İlköğretim Kemirgen Beyin mikrovasküler endotel hücreleri İzolasyonu

Bu prosedürün genel amacı, birincil murin, beyin mikrovasküler endotel hücreleri veya MBX elde etmektir. Bu, yetişkin farelerin meninkssiz ön beyinlerinin önce izole edilmesi ve ardından homojenize edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda, doku homojenatı enzimatik sindirim ile daha fazla işlenir.

Daha sonra son adımda, endotel hücreleri yoğunluk, gradyan, santrifüjleme ile ayrılır ve hücre kültürü için kaplanır. Sonuç olarak, CD 31 ekspresyonu için izole edilen hücrelerin immünofloresan boyama, MB mekanik kültürünün saflığını doğrulamak için kullanılabilir. Bu tekniğin, ölümsüzleştirilmiş beyin, endotel hücre dizilerinin kullanımı gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, primer hücrelerle elde edilen sonuçların in vivo duruma daha iyi aktarılabilirlik sağlamasıdır.

Bu yöntem, örneğin bağışıklık hücresi düşüncesinde hangi yolların yer aldığı gibi, kan beyin bariyeri araştırması alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin sonuçları, merkezi sinir sisteminin nörovasküler, enfeksiyöz, inflamatuar veya dejeneratif hastalıklarının tedavisine kadar uzanır. Kan-beyin bariyeri disfonksiyonu, bu tür hastalıkların patojeninde kritik bir rol oynar.

Bu prosedür, laboratuvarımızdan bir yüksek lisans öğrencisi olan Lisa Eeping tarafından gösterilecektir. Beyinleri on, sekiz ila 12 haftalık C 57 BL'den izole ettikten sonra, altı fare, dokuları beş mililitre steril PBS'de depolar. Daha sonra, beyin saplarını, serebella ve talami'yi çıkarmak için bir forseps kullanın ve ardından her beyni steril kurutma kağıdına dikkatlice yuvarlayın.

Meninksleri çıkarmak için beyinleri 50 mililitrelik bir şahin tüpünde toplayın ve 13.5 mililitre DM em ekleyin, ardından dokuyu önce 25 mililitrelik bir pipetle, ardından 10 mililitrelik bir pipetle ortam sütlü hale gelene kadar kıyın. Kollajenaz ve DNA'daki dokuyu 37 santigrat derecede 180 RPM'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde sindirin. Bir saat sonra, doku süspansiyonuna 10 mililitre DM em ekleyin ve hücreleri 1000 Gs ve dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin.

Gevşek peleti rahatsız etmemeye dikkat ederek süpernatanı atın ve ardından peleti 25 mililitre B-S-A-D-M-E-M içinde yaklaşık 25 kez denemek için 25 mililitrelik bir pipet kullanın. Hücreleri tekrar döndürdükten sonra, sütlü üst miyelin tabakasını çıkarmak için büyük çaplı kırık bir cam pipet kullanın. Ardından BSA katmanını normal bir PE veya pipetle çıkarın.

Peletleri dokuz mililitre DM em içinde yeniden süspanse edin ve daha sonra hücrelere bir mililitre kollajenaz disk alanı ve 0.1 mililitre DNA ekleyin. Çözeltiyi 37 santigrat derecede orbital çalkalayıcı üzerinde 180 RPM'de sindirin. Sindirim sırasında, bir ultrasantrifüjde bir perca yoğunluk gradyanı ayarlayın.

Bir saat sonra, reaksiyonu durdurmak için sindirilmiş hücre süspansiyonuna 10 mililitre DM E em ekleyin ve ardından hücreleri döndürün ve peleti yeniden süspanse edin İki mililitre DM E em'de, hücre süspansiyonunu çağrı başına gradyanının üzerine dikkatlice ekleyin ve ardından hücreleri santrifüjleme ile ayırın. Ayrılmadan sonra, hücreler bulutlu bir arayüz olarak görülebilir. Steril iğne boyunca 30 derecelik bir açıyla arayüze dikkatlice daldırın ve yaklaşık 12 mililitre çözelti toplayın.

Arayüz, mümkün olduğunca az kontaminasyon ile çok sayıda hücre elde etmek için genellikle görünmez. Arayüzün küçük bir miktarı aspire edilmelidir. Buna ek olarak, steril iğnenin ucu dikkatli ve sürekli olarak arayüzün her yerine hareket ettirilmeli, hücreleri beş mililitre DM em içeren yeni bir 50 mililitrelik Falcon'a aktarmalı ve daha sonra hücreleri tekrar döndürdükten sonra, reus, damağı bir hücre kültürü plakasının bir santimetrekare yüzeyi başına 0.2 mililitre endotel hücre ortamında askıya almalıdır.

Daha sonra, kaplama çözeltisini kaplanmış hücre kültürü plakalarından çıkarın ve her kuyucuğu iki ardışık yıkama adımında steril PBS ile durulayın. Son olarak, endotel hücre ortamındaki hücre kültürlerini steril bir inkübatörde 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte tutun. İzolasyondan hemen sonra ortamı her iki ila üç günde bir değiştirmek.

Murin, BM e ve kontamine hücreler, hücre kültüründe yüzerken gözlemlenebilen konglomeralar oluşturur. Misin ile orta muamele, murin BMAX seçimine yol açar, çünkü kirletici hücreler pur misin aracılı sitotoksisiteye çok daha duyarlıdır ve etkilenmemiş BM E, beşinci güne kadar kollajen dört fibronektin kaplı hücre kültürü plakalarına yapışmaya başlar, BME yaklaşık% 80 ila 90'lık bir yoğunluğa çoğalır ve sıkıca paketlenmiş bir tek tabaka oluşturur, uzunlamasına hizalanmış ve örtüşmeyen temas inhibe edilmiş hücreler, puram Misin seçimi ile tipik iğ şeklindeki görünümleri ile karakterize edilir, Endotel hücre markörü CD 31 tarafından onaylandığı gibi% 99'a kadar murin BMAX'a kadar yüksek bir saflığa ulaşılır. BM E, sıkı bağlantı proteinleri ile birbirine bağlanmış, sıkıca kapatılmış tek tabakalar oluşturur.

Yedi ila sekiz günlük kültürden sonra, bu hücre katmanları, santimetre kare olarak 20 ila 30 ohm arasında elektrik direnci için kararlı değerler oluşturur ve bu sırada doyurucu bir kapasitans, hücre göçü deneyleri veya Evans mavisi veya dekstran ile geçirgenlik testleri gibi fonksiyonel testler gerçekleştirilebilir. Bu teknik, bu prosedürü takiben dört ila beş saat içinde yapılabilir. Migrasyon deneyleri, geçirgenlik deneyleri veya elektrofizyolojik ölçümler gibi diğer yöntemler, örneğin belirli deneysel koşullar altında bağışıklık hücresi kaçakçılığı nasıl değiştirilir?

Ya da demir kanalları kan beyin bariyeri düzenlemesinde nasıl yer alır? Bu videoyu izledikten sonra, mekanik homojenizasyon, enzimatik, sindirim ve yoğunluk gradyanlı santrifüjleme ile idrar, beyin mikrovasküler endotel hücrelerinin nasıl izole edileceğini iyi anlamış olmalısınız.