Name: Fare Embriyo Duyu Akson Projeksiyonlar tüm montaj Görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Öğrenin, fare embriyolarında duyu akson büyüme fenotiplerini değerlendirmek için bütün montaj görüntüleme yöntemini. Bu teknik, genetik modifikasyonların ağrı mekanizmaları üzerindeki etkilerini incelemeye olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar anlayışlı tartışma ve önerileriniz için TrkA taulacZ fareler Dr. Annette Markus Dr. Louis Reichardt teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Burke Vakfı yanı sıra Whitehall Vakfı araştırma bursu 2010-08-61, Yaşam Vakfı (WFL-ABD-028/14) için Wings bir araştırma hibe başlangıç ​​fonları tarafından desteklenen, gelen ZB1-1102-1 hibe Christopher &amp; Dana Reeve Vakfı, ve JZ Ulusal Göz Enstitüsü hibe 1R01EY022409 ve 3R01EY022409-01S1. KJO bir Goldsmith üyesidir.

NOT: Tüm işlemler Laboratuvar Hayvanları Kullanımı ve Bakımı NIH Kılavuzu ile uyumlu. Hayvan protokolü Weill Cornell Medical College IACUC tarafından onaylanmıştır. 1. Doku Hazırlanması <ol><li> Servikal dislokasyon 15 ile zamanlanmış-gebelik kadın Euthanize. Ayrı ayrı soğutulmuş fosfat tamponlu tuz (PBS) ile doldurulmuş bir 6-yuvalı plakasının gözenekleri içinde zamanlanmış hamilelik kadın ve yer embriyolardan E18 embriyoları - embriyonik E16 ayır. </li><li> Soğuk PBS embriyolar durulayın. </li><li> Daha sonra genotipleme için önceden hazırlanmış bir proteinaz K solüsyonunda embriyo ve yer amniyotik zarın küçük bir kısmını çıkarmak. Amniyotik zar kaybolur Alternatif olarak, eğer embriyo kuyruk ucu küçük bir bölümünü kaldırmak ve proteinaz K çözeltisi yerleştirin </li><li> Tüm böcek işaretçilerine (yan başına en az 100) kullanılarak embriyo çevresindeki deri içine delikleri Poke. </li><li> (PFA) taze% 2 paraformaldehid ekleyin yavaş yavaş PBS çıkarın vekuyu pH 7.4. </li><li> Yavaşça 4 ° C&#39;de 2 saat boyunca çalkalanır. </li><li> PBS içinde iki kere embriyo yıkayın ve boyama kadar 4 ° C de PBS içinde depolar. </li></ol> 2. Genotipleme <ol><li> Üreticinin talimatlarına göre proteinaz K karışımı içinde amniyotik membranlar veya embriyo kuyrukları daldırın. </li><li> 10 dakika boyunca 56 ° C&#39;de inkübe edilir. </li><li> Bir ticari olarak temin edilebilir DNA saflaştırma kiti kullanılarak DNA ekstrakte edin. </li><li> Gen spesifik sens ve antisens primerler (10 uM), her biri 0.5 ul, 2 ul dNTP karışımı ile birleştirmek, genomik DNA solüsyonu arıtıldı toplam 200 ul, 0.5 ul alın (dATP 2.5 mM, dCTP, dGTP ve dTTP) 0.2 ul Taq polimeraz (5 U / ul) ve 2 ul PCR tamponu (10x), 20 ul toplam hacim H2O ekleyin. NOT: Primer dizileri aşağıda (Tablo 1): TrkA: TrkA_F: GCG GGC GCC KİK JGK ATG, TrkA_R: GAA GCC KİK TGC GCG GTT CTG CCA GGG TG; PCR fragment uzunluğu: 400 baz çifti (bp). Bax: In5R: GTT GAC CAG AGT GGC GTA GG, Ex5F: TGA TCA GAA CCA TCA TG, neoR: CCG CTT CCA TTG CTC AGC GG; PCR fragmanı uzunlukları: vahşi tip, 304 bp; Bax boş, 507 bp. TauLacZ: lacZup: ACA ACG TCG TGA GTG GGA AAA, lacZdown: ATC AAC ATT AAA TGT GAG CGA G; PCR parçası uzunluğu: 360 bp. </li><li> TrkA aşağıdaki program ile bir PCR çalıştırın: Aşama 1: 1 dakika 95 ° C, aşama 2 için: 30 saniye için 72 ° C: 68 ° C, aşama 4&#39;te, 20 saniye: 95 ° C, aşama 3 10 san. 40 döngü için 4 - Tekrar 2 adımları. <ol><li> LacZ ve Bax, aşağıdaki program ile bir PCR çalıştırın: Aşama 1: 1 dakika 95 ° C de, aşama 2: 10 saniye 95 ° C, aşama 3: 1 dak 54 ° C, aşama 4: 72 ° C&#39;da 1 dakika 35 döngü için 4 - ° C, tekrar adımları 2. </li></ol></li><li> DNA merdiveni bir şerit 20 dakika süre ile 1x Tris-Asetat-EDTA tampon maddesi içinde 100 V de,% 2 agaroz jel üzerinde yapılmıştır, PCR numuneleri fragmanı uzunlukları değerlendirmek. </li><li> Vahşi tip TrkA, T varlığı için embriyolar analizRKA-tauLacZ ve Bax boş allel. Bax - / -, deneysel sorular bağlı: - - / ve TrkA taulacZ / taulacZ Bax: Deneysel embriyoların genotipleri TrkA taulacZ / WT vardır. TauLacZ muhabiri eksik Embriyolar aksonal boyama için olumsuz olacak ve bu nedenle boyama işlemini kalibre etmek için negatif kontroller hizmet edebilir. </li></ol> 3. Embriyo Boyama <ol><li> 3.8 - 3.2 bölümlerde de aşağıda tarif edildiği gibi, bazı modifikasyonlarla, lacZ boyama için bir ticari kit kullanın. Burada, Millipore kiti kullanın. </li><li> Oda sıcaklığında hafifçe çalkalanarak, en az 1 saat süre ile tampon çözeltisi içinde, embriyolar bırakın. </li><li> Doğrudan, oda sıcaklığında hafifçe çalkalanarak, en azından 15 dakika için, Tampon B embriyolar bırakın. </li><li> Embriyolar Tampon A / B, 37 ° C&#39;de önceden sıcak Doku baz çözelti içinde iken. Her embriyo için doku baz çözeltisi 5 ml kullanın. </li><li> Embriyolar Tampon A / B olarak da, yeni 5-br hazırlanmasıomo-% 100 dimetil sülfoksit (DMSO) içinde 40 mg / ml arasında bir konsantrasyonda 3-indolil α-D-galaktopiranosid (X-gal) 4-klorofenil. </li><li> 1 mg / ml bir konsantrasyonda önceden ısıtılmış Doku baz çözeltisi içine X-gal ile seyreltilir ve bir cam sintilasyon şişesine X-gal / Doku baz karışımı 5 ml ilave ediniz. </li><li> X-gal / Doku baz karışımını ihtiva eden bir cam sintilasyon şişesine embriyolar aktarın. Parafilm ile kapağı kapatın ve boyası olup olmadığını kontrol, bir gece boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Taze% 4 PFA, pH 7.4 ile Postfix&#39;i embriyolar. Yavaşça 4 ° C de 4 saat süre ile çalkalanır. </li><li> Soğuk PBS iki kez embriyolar durulayın. </li></ol> 4. Doku Dehidrasyon ve Takas <ol><li> Cam şişeler içinde çalkalama ile oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 50 metanol /% 50 PBS karışımı içinde yer embriyolar. </li><li> Cam şişeler içinde çalkalanarak, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 75 metanol /% 25 PBS kurutmak için devam edin. </li><li> % 90 kurutmak devam metanol /% 10 pCam şişeler içinde çalkalanarak, oda sıcaklığında, 30 dakika, BS. </li><li> Cam şişeler içinde çalkalanarak, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca (2x) için% 100 metanol içinde kurutmak için devam edin. </li><li> 1 (v: v) benzoil alkol ve benzoil benzoat karışımı embriyolar dehidrasyon iken, bir 1 hazırlayın. Not: Benzoil alkol ve benzoil benzoat toksiktir. </li><li> 1: 1 embriyolar daldırın (v: v),% 100 metanol karışımı: 15 dakika boyunca% 100 BABB. BABB plastik eriyecektir çünkü sadece camını kullanın. </li><li> Tamamen açık doku% 100 Babb embriyolar daldırın ve temizlenmiş embriyo X-gal boyama görselleştirmek için. NOT: kısa sürede X-gal leke zamanla solmaya çünkü görüntü. </li></ol> 5. Tüm Dağı Görüntüleme <ol><li> Fotoğrafçılık ile metal forseps için uygun açılarda,% 100 Babb dalmış embriyo, stabilize. Işık-up ve altında ışık ışık kaynaklarının bir arada kullanarak Aydınlatmak. </li><li> Diseksiyon mikroskobu görüntüleri EdinmeBir dijital kamera ile donatılmış. 0.5 mm aralıklı Z ekseni boyunca beş ardışık odak düzlemleri birden fazla parlak bir alan poz alın. Pozlama süreleri ve f-durur aydınlatma ve kamera özelliklerine göre değişir ve her kurulum için optimize edilmesi gerekebilir. </li><li> Bindirme görüntüleri işlemek ve fotomontajların oluşturmak için standart görüntü işleme yazılımı kullanın. </li></ol>

<ol><li>Verze, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutaneous+innervation+in+hereditary+sensory+and+autonomic+neuropathy+type+IV%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Cutaneous innervation in hereditary sensory and autonomic neuropathy type IV.</a> Neurology. 55, 126-128 (2000).</li>
<li>Sethna, N. F., Meier, P. M., Zurakowski, D., Berde, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutaneous+sensory+abnormalities+in+children+and+adolescents+with+complex+regional+pain+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Cutaneous sensory abnormalities in children and adolescents with complex regional pain syndromes.</a> Pain. 131, 153-161 (2007).</li>
<li>Uceyler, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+fibers+in+Fabry+disease%3A+baseline+and+follow-up+data+under+enzyme+replacement+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Peripher+Nerv+Syst%22%5BJournal%5D)">Small fibers in Fabry disease: baseline and follow-up data under enzyme replacement therapy.</a> J Peripher Nerv Syst. 16, 304-314 (2011).</li>
<li>Reichardt, L. F., Mobley, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Going+the+distance%2C+or+not%2C+with+neurotrophin+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Going the distance, or not, with neurotrophin signals.</a> Cell. 118, 141-143 (2004).</li>
<li>White, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronous+onset+of+NGF+and+TrkA+survival+dependence+in+developing+dorsal+root+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synchronous onset of NGF and TrkA survival dependence in developing dorsal root ganglia.</a> J Neurosci. 16, 4662-4672 (1996).</li>
<li>Farinas, I., Wilkinson, G. A., Backus, C., Reichardt, L. F., Patapoutian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+neurotrophin+and+Trk+receptor+functions+in+developing+sensory+ganglia%3A+direct+NT-3+activation+of+TrkB+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Characterization of neurotrophin and Trk receptor functions in developing sensory ganglia: direct NT-3 activation of TrkB neurons in vivo.</a> Neuron. 21, 325-334 (1998).</li>
<li>Markus, A., Zhong, J., Snider, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raf+and+akt+mediate+distinct+aspects+of+sensory+axon+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Raf and akt mediate distinct aspects of sensory axon growth.</a> Neuron. 35, 65-76 (2002).</li>
<li>Kuruvilla, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neurotrophin+signaling+cascade+coordinates+sympathetic+neuron+development+through+differential+control+of+TrkA+trafficking+and+retrograde+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A neurotrophin signaling cascade coordinates sympathetic neuron development through differential control of TrkA trafficking and retrograde signaling.</a> Cell. 118, 243-255 (2004).</li>
<li>Zhong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raf+kinase+signaling+functions+in+sensory+neuron+differentiation+and+axon+growth+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Raf kinase signaling functions in sensory neuron differentiation and axon growth in vivo.</a> Nature. 10, 598-607 (2007).</li>
<li>Bulfone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+olfactory+sensory+map+develops+in+the+absence+of+normal+projection+neurons+or+GABAergic+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">An olfactory sensory map develops in the absence of normal projection neurons or GABAergic interneurons.</a> Neuron. 21, 1273-1282 (1998).</li>
<li>Moqrich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expressing+TrkC+from+the+TrkA+locus+causes+a+subset+of+dorsal+root+ganglia+neurons+to+switch+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Expressing TrkC from the TrkA locus causes a subset of dorsal root ganglia neurons to switch fate.</a> Nature. 7, 812-818 (2004).</li>
<li>Knudson, C. M., Tung, K. S., Tourtellotte, W. G., Brown, G. A., Korsmeyer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bax-deficient+mice+with+lymphoid+hyperplasia+and+male+germ+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bax-deficient mice with lymphoid hyperplasia and male germ cell death.</a> Science. 270 (5233), 96-99 (1995).</li>
<li>Lentz, S. I., Knudson, C. M., Korsmeyer, S. J., Snider, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophins+support+the+development+of+diverse+sensory+axon+morphologies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurotrophins support the development of diverse sensory axon morphologies.</a> J. Neurosci. 19, 1038-1048 (1999).</li>
<li>Patel, T. D., Jackman, A., Rice, F. L., Kucera, J., Snider, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+sensory+neurons+in+the+absence+of+NGF%2FTrkA+signaling+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Development of sensory neurons in the absence of NGF/TrkA signaling in vivo.</a> Neuron. 25, 345-357 (2000).</li>
<li>Donovan, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-RAF+kinase+drives+developmental+axon+growth+and+promotes+axon+regeneration+in+the+injured+mature+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">B-RAF kinase drives developmental axon growth and promotes axon regeneration in the injured mature CNS.</a> The Journal of experimental medicine. 211, 801-814 (2014).</li>
<li>Mercer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+endogenous+oncogenic+V600EB-raf+induces+proliferation+and+developmental+defects+in+mice+and+transformation+of+primary+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Expression of endogenous oncogenic V600EB-raf induces proliferation and developmental defects in mice and transformation of primary fibroblasts.</a> Cancer research. 65, 11493-11500 (2005).</li>
<li>Tronche, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+glucocorticoid+receptor+gene+in+the+nervous+system+results+in+reduced+anxiety%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+genetics%22%5BJournal%5D)">Disruption of the glucocorticoid receptor gene in the nervous system results in reduced anxiety.</a> Nature genetics. 23, 99-103 (1999).</li>
<li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+toolbox+of+Cre-dependent+optogenetic+transgenic+mice+for+light-induced+activation+and+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing.</a> Nat Neurosci. 15, 793-802 (2012).</li>
<li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Neuronal+Subsets+in+Transgenic+Mice+Expressing+Multiple+Spectral+Variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li>
<li>Schmidt, H., Rathjen, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DiI-labeling+of+DRG+neurons+to+study+axonal+branching+in+a+whole+mount+preparation+of+mouse+embryonic+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">DiI-labeling of DRG neurons to study axonal branching in a whole mount preparation of mouse embryonic spinal cord.</a> J Vis Exp. , (2011).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden çıkarların olmadığını beyan eder.

Embriyonik TrkA taulacZ farelerin yukarıda tarif edilen X-gal lekeleme prosedürü sağlam, sabit embriyo uzun mesafe akson çıkıntıların hızlı ve ayrıntılı olarak gösterebilir. Bu fareler akson büyümesi ve nöronal hayatta hem de katkıda bulunabilir mekanizmalar sinyal tarama izin Bax boş arka plan Çünkü. Ilgi transgenik veya nakavt fareler ile çiftleşme aksonal fenotip kapsamlı değerlendirilmesi için izin verir ve daha detaylı bir şekilde akson büyüme sinyalini incelemek için gelecek deneyler i...

Kesin nöronal ağların kurulması sinir sisteminin işlevselliği için gerekli karmaşık bir gelişimsel süreçtir. Bu süreçte sorunlar olduğu insan nörolojik hastalıklar 1-3 implike edilmiştir nöronal fonksiyon bozukluğuna yol açar. Memelilerde akson büyümesi ve hedef innervasyon yatan moleküler mekanizmaları incelemek için, iki genetiği değiştirilmiş fare hatları bir arada kullanarak duyusal nöronlar TrkA-ifade aksonal yörüngeleri görselleştirmek için bir protokol geliştirmiştir. TrkA sinir büyüme faktörü NGF için bir alıcı, ve nosiseptif duyu nöronlarının 4 fonksiyonel bir işaretleyici olarak kullanılabilir. TrkA derece erken gelişimi sırasında nosiseptif nöronların ifade ve NGF-bağımlı nöron hayatta kalma, akson büyümesini, arborization ve hedef innervasyon 5-9 aracılık eder. TrkA taulacZ farelerde, vahşi tip TrkA geninin taulacZ sentezleme c değiştirilirfarazi TrkA pozitif nöronlarının akson morfolojisi 11 boyama β-gal (X-gal) ile görüntülenebilir şekilde assette 10. Heterozigot TrkA taulacZ / WT hattını kullanarak, düzenlemek veya in vivo duyusal afferent projeksiyonlar gelişmesine engel olabilir faktörleri inceleyebilirsiniz. Ayrıca, TrkA ifadeleri, bu nedenle, NGF / TrkA sinyal olmadığında mekanizmaları teşvik akson büyümesini belirlemek üzere kullanılabilir homozigot TrkA taulacZ / taulacZ farelerde, yoktur. Nosiseptif nöronlar, NGF / TrkA sadece akson büyümesi için sinyal bağlı olduklarından, aynı zamanda hayatta kalmak için, başka türlü hücre ölümden kurtarmak, embriyonik DRG nöronlarının apoptosisi engellemek için, pro-apoptotik Bax geni eksik bir fare hattı kullanır TrkA sinyallemesinin yokluğunda gözlemlenen. Bax - / - Arka plan 12 Böylece molecu sağlarözellikle akson büyüme 7-9,13-15 etkileyen sinyal yollarının lar diseksiyonu. TrkA yılında - / -: Bax - / - fareler, DRG nöronlar hayatta, ama deride duyu afferent innervasyon tamamen 14,15 kaldırılmıştır. Biz seçici akson projeksiyonlar gelişmesine kendi katkılarını belirlemek için sinyal yolları aktive edebilirsiniz. Bu yöntemin yarar farklı genetik değişiklikler TrkA taulacZ / taulacZ üzerine yetiştirilen zaman aksonal büyüme fenotipleri değişikliklerin değerlendirilmesine olanak sağlamasıdır: Bax - / - veya TrkA taulacZ / WT: Bax - / - kökenden.

<table><tbody><tr><td>PFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6418</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Tech</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Doku Durulama Solüsyonu A</td><td>Millipore</td><td>BG-6-B</td><td></td></tr><tr><td>Doku Durulama Solüsyonu B</td><td>Millipore</td><td>BG-7-B</td><td></td></tr><tr><td>Doku Leke Baz Solüsyonu</td><td>Millipore</td><td>BG-8-C</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4252</td><td></td></tr><tr><td>Cam sintiallasyon şişesi</td><td>Kimble Chase</td><td>74500-20</td><td></td></tr><tr><td>İnkübatör</td><td>Labline</td><td>Model 120</td><td></td></tr><tr><td>Böcek pimleri</td><td>FST</td><td>26000-30</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>6 kuyulu çanak</td><td>USA Scientific</td><td>CC7672-7506</td><td></td></tr><tr><td>Primerler</td><td>IDT</td><td>özel DNA primerleri</td><td></td></tr><tr><td>Takara dNTP karışımı</td><td>Takara</td><td>4030</td><td></td></tr><tr><td>Takara LA tamponu</td><td>Takara</td><td>RR002A</td><td></td></tr><tr><td>Takara LA Taq</td><td>Takara</td><td>RR002A</td><td></td></tr><tr><td>PCR makinesi</td><td>Bio-Rad</td><td>DNA Motor Dyad</td><td></td></tr><tr><td>Benzil alkol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B-1042</td><td></td></tr><tr><td>Benzil benzoat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B-6630</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon mikroskobu</td><td>Leica</td><td>M205A</td><td></td></tr><tr><td>Kamera</td><td>Leica</td><td>DFC310FX</td><td></td></tr><tr><td>Halka ışık</td><td>Leica&nbsp;</td><td>MEB110</td><td></td></tr><tr><td>Photoshop</td><td>Adobe</td><td>Photoshop 4.0</td><td></td></tr></tbody></table>

fare embriyo duyu akson projeksiyonlar tüm montaj görüntüleme

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

embriyolarda tam uzunlukta nöronal projeksiyonlar görselleştirme nöronal ağlar nasıl geliştiğini memeli bir anlayış kazanmak esastır. Burada yerinde birkaç genetik manipüle fare hatları kullanarak fenotipik özelliklerini değerlendirmek için dorsal kök ganglion (DRG) akson projeksiyonlar bir alt kümesini etiketlemek için bir yöntem açıklanmaktadır. TrkA pozitif nöronların ağrı sinyallerinin iletimi için özel nosiseptör nöronlar vardır. Biz sağlam fare embriyo tüm TrkA-pozitif çevresel akson yörüngeleri etiketlemek için bir TrkA taulacZ fare hattını kullanmak. Biz daha bağımsız nöronal sağkalım üzerine genetik manipülasyonlar olası etkilerinin büyüme ile ilgili soruları değerlendirmek amacıyla, esasen nöronal apoptoz ortadan kaldıran bir Bax boş bir arka plan üzerine TrkA taulacZ hattını doğurmak. Daha sonra, ilgi genetiği değiştirilmiş fareler TrkA Taul ile yetiştirilenACZ / Bax boş hattı ve daha sonra burada tarif edilen teknikler kullanılarak çalışma için hazırdır. Bu sunum, tüm montaj hazırlanmasında tam uzunlukta aksonal yörüngeleri görünüm için izin diseksiyon, doku hazırlanması, boyama ve temizleme sırasında detaylı fare üreme planları hakkında bilgi, genotiplendirmesi içerir.

TrkA ağ / taulacZ genotipleri: Bax - / - ve TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / - embriyolar açıkça standart PCR genotipleme ile tespit edilebilir (Şekil 1). X-gal lekeleme görüntüler geleneksel lekeli embriyolar (Şekiller 2, 3a) 'da deri altından periferik aksonal milleri ayrıntılı ve doku temizleme sonra embriyo boyunca (Şekil 3b, 4). - / - Hattı nörona özgü Nestin promotör 17 k...

Burada, genetik olarak tasarlanmış farelerin geliştirilmesinde duyusal akson büyüme fenotiplerini değerlendirmek için etkili bir yöntem olarak, tüm hayvanda periferik nosiseptör akson projeksiyonlarının görüntülenmesi için fetal fareleri genotiplemek, boyamak ve hazırlamak için optimize edilmiş bir protokol sunuyoruz.

Fare Embriyo Duyu Akson Projeksiyonlar tüm montaj Görüntüleme

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, gelişmekte olan fetal farelerde duyusal akson büyüme fenotiplerini etkili bir şekilde değerlendirmektir. Bu, ilk önce uygun şekilde üreme ve genotipleme ile elde edilir, böylece aşağı akış boyama deneyleri ikinci bir adım olarak gerçekleştirilebilir. Fare embriyoları, tüm hayvandaki duyusal akson projeksiyonlarının görselleştirilmesine izin vermek için sabitlenir ve boyanır.Daha sonra, aksi takdirde görülemeyecek olan derin yatan akson çıkıntılarını tamamen görselleştirmek için embriyolar kurutulur ve temizlenir. Sonuçlar, bu yöntemlerin embriyonik nosiseptif akson büyüme fenotiplerini hızlı bir şekilde değerlendirmenin etkili bir yolu olduğunu göstermektedir. Bir Tau Lae muhabirinin izini kullanarak, Bu yöntem, araştırmacıların ilgilendikleri genleri bir tlac Z arka planına geçmelerine ve duyusal akson büyüme fenotiplerindeki herhangi bir değişiklik için taramalarına izin vererek duyusal akson büyümesi alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir.Tekniğimizin etkileri, bilim adamlarının bilinen konjenital mutasyonların duyusal akson büyüme fenotiplerine neden olup olmadığını test etmek için tekniğimizi kullanabilmeleri anlamında tedaviye kadar uzanır. Metin protokolünde atıfta bulunulduğu gibi servikal çıkık ile ötenazi zamanlanmış gebelik kadınlarına başlamak için, zamanlanmış gebelik dişilerinden embriyonik E 16 ila E 18 embriyolarını incelemeye devam edin, ardından embriyoları ayrı ayrı soğuk fosfat tamponlu salin veya PBS ile doldurulmuş altı kuyulu bir tabağın kuyucuklarına yerleştirin. Embriyoları soğuk PBS'de duruladıktan sonra, embriyonun amniyotik zarının küçük bir kısmını çıkarın ve DNA saflaştırma kitinden veya müteakip genotiplemeden hazırlanmış bir proteinaz K çözeltisine yerleştirin.Alternatif olarak, amniyotik zar kaybolursa, embriyo kuyruğunun ucunun küçük bir kısmını çıkarın ve proteinaz K çözeltisine yerleştirin. Daha sonra, her iki tarafta yaklaşık 100 delik açan böcek pimleri kullanarak embriyonun etrafındaki cilde sokun. PBS'yi çıkarın ve dört santigrat derecede iki saat hafifçe çalkaladıktan sonra kuyuya yavaşça taze% 2 paraform aldehit veya PFA pH 7.4 ekleyin.Embriyoları PBS'de iki kez durulayın ve lekelenene kadar PBS'de dört santigrat derecede saklayın Genotipleme için. Amniyotik zarları veya embriyo kuyruklarını üreticinin talimatlarına göre proteinaz K karışımına daldırın. 56 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin.Ticari olarak temin edilebilen bir DNA saflaştırma kiti kullanılarak DNA'yı çıkardıktan sonra, metin protokolünde açıklandığı gibi bir PCR reaksiyonu hazırlamak için toplam 200 mikrolitre saflaştırılmış genomik DNA çözeltisinin 0,5 mikrolitresini kullanın, ardından PCR programını burada ayrıntılı olarak açıklandığı gibi çalıştırmaya devam edin. PCR'yi takiben, PCR örneklerini 20 dakika boyunca bir ekstra asetat EDTA tamponunda 100 voltta %2'lik bir aros jel üzerinde çalıştırın. Parça uzunluklarını değerlendirmek ve rutin protokolleri kullanarak jeli boyamak için bir DNA merdiveni tutan bir şerit ekleyin.Embriyoları vahşi tip, parça a, parça a ve geri boş alellerin varlığı açısından analiz edin. Embriyoları boyamak için. Burada açıklanan değişikliklerle gevşek e boyama için ticari bir kit kullanın.Başlamak için, embriyoları oda sıcaklığında hafifçe çalkalayarak en az bir saat boyunca tampon A'ya daldırın. Daha sonra embriyoları en az 15 dakika boyunca doğrudan tampon B'ye daldırın ve oda sıcaklığında hafifçe çalkalayın. Daha sonra, mililitre başına 40 miligramlık bir xal stok çözeltisini, mililitre başına bir miligram konsantrasyonda ön ısıtıcı doku bazlı çözeltiye seyreltin.Ve elde edilen karışımın beş mililitresini bir cam sintilasyon şişesine ekleyin. Embriyoları, xal doku bazlı karışımı içeren cam sintilasyon şişesine aktarın. Kapağı perfil ile kapatın ve gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.Mavi leke olup olmadığını kontrol etme. Daha sonra embriyoları taze% 4 PFA pH 7.4 ile düzeltin. Dokuyu kurutmak için embriyoları soğuk PBS'de iki kez durulamadan önce dört santigrat derecede dört saat hafifçe çalkalayın, embriyoları oda sıcaklığında 30 dakika boyunca %50 metanol %50 PBS karışımına yerleştirin, camda çalkalayın.30 dakika boyunca% 75 metanol içinde cam eğelerde çalkalayarak oda sıcaklığında kurutmaya devam edin, ardından 30 dakika% 90 metanol ekleyin. Son olarak, 30 dakika boyunca% 100 metanol içinde iki kez kurutun. Daha sonra embriyoları 15 dakika boyunca bire bir% 100 metanol ve% 100 benzoil alkol ve% benzoil benzoat veya BABB karışımına daldırın.Cam kullandığınızdan emin olun çünkü BABB son adım olarak plastiği çözecektir. Dokuyu tamamen temizlemek ve temizlenen embriyoda X kal boyamasını görselleştirmek veya görüntülemeyi monte etmek için embriyoları %100 BABB'a daldırın, gerekirse metal forseps kullanarak fotoğraf çekimi için uygun açılarda %100 BABB'ye batırılmış embriyoyu stabilize edin. Yukarı ışık ve düşük ışık kombinasyonunu kullanarak aydınlatın.Işık kaynakları. Dijital kamera ile donatılmış bir diseksiyon mikroskobu ile görüntüler elde edin. Birbirini takip eden beş odak düzleminde birden fazla parlak alan pozu çekin.Z ekseni boyunca 0,5 milimetre aralıkla. Pozlama süreleri ve F-stop'lar, aydınlatma ve kamera özelliklerine göre değişebilir ve her kurulum için optimize edilmeleri gerekir. Bindirme görüntülerini işlemek ve fotoğraf montajları oluşturmak için standart görüntü işleme yazılımını kullanın.Track a tal Lai homozigotlarının genotipleri null ve track a tal lai heterozigotları geri alır. Snu embriyoları, standart PCR genotiplemesi ile açık bir şekilde belirlenebilir. ALS boyama, embriyolarda ayrıntılı subkutan periferik aksonal arborları gösterir, trigeminal gangliyonlardan akson çıkıntıları ve temizlenmemiş embriyoda gövde ve kafa gösterilir.Burada, ex GS boyama, Track A sinyalizasyonundan tamamen yoksun olan ancak yapısal olarak kinaz aktive olmuş embriyolarda, BABB ile temizlenmeden önce ve sonra orta gövdedeki dorsal kök gangliyonlarından yapılan projeksiyonlarda ayrıntılı periferik aksonal arborları gösterir. Nöron spesifik yuvanın kontrolü altında BRAF mutasyonu. Promotörde, nosiseptör periferik projeksiyonlarının morfolojisi normale yakın gelişti.Bu, periferik akson büyümesinde BRAF sinyalizasyonu için çok önemli bir işlevi gösterir ve A izinin hayatta kalma ve akson büyümesini teşvik eden işlevlerinin, A izine bağımlı hayatta kalma sinyalinin kaybının yerini alan arka boş genetik arka plan ile ayrılabileceğini gösterir. Beta buzların enzimatik aktivitesini tehlikeye atabilecek embriyoları aşırı sabitlememek önemlidir. Ayrıca BABB'ın çok tehlikeli bir malzeme olduğunu ve onunla çalışırken her zaman uygun havalandırma kullanmanız ve uygun kişisel koruyucu ekipman giymeniz gerektiğini unutmayın.Bu videoyu izledikten sonra, bozulmamış hayvanda gevşek lekeli aksonların nasıl etkili bir şekilde işleneceğini, boyanacağını ve görselleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.

whole-mount-imaging-of-mouse-embryo-sensory-axon-projections

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Source: Liau, E. S. et al. Işık Tabakası Floresan Mikroskobu Kullanılarak Fare Embriyolarında Motor Akson Navigasyonunun Görselleştirilmesi ve Akson Arborizasyonunun Miktarının Belirlenmesi. J. Vis. Exp. (2018). Bu video, motor nöron projeksiyonlarını ve akson dallanmasını görüntülemek için ışık tabakası floresan mikroskobunun kullanımını göstermektedir. transgenik fare embriyoları. Motor nöron büyümesini ve bağlantısını değerlendirmek için numune hazırlama, görüntüleme ve aksonal dallanmanın...

Işık Tabakası Floresan Mikroskobu Kullanılarak Motor Nöron Projeksiyonlarının ve Akson Dallanmasının Görselleştirilmesi

Kaynak: Jeong, S. Drosophila'da embriyonik motor nöronların aksonal projeksiyon modelinin görselleştirilmesi. J. Vis. Uzm.  (2017)Bu video, Drosophila embriyolarında aksonal projeksiyonların görselleştirilmesini göstermektedir. Motor nöronların immünoetiketlenmesi, nöronal yapıları ortaya çıkarmak için hassas diseksiyon ve diferansiyel girişim kontrast mikroskobu toplu olarak ayrıntılı nöronal mimariyi ortaya çıkararak aksonal projeksiyon paternlerini vurgular.

Drosophila'da Embriyonik Motor Nöronların Aksonal Projeksiyon Modellerinin Görselleştirilmesi

Nöral progenitör mitoz nöron kritik bir parametredir. Nöral progenitör mitoz anlayışımızın çok sabit doku analizine dayanmaktadır. Embriyonik beyin dilimleri Canlı görüntüleme, kontrollü bir ortamda, yüksek zamansal ve mekansal çözünürlük ile mitoz değerlendirmek için çok yönlü bir tekniktir.

Gelişmekte Fare Embriyonik Cortex mitoz Canlı Görüntüleme

Bu tür saç folikülleri ve sinir uçları gibi - - mekansal organizasyon farklı desen sergileyen Memeli cilt yapıları çeşitli bir dizi içerir. Düz bir montaj olarak cilt analiz deri yapıları tam kalınlığı yüksek çözünürlüklü görüntüler üretmek için bu doku 2-boyutlu geometri yararlanır.

Fare Cilt ve Saç Folikül Desenlendirme ve Duyusal Akson Morfoloji Analizi Uygulanması Düz ​​Görüntüleme Dağı

Bu çalışma, geç evre-16 Drosophila melanogaster embriyolarının motor nöron projeksiyonlarını görselleştirmek için standart bir immünohistokimya yöntemini ayrıntılarıyla anlatıyor . FasII antikoru ile lekelenmiş sabit embriyoların filleted hazırlığı, motor akson yol bulma ve sinirsel gelişim sırasında hedef tanıma için gerekli genlerin karakterize edilmesi için güçlü bir araç sağlar.

Embriyonik Motor Nöronlarının Aksonal Projeksiyon Paterninin Görselleştirilmesi<em&gt; Drosophila</em

Burada, motor nöron projeksiyon ve transgenik Hb9::GFP fare embriyo axon arborization görüntülenmesi için bir protokol açıklayın. Motor nöronlar için immunostaining sonra hafif levha Floresans mikroskobu Image embriyolar için sonraki kantitatif analiz için kullanılan. Bu iletişim kuralı diğer nöron gezinti süreçlerinde merkezi sinir sistemi için geçerlidir.

Görselleştirme Motor Axon navigasyon ve hafif levha Floresans mikroskobu kullanarak fare embriyo Axon Arborization miktar

Burada biz bir doku takas, floresan etiketleme ve büyük ölçekli görüntüleme sağlayan, böylece, görselleştirme yeni korteksimiz hücre tiplerinin üç boyutlu kuruluşun fare beyin dokusunun açıklayınız.

Hücresel Örgütü fare yeni korteksimiz yılında büyük ölçekli üç boyutlu görüntüleme

Transmisyon elektron mikroskobu ve rahimde iletim sinir sisteminin iyi ultrastructure morfolojik değişiklikler geliştirme sırasında çalışmak için güçlü bir yaklaşımdır. Bu kombine yöntem değişiklikleri içine derin anlayışlar nöroplastisite ile ilgili topografik ifadelerinin temel yapısal detayları verir.

Sonra Ultrastructural nöroplastisite parametrelerinde Utero iletim gelişmekte olan fare beyin ve omurilik değerlendirilmesi

Bu protokol, bir günlük Xenopus laevis embriyolarının göz tomurcuklarına bir DNA/DOTAP karışımının nasıl mikroenjekte edilebildiğini ve tek tek yeşil floresan proteinin (GFP) tek tek görüntülenme ve yeniden nasıl yeniden yapılandırılabildiğini göstermeyi amaçlamaktadır. bozulmamış, yaşayan Xenopus kurbağa yavruları.

Xenopus laevis Embriyolarında Göz tomurcuklarına DNA'nın mikroenjeksiyonu ve GFP'nin Sağlam Optik Aksonal Arbors'u İfade Etme Görüntülemesi, Yaşayan Xenopus Kurbağaları

Serebral korteksin gelişimi sırasında, nöronlar ve glial hücreler ventrikülü kaplayan ventriküler bölgeden kaynaklanır ve beyin yüzeyine doğru göç eder. Bu süreçte birçok gen yer alır. Bu protokol, göç eden nöronların ve glial progenitörlerin hızlandırılmış görüntüleme tekniğini tanıtır.

Embriyonik Fare Beyin Dilimlerinde Göç Eden Nöronların ve Glial Progenitörlerin Hızlandırılmış Görüntülenmesi

Bu çalışma, farelerin ön pençe derisindeki düşük eşikli mekanoreseptör (LTMR) akson terminallerinin görselleştirilmesi için in vivo iki fotonlu görüntüleme yaklaşımını sunmaktadır. Bireysel aksonların tekrarlanan, yüksek çözünürlüklü görüntülemesi kullanılarak, bu yöntem gelişim sırasında ve yetişkinlerde deri duyusal devresinin yapısı ve işlevini incelemek için yeni bir platform sağlar.

Fare Derisindeki Dokunma Duyusal Akson Morfolojisinin İntravital İki Fotonlu Görüntülemesi

Öğrenin, fare embriyolarında duyu akson büyüme fenotiplerini değerlendirmek için bütün montaj görüntüleme yöntemini. Bu teknik, genetik modifikasyonların ağrı mekanizmaları üzerindeki etkilerini incelemeye olanak tanır.

Fare Embriyo Duyu Akson Projeksiyonlar tüm montaj Görüntüleme

Daha fazla video keşfet