Name: Periyodik Asit Schiff Boyama ile periferik kan mononükleer hücreleri glikojen algılama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Öğrenin, periferik kan mononükleer hücrelerde glikojen içeriğini görselleştirmek için periyodik asit Schiff boyama yöntemini. Bu teknik, immün hücrelerin polisakkarit bileşimini anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma, NSERC Keşif programı hibe numarası RGPIN 418522-2013'ten alınan bir hibe ile desteklenmiştir. Yararlı tartışmalar için R. Kilgour'a ve fare kas bölümlerini sağladıkları için Katelin Gresty ve Dr. A. Berghdal'a teşekkür ederiz.

İnsan kan örnekleri ile Araştırma Concordia Üniversitesi Etik Değerlendirme Kurulu, sertifika numarası 10000618. tarafından Concordia Üniversitesi Etik Değerlendirme Kurulu, sertifika numarası 2010BERG tarafından onaylanan fare kas çalışmalarını kabul edildi. Tüm Blood 1. PBMC İzolasyon NOT: Steril teknik ve üretici-sterilize ekipmanı kullanarak bir biyogüvenlik kabini bu prosedürü gerçekleştirin. <ol><li> Dikkatli bir şekilde 50 ml steril konik tüp içine heparinize (anti-koagülant), kan toplama tüpleri tam kan 10-15 ml dökün. Küçük kan dökülmeleri için, temizlik bezi kullanarak GKD 2 O ve% 70 EtOH ile silin. </li><li> Fosfat tamponlu salin (PBS 1x), pH 7.4 ile 1: 1 oranında, konik bir tüp içinde kan seyreltin. Maksimum toplam hacim 30 ml aşmayacak emin olun. </li><li> Hafifçe kabarcıklar kaçınarak bir serolojik pipet tabancası kullanarak karıştırın. NOT: Kan a önlemek için tüp tersini KARIŞTIRMAYINIZSantrifüj sırasında kapak ve daha sonra sızma olarak ccumulation. </li><li> Yeni 50 ml kapasiteli konik tüp, Ficoll Paque 13 ml (Malzemeler ve Ekipmanları tabloya bakınız) ekleyin. Rafa tüp dik tutun. </li><li> Bir transfer pipet kullanarak, sulandırılmış kan almak tepesine yakın tüpün iç duvarına aktarım pipet dokunun. Yavaş ve sabit bir basınç ile, sukroz tabakanın üstünde kan tabakayı oluşturan borunun iç duvarı boyunca kan aktarın. Tüm kan transfer olmuştur kadar bu adımı birkaç kez yapın. </li><li> Sıkıca tüp Cap ve 5 orta hızlanma seti ile bir salıncak rotor 700 xg&#39;de 30 dakika oda sıcaklığında santrifüj tüpü, ve yavaşlama SIFIR ayarlanır. </li><li> Yavaşça tüp almak ve katmanları bozmadan, biyogüvenlik kabini onu geri almak. </li><li> Dikkatle PBS / plazma a arasına yerleştirilen PBMCler bulunduğu buffy coat (ince bulutlu beyaz tabaka), toplamaknd fikol tabakalar Bir transfer pipeti kullanarak. Sakaroz tabakası toplama kaçının ve kırmızı kan hücresi katmanı rahatsız etmeyin. </li><li> Yeni 50 ml steril konik tüp içine buffy coat aktarın. Tüm PBMC&#39;yi toplamak için adım 1.8 tekrarlayarak birkaç kez alabilir. </li><li> PBMC ile tüp PBS pH 7.4 ekleyin ve 45 ml işaretine kadar doldurun. Iyice tüp sallayın. Vorteks etmeyin. </li><li> 1 yıkayın: Santrifüj 15 dakika konik tüpün dibinde PBMC&#39;lerin bir pelet oluşumunu gözlemleyin 9&#39;a ayarlanmış maksimum hızlanma ve yavaşlama hem 480 xg&#39;de. </li><li> Ağartıcı 10 ml bir plastik geniş şişenin içine PBS (süpernatant) atın. </li><li> Hafifçe dalgalı bir yüzeye (yani, boş raf) karşı &quot;bozucu&quot; hücre pelet gevşetin. Vorteks etmeyin. </li><li> Tüpüne taze PBS pH 7.4, 25 ml ilave edilir. Birden fazla tüp işlenirken, bu aşamada topaklan bir arada havuz. </li><li> 2 yıkayın: santrifüj tüpüne 12 dakika için 480 xg wi9 ayarlanan maksimum hızlanma ve yavaşlama hem de inci. </li><li> Çamaşır suyu bir sıçrama ile plastik beher içine PBS (süpernatant) atın. </li><li> Bir dalgalı bir yüzeye (yani, boş raf) karşı yavaşça &quot;raf&quot;. Vorteks etmeyin. </li><li> Tüpüne taze PBS 25 ml ilave edilir. <ol><li> Hücrelerin 50 ul çıkarın ve canlılık saymak için bir mikrosantrifüj tüp içine aktarın. </li><li> Tripan mavisi (bir canlılık leke) ve pipet kadar eşit miktarda (50 ul) ekleyin ve yavaşça karıştırın. </li></ol></li><li> 10 ul çıkarın ve ml başına hücre canlılığı kontrol etmek için bir hemositometrede transfer. Hücre / ml sayısını kaydeder. </li><li> Hücrelerin istenilen miktarda çıkarın ve 9 ayarlanan maksimum hızlanma ve yavaşlama hem 480 xg&#39;de 12 dakika santrifüj tüpü. </li><li> Ağartıcı ile çanak içine PBS (süpernatant) atın. </li><li> Bir dalgalı bir yüzeye (yani, boş raf) karşı yavaşça &quot;raf&quot;. 8 EkleTüpüne PBS 0 ul. </li></ol> 2. PBMC Slide yapma <ol><li> Bir mikroskop lamı üzerine hücreler 80 ul koyun. Başka bir sürgü yardımı ile damla yayma ya da sürgünün her iki ucunda 40 ul, her 2 damla yerleştirin. </li><li> Kuruması için biyolojik güvenlik kabininde slayt bırakın. Buzlu tarafında bir kalem ile slayt etiketleyin. </li></ol> 3. Slaytlar üzerinde Örnekleri Tespit <ol><li> 4.5 ml% 99 etanol,% 37 formaldehid 0.5 ml karıştırılarak sabitleyici çözelti hazırlayın. </li><li> Slaytlar kurutulur sonra, taze yapılmış fiksatif solüsyonu 2 ml çıkar ve slayt tüm yüzeyi kaplı olduğunu, böylece slayt üzerine dökün. </li><li> 1 dakika slayt üzerinde çözüm bırakın. Musluk suyu ile 1 dakika boyunca slayt durulayın ve kurumaya bırakın. </li></ol> 4. Negatif Kontrol Amilaz Çözüm yapma <ol><li> Amilaz toz 0.25 g almak ve di 50 ml içinde çözülürstilled su. Temiz bir 100 ml beher çözüm dökün. </li><li> Sürgünün yarısı muameleye tabi tutulur ve diğer yarısı tedavi edilmezse, ve daha sonra oda sıcaklığında (Şekil 1 C) &#39;de 15 dakika boyunca inkübe yani beher içinde slayt bırakın. </li><li> Slayt yan amilaz tedavi olduğu not edin. Tedavi ve kontrol arasındaki sınırı gösteren slayt arkasında bir çizgi çizin. </li><li> Amilaz çözüm kaldırmak ve kuru hava slayt bırakmak GKD 2 O slaytlar yıkayın. </li></ol> 5. Periyodik Asit Schiff (PAS) Boyama ve Görüntüleme gerçekleştirin NOT: PAS reaktifler Teneffüs yoluyla toksik ve korozif, bu yüzden adımlar kimyasal davlumbaz yapılması gereken, ve atık ürünleri düzgün kurumsal kurallarına göre imha edilmelidir. <ol><li> Düz bir yüzeye yerleştirin ve slayt örnek üzerinde Periyodik Asit Çözüm 1,50-2,00 ml dökün. Doğmuş iyileşmesiniOda sıcaklığında 5 dakika boyunca te. </li><li> Distile su birkaç ücretleri slaytlar durulayın. </li><li> Slayt Schiff reaktifi 1,50-2,00 ml dökün ve 15 dakika için oda sıcaklığında inkübe edilir. </li><li> 5 dakika distile su ile yıkayın ve slayt kuru hava bırakın. </li><li> Slaytta 10 ul montaj medya uygulayın ve iki küçük lamelleri ile kaplayın ya da 50 ul uygulamak ve büyük bir lamel kullanın. </li><li> Lamel kenarlarında açık oje uygulayın, kuru gecede izin. </li></ol> 6. 100X Amaç kullanma Dürbün Işık Mikroskobu ile Görüntüler elde

<ol><li>Rich, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+machinery+of+keilin%27s+respiratory+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Soc.+Trans%22%5BJournal%5D)">The molecular machinery of keilin's respiratory chain.</a> Biochem. Soc. Trans. 31 (Pt 6), 1095-1105 (2003).</li>
<li>Peter, J. B., Barnard, R. J., Edgerton, V. R., Gillespie, C. A., Stempel, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+profiles+of+three+fiber+types+of+skeletal+muscle+in+guinea+pigs+and+rabbits%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Metabolic profiles of three fiber types of skeletal muscle in guinea pigs and rabbits).</a> Biochemistry. 11 (14), 2627-2633 (1972).</li>
<li>Jones, R. V., Goffi, G. P., Hutt, M. S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+glycogen+content+in+various+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte glycogen content in various disease.</a> J. Clin. Pathol. 15 (1), 36-39 (1962).</li>
<li>Scott, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+in+human+peripheral+blood+leukocytes.+I.+characteristics+of+the+synthesis+and+turnover+of+glycogen+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Glycogen in human peripheral blood leukocytes. I. characteristics of the synthesis and turnover of glycogen in vitro.</a> J. Clin. Invest. 47 (2), 344-352 (1968).</li>
<li>Fedele, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((positive+index+of+lymphocytes+and+metabolic+control+in+insulin-treated+and+type+II+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Diabete+Metab%22%5BJournal%5D)">positive index of lymphocytes and metabolic control in insulin-treated and type II diabetes mellitus.</a> Diabete Metab. 9 (3), 188-192 (1983).</li>
<li>Brelińska-Peczalska, R., Mackiewicz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochemical+studies+of+peripheral+blood+granulocytes+and+lymphocytes+in+patients+with+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Pol.Med.Sci.Hist.Bull%22%5BJournal%5D)">Cytochemical studies of peripheral blood granulocytes and lymphocytes in patients with systemic lupus erythematosus.</a> Pol.Med.Sci.Hist.Bull. 15 (2), 231-234 (1976).</li>
<li>Yunis, A. A., Arimura, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymes+of+glycogen+metabolism+in+white+blood+cells.+I.+glycogen+phosphorylase+in+normal+and+leukemic+human+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%2C+Res%22%5BJournal%5D)">Enzymes of glycogen metabolism in white blood cells. I. glycogen phosphorylase in normal and leukemic human leukocytes.</a> Cancer, Res. 24, 489-492 (1964).</li>
<li>Hagemans, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAS-positive+lymphocyte+vacuoles+can+be+used+as+diagnostic+screening+test+for+pompe+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Inherit.+Metab.+Dis%22%5BJournal%5D)">PAS-positive lymphocyte vacuoles can be used as diagnostic screening test for pompe disease.</a> J. Inherit. Metab. Dis. 33 (2), 133-139 (2010).</li>
<li>Totsuka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+performance+and+soleus+muscle+fiber+composition+in+wild-derived+and+laboratory+inbred+mouse+strains%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Physical performance and soleus muscle fiber composition in wild-derived and laboratory inbred mouse strains.</a> 95 (2), 720-727 (2003).</li>
<li>Murat, J. C., Serfaty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+enzymatic+determination+of+polysaccharide+%28glycogen%29+content+of+animal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Simple enzymatic determination of polysaccharide (glycogen) content of animal tissues.</a> Clin. Chem. 20 (12), 1576-1577 (1974).</li>
<li>Arrizabalaga, O., Lacerda, H. M., Zubiaga, A. M., Zugaza, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rac1+protein+regulates+glycogen+phosphorylase+activation+and+controls+interleukin+%28IL%29-2-dependent+T+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Rac1 protein regulates glycogen phosphorylase activation and controls interleukin (IL)-2-dependent T cell proliferation.</a> J. Biol. Chem. 287 (15), 11878-11890 (2012).</li>
<li>Pelletier, J., G, J., Mazure, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+titration+of+glycogen+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.Vis.Exp%22%5BJournal%5D)">Biochemical titration of glycogen in vitro.</a> J.Vis.Exp. (81), (2013).</li>
<li>Roach, P. J., Depaoli-Roach, A. A., Hurley, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tagliabracci+V.S.+Glycogen+and+its+metabolism%3A+Some+new+developments+and+old+themes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.J%22%5BJournal%5D)">Tagliabracci V.S. Glycogen and its metabolism: Some new developments and old themes.</a> Biochem.J. 441 (3), 763-787 (2012).</li>
<li>Salmoral, E. M., Tolmasky, D. S., Krisman, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+the+presence+of+glycogen+in+rat+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.Biol%22%5BJournal%5D)">Evidence for the presence of glycogen in rat thymus.</a> Cell Mol.Biol. 36 (2), 163-174 (1990).</li>
<li>Darlington, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diminished+Th17+%28not+Th1%29+responses+underlie+multiple+sclerosis+disease+abrogation+after+hematopoietic+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.Neurol%22%5BJournal%5D)">Diminished Th17 (not Th1) responses underlie multiple sclerosis disease abrogation after hematopoietic stem cell transplantation.</a> Ann.Neurol. 73 (3), 341-354 (2013).</li>
<li>Multiple Sclerosis International Federation Atlas of MS. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.atlasofms.org">http://www.atlasofms.org</a> (2013).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Bu video makalede kritik adım hücrelerin yıkanması ve amilaz işlemi sırasında idi. Slaytlar yıkarken önemli bir adım bir plastik sıkılabilir yıkama şişesi kullanarak ve su yavaşça slayt üzerinde numune üzerinden çalıştırmak izin ve örneklerin doğrudan hedefleyen değildi. Hatta ufak doğrudan su basıncı slayt dökülmek hücreleri neden olur. Bir başka önemli adım ± amilaz koşulları için aynı slayt kullanmak oldu. PBMC slayta yapıştırılmış sonra, dikkatli bir şekilde kayar, böylece yayma sadece yarısı amilaz çözeltisine maru...

Periyodik asit Schiff (PAS) boyama yaygın kas araştırma ve teşhis kullanılan bir immunohistokimyasal tekniktir. Aynı zamanda kan örnekleri üzerinde bir teşhis aracı olarak kullanılır. tekniği renksiz Schiff reaktifi böylece derin bir kırmızı ürünü üreten tepki polisakkarit oluşturarak aldehit grupları içinde birimler okside numune, periyodik asit çözeltisi uygulayarak çalışır. Bu işlem aşamaları, Şekil 1 'de gösterilmiştir. leke glikojen, glikoproteinler, glikolipidler, müsin veya polisakarit parçası ile diğer moleküller de dahil olmak üzere polisakaritler, kırmızı, herhangi bir şey döner. PAS boyama, genellikle kas lifleri glikojen seviyelerini ölçmek için kullanılır. Kaslar doku bölümleri onlar sıkıca slayt eklemek ve çoklu yıkama ve boyama aşamaları dayanacak gibi tekniği için idealdir. Glikojen yüksek bir talep var Tip II kas lifleri, hızlı seğirme en mevcutMaksimum performans için 1,2 glikojen gerektiren hızlı ATP üretimi için. Glikojen glikojen fosforilaz enzimlerinin hareketiyle serbest glukoz ayrılabilir bir glikoz dallı bir polimerdir. Dinlenme ve beslenme yeterliliği zamanlarda, glikojen, glikojen depo sürecinde doldurulan ise beslenme yetersizliği veya yüksek-enerji talebi zamanlarında; glikojen glikojenoliz tarafından glikoz bölünür. Kan örneklerinde olduğu gibi erken 1950 en klinisyen bilim adamları araştırdı gibi PAS boyama çeşitli hastalıklarda 3-7 glikojen içeriğini analiz etmek. Örneğin, Pompe hastalığı bir bonafide glikojen depolama hastalıksız beyaz kan hücreleri sağlıklı kontrollerden 8 önemli ölçüde farklıdır glikojen büyük miktarlarda birikir. Bu video-madde periferal kan tek-çekirdekli hücrelerinin (PBMC) sağlıklı bir insan deneklerin venöz kan numuneleri kullanmak için PAS boyanması uyarlanmış bir versiyonunu gösterir. PBMCs örneğin doğal katil hücreler ve monositler gibi T lenfosit ve B lenfosit ailesine ve diğer bağışıklık hücrelerinin, çoğunlukla lenfositler içerir. İlk saflaştırma adımı, eritrositleri, nötrofiller ve diğer granülositler kaldırır. Bu teknik, tam kan smear ile karşılaştırıldığında PAS pozitif hücrelerin daha güçlü sayımı için izin lenfositlerin konsantre oranı ilgili verileri sağlar. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52199/52199fig1highres.jpg"> Şekil 1:. PBMC PAS boyama aşaması yöntem vasıtasıyla, aşama (a) İlk olarak, PBMC izole Ficoll gradyanı ile elde edilir, Sol panel, santrifüj işleminden önce hazırlanışını göstermektedir, sağ panel santrifüj sonra gösterilmekte olup, burada PBMC içeren ince beyaz tabaka tüpün merkezinde görülmektedir. (B) izole edilmiş PBMC, formalinle etanol sabitleyici Solu kullanılarak slayt üzerine sabitleniryon. Slayt hafifçe plastik bir yıkama şişesinden damıtılmış su ile iyice durulanır. (C), Lam, daha sonra glikojen eriyecektir amilaz çözeltisi ile doldurulmuş 100 ml'lik bir beher yarım, yerleştirilir. Slayt hafifçe çalkalanır. (D) slayt sakarit oksidasyon meydana periyodik asit çözeltisi ile muamele edilir. Slaytlar hafifçe durulanır; bu fazla periyodik asit çıkarın ve oksidasyon aşamasını durur. (E) Schiff reaktif slaytlara eklendi, bu oksitleme adımı sırasında oluşturulan aldehit ile reaksiyona girer. Bu, renksiz bir reaktif maddesi daha sonra, bir koyu kırmızı eflatun bir ürün ile sonuçlanır. Slaytlar hafifçe fazla Schiff reaktifi kaldırmak için durulanır.

<table><tbody><tr><td>Periyodik Asit Schiff Kiti</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/395b?lang=en&amp;amp;region=CA" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma-Aldrich</a></td><td>395B</td><td>Kullanmadan önce oda sıcaklığına getirin. Bu kit içindeki malzemeler toksik ve zararlıdır. Dikkatli kullanın.</td></tr><tr><td>Domuz pankreasından &amp;alpha;-Amilaz</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a3176?lang=en&amp;amp;region=CA" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma-Aldrich</a></td><td>A3176</td><td></td></tr><tr><td>Binoküler Mikroskop</td><td>Carl Zeiss Microscopy</td><td>Axio Lab A0</td><td></td></tr><tr><td>Glikojen Analiz Kiti</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/mak016?lang=en&amp;amp;region=CA" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma-Aldrich</a></td><td>MAK016</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td><a href="https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?product_id=4779441" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> VWR, GE Healthcare</a></td><td>17-1440-02</td><td>Sükrozun noniyonik sentetik polimeri.</td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td></td><td></td><td>PBMC izolasyonu için açılı rotor (swing bucket) kullanılmıştır.</td></tr></tbody></table>

periyodik asit schiff boyama ile periferik kan mononükleer hücreleri glikojen algılama

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Periyodik asit Schiff (PAS) boyama, kas biyopsilerinde ve kan örnekleri için bir tanı aracı olarak kullanılan immünohistokimyasal bir tekniktir. Glikojen, glikoproteinler ve glikolipidler gibi polisakkaritler, parlak macentayı lekeleyerek doku içindeki pozitif ve negatif hücrelerin numaralandırılmasını kolaylaştırır. Kas hücrelerinde PAS boyama, farklı kas hücresi tiplerindeki glikojen içeriğini belirlemek için kullanılırken, kan hücresi örneklerinde PAS boyama, çeşitli durumlar için bir tanı aracı olarak araştırılmıştır. Kan, bağışıklık sistemine ait beyaz kan hücrelerinin bir kısmını içerir. Bağışıklık sistemi hücrelerinin glikojene sahip olduğu ve onu bir enerji kaynağı olarak kullandığı fikri geniş çapta araştırılmamıştır. Burada, insan venöz kanından periferik kan mononükleer bağışıklık hücrelerine uygulanabilen PAS boyama protokolünün uyarlanmış bir versiyonunu açıklıyoruz. PAS pozitif granüllü küçük hücreler ve diffüz PAS boyaması olan daha büyük hücreler gözlendi. Numunelerin amilaz ile muamele edilmesi, lekenin özgüllüğünü doğrulayarak bu kalıpları iptal eder. Enzimatik sindirime dayalı alternatif bir teknik, numunelerdeki glikojenin varlığını ve miktarını doğruladı. Bu protokol, kan kaynaklı lenfositlerde polisakkarit içeriğini inceleyen hematologlar veya immünologlar için yararlıdır.

Reaktifler ve temel tekniği doğrulamak için, PAS boyama fare soleus kas bölümlerinde üreticinin talimatlarına göre yapıldı. boyama kurban aynı gün yapıldı ve boyama son adımda, bölümler ksilen ile tespit edildi. Soleus Kas ~% 35 glikojen-pozitif hücrelerin 9 ihtiva ettiği bilinmektedir. lekeli, kas hücreleri, hücre içinde iki farklı PAS pozitif özellikleri-noktalı granüller görüntülenir ve hücre zarı (Şekil 2A) demarking işlem kesintisiz bir hat. noktalı granüllerin varlığının glikojen depola...

Periyodik asit Schiff boyama, dokuların polisakkarit içeriğini görselleştiren bir tekniktir. Bu makale, insan venöz kanından saflaştırılmış periferik kan mononükleer hücrelerinde kullanılmak üzere uyarlanmış periyodik asit Schiff boyama protokolünü göstermektedir. Bu tür örnekler, lenfositler ve bağışıklık sisteminin diğer beyaz kan hücreleri için zenginleştirilmiştir.

Periyodik Asit Schiff Boyama ile periferik kan mononükleer hücreleri glikojen algılama

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Bu prosedürün genel amacı, periferik kan mononükleer hücrelerinin glikojen içeriğini görselleştirmektir. Bu, ilk olarak yoğunluk gradyan santrifüjlemesi kullanılarak insan tam kanından P BMC'lerin izole edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, kan hücrelerini bulaştırarak veya pipetleyerek numune slaytları hazırlamak ve daha sonra bunları fiksatif solüsyon ile muamele etmek ve ardından negatif kontrol için yıkamaktır.Slaytın yarısı, glikojen polimerlerini çözen amilaz çözeltisine daldırılır ve ardından bir yıkama yapılır. Şimdi numuneler periyodik asit çözeltisi ile boyanır ve ardından bir yıkama yapılır. Son adım, vardiyanın reaktifini eklemek ve ardından bir yıkamadır.Sonuç olarak, hücrelerin içindeki glikojen depolarını göstermek için ışık mikroskobu kullanılır. Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, tam kan boyamaya kıyasla slayt başına daha fazla mononükleer hücre bulunmasıdır. Bu nedenle, nötrofiller ve kırmızı kan hücreleri olmadığı için glikojen içeriğini ve lenfositleri analiz etmek daha verimlidir.Bu işleme bir biyogüvenlik kabininde başlamak için, heparinize kan alma tüpünden 10 ila 15 mililitre tam kanı dikkatlice 50 mililitrelik steril bir konik tüpe aktarın. Daha sonra, kanı PBS one X'te pH 7.4'te bire bir oranında seyreltin ve maksimum toplam hacmin 30 mililitreyi geçmediğinden emin olun. Serolojik bir pipet tabancası kullanarak nazikçe karıştırın ve kabarcık oluşturmaktan kaçının.Daha sonra 13 mililitre iyonik olmayan sentetik sükroz polimeri, FICO'yu yeni bir 15 mililitrelik konik tüpe aktarın. Daha sonra, FICO tabakasının üstünde bir kan tabakası oluşturmak için seyreltilmiş kanı yavaş ve sabit bir basınçla ekleyin. Tüm kan transfer edilene kadar bu adımı birkaç kez gerçekleştirin.Daha sonra, tüpü sıkıca kapatın ve oda sıcaklığında 400 Gs'de 30 dakika santrifüjleyin, bundan sonra tüpü yavaşça çıkarın ve biyogüvenlik kabinine geri aktarın. Daha sonra, pbmc'nin bulunduğu PBS plazma ve FICO katmanları arasındaki buffy kaplamayı dikkatlice toplayın. FICO tabakasını toplamaktan kaçının ve kırmızı kan hücresi tabakasını rahatsız etmeyin.Daha sonra buffy coat u yeni bir 50 mililitrelik steril konik tüpe aktarın. PBS'yi P BMC'lerle tüpe ekleyin ve 45 mililitre işaretine kadar doldurun. Daha sonra tüpü iyice çalkalayın.Ardından 15 dakika santrifüj edin. 277 gs'de, konik borunun altında bir p BMC paleti oluşturulacaktır. Daha sonra, süpernatanı 10 mililitre çamaşır suyu içeren plastik bir behere atın.Tüpü dalgalı bir yüzeye hafifçe bastırarak hücre peletini gevşetin. Tüpe 20 mililitre taze PBS ekleyin. Birden fazla tüp işleniyorsa, bu adımda peletleri bir araya getirin.Daha sonra, tüpü 480 g'da 12 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı bir miktar çamaşır suyu ile plastik behere atın. Ardından tüpü dalgalı bir yüzeye nazikçe asın.Daha sonra tekrar tüpe 25 mililitre taze PBS ekleyin. Hücrelerin 50 mikrolitresini bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Canlılık için, hücreleri saymak için sayın.50 mikrolitre trian mavisi ekleyin ve karıştırmak için hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Daha sonra, karışımın 10 mikrolitresini bir hemo sitometreye aktarın. Hücrelerin canlılığını kontrol etmek ve mililitre başına hücre sayısını kaydetmek için.İstenilen miktarda hücre alın ve tüpü 177 gs'de 12 dakika santrifüjleyin. Bundan sonra, SUP natantı çamaşır suyu ile behere atın. Daha sonra tüpü dalgalı bir yüzeye hafifçe bastırın, ardından tüpe 80 mikrolitre PBS ekleyin.PBMC slaytını yapmak için, 80 mikrolitre hücreyi önceden etiketlenmiş bir mikroskop lamına yerleştirin, damlayı başka bir slayt yardımıyla sürün veya slaytın her iki ucuna iki damla 40 mikrolitre yerleştirin. Sürgüyü kuruması için biyolojik güvenlik kabininde bırakın. Daha sonra 0.5 mililitre% 37 formaldehit ile 4.5 mililitre% 99 etanol karıştırarak fiksatif çözeltiyi hazırlayın.Slaytlar kuruduktan sonra, tüm yüzeyi kaplamak için slayt üzerine iki mililitre taze yapılmış sabitleyici solüsyon ekleyin. Bir dakika daha musluk suyuyla durulamadan önce solüsyonu bir dakika slayt üzerinde bırakın. Ardından kurumaya bırakın.Şimdi çözün. 50 mililitre damıtılmış suda 25 gram amilaz tozunu işaret edin. Çözeltiyi 100 mililitrelik bir behere dökün.Daha sonra, slaytın yarısını behere daldırın ve 15 dakika inkübe edin. Oda sıcaklığında, amilaz işleminin yapıldığı tarafa bir not alın. Slaytın arkasına, tedavi ve kontrol arasındaki sınırı gösteren bir çizgi çizin.Bundan sonra, amilaz çözeltisini çıkarmak için slaydı damıtılmış suyla yıkayın. Ardından kaydırağı kurumaya bırakın Bu adımda, düz bir yüzeye bir slayt yerleştirin. Numune üzerine iki mililitre periyodik asit çözeltisi uygulayın ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.Ardından slaytı birkaç kez damıtılmış suyla durulayın. Lam üzerine iki mililitre vardiya reaktifi uygulayın ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Ardından, slaytı beş dakika damıtılmış suyla yıkayın ve ardından kurumaya bırakın.Ardından, sürgün üzerine 100 mikrolitre montaj ortamı uygulayın ve büyük bir kapak fişi ile örtün veya 50 mikrolitre uygulayın ve iki küçük kapak fişi kullanın. Bundan sonra, kapak kaymasının kenarlarına şeffaf oje sürün. Gece boyunca kurumaya bırakın.Daha sonra 100 x objektif PAS kullanarak binoküler ışık mikroskobu ile görüntüler elde edin. Sağlıklı deneklerin venöz kanından P BMC'lere boyama yapıldı. PAS boyalı P BMC'ler çeşitli boyama desenleri sergiledi.Granüllü küçük hücreler kolayca gözlendi. Dağınık bir boyama paternine sahip daha büyük hücrelerin bir kısmı da gözlendi. Örneklerin amilaz ile muamelesi granül sinyalini uzaklaştırdı ve dağınık PAS pozitifliğini azalttı.Tam kan lamında PAS ve HEMATIN boyaması yapıldı. Bu PBMC birçok eritrosit ile çevrilidir. PAS pozitif pbmc'lerin %98'i daha küçük hücreler, %40'ı daha büyük hücrelerdi.Amilaz tedavisi, küçük hücrelerde PAS sinyalini ortadan kaldırdı ve daha büyük hücrelerde PAS sinyalini %7'ye kadar önemli ölçüde azalttı. PAS reaktifleri ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken uygun kişisel koruyucu ekipman giymek ve kimyasal başlık kullanmak gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.

detecting-glycogen-peripheral-blood-mononuclear-cells-with-periodic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu video, periferik kan mononükleer hücrelerinin glikojen seviyelerini in vitro olarak değerlendirmek için periyodik asit-Schiff boyama tekniğini göstermektedir. Leke, hücre içi glikojen granüllerine macenta bir renk vererek onları mikroskop altında görünür hale getirir.

Hücrelerin Periyodik Asit-Schiff Boyama: Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinde Glikojen Düzeylerini Tespit Etmek İçin İn Vitro Bir Teknik

Bu videoda, karakterize edilmemiş bir yapıya sahip bir glikojen numunesindeki dallanma derecesini belirlemek için kalitatif bir spektrofotometrik testi açıklıyoruz. Karakterize edilmemiş numunenin absorbans maksimumlarının bilinen dallı yapılara sahip polisakkaritlerinkiyle karşılaştırılması, karakterize edilmemiş numunede dallanmanın varlığını gösterir.

Glikojen dallanma derecesini ölçmek için glikojen dallanma deneyi

Burada in vitro glikojen titrasyonu için bir doğru, tekrarlanabilir ve uygun biyokimyasal yöntem açıklanmaktadır. Bu teknik Abcam Glikojen deney kiti kullanır ve floresan ile titrasyon glikoz ve glikoz glikojen ardışık hidrolizi dayanmaktadır.

Glikojenin Biyokimyasal titrasyonu<em&gt; In vitro</em

Bu rapor, sülfatlı glikozaminolikanları (GAG) biyolojik örneklerden izole etme ve arındırma tekniklerini ve yaklaşık boyutlarına yönelik bir poliakrilamid jel elektroforez yaklaşımını açıklar. GAG'ler proteinlerle elektrostatik etkileşim yoluyla doku yapısına ve etki sinyalizasyon süreçlerine katkıda bulunur. GAG polimer uzunluğu, konyak ligandları için bağlayıcı yakınlıklarına katkıda bulunur.

Glikozamid Jel Elektroforez ve Gümüş Boyama ile Glikozaminolikanların Tespiti

Glikojen metabolizmasının anahtar enzimlerinin aktivitesini ölçmek için teknikler, görünür aralıkta çalışan basit bir spektrofotometre kullanılarak sunulmaktadır.

Ökaryotik Glikojen Metabolizmasının İncelenmesi için Spektrofotometrik Yöntemler

Sükroz yoğunluk gradyan santrifüjlemesi kullanılarak karaciğer glikojeninin ekstraksiyonu için optimal bir sükroz konsantrasyonu belirlendi. Glikojen parçalayıcı enzimleri inhibe etmek için 10 dakikalık bir kaynatma adımının eklenmesinin faydalı olduğu kanıtlandı.

Glikojen Yapısının Belirlenmesi için Karaciğer Glikojen Moleküllerinin Ekstraksiyonu

Modifiye edilmiş bir fiksasyon sonrası prosedür, dokudaki glikojen parçacıklarının kontrastını arttırır. Bu yazıda, iskelet kasında lif tipine özgü hücre altı glikojen dağılımı hakkında tarafsız ve nicel veriler elde etmek için dokunun nasıl ele alınacağını, görüntülemenin nasıl yapılacağını ve stereolojik yöntemlerin nasıl kullanılacağını açıklayan adım adım bir protokol sunulmaktadır.

İskelet Kas Liflerinde Subsellüler Glikojen Dağılımının İletim Elektron Mikroskobu Kullanılarak Ölçülmesi

Biyolojik bilimlerin öğretilmesi, deneylerin kullanılmasıyla öğrenciler için daha teşvik edici hale getirilebilir. Bu el yazması, öğrencileri yüksek kalorili diyetler, açlık ve yaşlanma ile ilgili hipotezleri formüle etmeye ve test etmeye teşvik etmek için sınıfta kullanılabilecek iki farklı ancak tamamlayıcı protokol sunmaktadır.

Caenorhabditis elegans'ta Glikojen Birikimini ve Bağırsak Bütünlüğünü Görselleştirmek için Düşük Maliyetli Boyaların Kullanılması

Hayvan dokusu tahlili, radyo etiketli glikozun glikojene dahil edilmesini ölçerek glikojen sentazın enzimatik aktivitesini belirlemek için nükleer sintilasyon tespitini kullanır.

Hayvan Dokusunda Glikojen Sentaz Enzim Aktivitesinin Radyokimyasal Değerlendirilmesi

Periton boşluğuna memelilerde doğuştan gelen bağışıklık yanıtları için çok önemli olan farklı bağışıklık hücre popülasyonlarının içerir. Verimli bir izolasyon yöntemi, bu hücrelerin biyokimyasal ve fonksiyonel analizler için gereklidir. Burada fare periton boşluğuna hücrelerin izolasyonu için kapsamlı bir yöntem sağlar.

Fare Periton Boşluk Hücreleri İzolasyon

Öğrenin, periferik kan mononükleer hücrelerde glikojen içeriğini görselleştirmek için periyodik asit Schiff boyama yöntemini. Bu teknik, immün hücrelerin polisakkarit bileşimini anlamaya yardımcı olur.

Periyodik Asit Schiff Boyama ile periferik kan mononükleer hücreleri glikojen algılama

Daha fazla video keşfet