Fare ve İnsan Özofagus gelen miyofibroblastların izolasyonu
January 18th, 2015
Miyofibroblast fenotipine sahip murin ve insan özofagus stromal hücrelerinin primer kültürlerini oluşturmak için bir protokol sunuyoruz. Kültürlenmiş hücreler iğ şeklinde morfolojiye sahiptir, α-SMA ve vimentin eksprese eder ve epitelyal, hematopoietik ve endotel hücre yüzey belirteçlerinden yoksundur. Karakterize edilmiş stromal hücreler, epitelyal-stromal etkileşimlerin fonksiyonel çalışmalarında kullanılabilir.
Bu prosedürün genel amacı, primer miyofibroblastları fare ve insan özofagusundan izole etmektir. Bu, önce donör yenidoğan fareden tüm yemek borusunun insan dokusu ile toplanmasıyla gerçekleştirilir. Mukoza, muskularis propriadan ayrılır.
İkinci adım, dokuyu kıymak ve HBSS'de birkaç kez yıkamaktır. Daha sonra, doku kollajenaz diss ile sindirilir ve daha fazla kıyılır, mezenkimal hücreler bağlı epitel ile birlikte serbest bırakılır. Heterojen hücre popülasyonu daha sonra miyofibroblastların yapıştığı, epitel hücrelerinin hayatta kalmadığı ve yıkandığı miyofibroblast ortamında kültürlenir.
Sonuç olarak, primer kültürdeki hücrelerin miyofibroblastlar olduğunu doğrulamak için immünokimya ve akış sitometrisi kullanılır. Prosedürleri gösteren ben, bir teknisyen olan Matthew Gargas ve laboratuvarım Tori'den bir doktora sonrası olan chow new olacak. Sekiz ila 12 günlük bir fareye ötenazi yaptıktan sonra, hayvanın sırt tarafını sabitleyin ve ventral yüzeyi% 70 etanol ile ıslatın.
Daha sonra, forseps kullanarak, üretral açıklığın önündeki cildi tutun ve kaldırın. Üretral açıklıktan çeneye kadar ventral orta hat boyunca kesin. Sadece cildi kesin.
Daha sonra üretral açıklıktan dizlere doğru kesiler yapın, baş aşağı bir Y oluşturun. Dizlere yapılan kesileri takiben, göğüs kafesinin her iki tarafında kesiler yapın. Kesileri tamamladıktan sonra cildi dikkatlice soyun ve bir kenara koyun. Şimdi peritonu kaldırın ve diyaframa ve göğüs kafesine kadar kesin.
Göğüs içi ve karın içeriğine zarar vermemek için makası yukarı bakacak şekilde tutun. Daha sonra, sternumun orta hattı boyunca ve göğüs kafesi boyunca servikal kuşağa kadar kesilen cerrahi makas kullanarak alttaki mideyi, yemek borusu mide kavşağını ve yemek borusunun abdominal kısmını ortaya çıkarmak için karaciğerin sol lobunu nazikçe yukarı kaldırın. Yine. Bunu yaparken, makası alttaki organlardan uzak açılı tutun.
Ardından göğüs boşluğunun içeriğini ortaya çıkarmak için göğüs kafesini bir kenara çekin. Şimdi kalbi ve akciğerlerin her iki lobunu nazikçe çıkarın. Kanamayı gerektiği gibi emmek için pamuklu aplikatörler kullanın.
Torasik özofagus, trakeanın arkasında ve torasik omurun önünde dar, esnek bir tüptür. Yenidoğanlarda, yemek borusunu mideden tanımlamak için yemek borusu mide kavşağını bulun. Kör bir şekilde, yağ ve mezenter dokusu da dahil olmak üzere yemek borusunu çevreleyen damar sistemini, servikal boşluktaki özofagus kökenine kadar inceleyin.
Şimdi yemek borusunun tüm uzunluğunu rezeke edin ve istenirse soğutulmuş HBSS'ye aktarın. Ayrıca, oryantasyon amacıyla midenin bir kısmını çıkarın. Bu protokole, HBSS'de fare veya insan dokusundan elde edilen mukozal parçaları sırasıyla 1.7 mililitrelik bir mikro füj tüpünde veya beş mililitrelik bir tüpte kıyarak başlayın.
Şimdi, insan özofagus stromal hücreleri elde edilirken, keskin diseksiyon ile mukozayı alttaki muskularis propria'dan ayırmak önemlidir. Şimdi tüpte ayrıca ince makas kullanarak dokuyu iki ila üç milimetrelik parçalar halinde nane eder. Özofagus mukozal fragmanından sonra, tortu yavaşça HBSS'yi boşaltır ve dokuyu yanlışlıkla atmamaya dikkat eder.
Ek HBSS'yi çıkarmak için büyük uçlu bir pipet de kullanabilirsiniz. Sonra taze HBSS ekleyin. Tüpü hafif bir çalkalama ile karıştırın ve dokunun yerleşmesine izin verin.
Yerleştikten sonra, HBSS'yi tekrar boşaltın ve bu yıkamayı tekrarlayın. Toplamda sekiz kez adım atın. Sekiz yıkamadan sonra, dokuyu kollajenaz 11 ile inkübe edin ve murin dokusunu yavaş bir hızda ve oda sıcaklığında sallanan bir çalkalayıcı üzerinde 25 dakikaya kadar inkübe edin.
Aynı koşullar altında, insan dokusunu altı saat inkübe edin. Sindirimden sonra, ince makas kullanarak dokuyu daha da karıştırın ve ardından dokuyu 10 dakika boyunca 200 G'de santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve peletlenmiş dokuyu temiz bir 1.7 mililitrelik tüpe boşaltın.
Daha sonra doku kültürü başlığının altında, cansız hücreleri ve diğer kalıntıları ortadan kaldırmak için hücreleri DMEM'de beş kez% 2 sorbitol ile yıkayın. Her yıkama için, hücrelerin yerçekimi ile çökelmesine izin verin ve yıkama solüsyonunu boşaltın. Yıkamalardan sonra, hücreleri altıda üç kuyuya tohumlayın.
Kuyu plakası ve vakumla filtrelenmiş takviye edilmiş DMEM'de kültürleyin. İnsan dokusu, numune kültürünün, hücrelerin boyutuna bağlı olarak, kuyucuklar% 80 birleşene kadar daha fazla kuyu veya plaka gerektirebilir. Daha sonra yapışma hücrelerini önce T 25 şişelerine geçirin, hücreleri yerinden çıkarmak için EDTA'da% 0.05 tripsin kullanın.
Ardından reaksiyonu etkisiz hale getirmek için medya ekleyin. Yerinden çıkan hücreleri bir santrifüj tüpüne toplayın. Daha sonra hücreleri mikroskop altında toplamak için 400 G'de döndürün.
Kültürlenmiş stromal hücreleri kas hücrelerinden ayırt etmek ve bunları Desmond için immün boyayınak, yapışık hücrelerin iğ şeklindeki morfolojisini gözlemleyin. Standart bir protokol kullanarak, 15.000 hücreyi dört kuyucuklu oda slaytlarında kısaca plakalayın ve 24 saat boyunca miyofibroblast ortamında büyütün. Ertesi gün, hücreleri sabitleyin ve daha sonra birincil antikor bloğunu uygulamadan önce, sabit hücreleri PBS'de% 5 keçi serumu ile bloke edin, hem birincil hem de ikincil antikorlar% 5 Keçi serumu içinde seyreltilmelidir.
Birincil antikor ile oda sıcaklığında veya gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra yıkamaları takiben hücreleri PBS ile üç kez durulayın. İkincil antikorları ekleyin ve hücreleri bir saat inkübe edin.
Oda sıcaklığında, ikincil antikorları çıkarmak için PBS'de üç yıkama kullanın. Daha sonra lekeli hücreler yıkamayı takiben analiz edilebilir. Özofagus hücrelerinin saflığını belirlemek için montaj ortamı ve kapak kayması ile DPI uygulayın.
Hematopoietik ve endotel hücre yüzey belirteçleri için bunları kontrol edin. Akış sitometrisi kullanma. Toplamaya hazır olana kadar kültür şişelerinde yeterli sayıda büyütün.
Daha sonra, 10 dakika boyunca 37 santigrat derecede enzimatik olmayan hücre ayrışma çözeltisi kullanarak kültürlenmiş fare özofagus stromal hücrelerini ayırın. Koleksiyonlarını takip ediyor. Hücreleri faks arabelleği ile iki kez yıkayın ve hücreleri sayın.
Şimdi standart bir boyama prosedürü kullanarak, bağışıklık hücrelerini tanımlamak için CD 45 ile boyayın ve endotel hücrelerini tanımlamak için CD 31 ile boyayın, ardından hücreleri akış sitometresinden geçirin. Özofagus stromal hücreleri, mekanik ve enzimatik sindirim kullanılarak izole edildi ve kaplamadan sonraki saatler içinde altı oyuklu plakada kültürlendi. Hücreler, plakaya gevşek bir şekilde yapışmış karışık bir süspansiyon içindeydi.
Sonraki 24 saat boyunca, iğ şeklindeki hücreler hücre süspansiyonundan filizlendi ve plakanın tabanına sıkıca yapıştı. Bu hücreler beş gün içinde tüm kuyuyu kapladılar ve burada görülen en az 15 geçiş boyunca morfolojilerini başarıyla korudular, hücreler düşük yoğunlukta. Bunlar, özofagus stromal hücrelerinin primer kültürlerinin immün boyanması, ko-akıcılığına yakın iğ şeklindeki hücrelerdir.
Oda slaytlarında yetiştirilen slaytlar, miyofibroblast hücre iskeleti belirteçlerinin bol miktarda ekspresyonunu göstermiştir. Alfa, SMA ve menton kültür saflığı akım sitometrisi ile değerlendirildi. Primer murn özofagus stromal hücreleri için ileri ve yan saçılma sağlandı, ardından hücre yüzey proteinleri için canlı hücrelerin geçitlenmesi ve analizi yapıldı.
Primer murn özofagus stromal hücrelerinde hematopoietik CD 45 ekspresyonu yoktu ve endotelyal CD 31 hücre yüzeyi belirteçlerinin ekspresyonu yoktu. Bu videoyu izledikten sonra, fare ve insan özofagusundan miyofibroblastların birincil kültürlerinin nasıl oluşturulacağını iyi anlamış olmalısınız. Evet.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu protokol, murin ve insan özofagundan birincil miyofiborblastların izolasyonunu tasvir eder. Kültürlenen hücreler, iğ şeklindeki morfoloji ve spesifik marker ekspresyonu ile karakterize edilen bir miyofiborblast fenotipi sergiler.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hücre biyolojisi
- Nörobilim
- Doku mühendisliği
Arka Plan
- Miyofiborblastlar doku onarımı ve fibrozda önemli bir rol oynar.
- Epitelyal-stroma etkileşimlerinin anlaşılması çeşitli biyolojik çalışmalar için esastır.
- Birincil kültürler bu etkileşimleri incelemek için uygun bir model sağlar.
- Miyofiborblastların izolasyonu, özofagus hastalıkları üzerindeki araştırmaları geliştirebilir.
Çalışmanın Amacı
- Birincil miyofiborblastları izole etmek için güvenilir bir yöntem geliştirmek.
- İzole edilen hücreleri fonksiyonel çalışmalar için karakterize etmek.
- Özofagusta epitelyal-stroma etkileşimleri üzerindeki araştırmayı kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Donör yenidoğan farelerden özofagus hasat etmek.
- Mukozayı muscularis propriadan ayırmak.
- Dokusunu kesmek ve HBSS'de yıkamak.
- Mezenkimal hücreleri serbest bırakmak için dokuyu kollagenaz ile sindirmek.
Ana Sonuçlar
- İğ şeklindeki morfolojiye sahip miyofiborblastların başarılı bir şekilde izolasyonu.
- α-SMA ve vimentin ekspresyonu miyofiborblast fenotifini doğruladı.
- Kültürlenen hücrelerde epitelyal, hematopoietik ve endotelyal markerlerin yokluğu.
- Hücreler, epitelyal-stroma etkileşimlerinin fonksiyonel çalışmaları için uygundur.
Sonuçlar
- Protokol, özofagus dokusundan birincil miyofiborblastları etkili bir şekilde izole eder.
- Karakterize edilen hücreler ileri araştırmalarda kullanılabilir.
- Bu yöntem, özofagus biyolojisinde miyofiborblastların rolünü anlamak için katkıda bulunur.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Reliable isolation and characterization of primary esophageal myofibroblasts enables disease-relevant modeling of stromal-epithelial interactions, a critical inflection point for target validation in fibrosis and tissue remodeling research. This protocol supports predictive confidence in early discovery by providing primary cell systems that closely reflect in vivo biology, reducing mechanistic ambiguity compared to immortalized lines. Consistent generation of pure stromal cultures facilitates cross-study and cross-condition comparisons, enhancing translational continuity across the R&D pipeline.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of stromal cell contributions to esophageal disease mechanisms.
- Supports functional target validation by providing primary, non-hematopoietic, non-endothelial stromal cells.
- Facilitates mechanistic de-risking through direct study of epithelial-stromal interactions.
- Improves predictive confidence for pathway and target selection in fibrotic disease research.
Screening & Assay Development
- Provides validated primary cell systems for downstream functional assays.
- Ensures assay reproducibility and standardization by confirming cell purity via flow cytometry and immunostaining.
- Enables quantitative assessment of stromal cell responses to candidate compounds.
- Supports development of disease-relevant screening platforms for esophageal disorders.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro models with in vivo disease states by using primary human and murine cells.
- Facilitates translational biomarker discovery through comparative studies across clinical and experimental conditions.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing physiologically relevant data for preclinical validation.
- Enables functional studies of stromal-epithelial crosstalk relevant to fibrosis and tissue repair.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates at the interface of early discovery and preclinical research, providing a foundation for target validation, assay development, and translational studies in esophageal disease models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating pure stromal populations for mechanistic studies.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for compound evaluation using primary myofibroblast cultures.
- Analytics: Enables robust measurement of cell marker expression and purity via flow cytometry and immunostaining.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical validation by modeling disease-relevant stromal-epithelial interactions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable protocol for isolating primary stromal cells from diverse clinical and experimental sources.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes primary cell isolation and characterization for reproducible results across studies.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by providing physiologically relevant data early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of candidates based on disease-relevant functional data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue dissection, primary cell culture, and flow cytometry analysis.
- Needs access to specialized instrumentation for cell sorting and immunostaining.
- Demands rigorous cross-team standardization to ensure reproducibility of primary cultures.
- Adaptation may be necessary for different tissue sources or disease contexts.
- Primary culture variability across donors must be managed for consistent experimental outputs.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:22
Isolating Murine Esophagi
3:51
Isolating Murine and Human Esophageal Stromal Cells
6:58
Characterizing Murine and Human Esophageal Stromal Cells
9:23
Results: Morphology, Cytochemistry and Purity of Cultured Esophageal Stromal Cells
10:56
Conclusion
