Periyodik Asit Schiff Boyama ile periferik kan mononükleer hücreleri glikojen algılama

Bu prosedürün genel amacı, periferik kan mononükleer hücrelerinin glikojen içeriğini görselleştirmektir. Bu, ilk olarak yoğunluk gradyan santrifüjlemesi kullanılarak insan tam kanından P BMC'lerin izole edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, kan hücrelerini bulaştırarak veya pipetleyerek numune slaytları hazırlamak ve daha sonra bunları fiksatif solüsyon ile muamele etmek ve ardından negatif kontrol için yıkamaktır.

Slaytın yarısı, glikojen polimerlerini çözen amilaz çözeltisine daldırılır ve ardından bir yıkama yapılır. Şimdi numuneler periyodik asit çözeltisi ile boyanır ve ardından bir yıkama yapılır. Son adım, vardiyanın reaktifini eklemek ve ardından bir yıkamadır.

Sonuç olarak, hücrelerin içindeki glikojen depolarını göstermek için ışık mikroskobu kullanılır. Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, tam kan boyamaya kıyasla slayt başına daha fazla mononükleer hücre bulunmasıdır. Bu nedenle, nötrofiller ve kırmızı kan hücreleri olmadığı için glikojen içeriğini ve lenfositleri analiz etmek daha verimlidir.

Bu işleme bir biyogüvenlik kabininde başlamak için, heparinize kan alma tüpünden 10 ila 15 mililitre tam kanı dikkatlice 50 mililitrelik steril bir konik tüpe aktarın. Daha sonra, kanı PBS one X'te pH 7.4'te bire bir oranında seyreltin ve maksimum toplam hacmin 30 mililitreyi geçmediğinden emin olun. Serolojik bir pipet tabancası kullanarak nazikçe karıştırın ve kabarcık oluşturmaktan kaçının.

Daha sonra 13 mililitre iyonik olmayan sentetik sükroz polimeri, FICO'yu yeni bir 15 mililitrelik konik tüpe aktarın. Daha sonra, FICO tabakasının üstünde bir kan tabakası oluşturmak için seyreltilmiş kanı yavaş ve sabit bir basınçla ekleyin. Tüm kan transfer edilene kadar bu adımı birkaç kez gerçekleştirin.

Daha sonra, tüpü sıkıca kapatın ve oda sıcaklığında 400 Gs'de 30 dakika santrifüjleyin, bundan sonra tüpü yavaşça çıkarın ve biyogüvenlik kabinine geri aktarın. Daha sonra, pbmc'nin bulunduğu PBS plazma ve FICO katmanları arasındaki buffy kaplamayı dikkatlice toplayın. FICO tabakasını toplamaktan kaçının ve kırmızı kan hücresi tabakasını rahatsız etmeyin.

Daha sonra buffy coat u yeni bir 50 mililitrelik steril konik tüpe aktarın. PBS'yi P BMC'lerle tüpe ekleyin ve 45 mililitre işaretine kadar doldurun. Daha sonra tüpü iyice çalkalayın.

Ardından 15 dakika santrifüj edin. 277 gs'de, konik borunun altında bir p BMC paleti oluşturulacaktır. Daha sonra, süpernatanı 10 mililitre çamaşır suyu içeren plastik bir behere atın.

Tüpü dalgalı bir yüzeye hafifçe bastırarak hücre peletini gevşetin. Tüpe 20 mililitre taze PBS ekleyin. Birden fazla tüp işleniyorsa, bu adımda peletleri bir araya getirin.

Daha sonra, tüpü 480 g'da 12 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı bir miktar çamaşır suyu ile plastik behere atın. Ardından tüpü dalgalı bir yüzeye nazikçe asın.

Daha sonra tekrar tüpe 25 mililitre taze PBS ekleyin. Hücrelerin 50 mikrolitresini bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Canlılık için, hücreleri saymak için sayın.

50 mikrolitre trian mavisi ekleyin ve karıştırmak için hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Daha sonra, karışımın 10 mikrolitresini bir hemo sitometreye aktarın. Hücrelerin canlılığını kontrol etmek ve mililitre başına hücre sayısını kaydetmek için.

İstenilen miktarda hücre alın ve tüpü 177 gs'de 12 dakika santrifüjleyin. Bundan sonra, SUP natantı çamaşır suyu ile behere atın. Daha sonra tüpü dalgalı bir yüzeye hafifçe bastırın, ardından tüpe 80 mikrolitre PBS ekleyin.

PBMC slaytını yapmak için, 80 mikrolitre hücreyi önceden etiketlenmiş bir mikroskop lamına yerleştirin, damlayı başka bir slayt yardımıyla sürün veya slaytın her iki ucuna iki damla 40 mikrolitre yerleştirin. Sürgüyü kuruması için biyolojik güvenlik kabininde bırakın. Daha sonra 0.5 mililitre% 37 formaldehit ile 4.5 mililitre% 99 etanol karıştırarak fiksatif çözeltiyi hazırlayın.

Slaytlar kuruduktan sonra, tüm yüzeyi kaplamak için slayt üzerine iki mililitre taze yapılmış sabitleyici solüsyon ekleyin. Bir dakika daha musluk suyuyla durulamadan önce solüsyonu bir dakika slayt üzerinde bırakın. Ardından kurumaya bırakın.

Şimdi çözün. 50 mililitre damıtılmış suda 25 gram amilaz tozunu işaret edin. Çözeltiyi 100 mililitrelik bir behere dökün.

Daha sonra, slaytın yarısını behere daldırın ve 15 dakika inkübe edin. Oda sıcaklığında, amilaz işleminin yapıldığı tarafa bir not alın. Slaytın arkasına, tedavi ve kontrol arasındaki sınırı gösteren bir çizgi çizin.

Bundan sonra, amilaz çözeltisini çıkarmak için slaydı damıtılmış suyla yıkayın. Ardından kaydırağı kurumaya bırakın Bu adımda, düz bir yüzeye bir slayt yerleştirin. Numune üzerine iki mililitre periyodik asit çözeltisi uygulayın ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.

Ardından slaytı birkaç kez damıtılmış suyla durulayın. Lam üzerine iki mililitre vardiya reaktifi uygulayın ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Ardından, slaytı beş dakika damıtılmış suyla yıkayın ve ardından kurumaya bırakın.

Ardından, sürgün üzerine 100 mikrolitre montaj ortamı uygulayın ve büyük bir kapak fişi ile örtün veya 50 mikrolitre uygulayın ve iki küçük kapak fişi kullanın. Bundan sonra, kapak kaymasının kenarlarına şeffaf oje sürün. Gece boyunca kurumaya bırakın.

Daha sonra 100 x objektif PAS kullanarak binoküler ışık mikroskobu ile görüntüler elde edin. Sağlıklı deneklerin venöz kanından P BMC'lere boyama yapıldı. PAS boyalı P BMC'ler çeşitli boyama desenleri sergiledi.

Granüllü küçük hücreler kolayca gözlendi. Dağınık bir boyama paternine sahip daha büyük hücrelerin bir kısmı da gözlendi. Örneklerin amilaz ile muamelesi granül sinyalini uzaklaştırdı ve dağınık PAS pozitifliğini azalttı.

Tam kan lamında PAS ve HEMATIN boyaması yapıldı. Bu PBMC birçok eritrosit ile çevrilidir. PAS pozitif pbmc'lerin %98'i daha küçük hücreler, %40'ı daha büyük hücrelerdi.

Amilaz tedavisi, küçük hücrelerde PAS sinyalini ortadan kaldırdı ve daha büyük hücrelerde PAS sinyalini %7'ye kadar önemli ölçüde azalttı. PAS reaktifleri ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken uygun kişisel koruyucu ekipman giymek ve kimyasal başlık kullanmak gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.