FIM Görüntüleme ve FIMtrack: Yüksek verim ve Maliyet Etkili Hareket Analizi izin İki Yeni Araçlar

FIM C gibi küçük hareketli nesneleri izlemek için tasarlanmış bir roman, maliyet etkin bir görüntüleme sistemi elegans, planaria veya Drosophila larvaları. Ekteki FIMTrack programı hızlı ve verimli veri analizi sunmak için tasarlanmıştır. Birlikte, bu araçlar davranışsal özelliklerin yüksek verim analizi sağlar.

Aşağıdaki metodolojinin genel amacı, Drosophila Melan Gaster larvalarının hareketini görselleştirmek ve ölçmek, serbest hareket koşullarında yüksek verimli taramaya izin vermektir. Bu, FIM kurulumunda bir izleme yüzeyi oluşturularak ve dolaylı aydınlatma için hayal kırıklığına uğramış toplam iç yansıma kullanılarak elde edilir. Farklı genotiplerdeki larvalar daha sonra yüzeye yerleştirilir ve bir ısı gradyanına tepki olarak sürünme davranışı kaydedilir.

Videolar daha sonra FIM Track tarafından analiz edilir. Elde edilen yazılım ve veriler, larva, hareket modellerindeki farklılıkları tanımlayan grafikler oluşturmak için kullanılır. Sonuçlar, larvaların hassas, yüksek verimli, esnek ve kullanımı kolay miktarlarının olduğunu göstermektedir.

Hareket, FIM görüntüleme tekniğine ve ilgili FIM izleme programına dayalı olarak yapılabilir. Bu görüntüleme tekniğinin, gelen veya iletilen ışığı kullanmak gibi mevcut yöntemlerin ana avantajı, yalnızca yüzeye dokunan hayvanların görünür olmasıdır, bu da rahatsız edici Artefaktlar olmadan mükemmel bir ön plan arka plan kontrastı ile sonuçlanır, ancak bu yöntem oph lavının biyolojisi hakkında fikir verebilir. Deniz zarafeti, genel kurullar ve hatta bitkilerin kök büyümesi gibi diğer mono organizmaların yürüme davranışını, sineklerini ve hareketlerini incelemek için de uygulanabilir.

Bu yöntemin görsel gösterimi, başkalarını karmaşık bir teknolojinin kullanımının kolay olduğuna ikna etmek için kritik öneme sahiptir. İlk adım, FITR tabanlı görüntüleme yöntemi veya fim için nemli bir tarama yüzeyi oluşturmaktır. Bunu yapmak için, deiyonize ultra saf suda% 0.8 gıda sınıfı burgu.

Sıcak burguyu akrilik bir cam tabağa dökün. Burguyu kaynattıktan sonra çalkalamayın ve sürekli dökün. Bu sıcaklıkta kabarcıkları önlemek için iki milimetre kalınlığında bir levha oluşturulmalıdır.

Standart altı santimetre Petri kaplarını doldurmak için kalan burgu solüsyonunu kullanın. Bunlar, deneyden önce larvaları sıralamak, temizlemek ve alışkanlık haline getirmek için kullanılacaktır. Ardından, kayıt için düz bir kare yüzey elde etmek için burgu levhasının çevresinden yaklaşık iki santimetre kesin.

Burgu levhasını soğuduktan hemen sonra FIM kurulumuna aktarın. Burguyu akrilik cam plakanın kenarından nazikçe iterek, burgu yerinde kaymalıdır. Artık, tarama yüzeyine caydırıcı bir burgu bariyeri eklemek için görüntüleme hazırlığına hazırsınız.

Deiyonize ultra saf suda üç molar NACL ile% 2,5 gıda sınıfı burgu kaynatın. Daha sonra, görüş alanını çevreleyen iki santimetre genişliğinde bir çentiği daha önce dökülen tarama yüzeyine kesin. Hazır olduğunda, çentiği izleme yüzeyinden 0,1 ila 0,3 santimetre daha yüksek tuz burgu ile doldurun.

Ardından, ısı gradyanı cihazını hazırlayın. Cihaz, yalıtkan bir yüzeyle kaplanmış ve her iki ucunda pompalardan gelen su ile perfüze edilmiş bir alüminyum levhadır. Sıcaklık kontrolüne izin vermek için, kullanmadan bir saat önce ısı gradyanı cihazını açın ve istenen sıcaklığa ulaşmasını sağlamak için kurulumun üzerine yerleştirin.

Bu süre daha fazla hazırlık için kullanılabilir. Hazır olduğunda, tarama yüzeyi burgusunu bir tuz bariyeri ile kuruluma aktarın. Radyatör plakasını burgunun üzerine yerleştirin ve plaka ile sürünme yüzeyi arasındaki boşluğu iki milimetreye ayarlayın.

Su devrelerinin sıcaklığını bu ekipman için uygun olan bir santigrat derece ve 45 santigrat dereceye ayarlayarak 34 santigrat dereceden 18 santigrat dereceye kadar doğrusal bir gradyan oluşturun. Tarama yüzeyinin 20 dakika boyunca gradyanda dengelenmesine izin verin. Devam etmeden önce, sinekleri hazırlamak için sıcaklık gradyanını bir TER ile test edin, onları 25 santigrat derecelik bir inkübatörden alın ve yıldız larva hareketinde üçüncü sırayı almak için kültür şişelerine biraz su bırakın.

Daha sonra, kayıttan iki ila beş dakika önce küçük bir boya fırçası kullanarak flakon duvarlarından en büyük larvaları toplayın, bir video için yeterli larvayı daha önce hazırlanmış bir Petri kabına aktarın. Sıcaklık gradyanı oluşturulduktan sonra kayıt yazılımını kurun. Video başına kare sayısını belirtin.

Kaydetme yolunu tanımlayın ve 20 saniye içinde anında kayıt için ayarlayın. Larvaları tarama yüzeyine yerleştirdikten sonra, larvalardan birini görüntülemeye başlayın ve iyi bir kontrast elde etmek için aydınlatma yoğunluğunu ayarlayın. Hazır olduğunuzda, radyatör plakasını hafifçe kaldırın ve larvaları tuz bariyerinden iki santimetre uzakta 34 santigrat dereceye yerleştirin.

Radyatör plakasını tekrar indirin ve hayvanları rahatsız etmemek için karanlıkta kayda başlayın. Kayıttan sonra larvaları temizleyin ve yüzeyi nemlendirin. NACL'nin yayılmasını önlemek için, çalışırken tuz burgusuna dokunmayın, yüzeyin her zaman nemli tutulması gerekirken, larvaları çevreleyen haleler veya damlalar olarak görülebilen aşırı nemden kaçının.

Kayıtlarda ve rahatsız izlemede, devam etmeden önce burgu yüzeyinin bir ila iki dakika dengelenmesine izin verin. Bu süre zarfında, toplanan görüntüleri kaydedin ve yeni hayvanlar toplayın. Bir sonraki videoya hazırlanmak için, her beş videoda bir TER kullanarak sıcaklık gradyanını kontrol edin ve gerekirse sıcaklık cihazını ayarlayın.

Hareketi izlemeye başlamak için, önizleme seçeneğini kullanarak izleme parametrelerini ayarlayın. Kameraya ve görüş alanına göre piksel başına milimetreyi ayarlayın. Ardından, kamera ayarlarına göre saniyedeki kare sayısını ayarlayın, tüm hayvanların doğru şekilde algılanması için parlaklık eşiklerini ayarlamak için önizleme penceresinde verilen geri bildirimi kullanın.

Daha sonra, larva alanı boyutu eşiklerini ayarlayın, tek hayvanlar sarı dairelerle vurgulanır, çarpışan larvalar kırmızı ile vurgulanır ve her hayvanın alanı mavi olarak verilir. Sağ altta bulunan butonu kullanarak takibe başlayın Takip seansından sonra larva izlerini içeren bir görüntü ve hesaplanan hareket ve duruş özelliklerini içeren bir CSV dosyası görüntü dizininde saklanır. Son olarak, izleme sonuçlarını gözden geçirmek ve el ile ayarlamak için FIM sonuçları görüntüleyici modülünü kullanın.

Bu uyarana dayalı verileri değerlendirmek için ısı gradyanına göre tarama yönünü tanımlayın. Burada gösterilen larva gösteriminde, baş ve kuyruk noktası bu noktalar arasında işaretlenmiştir. Bir yarıçap ile rastgele tek sayıda omurga noktası ayarlanabilir.

Ek olarak, kütle merkezi ve ana gövde bükülme açısı hesaplanır. Burada, farklı kameralardan alınan FI görüntüleme ve izleme sonuçları gösterilmektedir. Soldaki görüntüler, 10 santimetreye 10 santimetrelik bir izleme aşamasında sürünen üç larvayı yakalar.

Tek bir larvanın kütle yörüngesi ve alanı sağda gösterilmiştir. Kırmızı ok, kırpılan görüntünün uygulanma sonuçlarının zaman noktasını gösterir. Burada bir ısı uyaranı, F izi ile hesaplanan farklı renkli yörüngeler olarak gösterilir.

Üçüncü, ikinci ve birinci yıldız larvalarının bu yüksek çözünürlüklü uygulama görüntüleri makro lens ile elde edilmiştir. Deniz gibi diğer organizmalar da kolayca görüntülenebilir. Bir kez ustalaştıktan sonra, her izleme kurulumu başına saatte yaklaşık yüz laboratuvar analiz edilebilir.

Bu prosedürü denerken, bu prosedürü takiben her zaman aynı koşullar altında kayıt yapmayı unutmamak önemlidir. Optogenetik stimülasyon veya nöral aktivitenin in vivo tespiti gibi diğer yöntemler kuruluma dahil edilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, ular hareketi verimli bir şekilde analiz etmenin ne kadar kolay olabileceğini iyi anlamış olmalısınız.