Name: İlköğretim Kemirgen Beyin mikrovasküler endotel hücreleri İzolasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Öğrenin, mekanik homojenizasyon ve enzimatik sindirim kullanarak primer fare beyin mikrovasküler endotel hücrelerinin (BMEC) izolasyonunu. Bu yöntem, kan-beyin bariyeri araştırmaları için yüksek saflıkta hücre kültürleri sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma, Deutsche Forschungsgemeinschaft tarafından Klinik Araştırma (IZKF) Münster Disiplinlerarası Merkezi (TOHUM 12/3, SB), (DFG) tarafından desteklenen, Hücreler-in-Motion Mükemmeliyet Kümesi (EXC 1003 - CIM), Muenster Üniversitesi (SB ve SGM kadar) ve Else Kröner-Fresenius-Stiftung (SB ve SGM için 2012_A88) tarafından. Biz mükemmel resimler için Heike Blum teşekkür ederiz.

Hayvan koruma Alman yasalarına göre ve yapılan tüm hayvan deneyleri yerel yönetimler (&quot;Recklinghausen, Almanya;; Fachbereich 87, Tiergesundheit, Tierschutz LandesamtfürNatur, Umwelt und Verbraucherschutz NRW&quot;) tarafından kabul edildi. Fare Deneyleri 1. Genel Yorumlar <ol><li> İlgili Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu kurallarına uygun olarak fareleri kullanarak tüm deneyler yapın. </li><li> Patojenden serbest durumlar altında farelerin tutmak ve yiyecek ve su ad libitum erişmesini sağlayacak. </li><li> Biyolojik özellikleri, yaş ve cinsiyete göre değişir, çünkü deney gruplarında yaş ve cinsiyet uyumlu fareler kullanın. </li><li> Mümkün azaltmak rafine veya hayvan deneyleri değiştirmeye çalışın. </li></ol> Percoll 2. hazırlanması <ol><li> 1 mi 10x PBS, 1 mi FCS ve 10 ml Percoll 1x PBS 19 ml karıştırın. </li><li> Ste gerçekleştirinbir cam tüp içinde filtrasyonu (: 0.2 um filtre gözenek çapı) çözündürülür. Daha sonra 4 ° C&#39;de çözelti saklayın. </li></ol> Endotel hücre ortamı ve hücre kültür plakalarının Kaplamanın 3. hazırlanması <ol><li> Endotel hücre ortamı: <ol><li> 500 ml ortam hazırlanması: (. Yaklaşık% 20), 100 mi PDS ile 400 mi DMEM ortamı (. Yaklaşık% 80) karıştırın, 0.25 ml bFGF (. 20 ug / ml; yaklaşık% 0.05), 0.5 ml heparin (100 ul / mi;., yaklaşık% 0.1) ve 0.5 ml pyrumycin (4 mg / ml., yaklaşık% 0.1). Ancak kültür ilk 2 gün içinde kullanılan hücre kültür ortamı için pyrumycin ekleyin. </li><li> Bir cam tüp içinde bir steril süzme (: 0.2 um filtre gözenek çapı) yapın. Daha sonra 4 ° C&#39;de çözelti saklayın. </li></ol></li><li> Hücre kültür plakalarının Kaplama: <ol><li> Kaplama çözeltisi, 1 ml için, 500 ul GKD 2, O, 400 ul kolajen IV (0.4 mg / ml) ve 100 ul fibronektin (0.1 mg / ml) ihtiva eden bir çözelti hazırlayın. </li><li> EAC bütün yüzeyini kaplayacakkaplama solüsyonu ile hücre kültürü plakasının h yanı. Gece boyunca 4 ° C &#39;de plaka saklayın. </li></ol></li></ol> Fare Beyin mikrovasküler endotel hücreleri 4. izolasyonu (MBMEC) <ol><li> Servikal dislokasyon - (12 haftalık, C57BL / 6 8) 10 yetişkin fareler kurban. Daha sonra PBS 5 ml fare beyinleri ve mağaza izole (ihtar:! Çalışma steril). </li><li> Bir forseps ile beyin sapları, serebellası ve Thalami çıkarın. Dikkatlice steril bir kurutma kağıdı üzerine beyinleri yuvarlayarak meninksleri ayırın. Elde edilen Beyin zarı içermeyen forebrains toplayın. </li><li> DMEM 13.5 ml ile doldurulmuş bir 50 ml Falcon tüpüne beyinleri aktarın. </li><li> Ortam sütlü hale gelene kadar, 10 ml&#39;lik bir pipet ile ilk önce, sonra 25 ml&#39;lik bir pipet ile, doku kıyma. </li><li> Daha sonra, bir yörünge üzerinde 37 ° C de 1 saat süre ile Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) &#39;de 0.6 ml kollajenaz CLS2 (10 mg / DMEM içerisinde mi) ve 0.2 ml DNAse (PBS içinde 1 mg / ml) içeren bir karışım ile doku özet sallamak180 rpm&#39;de r. </li><li> DMEM ekleme 10 mi, 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 1000 x g&#39;de doku süspansiyon ve santrifüj hücreleri ilave edildi. </li><li> Atma süpernatant (İhtar:! PELLET kaybetmek kolaydır) </li><li> 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 1000 x g&#39;de (yakl. 25 defa) (20 a / h%), ve santrifüj, miyelin kaldırmak BSA-DMEM, 25 ml, 25 ml&#39;lik bir pipet ile pelet tekrar süspansiyon. </li><li> Büyük çaplı bir kırık cam Pasteur pipeti ile üst miyelin tabakasının (süt) atın ve daha sonra normal bir Pasteur pipeti ile BSA katman atılır. </li><li> 9 ml DMEM içinde pelletini ve 1 ml kolajenaz / dispaz ve 0.1 ml DNAse (nihai konsantrasyon 1 mg / ml) ilave edilmektedir. 180 rpm&#39;de bir orbital çalkalayıcı üzerinde 37 ° C&#39;de 1 saat boyunca çözeltinin Digest (uyarı: yeniden askıya almak için pipet - kullanmayın hücrelerin yok edilebilir). </li><li> Sindirim sırasında, ivme, wi ile, 4 ° C&#39;de 1 saat süre ile 3000 x g hızında bir ultrasantrifüj kullanarak, yoğunluk gradyanı ayarlamak için Percoll çözeltisi santrifüjthout fren. </li><li> Sindirilmiş hücre süspansiyonuna DMEM, 10 ml ilave edilir. 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 1000 x g&#39;de süspansiyon santrifüjleyin. Daha sonra süpernatan atılır ve DMEM 2 ml pelletini. </li><li> Hızlanma ve fren olmadan 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 700 x g&#39;de Percoll gradient ve santrifüj üzerine dikkatli bir şekilde yeniden süspansiyon haline getirilmiş hücreler ekleyin. Not: Hücreler interfazda bir bulut gibi görünür. </li><li> Yaklaşık alın. Uzun bir steril bir iğne ile hücreleri ile ara faz 12 ml ve 5 ml DMEM ile yeni bir 50 ml&#39;lik Falcon yerleştirin. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 1,000 x g hızında tekrar hücreleri santrifüjleyin. Daha sonra endotel hücre ortamı içinde tekrar süspansiyon pelet (yaklaşık kullanın. Ortamın 0.2 ml ve 1 cm hücre kültürü plakasının 2 yüzeyi başına). </li><li> Kaplanmış hücre kültür levhalarından Kaplama çözeltisini çıkarın (adım 3.2) ve iki ardışık yıkama aşamaları steril PBS ile de her yıkayın. </li><li> Endotelyal hücre kültürleri korumakHücre, 37 ° C&#39;de orta ve% 5 steril bir kuluçka makinesi içinde CO2. Her 2-3 gün orta değiştirin. % 90 izdiham Split hücreleri. </li></ol>

<ol><li>Neuwelt, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engaging+neuroscience+to+advance+translational+research+in+brain+barrier+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Engaging neuroscience to advance translational research in brain barrier biology.</a> Nature reviews. Neuroscience. 12, 169-182 (2011).</li>
<li>Ohtsuki, S., Terasaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+carrier-mediated+transport+systems+to+the+blood-brain+barrier+as+a+supporting+and+protecting+interface+for+the+brain%3B+importance+for+CNS+drug+discovery+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Contribution of carrier-mediated transport systems to the blood-brain barrier as a supporting and protecting interface for the brain; importance for CNS drug discovery and development.</a> Pharmaceutical Research. 24, 1745-1758 (2007).</li>
<li>Bittner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+TWIK-related+potassium+channel-1+%28TREK1%29+regulates+immune-cell+trafficking+into+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Endothelial TWIK-related potassium channel-1 (TREK1) regulates immune-cell trafficking into the CNS.</a> Nature Medicine. 19, 1161-1165 (2013).</li>
<li>Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-brain+barrier+in+health+and+chronic+neurodegenerative+disorders.Neuron%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The blood-brain barrier in health and chronic neurodegenerative disorders.Neuron.</a> 57, 178-201 (2008).</li>
<li>Stoll, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+widespread+blood-brain+barrier+alterations+after+cerebral+photothrombosis+as+revealed+by+gadofluorine+M-enhanced+magnetic+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Transient widespread blood-brain barrier alterations after cerebral photothrombosis as revealed by gadofluorine M-enhanced magnetic resonance imaging.</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 29, 331-341 (2009).</li>
<li>Kleinschnitz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoid+insensitivity+at+the+hypoxic+blood-brain+barrier+can+be+reversed+by+inhibition+of+the+proteasome%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoid insensitivity at the hypoxic blood-brain barrier can be reversed by inhibition of the proteasome.</a> Stroke. 42, 1081-1089 (2011).</li>
<li>Hawkins, B. T., Davis, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-brain+barrier%2Fneurovascular+unit+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+reviews%22%5BJournal%5D)">The blood-brain barrier/neurovascular unit in health and disease.</a> Pharmacological reviews. 57, 173-185 (2005).</li>
<li>Bazzoni, G., Dejana, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell-to-cell+junctions%3A+molecular+organization+and+role+in+vascular+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+reviews%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell-to-cell junctions: molecular organization and role in vascular homeostasis.</a> Physiological reviews. 84, 869-901 (2004).</li>
<li>Pardridge, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier delivery.</a> Drug Discovery Today. 12, 54-61 (2007).</li>
<li>Persidsky, Y., Ramirez, S. H., Haorah, J., Kanmogne, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier%3A+structural+components+and+function+under+physiologic+and+pathologic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroimmunepharmacology+%3A+the+official+journal+of+the+Society+on+NeuroImmune+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier: structural components and function under physiologic and pathologic conditions.</a> Journal of neuroimmunepharmacology : the official journal of the Society on NeuroImmune Pharmacology. 1, 223-236 (2006).</li>
<li>Pardridge, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+biology+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Molecular biology of the blood-brain barrier.</a> Molecular Biotechnology. 30, 57-70 (2005).</li>
<li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+to+the+site+of+inflammation%3A+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nature Reviews Immunology. 7, 678-689 (2007).</li>
<li>Wilson, E. H., Weninger, W., Hunter, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trafficking+of+immune+cells+in+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Trafficking of immune cells in the central nervous system.</a> Journal of Clinical Investigation. 120, 1368-1379 (2010).</li>
<li>Engelhardt, B., Capture Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((crawl%2C+cross%3A+the+T+cell+code+to+breach+the+blood-brain+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">crawl, cross: the T cell code to breach the blood-brain barriers.</a> Trends in Immunology. 33, 579-589 (2012).</li>
<li>Zonta, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuron-to-astrocyte+signaling+is+central+to+the+dynamic+control+of+brain+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuron-to-astrocyte signaling is central to the dynamic control of brain microcirculation.</a> Nature Neuroscience. 6, 43-50 (20003).</li>
<li>Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+are+required+for+blood-brain+barrier+integrity+during+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis.</a> Nature. 468, 562-566 (2010).</li>
<li>Gerhardt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF+guides+angiogenic+sprouting+utilizing+endothelial+tip+cell+filopodia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">VEGF guides angiogenic sprouting utilizing endothelial tip cell filopodia.</a> Journal of Cell Biology. 161, 1163-1177 (2003).</li>
<li>Engelhardt, B., Sorokin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-brain+and+the+blood-cerebrospinal+fluid+barriers%3A+function+and+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+immunopathology%22%5BJournal%5D)">The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction.</a> Seminars in immunopathology. 31, 497-511 (2009).</li>
<li>Perriere, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Puromycin-based+purification+of+rat+brain+capillary+endothelial+cell+cultures.+Effect+on+the+expression+of+blood-brain+barrier-specific+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties.</a> J. Neurochem. 93, 279-289 (2005).</li>
<li>Ruck, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2BNKG2D%2B+T+cells+exhibit+enhanced+migratory+and+encephalitogenic+properties+in+neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">CD4+NKG2D+ T cells exhibit enhanced migratory and encephalitogenic properties in neuroinflammation.</a> PLoS One. 8, 81455(2013).</li>
<li>Weidenfeller, C., Schrot, S., Zozulya, A., Galla, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+brain+capillary+endothelial+cells+exhibit+improved+barrier+properties+under+the+influence+of+hydrocortisone%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Murine brain capillary endothelial cells exhibit improved barrier properties under the influence of hydrocortisone.</a> Brain Res. 1053, 162-174 (2005).</li>
<li>Gumbleton, M., Audus, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+limitations+in+the+use+of+in+vitro+cell+cultures+to+serve+as+a+permeability+screen+for+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmaceutal+Sci%22%5BJournal%5D)">Progress and limitations in the use of in vitro cell cultures to serve as a permeability screen for the blood-brain barrier.</a> J. Pharmaceutal Sci. 90, 1681-1698 (2001).</li>
<li>Watanabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracellular+barrier+and+tight+junction+protein+expression+in+the+immortalized+brain+endothelial+cell+lines+bEND.3%2C+bEND.5+and+mouse+brain+endothelial+cell+4%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+%26+Pharmaceutical+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Paracellular barrier and tight junction protein expression in the immortalized brain endothelial cell lines bEND.3, bEND.5 and mouse brain endothelial cell 4.</a> Biological & Pharmaceutical Bulletin. 36, 492-495 (2013).</li>
<li>Omidi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+immortalised+mouse+brain+capillary+endothelial+cell+line%2C+b.End3%2C+as+an+in+vitro+blood-brain+barrier+model+for+drug+uptake+and+transport+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the immortalised mouse brain capillary endothelial cell line, b.End3, as an in vitro blood-brain barrier model for drug uptake and transport studies.</a> Brain Research. 990, 95-112 (2003).</li>
<li>Sacharidou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+lumen+signaling+complexes+control+3D+matrix-specific+tubulogenesis+through+interdependent+Cdc42-+and+MT1-MMP-mediated+events%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Endothelial lumen signaling complexes control 3D matrix-specific tubulogenesis through interdependent Cdc42- and MT1-MMP-mediated events.</a> Blood. 115, 5259-5269 (2010).</li>
<li>Urich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+self-assembled+spheroidal+model+of+the+blood+brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Multicellular self-assembled spheroidal model of the blood brain barrier.</a> Scientific reports. 3, (2013).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Kan beyin bariyeri disfonksiyon multipl skleroz BBB örneğin bir arıza yoğun Otoreaktif bağışıklık hücreleri tarafından MSS işgali kolaylaştırır ve oligodendrositlerin karşılaşma ve yıkımı sağlayan çeşitli zararlı MSS hastalıklarının bir işareti olur. Iskemik inme BBB bozulması ve beyin ödemi sonraki oluşumu ikincil enfarktüs büyüme ve hastaların 6 genel sağkalımı etkileyen önemli faktörlerdir. Ayrıca, uzak bölgelerde BBB değişimlerden fokal iskemik lezyonlar beyinde yaygın işlevsel değişikliklere neden edebiliyoruz. Ancak, altta yatan moleküler mekanizmaları 5 büyük ölçüde bilinmemektedir. Bunun aksine, fonksiyonel BMECs yüksek yoğunluğu ve akış taşıyıcıların çeşitlilik, enfeksiyöz hastalıklar için, beyin hastalıklar ya da antibiyotikler için kemoterapi maddeleri olarak yararlı ilaçların yoğunluğunu azaltır. Bu nedenle, kan-beyin-çubuğunun daha derin bir anlayışfizyolojik ve patofizyolojik koşullarda rier işlevi, özellikle tercih edilen bir yönünde 21 bariyer fonksiyonunu regüle edebilirler farmakolojik maddeler geliştirmek için gereklidir. BBB in vitro modellerinde Güvenilir BBB düzenleyici mekanizmaları incelemek için vazgeçilmez araçlardır. Birçok ölümsüzleştirilmiş beyin endotelyal hücre soyları kurulmuştur ve in vitro olarak BBB model 22 olarak da kullanılmıştır. Daha hızlı büyür ve birkaç pasaj üzerinde bazı BBB özelliklerini tutmak gibi bu hücre hatları birincil BMECs üzerinde bazı avantajlar sunuyoruz. Bununla birlikte, endotel hücre hatları tamamen in vivo durumu deneysel bulguların devredilebilirliği ile karışmasına gibi önemli özellikleri değiştirildiğinde birincil hücreler yerini alamaz. Örneğin, kemirgen beyin endotelyal hücre hattı bEnd.5 yüksek Parac neden kesikli olarak dağıtılmış sıkı birleşme proteinlerinin ancak düşük düzeylerde ekspreseellular geçirgenliği 23. BEnd.3, sıklıkla kullanılan bir diğer murin beyin endotelyal hücre hattı, yoğun ve sürekli dağıtılan sıkı kavşaklar, yüksek transendoteliyal direnci, çeşitli akış transporterlerini ve düşük paraselüler geçirgenlik gösterir. Birincil BMECs bazı hücre üzerinden ve paraselüler alt tabakaların 24 permeabilitesi ile ilgili gerçek bir ayrımı eksikliği Ancak bEND.3 hücre tabakaları karşılaştırıldı. Primer hücre kültürleri hazırlıklarında, bulaşıcı hücreler önemli ölçüde deneysel bulguların geçerliliği engelleyebilir. Endotel hücrelerinin yüksek saflık elde etmek için tarif edilen protokol, pyrumicin seçici bir madde olarak kullanılır. Bununla birlikte, hücre kültürünün, düzenli bir kalite kontrol kaçınılmaz olarak güvenilir deneyler için garanti etmek için gereklidir. Endotel hücrelerinin tipik morfolojik özellikleri (Şekil 1A bakınız), transendothelia yanı sıra kalite kontrolü için çeşitli yöntemler vardırl direncinin ölçülmesi olabilir ya da bu tür CD31 gibi endotel hücre markeri ekspresyonu (Şekil 1B&#39;ye bakınız) ya da, von Willebrand faktörü (vWF) ile değerlendirilebilir. Bir fare beyninden izole edilmiş beyin endotelyal hücrelerin sayısı göreceli olarak düşüktür ve çok sayıda deney için uygun bir hücre kültürünün ayarlamak için birkaç farelerin beyinleri toplanmış gerekir. Deneyimlerimize göre, en az 10 farenin ilgili hayvan tesisine kaynaklarına bağlı olarak sınırlayıcı bir faktör olabilir, bir deney için kullanılması gerekmektedir. Bias ve eşlik eden faktörler önlemek için, benzer bir genetik ve çevresel kökenli fareler sadece bir araya getirilmiş olması gerekir. Bunun tersine, sığır ve domuz beyin endotelyal hücre preparatları, bir beyin bölgesindeki uygun beyin endotelyal hücrelerin geniş bir dizi sağlar. Bununla birlikte, karmaşık olmayan bir üretim ve barındırma, mevcut transgenik farelerin, geniş ve artan repertuarına yanında birincil sıçangil BMECs ideal olarak işlemekmodeli, kan-beyin bariyeri işlevini incelemek için. BBB ve altta yatan moleküler mekanizmaların işlevleri hakkında birkaç önemli bulgular 2D doku kültürü sistemlerinde çalışmalardan gelir. Son zamanlarda, 3D kültür sistemleri endotel hücreleri lümeni ve boru şekilli ağlar oluşturmak üzere sağlayarak bir kollajen matrisi içine yerleştirilen 25, geliştirilmiştir. Bu yeni hücre kültür sistemleri, in vivo olarak da faal organizma üzerindeki vasküler süreçlerin daha da hassas üretimi için izin verir. Böyle perisitlere ve astrositleri NVU 3D hücre kültürü sistemlerinin daha hücrelerin katılımı kan-beyin-bariyer fonksiyonunun okuyan in vitro devrim olabilir; İlk modelleri son 26 geliştirilmiştir. Sorun giderme için bazı öneriler vardır. Tüm steril çalışma önce endotel hücre kültürünün kalitesi için gereklidir. İkinci olarak, pyrumycin sadece hücre eklenmelidirKültürün ilk 2 gün içinde kullanılan kültür ortamı, uzun uygulama artan MBMEC hücre ölümü ve düşük kaliteli bir bariyer fonksiyonunun neden olabilir. Üçüncü olarak, bu protokolde uygulanan enzimler üretici firmanın talimatlarına uygun olarak kullanılmış ve muhafaza edilmelidir; aksi takdirde düzgün işlevi bozulabilir. Endotel hücreleri EKLEMEYİNİZ Dahası, hücre kültür plakalarının kaplama değişiklik olabilir. Fibronektin ve kollajen konsantrasyonları değiştirilebilir olabilir veya başka bir matris proteinleri, kaplama çözeltisine eklenebilir. Son olarak, yaş, cinsiyet, hayvan tesis içinde yıl ve çevre koşullarının sezon MBMEC izolasyonu ve deneyler karşılaştırılabilirlik kalitesini etkileyebilecek önemli faktörlerdir. Bu koşullar, bağımsız deneyler arasında karşılaştırılabilir olması sağlanmalıdır. Açıklanan protokol, sıçangil BMECs izole etmek için temel bir nöroimmünolojik yöntem olarak kabul edilmelidir. Izole edilmiş hücreler olabilir, uBu tür göç deneyleri, gen ve protein ifade çalışmaları, elektrofizyolojik değerlendirmeler veya geçirgenlik deneyleri gibi BBB fonksiyonu içine daha fazla fikir, kazanmak için geniş bir uygulama yelpazesi için sed. Yukarıda zikredildiği gibi, BMECs 3D hücre kültür sistemleri Nvu bağlamında bbb düzenlenmesinde rol oynayan karmaşık mekanizmalarını incelemek için yeni fırsatlar sağlayabilir. Bu nedenle, primer endotel hücrelerinin izolasyonu gelecek BBB araştırma alanında çok değerli bir teknik kalacaktır.

<html> Son derece uzmanlaşmış, kan-beyin-bariyerinin (KBB) ayrılmaz bir parçası olan beyin mikrovasküler endotel hücreleri (BMEC) form monotabaka. BMECs bir bazal membran bağlı birleşim proteinler tarafından birbirine bağlanır. Birlikte perisitlerin, düz kas hücreleri, astrositik son ayak ve dolaşımdaki kan hücreleri ile bu sözde nörovasküler ünitesi (Nvu) 1 oluşturmak. Kan ve merkezi sinir sistemi (MSS) arasında su geçirmez bir bariyer önceki fikrine karşı, NVU serebral kan damarları ve merkezi sinir sistemi 2 ile sıvı, moleküller ve hücrelerin geçişini kontrol eden bir dinamik, son derece spesifik ve düzenli bir arayüz . Nvu bir fonksiyon bozukluğu ya da düzensizliği, başlatma ve / veya mesela iskemik inme, HİV-ensefalopati, multipl skleroz, Alzheimer ya da Parkinson hastalığı 3-6 gibi merkezi sinir sisteminin nörovasküler, enfeksiyöz enflamatuar veya dejeneratif hastalıkların, çeşitli katkıda bulunabilir. _content &quot;&gt; BMEC tek tabaka sıkıca sıkı (TJ) oluştuğu bir kavşak kompleksi tarafından mühürlenir ve (AJ) 7., yüksek elektrik direnci ve BBB düşük paraselüler geçirgenlik ağırlıklı TJ proteinler dayanmaktadır kavşakları 8. TJs vardır adherens örneğin zonulaoccludens (zo) proteinleri olarak adaptör moleküller, endotel hücrelerinin hücre iskeleti ile bağlantılıdır Claudin ve occludin ailesinin zar proteinleri, oluşan kompleksler ZO1-3 4 adherens birleşme esas olarak bütün zar proteini tarafından monte edilir. kateninlerin 8 yoluyla hücre iskeleti ile bağlantılı vasküler endotelyal (VE) -cadherin. BBB sıkı sızdırmazlık kan ve BOS arasında yüzeylerde ve hücrelerin serbest değişimini engeller. Bu kuralın istisnaları lipid-aracılı difüzyon 9 tarafından BBB geçmeye edebiliyoruz bir molekül ağırlığı &lt;400 Da ile lipofilik, küçük moleküllerdir. Geçişi, daha büyük ve / veyaörneğin glükoz, amino asitler, peptidler, proteinler ve bazı ilaçlar gibi hidrofil olan moleküller, beş ana sınıfa ayrılabilir yüksek oranda kontrol edilen hücre üzerinden taşıma sistemleri 10, sınırlı: taşıyıcı aracılı taşıma, iyon taşıma, aktif akış ulaşım, reseptör aracılı ulaşım ve kaveolanın aracılı taşıma 4. Bu taşıyıcı sistemleri, bir doğru sinyal üretimi, transdüksiyon ve entegrasyon için gerekli olan merkezi sinir sistemi, dengesini sağlamaya yardımcı olur. Ayrıca, BMECs aktif ectoenzymes çeşitli ifadesi ile ayrı moleküllerin geçişini kontrol etmek mümkün bulunmaktadır. Bu enzimler, engelleyici ya da BBB 11 geçişini sağlayan belirli bir iç ve dış alt tabakalar, hücre yüzeyinde lokalize ve değiştirmesi. CNS uzun bir süre için bir bağışıklık ayrıcalıklı bir organ olarak kabul edildi ise, son bulgular bağışıklık Surv bir oldukça dinamik ve sıkı düzenlenmiş sistemini önermekMSS&#39;nin eillance. BMECs eleştirel bağışıklık hücre göçü düzenlenmesinde rol. Yüzey lenfositler üzerinde selektinler sentezlenmesi ile seçici olarak gevşek endotelyuma bağlamak için indüklenir. Lökositler üzerinde belirli reseptörler ile karşılaşma kemokinlerin salgılanması ekspresyonu ya da LFA-1 gibi lökosit bütünleyicilerinin konformasyonel değişikliklere neden olmaktadır (limfosit fonksiyonu ile ilişkili antijen-1) ve VLA-4 (çok geç antijen-4). Integrinleri arasında ya BBB 12-14 BMECs ile beyin parankiması içine transmigrasyonu sağlayan endotel counterreceptors, örneğin, VCAM-l (damar hücresi yapışma molekülü), ICAM-I, (hücreler arası adhezyon molekülü) bağlanma ile sıkı bir yapışmaya aracılık eder. Bunlar ve diğer bulgular, bağışıklık hücre göçünü düzenlenmesinde endotel kendisinin aktif rolünü göstermektedir. Ayrıca, BMECs Nvu parçası serebral kan akımı li düzenlenmesinde rol gibidiryerel nöronal metabolik talepleri nked. Astrositik uyarımı üzerine, endotel hücreleri, vasküler düz kas hücreleri 15 gevşemesine neden olan nitrik oksit gibi vazoaktif maddeler üretmektedir. Gelişmekte yanı sıra yetişkin beyin gösteri paralel desenleme ve geliştirme ve düzenleme 1, 4, birçok özelliklerini paylaşmak Anjiyogenesis ve nöron. Endotel hücreleri kritik Bu işlemler 16, 17 yer alırlar. Özetle, BMECs MSS uygun bir geliştirme ve işleyişini garanti için gerekli özellikleri sağlar. BBB fonksiyon bozukluğu pek çok ciddi nörolojik bozukluklara bağlıdır. Bununla birlikte, çok az hedef spesifik ve etkili tedavi 18 beyin-damar sistemi ara yüzeyinde tespit edilmiştir. In vitro modellerinin basitleştirilmiş bir lo için fonksiyonu ve karmaşık fizyolojik sistemlerin düzenlenmesinde rol mekanizmaları anlamak için kullanılmıştırng zamanı. Bu yazıda ve murin BMECs in vitro çalışmada tarif edilen özel fare nakavt-suşların çeşitli verilen izolasyon, yeni tedavi edici kapılar açmaktadır fizyolojik ve patofizyolojik koşullarda KBB fonksiyonu ve düzenleme daha iyi anlaşılmasını sağlayabilir.

<table><tbody><tr><td>bFGF</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>Temel fibroblast büyüme faktörü</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9418</td><td>Sığır serum albümini</td></tr><tr><td>Kollajenaz CLS2</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td>Yüksek nispi proteaz aktivitesi</td></tr><tr><td>seviyesi Kollajenaz dispas</td><td>Roche</td><td>10269638001</td><td>V. alginolyticus'den kollajenaz, B'den dispas. polimiksa</td></tr><tr><td>Kollajen IV</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0543</td><td>Engelbreth-Holm-Swarm'dan murin sarkomu bazal membran</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5030</td><td>37 ° C'de sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu</td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4513</td><td>Sığır pankreasından Deoksiribonükleaz I</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6178</td><td>Fetal buzağı serumu (fetal sığır serumu olarak da adlandırılır)</td></tr> <tr><td>Heparin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3393</td><td>Antikoagülan</td></tr><tr><td>PDS</td><td>First Link UK Ltd.</td><td>60-00-850</td><td>Plazma türevli serum</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1644</td><td>Kullanmadan önce oda sıcaklığına ısıtın</td></tr><tr><td>Pyrumycin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8833</td><td>Sadece kültürün ilk 2 gününde kullanılmalıdır</td></tr></tbody></table>

İlköğretim kemirgen beyin mikrovasküler endotel hücreleri İzolasyonu

Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

Kan-beyin bariyeri, sıkı ve aderens bağlantılarından oluşan bir kavşak kompleksi ile birbirine bağlanan tek katmanlı bir beyin mikrovasküler endotel hücreleri (BMEC) tarafından ultrastrüktürel olarak birleştirilir. Astrositler veya perisitler gibi diğer hücre tipleriyle birlikte, periferik kan ve CNS arasındaki sıvıların, moleküllerin ve hücrelerin değişimini spesifik olarak düzenleyen nörovasküler üniteyi (NVU) oluştururlar. Bu karmaşık ve dinamik sistem sayesinde, BMEC'ler CNS'nin homeostazını koruyan çeşitli süreçlerde yer alırlar. BBB'nin disfonksiyonu, birçok ciddi CNS hastalığının patogenezinde önemli bir adım olarak gözlenmektedir. Bununla birlikte, altta yatan mekanizmalar hala anlaşılmaktan uzak olduğu için spesifik ve hedefe yönelik tedaviler çok sınırlıdır. 
Hayvan ve in vitro modeller, karmaşık fizyolojik ve patofizyolojik süreçlerin derinlemesine anlaşılmasını sağlamak için yaygın olarak kullanılmaktadır. İndirgeme ve basitleştirme yoluyla, araştırmayı ilgilenilen konuya odaklamak ve çeşitli kafa karıştırıcı faktörleri dışlamak mümkündür. Bununla birlikte, değerlendirme için dikkate alınması gereken model sistemlerde karşılaştırılabilirlik ve aktarılabilirlik de azalmaktadır. En yaygın hayvan modelleri, diğer nedenlerin yanı sıra, esas olarak sürekli artan metodoloji olanakları nedeniyle farelere dayanmaktadır. İzole edilmiş murin BMEC'lerinin in vitro çalışmaları, fizyolojik ve patofizyolojik koşullar altında özelliklerinin ve kan-beyin bariyerinin derinlemesine bir analizini sağlayabilir. BBB'deki karmaşık mekanizmalar hakkında daha fazla bilgi, potansiyel olarak yeni terapötik stratejiler için temel sağlar.
Bu protokol, birincil murin mikrovasküler endotel hücrelerini bir dizi fiziksel ve kimyasal saflaştırma adımıyla izole etmek için bir yöntemi tanımlar. MBMEC'lerin saflığı ve yetiştirilmesinin yanı sıra kalite kontrolü, potansiyel uygulamalar ve sınırlamalar için özel hususlar tartışılmaktadır.

Hemen olarak izolasyon işleminden sonra, kemirgen BMECs ve bulaşıcı hücreler, hücre kültür ortamı (Şekil 1 A, 0 gün) içinde yüzen konglomera oluşturur. Bu tür toksinler için göreli bir dirence yol açan, P-glikoprotein olarak akış taşıyıcıların yüksek seviyelerde ifade ettiklerinden pyrumycin ile muamele sıçangil BMECs bir seçimine neden olur. Kirlenmesine neden olan hücreleri aracılı sitotoksisite 19 pyrumycin çok daha hassastır. MBMECs kolajen IV / fibronektin kaplı hücre kültürü plakaları (Şekil 1A, Gün 1 ve Gün 2) takmak için başlar ise pyrumicin seçim sürecinde, bulaşıcı hücreler, apoptotik ya da nekrotik hücre ölümü girin. 5 gün kadar, MBMECs, yaklaşık bir yoğunluğa çoğalır. 80-90%. Bunlar tipik iğ şekilli bir görünüm ile karakterize edilir. Konflüansta, sıkıca uzunlamasına hizalanmış, paketlenmiş olan ve olmayan üst üste binen temas inhibe hücreleri (Şekil 1A, gün 5) bir tek tabaka oluşturur. Tarafından(Şekil 1B PECAM1) endotelyal hücre belirteci, CD31 ile gösterildiği gibi pyrumicin seçimi,% 99'a kadar MBMEC bir yüksek saflıkta ulaşılır. MBMECs sıkı sıkı birleşme proteinleri tarafından birbirine bağlanmış, kapalı tek katmanlarını oluştururlar. 7. Sonra - Kültür 8 gün, endotel hücre elektrik direnci için sabit değerler oluşturmak (20 arasındaki tipik değerlere ulaşır - Ω 30 x cm2). Ve kondansatör (Şekil 1C) bu zaman noktasında fonksiyonel deneyler, bu hücre-gibi Evans mavi ya da dekstran, örneğin geçiş Deneyler 3, 20,21 ve geçirgenlik testi, yapılmalıdır. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52204/52204fig1highres.jpg" width="500"> Şekil 1. Morfolojik ve faregiller BMECs fonksiyonel özellikleri. Transmisyon ışık mikro tarafından izlendi kültürlü BMECs (A) Temsilcisi zaman dersüzerinde 5 gün skopi. Skala çubuğu bütün resimler için de geçerlidir. Endotelyal hücre belirteci CD31 (B), immünofloresan boyama gün 5 CD31 (yeşil) ve DAPI (mavi) de. (C), hücreler, 5 gün süreyle önceden kültürlenmiş ve daha sonra otomatik bir sisteme aktarıldı biyofiziksel özellikleri (direnç ve kondansatör) analizi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52204/52204fig1highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Beyin mikrovasküler endotel hücreleri (BMEC), kan-beyin bariyeri (BBB) olarak adlandırılan, kanı ve merkezi sinir sistemini (CNS) ayıran yüksek düzeyde düzenlenmiş bir bariyer oluşturan spesifik bağlantı proteinleri ile birbirine bağlanır. Bu protokolde tartışıldığı gibi primer murin beyin mikrovasküler endotel hücrelerinin izolasyonu, BBB'nin ayrıntılı in vitro çalışmalarını mümkün kılar.

İlköğretim Kemirgen Beyin mikrovasküler endotel hücreleri İzolasyonu

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional ...

Bu prosedürün genel amacı, birincil murin, beyin mikrovasküler endotel hücreleri veya MBX elde etmektir. Bu, yetişkin farelerin meninkssiz ön beyinlerinin önce izole edilmesi ve ardından homojenize edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda, doku homojenatı enzimatik sindirim ile daha fazla işlenir.Daha sonra son adımda, endotel hücreleri yoğunluk, gradyan, santrifüjleme ile ayrılır ve hücre kültürü için kaplanır. Sonuç olarak, CD 31 ekspresyonu için izole edilen hücrelerin immünofloresan boyama, MB mekanik kültürünün saflığını doğrulamak için kullanılabilir. Bu tekniğin, ölümsüzleştirilmiş beyin, endotel hücre dizilerinin kullanımı gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, primer hücrelerle elde edilen sonuçların in vivo duruma daha iyi aktarılabilirlik sağlamasıdır.Bu yöntem, örneğin bağışıklık hücresi düşüncesinde hangi yolların yer aldığı gibi, kan beyin bariyeri araştırması alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin sonuçları, merkezi sinir sisteminin nörovasküler, enfeksiyöz, inflamatuar veya dejeneratif hastalıklarının tedavisine kadar uzanır. Kan-beyin bariyeri disfonksiyonu, bu tür hastalıkların patojeninde kritik bir rol oynar.Bu prosedür, laboratuvarımızdan bir yüksek lisans öğrencisi olan Lisa Eeping tarafından gösterilecektir. Beyinleri on, sekiz ila 12 haftalık C 57 BL'den izole ettikten sonra, altı fare, dokuları beş mililitre steril PBS'de depolar. Daha sonra, beyin saplarını, serebella ve talami'yi çıkarmak için bir forseps kullanın ve ardından her beyni steril kurutma kağıdına dikkatlice yuvarlayın.Meninksleri çıkarmak için beyinleri 50 mililitrelik bir şahin tüpünde toplayın ve 13.5 mililitre DM em ekleyin, ardından dokuyu önce 25 mililitrelik bir pipetle, ardından 10 mililitrelik bir pipetle ortam sütlü hale gelene kadar kıyın. Kollajenaz ve DNA'daki dokuyu 37 santigrat derecede 180 RPM'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde sindirin. Bir saat sonra, doku süspansiyonuna 10 mililitre DM em ekleyin ve hücreleri 1000 Gs ve dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin.Gevşek peleti rahatsız etmemeye dikkat ederek süpernatanı atın ve ardından peleti 25 mililitre B-S-A-D-M-E-M içinde yaklaşık 25 kez denemek için 25 mililitrelik bir pipet kullanın. Hücreleri tekrar döndürdükten sonra, sütlü üst miyelin tabakasını çıkarmak için büyük çaplı kırık bir cam pipet kullanın. Ardından BSA katmanını normal bir PE veya pipetle çıkarın.Peletleri dokuz mililitre DM em içinde yeniden süspanse edin ve daha sonra hücrelere bir mililitre kollajenaz disk alanı ve 0.1 mililitre DNA ekleyin. Çözeltiyi 37 santigrat derecede orbital çalkalayıcı üzerinde 180 RPM'de sindirin. Sindirim sırasında, bir ultrasantrifüjde bir perca yoğunluk gradyanı ayarlayın.Bir saat sonra, reaksiyonu durdurmak için sindirilmiş hücre süspansiyonuna 10 mililitre DM E em ekleyin ve ardından hücreleri döndürün ve peleti yeniden süspanse edin İki mililitre DM E em'de, hücre süspansiyonunu çağrı başına gradyanının üzerine dikkatlice ekleyin ve ardından hücreleri santrifüjleme ile ayırın. Ayrılmadan sonra, hücreler bulutlu bir arayüz olarak görülebilir. Steril iğne boyunca 30 derecelik bir açıyla arayüze dikkatlice daldırın ve yaklaşık 12 mililitre çözelti toplayın.Arayüz, mümkün olduğunca az kontaminasyon ile çok sayıda hücre elde etmek için genellikle görünmez. Arayüzün küçük bir miktarı aspire edilmelidir. Buna ek olarak, steril iğnenin ucu dikkatli ve sürekli olarak arayüzün her yerine hareket ettirilmeli, hücreleri beş mililitre DM em içeren yeni bir 50 mililitrelik Falcon'a aktarmalı ve daha sonra hücreleri tekrar döndürdükten sonra, reus, damağı bir hücre kültürü plakasının bir santimetrekare yüzeyi başına 0.2 mililitre endotel hücre ortamında askıya almalıdır.Daha sonra, kaplama çözeltisini kaplanmış hücre kültürü plakalarından çıkarın ve her kuyucuğu iki ardışık yıkama adımında steril PBS ile durulayın. Son olarak, endotel hücre ortamındaki hücre kültürlerini steril bir inkübatörde 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte tutun. İzolasyondan hemen sonra ortamı her iki ila üç günde bir değiştirmek.Murin, BM e ve kontamine hücreler, hücre kültüründe yüzerken gözlemlenebilen konglomeralar oluşturur. Misin ile orta muamele, murin BMAX seçimine yol açar, çünkü kirletici hücreler pur misin aracılı sitotoksisiteye çok daha duyarlıdır ve etkilenmemiş BM E, beşinci güne kadar kollajen dört fibronektin kaplı hücre kültürü plakalarına yapışmaya başlar, BME yaklaşık% 80 ila 90'lık bir yoğunluğa çoğalır ve sıkıca paketlenmiş bir tek tabaka oluşturur, uzunlamasına hizalanmış ve örtüşmeyen temas inhibe edilmiş hücreler, puram Misin seçimi ile tipik iğ şeklindeki görünümleri ile karakterize edilir, Endotel hücre markörü CD 31 tarafından onaylandığı gibi% 99'a kadar murin BMAX'a kadar yüksek bir saflığa ulaşılır. BM E, sıkı bağlantı proteinleri ile birbirine bağlanmış, sıkıca kapatılmış tek tabakalar oluşturur.Yedi ila sekiz günlük kültürden sonra, bu hücre katmanları, santimetre kare olarak 20 ila 30 ohm arasında elektrik direnci için kararlı değerler oluşturur ve bu sırada doyurucu bir kapasitans, hücre göçü deneyleri veya Evans mavisi veya dekstran ile geçirgenlik testleri gibi fonksiyonel testler gerçekleştirilebilir. Bu teknik, bu prosedürü takiben dört ila beş saat içinde yapılabilir. Migrasyon deneyleri, geçirgenlik deneyleri veya elektrofizyolojik ölçümler gibi diğer yöntemler, örneğin belirli deneysel koşullar altında bağışıklık hücresi kaçakçılığı nasıl değiştirilir?Ya da demir kanalları kan beyin bariyeri düzenlemesinde nasıl yer alır? Bu videoyu izledikten sonra, mekanik homojenizasyon, enzimatik, sindirim ve yoğunluk gradyanlı santrifüjleme ile idrar, beyin mikrovasküler endotel hücrelerinin nasıl izole edileceğini iyi anlamış olmalısınız.

isolation-of-primary-murine-brain-microvascular-endothelial-cells

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu yöntem, fare beyin mikrovasküler endotel hücreleri izole etmek ve ölümsüzleştirmek açıklamaktadır. Biz beyin dokusu, sindirim adımları, tohumlama ve hücre ölümsüzlük ve homojenizasyon başlayarak adım adım protokol açıklar. Genellikle, homojen, ölümsüzleştirdi mikrovasküler endotel hücre hattı elde etmek için yaklaşık beş hafta sürer.

Bir olarak ölümsüzleştirdi murin Beyin Mikrovasküler Endotel Hücre Hattı Üretimi<em&gt; In Vitro</em&gt; Kan Beyin Bariyeri Modeli

Bu videoda, endotel hücre kontaminasyonu olmadan sığır beyin kılcal damarlarından perisitleri izole etme ve kültürleme prosedürünü gösteriyoruz.

Primer Beyin Perisitlerinin İzolasyonu ve Kültürü: Endotel Hücre Kontaminasyonu Olmadan Sığır Beyin Kılcal Damarlarından Perisitleri İzole Etme ve Kültür Prosedürü

Bu video, nöronlar ve glial hücrelerle birlikte kan-beyin bariyerini (BBB) oluşturan bir farenin beyninden sağlam damarların izolasyonunu göstermektedir. İzole edilmiş damarlar, beyin homeostazının korunmasındaki rollerini incelemek için in vitro bir model olarak kullanılabilir.

Fare Beyin Damarlarının İzole Edilmesi: Murin Beyin Örneğinden Sağlam Damarları İzole Etmek İçin Bir Protokol

Bu video 10-12 gün içinde embriyonik ön beyin endotel hücreleri saf kültürlerin hazırlanması için kolay ve güvenilir bir strateji gösterir ve serebral damar birçok açıdan odaklanmış araştırma için yararlı olacaktır.

Embriyonik ön beyin gelen Endotel Hücreleri İzolasyon ve Kültürü

Vasküler endotel hücreleri birçok önemli kardiyovasküler hastalıkta önemli rol oynamaktadır. Bu makale, herhangi bir özel ekipman kullanmadan fare aortundan endotel hücrelerini izole etmek ve genişletmek için basit bir yöntemi açıklamaktadır. Protokolümüz, endotel hücre fizyopatolojisindeki mekanizmaları tanımlamak için etkili bir yol sağlar.

İzolasyon ve Fare aort endotel hücreleri İlköğretim Kültür

Fare beyninin damar bölmesinin saflaştırılmasına izin veren bir protokol tarif ediyoruz. İzole beyin damarları, sıkı bağlantılarla bağlanmış ve sürekli bir bazal lamina, perisitler, vasküler düz kas hücreleri ve ayrıca perivasküler astroglial membranlarla çevrili endotel hücrelerini içerir.

Fare Beyin Gemiler saflaştırılması

Kan-beyin bariyerinin korunması, merkezi sinir sisteminin homeostazı için kilit unsurdur. Bu protokol, kan-beyin bariyerinin kapsamını düzenleyen temel ve patolojik süreçleri tanımlamak için in vitro teknikleri tanımlamaktadır.

Kan-beyin Bariyeri Mesh Benzeri Gemi Oluşumu ve Kesintisini Değerlendiren İn Vitro Tahliller

Mikrovasküler endotel hücreleri iskelet kas (MMEC) kas kılcal iç duvar şekil ve her ikisi de, düzenleyen sıvıları/molekülleri ve geçiş (bağışıklık) hücre arasında kas doku ve kan değişimi. Birincil fare MMEC, yalıtım burada açıklandığı gibi kapsamlı tüp bebek araştırmalar "myovascular birimi" sağlar.

Birincil fare iskelet kas mikrovasküler endotel hücre izolasyon

Bu makalede, primer akciğer endotel hücreleri yenidoğan farelerden izole edilmiş ve kültürlenmiştir.

Primer Fare Akciğer Endotel Hücrelerinin İzolasyonu

Serebral parankimal arteriollerden sağlam fare serebral endotelyal "tüplerinin" yoğun bir şekilde hazırlanması, serebral kan akışı regülasyonunu incelemek için gösterilmiştir. Ayrıca, bu endotel çalışma modelinin floresan görüntüleme ve anahtar hücresel sinyal yollarının elektrofizyoloji ölçümü için, hücre içi [Ca2+] ve membran potansiyelindeki değişiklikler de dahil olmak üzere deneysel güçlerini gösteriyoruz.

Fare Beyin Parankiminin Arteriyolar Endotelinin İzolasyonu ve Fonksiyonel Analizi

Beyin mikrovasküler endotel hücrelerinin (BMEC) neonatal fare beyin dokusundan izole edilmesi ve birincil kültürü için bir protokol sunulur; bu protokol kan-beyin bariyer fonksiyonunu fizyolojik ve patolojik koşullarda incelemek için sağlam bir in vitro model oluşturulur.

Fare Bin Mikrovasküler Endotel Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü

Öğrenin, mekanik homojenizasyon ve enzimatik sindirim kullanarak primer fare beyin mikrovasküler endotel hücrelerinin (BMEC) izolasyonunu. Bu yöntem, kan-beyin bariyeri araştırmaları için yüksek saflıkta hücre kültürleri sağlar.

İlköğretim Kemirgen Beyin mikrovasküler endotel hücreleri İzolasyonu

Daha fazla video keşfet