hücreler sürekli opsonize bakterileri fagosite izin Sürekli fagositoz yöntemiyle (Şekil 2) için hücrelerle dokunun. Bir zamanlaması, deney yapılması halinde, farklı zaman aralıklarında bakteri ekleyebilir ve işleme hızını artırmak için, aynı zamanda reaksiyonların tüm plaka durdurun. </li><li> Parçacık artırır senkronize fagositoz yöntemiyle (Şekil 2) için: santrifüj yoluyla hücre teması, her zaman noktalarında senkronizasyonunu kolaylaştırmak için hücreleri ve parçacıklar (500 xg'de 5 dakika) kısa sürede parçacıklar ilave olarak içeren tüm plaka aşağı spin ve Hücre etkileşimi: parçacık hızlandırmak için. <ol><li> Sağ merkezkaç tamamlanmasından sonra başlayan süresi kursu ölçünfugation adım. Zamana yayılmış bir deneyi yürütülmesi durumunda aşağıda tarif edildiği gibi, farklı zaman aralıklarında bağımsız olarak her zaman noktasını durdurun. </li></ol></li></ol></li></ol> NOT: senkronize fagositoz yöntemi biraz daha zahmetli bir öncekinden olduğunu, ancak daha kısa sürede daha yüksek fagositik indeksi sağlar. 4. Durdurma Fagositoz <ol><li> Yapışkan hücreler için, süpernatant kaldırmak ve PBS ile seyreltildi tripan mavisi 50 ul: olmayan içsel bakteri floresan söndürmek için, (2: 1 seyreltme). </li><li> Yapışmayan hücreler için, plaka aşağı spin ve süpernatant kaldırmak. Seyreltilmiş tripan mavisi 50 ul ekleyin. Hücre kaybını en aza indirmek ve yeterli yıkama sağlamak için, her bir yıkama arasında en plaka (500 x g'de 5-10 dakika) santrifüj emin olun. </li><li> Tripan inkübasyon sonrasında, (de açık döner PBS kaldırılana kadar) herhangi bir kalıntı numuneler Tripan kaldırmak için PBS ile hücreleri iki kez yıkayın. Trypan fakat canlı bir bakteri ya da OPDex boncuk, floresan etiketli olmayan içsel ısı öldürülmüş bakteriyel parçacıkların floresan 15,16 söndürmek için gösterilmiştir. Canlı bakteri için, penisilin, streptomisin, veya gentamisin yerine olmayan içsel partiküllerden floresan karıştırıcı etkilerini önlemek için tripan yıkama gibi antibiyotikler ile bir yıkama içerir. </li><li> PBS ile yıkayın, sonra% 4 paraformaldehid, 100 ul hücreleri saptamak, ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edilir (her bir yıkama için oyuk başına 100 ul). Bu adımda, bir haftaya kadar 4 ° C 'de hücreler, kaydetme ve boyama ve miktar, doğrudan devam edin. NOT: Tüm sonraki adımlar bu nokta önsöz hücre kültürü kaputu dışında yapılabilir oluştururlar. </li><li> Tüm sıvı çıkarın ve PBS içinde yeniden 5 ng / ml DAPI 50 ul ekle. Boyama için 5 dakika izin verin ve daha sonra iki kez PBS ile yıkayın. Yıkama adımından sonra, her bir kuyunun ve kayıt fagositozu PBS 50 ul ekleyin. </li> 5. Aktin Boyama Not: fagositoz ek olarak, florometrik yöntem lamellipodia, pseudopodiae inhibisyonu sırasında azalır aktin, yoğunluğunu ölçmek ve membran bir inhibitör (Şekil 1A) ile muamele sonucu olarak kabarması ile aktin polimerizasyonu miktarının sağlayacaktır. Bu fagositoz ek olarak aktin polimerizasyonu ölçümü ilgilenen varsa isteğe bağlı bir adımdır. Aktin polimerizasyon fagositoz için floresan parçacıklar kullanılarak, nihai hedefi ise isteğe bağlıdır. <ol><li> Paraformaldehit sabitleme (adım 4.3) takiben, her bir yıkama için oyuk başına 100 ul PBS ile iki kez plakayı yıkayın. Nüfuziyet kabiliyeti PBS içinde% 0.1 Triton X-100, 50 ul ilave edin ve oda sıcaklığında -5 dakika inkübe edilir. </li><li> (Yukarıdaki gibi) PBS ile% 0.1 Triton X-100, 2 kez yıkayın ve Labe spesifik olmayan bağlanmanın olmaması için 20 dakika boyunca,% 1 sığır serum albümini (BSA) ile blokel. </li><li> Engelleme ardından, BSA çözüm kaldırmak ve hemen rodamin Phalloidin ekleyin. , Rodamin leke çalışma çözeltisi hazırlamak (bir plaka için yeterli) PBS, 5 ml (üretici tarafından sağlanan) metanoik çözeltisi 100 ul kullanın. Çalışma çözeltisinden oyuk başına 50 ul ilave edildi ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edilir. NOT: adımda çamaşır adımları ve DAPI boyama takiben 4.4 hücreleri ölçümü için hazır olacak. </li></ol> 6. sayısallaştırılması <ol><li> Λ = 460 nm λ = 355 nm ve emisyon filtresi uyarma filtresi kullanılarak λ = 518 nm, mavi floresan de λ = 488 nm ve emisyon filtresi uyarma filtresi kullanılarak floresan plak okuyucu kayıt yeşil floresan ile fagositozu ölçmek için. </li><li> Λ = 355 nm ve λ = 460 nm (yukarıdaki gibi), ve kırmızı grip ile bir floresan plaka okuyucu kayıt mavi floresan kullanılarak aktin polimerizasyonu ölçmek içinλ = 584 nm ve emisyon filtresi λ = 620 nm uyarma filtresi üzerinden orescence. NOT: Orbital veya merkezi algılama kayıt için kabul edilebilir. Bazı hücre tiplerinin vaka yörünge kayıt avantaj olabilir hangi merkeze daha kuyudan, kenarına daha toplamak. Özellikle, yörünge etrafında üç nokta, ortalama aynı zamanda daha hassas sonuçlar elde etmek için kullanılabilir. </li><li> Aktin ölçümü (Grafik 1) vs parçacık etiket veya fagositik bağlı, (DAPI itibaren) mavi floresan okuma yeşil veya kırmızı floresan toplam RFU bölün. Yüksek olması nedeniyle plaka için plaka varyans, en iyi gözlenen eğilimleri göstermek ve daha güvenilir istatistiksel analiz kolaylaştırmak için, (örneğin = 0 kontrolü t göreceli olarak) göreceli indeksleri kullanın. </li></ol></ol>

<ol><li>Murphy, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMurphy%2C+K+%22Janeway%27s+Immunobiology%22">Janeway's Immunobiology</a>. , 8th edn, Garland Science. New York, NY. (2012).</li>
<li>Burke, D. W., O'Connor, D. O., Zalenski, E. B., Jasty, M., Harris, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromotion+of+cemented+and+uncemented+femoral+components%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+Of+Bone+And+Joint+Surgery.+British+Volume%22%5BJournal%5D)">Micromotion of cemented and uncemented femoral components.</a> The Journal Of Bone And Joint Surgery. British Volume. 73 (1), 33-37 (1991).</li>
<li>Duan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+to+malaria+by+enhanced+phagocytosis+of+erythrocytes+in+LMP7-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Resistance to malaria by enhanced phagocytosis of erythrocytes in LMP7-deficient mice.</a> PloS One. 8 (3), 59633(2013).</li>
<li>Dementhon, K., El-Kirat-Chatel, S., Noel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+in+vitro+model+for+the+multi-parametric+quantification+of+the+cellular+interactions+between+Candida+yeasts+and+phagocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Development of an in vitro model for the multi-parametric quantification of the cellular interactions between Candida yeasts and phagocytes.</a> PloS One. 7 (3), 32621(2012).</li>
<li>Al-Bader, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+trehalose+biosynthesis+in+Aspergillus+fumigatus+development%2C+stress+response%2C+and+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+And+Immunity%22%5BJournal%5D)">Role of trehalose biosynthesis in Aspergillus fumigatus development, stress response, and virulence.</a> Infection And Immunity. 78 (7), 3007-3018 (2010).</li>
<li>Acosta-Iborra, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+oxygen+sensing+modulates+antigen+presentation+and+phagocytic+functions+involving+IFN-gamma+production+through+the+HIF-1+alpha+transcription+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Macrophage oxygen sensing modulates antigen presentation and phagocytic functions involving IFN-gamma production through the HIF-1 alpha transcription factor.</a> Journal Of Immunology. 182 (5), 3155-3164 (2009).</li>
<li>Ojielo, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+phagocytosis+and+clearance+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+the+lung+following+bone+marrow+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Defective phagocytosis and clearance of Pseudomonas aeruginosa in the lung following bone marrow transplantation.</a> Journal Of Immunology. 171 (8), 4416-4424 (2003).</li>
<li>Neu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD14-dependent+monocyte+isolation+enhances+phagocytosis+of+listeria+monocytogenes+by+proinflammatory%2C+GM-CSF-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">CD14-dependent monocyte isolation enhances phagocytosis of listeria monocytogenes by proinflammatory, GM-CSF-derived macrophages.</a> PloS One. 8 (6), 66898(2013).</li>
<li>Sokolovska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+caspase-1+by+the+NLRP3+inflammasome+regulates+the+NADPH+oxidase+NOX2+to+control+phagosome+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Activation of caspase-1 by the NLRP3 inflammasome regulates the NADPH oxidase NOX2 to control phagosome function.</a> Nature Immunology. 14 (6), 543-553 (2013).</li>
<li>Janko, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRP%2Fanti-CRP+antibodies+assembly+on+the+surfaces+of+cell+remnants+switches+their+phagocytic+clearance+toward+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">CRP/anti-CRP antibodies assembly on the surfaces of cell remnants switches their phagocytic clearance toward inflammation.</a> Frontiers in Immunology. 2 (2), 70(2011).</li>
<li>Clatworthy, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+lupus+erythematosus-associated+defects+in+the+inhibitory+receptor+FcgammaRIIb+reduce+susceptibility+to+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Systemic lupus erythematosus-associated defects in the inhibitory receptor FcgammaRIIb reduce susceptibility to malaria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (17), 7169-7174 (2007).</li>
<li>Ninkovic, J., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphine+decreases+bacterial+phagocytosis+by+inhibiting+actin+polymerization+through+cAMP-%2C+Rac-1-%2C+and+p38+MAPK-dependent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+Of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Morphine decreases bacterial phagocytosis by inhibiting actin polymerization through cAMP-, Rac-1-, and p38 MAPK-dependent mechanisms.</a> The American Journal Of Pathology. 180 (3), 1068-1079 (2012).</li>
<li>Nix, R. N., Altschuler, S. E., Henson, P. M., Detweiler, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemophagocytic+macrophages+harbor+Salmonella+enterica+during+persistent+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Hemophagocytic macrophages harbor Salmonella enterica during persistent infection.</a> PLoS Pathogens. 3 (12), 193(2007).</li>
<li>Xue, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+gene+transfer+and+expression+in+cord+blood-derived+CD34%2B+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+by+a+hyperactive+Sleeping+Beauty+transposon+system%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Stable gene transfer and expression in cord blood-derived CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells by a hyperactive Sleeping Beauty transposon system.</a> Blood. 114 (7), 1319-1330 (2009).</li>
<li>Hed, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+distinguishing+ingested+from+adhering+particles.+Methods+in+Enzymology%5BTitle%5D)+AND+%22132%22%5BJournal%5D)">Methods for distinguishing ingested from adhering particles. Methods in Enzymology.</a> 132. , 198-204 (1986).</li>
<li>Scott, A. J., Woods, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+internalization+of+Histoplasma+capsulatum+by+mammalian+cell+lines+using+a+fluorometric+microplate+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Mycology%22%5BJournal%5D)">Monitoring internalization of Histoplasma capsulatum by mammalian cell lines using a fluorometric microplate assay.</a> Medical Mycology. 38 (1), 15-22 (2000).</li>
</ol>

Yazarların birbiriyle rekabet eden hiçbir mali çıkarı yoktur.

Florometrik tekniğin başlıca kısıtlamaları deney varyans yanı sıra geniş bir yıkama ve yapışkan olmayan hücrelerin kullanımı ile ortaya çıkan hücre kaybı vardır. Varyans nedeniyle hazır çözeltinin hazırlanması sırasında tartım ve pipetleme gibi floresan parçacıkların varyasyon büyük ölçüde görülmektedir deney için deney parçacıkların aynı sayıda muhafaza tam bir yol değildir. (-; Parçacıklar hemen eklenen ve kaldırılan t = 0 kontrol) deneyler arasındaki varyans sorunu çözmek için, veri,% fag...

Floresan sinyal miktarının belirlenmesi yaygın, akım sitometri konfokal mikroskopi ve ELISA multiplex için analiz FRET, PCR kadar bilimsel yöntemlerle çok sayıda kullanılmıştır. Floresan görüntüleme ve miktar geniş bir uygulama vardır ve çeşitli hücresel süreçlerin kantitatif analiz için harika bir araç olabilir. Floresan belirteçleri ve sinyal kullanımı son on yılda devrim olmuştur, ve floresan plaka okuyucu çıkması hücresel süreçleri sırasında yayılan floresan yüksek verim miktarının kolaylaştırmıştır. Florimetrik analiz fagositoz miktarının büyük bir araç olarak hizmet verebilir. Fagositoz, 1800 1 Metchnikoff tarafından fagositoz keşfinden bu yana çalışılmıştır. Yıllar geçtikçe, çeşitli yöntemler bakteriyel, viral, fungal ve parazitik patojenler 2-5 istila karşı doğal bağışıklık savunma için gerekli bu önemli süreci incelemek için kullanılmıştır. Sırayla miktar kullanılan mikroskopi ve Stereolojik tekniklerin Önceki yöntemler daha sonra içselleştirilmiş parçacıklar (manuel veya yazılım kullanımı ile) 6-8 sayılarak ölçüldü phagocytosing hücreleri, görselleştirmek için. Kantitatif analiz için yalnız mikroskopi kullanılarak bazı dezavantajları bakterilerin manuel sayım emek yoğun ve gözlemci önyargı daha eğilimli olduğunu vardır. Fagositoz belirlenmesinde kullanılan diğer bir yöntem, bakteriyel kültür tabakalarına (fagositoz sonra) hücre lizatları bakterilerin kaplama mikrobiyolojik bir tekniktir, ancak bu yöntem bakteri mekanizmaları ve kısmen içsel bakterilerin varlığı hesaba başarısız olabilir. Bu yöntem mikroskopi göre daha emek yoğun ve analiz için birkaç gün sürer. Akış sitometri fagositoz ölçmek için hızlı, en etkili yolu olarak görünmektedir ve birçok grup 9-11 tarafından kullanılmıştır, ancak yüksek maliyet yaygın in ile ilgiliDaha önce de belirtildiği deneylere göre analiz için gerekli gösterge en pahalı bir yöntem sağlar. flüorometrik yöntem engelleyici maliyeti olarak değil floresan kullanarak ekipman tarafsız ölçümü sunar beri parçacık içselleştirilmesi analizi için flow sitometri için iyi bir alternatiftir. Fluorometri diğer katma faydaları, yüksek verimlilik ve etiketli içselleştirilmiş parçacıklar tarafından yayılan floresan ölçülmesi için yüksek verimlilik yetenekleri vardır. Fluorometri Faydaları fagositoz dışındaki süreçlerin ölçümü için çıkarım olabilir. Örneğin, florometrik analiz aktin polimerizasyonunda hücre içi ya da zar bağlı reseptör, hücre geçirgenliği / canlılığı, transfeksiyon etkinliği değişiklikler ve modülasyon ifadesi değişikliklere yol açan herhangi bir işlem çalışma uygulanabilir. Florometrik tekniğin bir dezavantajı kullanılan etiketlerin bağlı olarak, yüksek olabilir, yaniDeney genellikle kat değişikliği veya kontrolden oranında artış göreli miktar üzerinden veri, göstererek çözülebilir değişkenliği deneme.

<table><tbody><tr><td>1 &mu; m sarı-yeşil floresan Fluo-Küreler;</td><td>Moleküler Problar</td><td>F8852</td><td>50&mu'yu birleştirir; L 50&mu ile; l Kullanmadan önce 37 o C'de 30 dakika boyunca reaktifi</td></tr><tr><td>öldürün Isı öldürüldü E. coli Biyopartiküller floresein konjugatı</td><td>Moleküler Problar</td><td>E2861</td>, <td>50 & mu'da (5 mg) sulandırılır; l PBS ve 50 &mu ile birleştirin; l 37 ° C'de 30 dakika boyunca opsonizing reaktif; C kullanmadan önce</td></tr><tr><td>Opsonizing reaktif</td><td>Moleküler Problar</td><td>E2870</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine phalloidin</td><td>Moleküler Problar</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Tripan mavisi</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Aşağıdaki ürünler birçok markada mevcuttur, ancak bu çalışmada kullandığımız ürünler aşağıdaki üreticilerdendir:</td></tr><tr><td>RPMI Hücre büyüme ortamı</td><td>Gibco</td><td></td><td>%10 FBS ve %1 pennikilin / streptomisin ile desteklenmiş; 37 ° C'de sıcak; Kullanmadan önce C</td></tr><tr><td>Floresan plaka okuyucu - Fluostar Omega BMG</td><td>Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit (%16)</td><td>Fischer Scientific</td><td>AA433689M</td><td>kullanmadan önce %4'e seyreltin</td></tr><tr><td>96 oyuklu plakalar</td><td>Greiner</td><td>655097</td><td>şeffaf veya siyah veya şeffaf alt - siyah plakalar</td></tr><tr><td>Çok kanallı pipet (8 - 12 kanal)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reaktif rezervuarları</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrofüj tüpleri (0.6 ml)Konik</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>(10 ml)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

makrofaj fagositoz ve aktin polimerizasyon değerlendirme yüksek verimli florimetrik tekniği

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

flüorometrik analiz amacı fagositozunu ve diğer hücresel süreçleri analiz verimli, düşük maliyetli, yüksek verim yöntemi olarak hizmet etmektir. Bu teknik, hücre çeşitli özelliklerini incelemek için, yapışkan ve yapışkan olmayan, her iki hücre tipinde, çeşitli kullanılabilir. Fagositozu okuyan zaman flüorometrik tekniği gibi makrofajlar ve kimin floresan tripan mavisi varlığında sönmüş olabilir floresan etiketli opsonize edilmiş parçacıklar gibi fagositik hücre tiplerini kullanır. 96 oyuklu plakalar, floresan parçacıkların (yeşil veya kırmızı) yapışkan makrofaj kaplama izlenerek tatbik edilmektedir ve hücreler, zaman çeşitli miktarlarda fagosite izin verilir. Floresan parçacıkların içselleştirme sonra hücreler içsel olmayan, ya da sadece hücre yüzeyine yapışan bakterilerden floresan sinyalin yok olmasına olanak tripan mavisi ile yıkanır. Tripan yıkamayı takiben, hücreler, sabit, PBS ile yıkanır, birnd hücrelerin çekirdekleri etiketlemek için hizmet veren DAPI (nükleer mavi floresan etiket) ile boyandı. Levha çekirdek (mavi) okunması ya da bir parçacık içinde basit bir florometrik miktar olarak (kırmızı / yeşil) floresans yeşil nispi floresan birimlerinin oranı inceleyebilir: mavi ve hücre başına içsel floresan bakteri miktarının göstergesi olan bir fagositik endeksinin belirlenmesi. yıkama için 96 çukurlu bir yöntem ve çok kanallı pipet kullanılarak tahlil süresi, veri toplama sonuna fagositoz sonundan, 45 dakikadan daha azdır. Akış sitometrisi, benzer bir şekilde kullanılabilir, ancak fluorometri avantajı, yüksek verim, numune en az bir manipülasyon ve hücre başına floresan yoğunluğu hızlı ölçümü ile değerlendirme olarak hızlı bir yöntemdir edilebilir. Benzer stratejiler, esasen yapışkan hücreler, canlı etiketli bakteriler, aktin polimerizasyonu, ve floresan kullanılarak herhangi bir işlem uygulanabilir. Bu nedenle, fluorometri düşük maliyetli, yüksek throughp için umut verici bir yöntemdirhücresel süreçlerin çalışmada ut yetenekleri.

Bu protokol kullanılarak fagositozunu ve sonraki aktin polimerizasyonu miktarının iki önemli yolu, sürekli veya senkronize fagositoz gözlemlemektir. Mikroskopik analiz (Şekil 1B) florimetre kayıt ne karşılaştırılabilir floresan görüntüleri göstermektedir (ayrıca Diagram 1). Şekil 1B aktin kırmızı floresan, FITC yeşil floresan 268 HKOP E. etiketleri vardır coli, nükleer DAPI leke ve üç 269 birleştirilmiş görüntü bir araya flüoroforlar. Bu gö...

Burada, florometrik bir yöntem kullanarak yapışık makrofaj hücre hattı ile floresan parçacıkların fagositozunu ölçmek için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, partikül içselleştirmesinin yanı sıra ortaya çıkan aktin polimerizasyonunun yüksek verimli bir miktar tayinini kolaylaştırır.

Makrofaj Fagositoz ve Aktin Polimerizasyon Değerlendirme Yüksek Verimli Florimetrik Tekniği

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, fagositik süreçteki değişiklikleri ölçmek veya agonistlerin veya antagonistlerin eklenmesini takiben polimerizasyonda hareket etmektir. Bu, fagositik hücrelere floresan etiketli parçacıklar eklenerek ve fagositozun gerçekleşmesi için yeterli zaman tanınarak elde edilir. Fagositozu durdurmak için ikinci bir adım olarak, hücreler içselleştirilmemiş partiküllerin floresansını söndürmek için triam mavisi ile muamele edilir, yıkanır ve daha sonra paraaldehit ile sabitlenir.Sıradaki boyama ve nicelleştirmedir. Hücrelerin ve partiküllerin, DPI veya aktin ile sürdürülen hücrelerin floresan tespitini kolaylaştırmak için, sonuçlar, floro metrik analizine dayalı olarak yeşil kırmızı floresan ile mavi arasında bir oran ile ölçüldüğü üzere tedavinin fagositoz ve aktin polimerizasyonu üzerindeki etkisini göstermektedir. Florometrik tekniğin mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, fagositozun değerlendirilmesi için yüksek verimli ve uygun maliyetli bir yöntem olmasıdır.Minimum numune manipülasyonuna ve hücre başına floresan yoğunluğunun hızlı bir şekilde ölçülmesine izin verir. Bu yöntem, immünoloji ve hücre biyolojisi alanında, bu patojen klirensinin ne kadar etkili ve ne kadar hızlı olduğu gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Fagositoz sırasında değişen aksiyon polimerizasyonu ve agonistler veya antagonistler tarafından nasıl modüle edilen fagositoz veya akson polimerizasyonu.Prosedür plakasına başlamak için, berrak veya siyah bir tabana sahip 96 oyuklu bir plakadaki Murin J 7 74 hücre hattından gelen makrofajlar, plakaya adion sağlamak için yapışma hücrelerini bir ila iki saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe eder. Daha sonra istenen agonistleri veya antagonistleri veya araç kontrolünü 50 mikrolitre PBS veya takviye edilmiş ortamda iki x konsantrasyonda hücrelere ekleyin ve istenen bir süre boyunca inkübe edin. Bu adımda, floresan parçacıklarının ve etiketlerin işleme, yıkama ve inkübasyon sırasında her zaman ışıktan korunduğundan emin olun.Foto ağartmayı önlemek için, floresan etiketli dextra boncuklar gibi partikülleri süspansiyon halinde kullanmak için orex stok solüsyonunu bir dakika boyunca kullanın. Daha sonra, floresan parçacıklarına eşit miktarda opsonize edici reaktif ekleyin ve bir dakika daha kuvvetlice girdap yapın. Daha sonra, karışımı bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin, inkübasyon santrifüjünü takiben parçacıklar beş dakika idi.500 kez G. Aşırı opsonizing reaktif içeren S süpernatanı çıkarın. Bundan sonra, parçacıkları 100 mikrolitre PBS ile yıkayın. Peletleri yeniden süspanse etmek için numuneyi girdaplayın ve beş dakika boyunca 500 ila kez santrifüjleyin G. Bağlanmamış antikorun uygun optimizasyonunu ve çıkarılmasını sağlamak için bu adımları iki kez daha tekrarlayın.İyonize parçacıkların çalışma çözeltisini hazırlamak için, parçacıkları beş mililitre ortamda yeniden süspanse edin. Daha sonra tekrar kullanana kadar ışıktan uzakta saklayın. Şimdi parçacıkların çalışma çözeltisini steril bir reaktif rezervuarına yerleştirin.Daha önce hazırlanan hücrelere mililitre başına 15 nanogramlık bir nihai konsantrasyona 50 mikrolitre opsonize partikülü ekleyin ve fagositozun standart hücre kültürü koşullarında gerçekleşmesine izin verin. Sürekli fagositoz yöntemi için, floresan parçacıklarının kuyunun dibine ulaşması ve hücrelerle temas etmesi için 30 dakika ila bir saat bekleyin. Bir zaman rotası deneyi yapıyorsanız, farklı zaman aralıklarında bakteri ekleyin ve tüm reaksiyon plakasını aynı anda durdurun.Yapışma hücreleri için işlem hızını arttırmak için, sinameki çıkarın ve trian inkübasyonunu takiben içselleştirilmemiş bakterilerin floresansını söndürmek için PBS ile 50 mikrolitre seyreltilmiş triam mavisi ekleyin. Kalan trian'ı çıkarmak için plakayı PBS ile iki kez yıkayın. Daha sonra, hücreleri 50 mikrolitre% 4 paraldehit ile sabitleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.Ardından plakayı PBS ile yıkayın. Tüm sıvıyı çıkarın ve 50 mikrolitre DPI ekleyin Beş dakikalık boyamadan sonra, plakayı PBS ile iki kez yıkayın. Daha sonra, her oyuğa 50 mikrolitre PBS ekleyin ve paraaldehit fiksasyonunu takiben fagositozu kaydedin.Plakayı her yıkama için kuyucuk başına 100 mikrolitre PBS ile iki kez yıkayın. Daha sonra hücrelere nüfuz etmek için PBS'de 50 mikrolitre% 0.1 Triton X 100 ekleyin ve oda sıcaklığında üç ila beş dakika inkübe edin. Ardından, %0.1 Triton X'i PBS ile iki kez yıkayın.Ardından, etiketin spesifik olmayan şekilde bağlanmasını önlemek için hücreleri 20 dakika boyunca %1 BSA ile bloke edin. Şimdi beş mililitre PBS'ye 100 mikrolitre metanol stok çözeltisi ekleyerek Çubuk domine boyasının çalışma çözeltisini hazırlayın. Engellemenin ardından BSA solüsyonunu hemen çıkarın.Her oyuğa 50 mikrolitre rumin foid ve çalışma solüsyonu ekleyin ve hücreleri karanlıkta 20 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Fagositozu ölçmek için, plakayı bir floresan plaka okuyucusuna yerleştirin 488 nanometre dalga boyunda bir uyarma filtresi ve 518 nanometre dalga boyunda bir emisyon filtresi kullanarak yeşil floresan ve 355 nanometre dalga boyunda bir uyarma filtresi kullanarak mavi floresan ve 460 nanometre dalga boyunda bir emisyon filtresi kullanın. Bir floresan plaka okuyucu kullanarak aktin polimerizasyonunu ölçmek için, 584 nanometre dalga boyunda bir uyarma filtresi ve 620 nanometre dalga boyunda bir emisyon filtresi ve mavi floresan aracılığıyla kırmızı floresan kaydedin.355 nanometre dalga boyunda yangın ve uyarma filtresi ve 460 nanometre dalga boyunda emisyon filtresi. Daha sonra, yeşil veya kırmızı floresanın toplam RFU'sunu, partikül etiketine veya yüksek plaka nedeniyle fagositik ve aktin kantitasyonuna bağlı olarak mavi floresan okumasına bölün. Varyansı ölçmek için, gözlemlenen eğilimleri en iyi şekilde göstermek ve daha güvenilir istatistiksel analizi kolaylaştırmak için göreceli indeksleri kullanın.Bu görüntü, inhibitör ilavesini takiben aktin polimerizasyonundaki değişiklikleri göstermektedir. Bunlar psödopodia oluşumudur ve işte zar fırfırlamasındaki değişiklikler. Bu görüntüde, hücrelerin 60 dakika boyunca 20'ye bir boncuk / hücre oranında fitzy konjuge X boncuklarını içselleştirmesine izin verildi.Daha sonra hücreler, paraldehit ile sabitlenmiş, aseton ile geçirgen olan ve F aktin için leke olan trian ve PBS ile yıkanacaktır Çubuk domin, F loin ve dpi kullanılarak, opsonize ve oksitlenmemiş parçacıkların sürekli fagositozu oldukça karşılaştırılabilir. J 7 74 hücrelerinin dextra boncukları içselleştirdiği yer. İlginç bir şekilde, fagositozu takiben aktin polimerizasyonu artar, daha sonraki zaman noktalarında yavaşlarken, unop partiküllerinin içselleştirilmesini takiben aktin polimerizasyonu, dextra partikülleri kullanan fagositik yöntemlerin hiçbirini artırmaz, hücre canlılığında değişikliklere neden olur Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, uygun şekilde gerçekleştirilirse, bir seferde birden fazla plaka ile bir ila iki saat içinde yapılabilir.Bu videoyu izledikten sonra, fagositoz ve diğer hücresel süreçleri analiz etmek için verimli, uygun maliyetli, yüksek verimli bir yöntem olarak Flor metrik analizinin nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.

high-throughput-fluorometric-technique-for-assessment-macrophage

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu videoda, floresan tabanlı transwell makrofaj etkileşim testi kullanarak tümör-makrofaj etkileşimini inceliyoruz. Tahlil, makrofajların kimyasal kaynaklı kemotaksis yoluyla göçünün analizini içerir.

Floresan Bazlı Transwell Makrofaj Çekim Testi: Kimyasal Kaynaklı Kemotaksis Yoluyla Tümör-Makrofaj Etkileşimini İncelemek İçin İn Vitro Bir Yöntem

Toplam iç yansıma floresan mikroskobu kullanarak, canlı makrofajlarda eşi benzeri görülmemiş yüksek çözünürlüklü fagozom oluşumunu ve kapanışını üç boyutta görselleştirmek için bir deney düzeneği tanımlıyoruz. Fagositik kabın tabanının, uzayan psödopodların ve ayrıca fagozom kesilmesinin kesin yerinin izlenmesine izin verir.

&quot;Fagozomun Kapatma Deneyi&quot; kullanma Üç Boyutta fagozomun Formasyonu Visualize&#39;a Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu (TIRFM)

Burada dönen disk confocal mikroskobu görüntüsü tek fagositik olayları için fare ikamet periton makrofajlar tarafından kullanma yöntemleri açıklanmaktadır. İletişim kuralları diğer fagositik hücreler için genişletilebilir.

Fagositoz fare makrofajlar tarafından hızlandırılmış 3D görüntüleme

Biz nasıl sıkı BAĞLAMAK ve photoactivation gibi mikro - ve photomanipulation teknikleri hareketliliği parametreleri belirlenmesi etkinleştirmek ve proteinler geçiş içinde kronolojik zamanmekansal dinamikleri hücreleri tanımlamak. Deneysel veriler hücre altı dinamikleri ve ciro hareketliliği düzenleyiciler veya temel aktin sitoiskeleti içerir.

Morfogenetik dinamiklerini analiz ve hücre iskeleti düzenleyiciler ciro sağlayan Embriyolardan teknikleri

Efferocytosis, apoptotik hücreler, fagositik kaldırılması homeostazı korumak için gerekli ve reseptörleri ve tanıma, engulfment ve apoptotik hücreler içselleştirilmesi için izin sinyal yollar tarafından yönetilir. Burada, biz efferocytosis miktar ve efferocytic sinyal yolları etkinlik için bir floresans mikroskobu Protokolü mevcut.

Efferocytosis tek hücreli floresans mikroskobu tarafından miktar

Burada, fare peritoneal makrofaj fagositoz gelişmiş yeşil floresans Escherichia coliprotein ifade kullanarak değerlendirmek için bir protokol mevcut.

Yeşil floresans Protein-ifade gelişmiş kullanma fare Peritoneal makrofaj fagositoz değerlendirmek için Escherichia Coli

Nörodejeneratif hastalıklar düzensiz mikroglia fonksiyonları ile ilişkilidir. Bu makalede, iPSC-makrofajlar tarafından nöroblastom hücrelerinin fagositozunun in vitro bir tahlili özetlenen bir makale verilmiştir. Nicel mikroskopi okumaları hem canlı hücre zaman atlamalı görüntüleme hem de sabit hücreli yüksek içerikli görüntüleme için açıklanmıştır.

İPSC-Makrofajlar tarafından Ölü Nöroblastom Hücrelerinin Fagositozu için İn vitro Nicel Görüntüleme Tahlili

Kemirgenlerin ve insan deneklerin beyin dokularından alınan ex vivo biyolojik örneklerde aksin filamentlerinin nicelleştirilmesi için basit, zaman verimli ve yüksek verimli floresan spektroskopi tabanlı bir tahlil rapor ediyoruz.

Kemirgen ve İnsan Beyin Dokularında Aktüer Polimerizasyon Durumunu Değerlendirmek için Zaman Verimli Floresan Spektroskopi Tabanlı Bir Tahlil

Burada sunulan, pH'a duyarlı bir floresan moleküle konjuge edilen opsonize olmayan maya (zymosan) parçacıklarının makrofaj (MΦ) fagositozunun mezenkimal kök hücre (MSC) aracılı regülasyonunun dinamik görüntülerini ölçmek ve üretmek için bir protokol sunulmaktadır.

Makrofaj Fagositozun Mezenkimal Kök Hücre Regülasyonu; Nicellik ve Görüntüleme

Çok kuyulu mikro plakalar kullanan otomatik tahliller, tek bir deneyde çok sayıda koşulun değerlendirilmesine izin vererek yol düzenleyicilerini tanımlamak için avantajlı yaklaşımlardır. Burada, köklü makropinozom görüntüleme ve niceleme protokolünü 96 kuyulu bir mikro plaka formatına uyarladık ve çok modlu bir plaka okuyucu kullanarak otomasyon için kapsamlı bir anahat sağladık.

Floresan Etiketli Makropinozomların Nicelleştirilmesi için Otomatik Görüntüleme ve Analiz

Öğrenin makrofaj fagositoz ve aktin polimerizasyon değerlendirmesi için yüksek verimli florimetrik teknik. Bu yöntem, immünoloji ve hücre biyolojisi araştırmalarında hızlı ve maliyet etkin niceliksel analiz sağlar.

Makrofaj Fagositoz ve Aktin Polimerizasyon Değerlendirme Yüksek Verimli Florimetrik Tekniği

Daha fazla video keşfet