Name: 2D Elektroforez ile Makrofagların proteomik Profil (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Keşfedin, 2D diferansiyel jel elektroforezi ile insan M1 ve M2 makrofajlarının proteomik profillerini analiz etme yöntemini. Bu hassas teknik, sadece beş mikrogram protein ile protein farklılıklarını tespit eder.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Inserm tarafından desteklenmiştir. Marion Bouvet, Fransa Araştırma ve Teknoloji Bakanlığı üyesidir. Annie Turkieh, Avrupa Birliği FP7 HOMAGE (305507) tarafından verilen bir bursiyerdir.

Protokolü kurumların insan araştırma etik kurulunun yönergeleri takip eder. Sağlıklı insan donörlerden Buffy coat Bölge Kan Transfüzyon Merkezi (Lille, Fransa) elde edilmiştir. Buffy kat elde edilen Numune bir Inserm koleksiyon (n ° DC2010-1209) olarak ilan edilmiştir. 1. Malzeme ve Kültür Medya Hazırlık <ol><li> 1x PBS elde etmek için steril damıtılmış su içinde, 10X fosfat tamponlu salin (PBS) ile seyreltilir. </li><li> Ve% 10 toplanmış insan serumu olmadan gentamisin (40 ug / ml) ve L-glutamin (2 mM) ile takviye edilmiş RPMI 1640 ortamı sağlayın. </li></ol> Monosit türevli makrofajlar 2. Primer Kültürleri (MDM), <ol><li> 1x PBS ile buffycoat (25 mi) seyreltin. Dikkatlice oda sıcaklığında, 20 dakika boyunca 1600 x g&#39;de Ficoll / leucosep tüp ve santrifüj yüklemek. </li><li> Yeni bir tüp içine arayüzde monositleri toplayın. 10 ml ile yıkayın 3x PBS% 0.1 etılendiamıntetra içeren 1x1,000 xg, 370 x g ve 10 dakika her biri için 160 x g ve daha sonra bir kez 1 x PBS içinde tek başına 160 x g&#39;de, 10 dakika boyunca arka arkaya santrifüjleme ile asetik asit (EDTA). </li><li> Serumsuz 5 mi RPMI-1640 ortamı içinde hücre pelletini ve kap başına 1 x 10 6 hücre yoğunluğunda 35 mm&#39;lik kaplara hücreleri tohum. </li><li> Inkübatörde 90 dakika boyunca çökelme sonra yapışmayan hücreler ihtiva eden üst sıvıyı atmak. 1 ml PBS ile, monositlerin 3x oluşan yapışmış olan hücrelerin yıkayın; Daha sonra, daha önce serumsuz hücreler% 10 gliserol içeren taze ortam (h / h) insan serumunun 1 ml. </li><li> 6 günlük bir kültürden sonra, alternatif farklı makrofajlar (M2) elde rekombinant insan IL-4 (15 ng / ml) ekleyin ve 6 gün için muhafaza etmek. Daha sonra, M1, makrofajlar elde etmek üzere 4 saat 12. günde lipopolisakarit (100 ng / ml) ile farklılaştırılmış makrofajlar tedavi. </li></ol> 2D Elektroforez için M1 ve M2 Makrofaj Proteinlerin 3. Ekstraksiyon <ol><li> Yıkama macrophyaşları 25 mM Tris, 30 mM Tris pH 8, 4,% 3 ihtiva eden tampon içinde pH 7,4 ve hurda ile üç kez - [(3-kolamidopropil) -dimetilamonyo] -1-propansülfonat (CHAPS), 2M tioüre ve 7 M üre. </li><li> -20 ° C&#39;de bir buz ve deposunda 5 dakika için 1.5 ml mikrosantrifüj tüplerine için müsait bir mikser kullanılarak Hücreleri. </li><li> Ticari bir Bradford reaktifi kullanılarak protein konsantrasyonunu belirleyin. Kullanılana kadar -20 ° C&#39;de, proteinlerin 100 ul alikotları saklayın. </li></ol> 4. izoelektro-odaklanma NOT: Karanlıkta bütün etiketleme prosedürleri uygulayın. <ol><li> 37 ° C&#39;de 1 saat boyunca 2 mM Tris (2-karboksietil) fosfin (TCEP); ihtiva eden liziz tamponu ile 9 ul ayarlandı her bir örnek (M1 ve M2 makrofajlar) 5 ug azaltır. </li><li> 0.8 nM / ug protein konsantrasyonunda M1 özü ve M2 sülfidril-reaktif boya ekstreye siyanin 3 (Cy3) ekleyin. M1 siyanin 5 (Cy5) ilave et ve M2 0.8 nM / ug protein konsantrasyonunda alır ve inkübe37 ° C&#39;de 30 dakika karıştırıldı. </li><li> 7 M üre, 2 M tioüre, 4% CHAPS, 130 mM ditiotreitol (DTT) ve% 2 pharmalytes ihtiva eden numune tampon maddesinin eşit hacmi eklenerek reaksiyonu durdurun. </li><li> Mix bir yandan Cy5 etiketli M2 örnekleri ile M1 örnekleri Cy3 etiketli ve başka bir el Cy5 etiketli M1 örnekleri ile M2 örnekleri Cy3 etiketli. </li><li> Bir İmmobilize pH gradyanı Rehydrate (IPG) şerit (240 mm, pH 3-10 doğrusal gradyan) 7 M üre, bir İsoelektrik 2 M tiyoüre ve% 4 CHAPS odaklanarak içeren tamponda etiketli karışık örneklerin 450 ul (İEF) hücre sistemi herhangi bir akım uygulamadan 24 saat karıştırıldı. </li><li> 3 saat ve 3 saat sonunda 8,000 V 8000 V bir gradyan ile, 6 saat süre ile 1000 V bir gradyan daha sonra da 3 saat boyunca 300 volt (V) &#39;de odaklama yapın ve. </li></ol> 5. İkinci Boyut NOT: Karanlıkta bütün elektroforez işlemleri gerçekleştirin. <ol><li> Dengeleme tamponunda IPG şeritler içeren inkübe10 dakika süre ile 0.1 mM Tris-HCl (pH 8), 6 M üre,% 2 sodyum dodesil sülfat (w / v) (SDS) ve% 30 (h / h) gliserol ing. </li><li> % 12.5 PAGE jelleri üzerine, ikinci boyutta (SDS-poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE)) için dengelenmiş IPG şerit aktarma ve agaroz, erime noktası düşük ile sağlanır. </li><li> Bromofenol mavisi önü jelin dibine ulaşana kadar, gece boyunca 300 V ve ardından, 70 V sabit gerilimde, bir Ettan-Daltsix sistemi kullanılarak 20 ° C &#39;de elektroforez yapınız. </li></ol> 6. Görüntü Alma ve Biyoinformatik Analizi <ol><li> Cy5 100 um bir piksel boyutu ile görüntü elde etmek için Cy3 için 532/580 nm ve 633/670 nm uyarım / emisyon dalga boylarında, bir DIGE Görüntüleyici tarayıcı ile iki düşük floresan cam plakalar arasına dökülmektedir Tarama jeller. </li><li> Daha önce 12 ayrıntılı olarak ticari yazılım ile görüntü analizi yapın. </li><li> Hesaplayın ve her görüntüde spot hacimleri normale. Bir pervane gibi bir normalize nokta hacmi atamaHer nokta, toplam değerinin ortion jel saptanmıştır. </li><li> Iki grup (M1 ve M2) arasındaki normalize nokta hacim değeri karşılaştırarak makrofajlar her tip protein nokta hacimlerindeki farklılıkları analiz. Değişim 1.5 kat (p &lt;0.05, tek yönlü ANOVA analizi) ise anlamlı nokta hacimleri arasındaki farkı düşünün. </li></ol>

<ol><li>van Ginderachter, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classical+and+alternative+activation+of+mononuclear+phagocytes%3A+picking+the+best+of+both+worlds+for+tumor+promotion%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Classical and alternative activation of mononuclear phagocytes: picking the best of both worlds for tumor promotion.</a> Immunobiology. 211, (2006).</li>
<li>Porcheray, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+switching%3A+an+asset+for+the+resolution+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation switching: an asset for the resolution of inflammation.</a> Clin. Exp. Immunol. 142, 481-489 (2005).</li>
<li>Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+activation+of+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Alternative activation of macrophages.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).</li>
<li>Mantovani, A., Locati, M., Vecchi, A., Sozzani, S., Allavena, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoy+receptors%3A+a+strategy+to+regulate+inflammatory+cytokines+and+chemokines%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Decoy receptors: a strategy to regulate inflammatory cytokines and chemokines.</a> Trends Immunol. 22, 328-336 (2001).</li>
<li>Pinet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology%2C+homogeneity+and+functionality+of+human+monocytes-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Morphology, homogeneity and functionality of human monocytes-derived macrophages.</a> Cell. Mol. Biol. 49, 899-905 (2003).</li>
<li>Boyum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mononuclear+cells+and+granulocytes+from+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Isolation+of+monuclear+cells+by+one+centrifugation%2C+and+of+granulocytes+by+combining+centrifugation+and+sedimentation+at+1%22%5BJournal%5D)">Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood.</a> Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1. 97, 77-89 (1968).</li>
<li>Chinetti-Gbaguidi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+atherosclerotic+plaque+alternative+macrophages+display+low+cholesterol+handling+but+high+phagocytosis+because+of+distinct+activities+of+the+PPAR%CE%B3+and+LXR%CE%B1+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Human atherosclerotic plaque alternative macrophages display low cholesterol handling but high phagocytosis because of distinct activities of the PPARγ and LXRα pathways.</a> Circ. Res. 108, 985-995 (2011).</li>
<li>Tonge, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+and+development+of+fluorescence+two-dimensional+differential+gel+electrophoresis+proteomics+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Validation and development of fluorescence two-dimensional differential gel electrophoresis proteomics technology.</a> Proteomics. 1, 377-396 (2001).</li>
<li>Shaw, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+saturation+labelling+two-dimensional+difference+gel+electrophoresis+fluorescent+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Evaluation of saturation labelling two-dimensional difference gel electrophoresis fluorescent dyes.</a> Proteomics. 3, 1181-1195 (2003).</li>
<li>Dupont, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+saturation+dye+2D+DIGE+proteomics+to+characterize+proteins+modulated+by+oxidized+low+density+lipoprotein+treatment+of+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Application of saturation dye 2D DIGE proteomics to characterize proteins modulated by oxidized low density lipoprotein treatment of human macrophages.</a> J. Proteome Res. 7, 3572-3582 (2008).</li>
<li>Dupont, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+maps+and+databases+of+the+human+macrophage+proteome+and+secretome%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional maps and databases of the human macrophage proteome and secretome.</a> Proteomics. 4, 1761-1778 (2004).</li>
<li>Acosta-Martin, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+incomplete+DNase+I+treatment+on+human+macrophage+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clin.+Appl%22%5BJournal%5D)">Impact of incomplete DNase I treatment on human macrophage analysis.</a> Proteomics Clin. Appl. 3, 1236-1246 (2009).</li>
<li>Acosta-Martin, A. E., Lane, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+bioinformatics+and+MS-based+proteomics%3A+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Combining bioinformatics and MS-based proteomics: clinical implications.</a> Expert Rev Proteomics. , (2014).</li>
<li>Boytard, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+proinflammatory+CD68%2BMR-+macrophages+in+peroxiredoxin-1+expression+and+in+abdominal+aortic+aneurysms+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb.+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of proinflammatory CD68+MR- macrophages in peroxiredoxin-1 expression and in abdominal aortic aneurysms in humans.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 33, 431-438 (2013).</li>
</ol>

Beyan edilmiş bir çıkar çatışması yoktur.

Bu tarifnamede tarif edilen protokol makrofajlar, M1 (pro-enflamatuar) ve M2 (anti-iltihap) olarak iki alt-tip farklı uyaranların etkisini analiz etmek için bir yöntem göstermektedir. Daha önce 7 yayınlanan M1 ve M2 makrofajların birincil kültürleri monositlerin farklılaşması elde edilmiştir. 2D DIGE jel elektroforezi prosedür, Cy3 ve Cy5 floresans bir tarayıcı için uyarım / emisyon dalga iki kez jel tarama yapmak için SDS-PAGE için izoelektro-odaklanma, düşük floresan levhaları I...

Makrofajlar, ayırt edici fonksiyonel fenotipleri elde edebiliyoruz heterojen ve plastik hücrelerdir. İn vivo olarak, bu hücreler mikrobiyal ürünler, sitokinler, vb. 1 mikro çevre signalssuch büyük bir çeşitlilik yanıt. İn vitro, pro-enflamatuar fenotip (M + -1) makrofaj lipopolisakarit (LPS) ve interlökin-4 (IL-4) gibi sitokinler tarafından anti-iltihabik bir fenotipe (M2) tarafından indüklenebilir. Dahası, makrofajlar belirli sinyalleri 2 üzerine, tersine M2 fenotip bir aktive M1 geçiş yapabilirsiniz. Fenotip bağlı olarak, makrofajlar farklı işlevlere sahip olacaktır. M1 makrofajlar mikroorganizmaları ve tümör hücrelerini öldürmeye 3, tümör nekroz faktörü α (TNF-α) gibi pro-enflamatuar sitokinleri üreten hücrelerdir. Buna karşılık, M2 makrofajlar anti-enflamasyon üreterek yara iyileşmesi ve fibrozis gibi bu enflamatuar yanıtı önlemekörneğin 3,4, TGF-β Y faktörler. Daha önce Boyum 6 uyarlanan bir teknik kullanarak 5 tarif edilen sağlıklı donörlerden elde edilen insan periferal kan tek-çekirdekli hücreleri Ficoll yoğunluk farklı santrifüjü yoluyla izole edilmiştir. Kültür makrofajlar primer kültür 7 6 gün sonra M1 veya M2 fenotip ayırt edilebilir. Protein ekspresyonu ya da ana bilgisayar patojenik veya mikrobik toksinler gibi çeşitli kontrollü uyaranlarla altında makrofajların iki alt tip arasında, protein değişikliklerin analizi, pro- ve anti-inflamatuar makrofaj özelliğe deşifre yararlı olacaktır. Proteomiks özellikle yukarı veya çeşitli uyaranlara altında insan kültürlü makrofajlar aşağı-regüle olan proteinlerin doğrudan izlenmesi için benzersiz araçlardır. Floresan boyalar gibi düşük duyarlılık ve görüntü analizi 8 gibi 2D jel elektroforezi sınırlamaları, bazı çözdük &lt;<html> / Sup&gt;. Sistein kalıntıları ile reaksiyona sokulması boyalar lizin kalıntıları 9 ile reaksiyona kıyasla tespit karşı artmış bir hassasiyet. Önceki bir çalışmada, klasik, gümüş-lekeli 2D elektroforez 11 kıyasla çok az örnekleri 10 analizinde DIGE doygunluk etiketleme yararını göstermiştir. Bu teknoloji hızlı bir makrofaj iki alt tip arasında veya aynı tipinin muamele edilmemiş ve edilmiş makrofajlar arası protein değişiklikleri analiz etmek yararlıdır. Bu proteomik tekniğin avantajları, 2 boyutlu jel 12 analiz protein boyut ve post-translasyonel modifikasyonları bilgilere erişim sahip olanlardır. Bu analiz edilebilir numunelerin sayısının sınırlandırılması, bu yüksek verimli bir yöntem değildir dikkate alınmalıdır. Kütle spektrometresi dayalı yüksek verimli deneyler gelişimi gözden olarak son 13 bu artırabilirsiniz. _content &quot;&gt; Burada elektroforez, izoelektro-odaklanma süreçleri yoluyla kültürlü makrofajlar protein çıkarılması 2D DIGE analizi gerçekleştirmek için nasıl sunmak ve yeterli 2D yazılım kullanışlılığı SDS-PAGE yanı sıra bilgi.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Canlandırıcı</td><td>31870-074</td><td></td></tr><tr><td>PBX 10 X</td><td>Canlandırıcı</td><td>14200-083</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamin-200 mM-100X</td><td>Canlandırıcı</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>gentamisin 10 mg / ml</td><td>İçleyici</td><td>15710-049</td><td></td></tr><tr><td>insan serumu</td><td>Canlandırıcı</td><td>34005100</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll d = 1,077</td><td>ATGC</td><td>L6115</td><td></td></tr><tr><td>Leucosep</td><td>Dutscher</td><td>16760</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 6 kuyulu plaka PRIMARIA&nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td>353846</td><td></td></tr><tr><td>IL-4</td><td>Promocell</td><td>B-61410</td><td></td></tr><tr><td>lipopolisakkarit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-2654</td><td></td></tr><tr><td>Giemsa</td><td>Fluka</td><td>48900</td><td></td></tr><tr><td>EDTA MM372,2</td><td>Araştırma Organikleri&nbsp;</td><td>3.00E + 01</td><td></td></tr><tr><td>Filtre 0.22 ve mikro; m</td><td>Millipore</td><td>SCGPTORE</td><td></td></tr><tr><td>100 ml silindir</td><td>Corning</td><td>430182</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Interchim</td><td>UP242214</td><td></td></tr><tr><td>Bradford reaktifi</td><td>Bio-Rad</td><td>5000006</td><td></td></tr><tr><td>Cy3+Cy5-reaktif boya</td><td>GE Healthcare</td><td>25-8009-83</td><td></td></tr><tr><td>IPG şeridi 3-10 24cm</td><td>GE Sağlık</td><td>17-6002-44</td><td></td></tr><tr><td>Protean IEF hücresi</td><td>Bio-Rad</td><td>165-4000</td><td></td></tr><tr><td>Düşük erime noktalı agaroz</td><td>Invitrogen</td><td>15517-014</td><td></td></tr><tr><td>Ettan-Daltsix sistemi</td><td>GE Healthcare</td><td>80-6485-08</td><td></td></tr><tr><td>Ettan DIGE Görüntüleyici tarayıcı</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Progenesis Samespot Doğrusal</td><td>olmayan dinamikler</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml tüpler</td><td>herhangi bir tedarikçi</td><td>yok</td><td></td></tr><tr><td>15 ml tüpler</td><td>herhangi bir tedarikçi</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5070</td><td></td></tr><tr><td>sizin&ekanlığınız; e</td><td>Merk</td><td>108484-500</td><td></td></tr><tr><td>Thiour&eacute; e</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7875</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Bio-Rad</td><td>1610611</td><td></td></tr><tr><td>APS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Farmalitler 3-10</td><td>GE Sağlık</td><td>17-0456-01</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3773</td><td></td></tr><tr><td>Bromofenol mavisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114391</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6279</td><td></td></tr><tr><td>Akrilamid% 40</td> <td>Bio-Rad</td><td>161-0148</td><td></td></tr><tr><td>2D temizleme</td><td>GE Healthcare</td><td>80-6454-51</td><td></td></tr><tr><td>Glisin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>Loş ve eacute; thylformamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22705-6</td><td></td></tr><tr><td>elektrot fitilleri</td><td>Bio-Rad</td><td>165-4071</td><td></td></tr></tbody></table>

2d elektroforez ile makrofagların proteomik profil

Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

Burada açıklanan iki boyutlu (2B) elektroforez protokolünün amacı, insan kültürlü makrofajların fenotipinin nasıl analiz edileceğini göstermektir. Makrofajların anahtar rolü, inflamatuar, immünolojik ve enfeksiyöz hastalıklar gibi çeşitli patolojik bozukluklarda gösterilmiştir. Bu protokolde, M1 (pro-inflamatuar) veya M2 (anti-inflamatuar) fenotipine farklılaştırılabilen insan monosit türevi makrofajların birincil kültürlerini kullanıyoruz. Bu in vitro model, M1 ve M2 makrofajlarının biyolojik aktivitelerini incelemek ve ayrıca proteomik bir yaklaşım için güvenilirdir. Proteomik teknikler, konak patojenitesi sırasında M1 ve M2 makrofajlarının fenotipini ve davranışını karşılaştırmak için yararlıdır. 2D jel elektroforezi, çok sayıda proteini veya polipeptidi aynı anda haritalamak için güçlü bir proteomik tekniktir. 2D Diferansiyel Jel Elektroforezi (DIGE) adı verilen floresan boyalar kullanarak 2D elektroforez protokolünü açıklıyoruz. M1 ve M2 makrofaj proteinleri, birinci boyuttaki izoelektrik noktalarına ve ikinci boyuttaki moleküler kütlelerine göre, izoelektrik odaklama ile ayrılmadan önce siyanin boyaları ile etiketlenir. Ayrılmış protein veya polipeptit noktalar daha sonra protein veya polipeptit ekspresyon seviyelerindeki farklılıkları tespit etmek için kullanılır. Burada açıklanan proteomik yaklaşımlar, konak patojenitesi veya mikrobiyal toksinler gibi çeşitli bozukluklarla ilişkili makrofaj protein değişikliklerinin araştırılmasına izin verir.

Uygun diferansiyel proteomik analizi gerçekleştirmek için, analiz edilecek örneklerin işlenmesi doğrulanması gerekir. Önce 5 yayınlanan sunulan örnekte, makrofaj hücre kültürü kalitesi, morfolojik ve moleküler özellikler için gereklidir. Makrofajlar monositlerin farklılaşması ve kültürün homojenliği faz mikroskobu ile takip edilmiştir. Şekil 1, M1 ve M2 makrofajların primer kültürlerinde bir örnek göstermiştir. Gösterildiği gibi, M1 (Şekil 1A, B) ...

Makrofajlar, konak patojenitesinde rol oynayan anahtar hücrelerdir. Makrofajlar, proteomik analiz ile analiz edilebilen ve tespit edilebilen fenotipik ve fonksiyonel çeşitlilik gösterir. Bu makale, M1 veya M2 fenotipine farklılaşmış insan makrofajlarının birincil kültürlerinin 2D elektroforezinin nasıl gerçekleştirileceğini açıklamaktadır.

2D Elektroforez ile Makrofagların proteomik Profil

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

Bu prosedürün genel amacı, insan pro-inflamatuar M1 ve anti-inflamatuar M iki makrofaj alt kümesinin fenotipini jel elektroforezinde 2D diferansiyel ile analiz etmektir. Bu, ilk olarak birincil M1 ve M iki makrofaj kültüründen ekstrakte edilen proteinlerin sinüs boyaları ile etiketlenmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda, proteinler birbirine karıştırılır ve numuneler üzerinde rehidrasyon yoluyla ISO elektro odaklama gerçekleştirilir.Bir sonraki ikinci boyut, elektroforez, karanlıkta mobilize bir pH gradyanı veya IPG şeritleri ile gerçekleştirilir ve daha sonra jeller, jel elektroforez tarayıcısındaki diferansiyel ile taranır. Son olarak, M1 ve M iki makrofaj alt grubu arasındaki polip peptik noktalardaki farklılıkları tespit etmek için numaralandırılmış görüntülerin analizi yapılır. Bu tekniğin klasik todi jel elektroforezi gibi mevcut yöntemler arasındaki en büyük avantajı, bu tekniğin daha hassas olması, sadece beş mikrogram protein gerektirmesidir, bu da insan hastalardan elde edilen örnekler için çok önemlidir.Prosedürü gösterenler, bir doktora öğrencisi olan Mario Bove, Olivia Beza ve laboratuvarımdan Magac teknisyeni olacak Monosit türevli makrofajların birincil kültürlerini hazırlamak için, 25 mililitre Buffy ceketini 25 mililitre PBS'de seyrelterek başlayın. Daha sonra seyreltilmiş kanı dikkatlice bir ayırma gradyanına yükleyin ve hücreler dönmeyi bitirdiğinde hücreleri 1600 Gs ve oda sıcaklığında 20 dakika santrifüjleyin. Monositleri arayüz katmanında toplayın, ardından üçüncü yıkamadan sonra% 0.1 EDTA içeren 10 mililitre PBS'de hasat edilen hücrelerin art arda üç yıkaması yapın.Hücreleri yalnızca PBS'de bir kez daha döndürün ve ardından peleti serum tohumu olmadan beş mililitre RPMI 1640 ortamında yeniden süspanse edin. 35 milimetrelik tabaklardaki hücreler, tabak başına 10 ila altı hücre arasında bir yoğunlukta ve daha sonra inkübatörde 90 dakikalık bir çökeltmeden sonra, süpernatanı atın ve yapışan monositleri bir mililitre PBS ile üç kez yıkayın. Daha sonraki kültür, 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte altı gün boyunca insan serumunun hacmi başına% 10 hacim içeren 10 mililitre taze ortamdaki hücreler.Daha sonra anti-enflamatuar M iki makrofaj elde etmek için, 12. günde pro-inflamatuar makrofajlar elde etmek için kültürün altıncı gününde mililitre IL dördü başına 15 nanogram ile bazı kültürleri destekleyin. 2D elektroforez için makrofaj alt kümelerini izole etmek için farklılaşmış makrofajların diğer kültürlerini mililitre LPS başına 100 nanogram ile dört saat boyunca tedavi edin. Daha sonra, ilgilenilen kültürü 25 milimolar tris ile üç kez yıkayın ve daha sonra hücreleri plakaların tabanlarından chaps ekstraksiyon tamponu ile serbest bırakın.Daha sonra, hücreleri 1.5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve dört santigrat derecede bağlayın. Beş dakika sonra, hücreleri 100 mikrolitrelik alikotlarda, makrofaj alt kümelerinin ISO elektro odaklaması için protein konsantrasyonu analizine kadar eksi 20 santigrat derece depolamaya aktarın. İlk olarak, numuneleri dokuz mikrolitrelik alikotlara ayarlayın ve daha sonra hücre çözeltilerini 37 santigrat derecede iki milimolar TCEP ile desteklenmiş lizis tamponu ile azaltın.Bir saat sonra, ekstraktları S SI üç ve S SI beş ile 37 santigrat derecede inkübe edin ve eşit hacimde numune tamponu ilavesiyle reaksiyonu 30 dakika sonra durdurun. Daha sonra, eşit hacimlerde S, SI, üç etiketli M1 proteini, SCI beş etiketli M iki proteinden oluşan iki ayrı karışım oluşturun. Daha sonra, herhangi bir akım uygulamadan 24 saat boyunca bir izoelektrik odaklama hücre sistemi üzerinde chaps ekstraksiyon tamponunda 450 mikrolitre etiketli karışık numune içeren bir IPG şeridini yeniden sulandırın.Ertesi gün, odaklamayı üç saat boyunca 300 voltta başlatın, ardından altı saat boyunca 1000 volta bir gradyan ayarlayın, ardından IPG şeritlerini dengeleme tamponunda inkübe etmek için ikinci boyut elektroforezini gerçekleştirmek için her biri üç saat boyunca iki adet 8.000 voltluk gradyan izleyin. 10 dakika sonra şeritleri %12,5 sayfa jellerine aktarın ve düşük erime noktalı aros ile kapatın. Daha sonra, elektroforezi gece boyunca 20 santigrat derecede gerçekleştirmek için 70 voltluk sabit bir voltajda bir edindsic sistemi kullanın, ardından jellerin görüntülerini elde etmek için bromo fenol mavisi ön kısım jelin dibine ulaşana kadar 300 voltluk bir çalışma yapın.Bunları bir diferansiyel ve jel elektroforez görüntüleyici görüntüleyicinin iki düşük floresan cam plakası arasına yerleştirin ve jelleri 5 32, 5 80 nanometre üç ve 6 33 6 70 nanometre beş uyarma emisyon dalga boylarında tarayın ve 100 mikrometre piksel boyutunda görüntüler elde edin. Uygun yazılımla analiz edin ve ardından jelde tespit edilen her bir noktanın toplam değerinin bir oranı olarak normalleştirilmiş bir nokta hacmi atayarak her görüntüdeki nokta hacimlerini hesaplayın ve normalleştirin. İki makrofaj grubu arasındaki normalleştirilmiş spot hacim değerini karşılaştırarak, değişimin 1,5 kat olması durumunda spot hacimler arasındaki farkın önemli olacağını göz önünde bulundurarak, her bir makrofaj türü için protein spot hacimlerindeki farklılıkları analiz edin.Bu deneyde. Makrofajların iki alt tipi olan M1 proinflamatuar ve M iki anti-inflamatuarın 2D protein paternleri 2D diferansiyel ile belirlendi. Jel elektroforezinde, kullanılan camgöbeği boyalardan bağımsız olarak M1 veya M iki için aynı protein modeli gözlendi.İlginç bir şekilde, jelin biyoinformatik analizi, lekeler içeren 20 alanı ortaya çıkardı, nokta hacimleri arasındaki artışlar ve düşüşler, sarı, mavi ve yeşil renklenme ile görselleştirildiği gibi ölçüldü, normalleştirilmiş nokta hacminin kıvrım değişimi 1.5'ten büyükse ve P değeri 0.05'ten küçükse, önemli bir diferansiyel ifadeye sahip olduğu kabul edildi. Bu CHE'yi takiben, çeşitli uyaranlara yanıt olarak iki makrofaj alt kümesi arasında hangi tür proteinlerin farklı şekilde ifade edildiği gibi ek soruları yanıtlamak için kantitatif, kütle spektrometresi veya ek proteomik analiz gibi teklif yöntemleri gerçekleştirilebilir.

proteomic-profiling-of-macrophages-by-2d-electrophoresis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Basit ve spesifik bir yöntem, bir fraksiyonasyonu adım olmadan floresan etiketleme ve hücre yüzey proteinleri gelişmiş algılama gösterilmiştir. Hücre yüzey proteinleri Diferansiyel bereket, iki-boyutlu (2-D) elektroforez ve Ettan ™ Dige teknolojisi kullanılarak analiz edildi.

Hücre yüzey Proteinlerin CyDye Dige Fluor Minimal Boyalar kullanarak Seçici Etiketleme

Bu protokol, ökaryotik hücrelerde tam hücre MALDI-TOF kütle spektrometresinin kullanımını açıklar. Burada, makrofajların mikro çevrelerine yanıt olarak çoklu aktivasyon durumlarını analiz ederek bu tekniğin doğruluğunu gösteriyoruz.

Tüm hücre MALDI-TOF Kütle Spektrometre Makrofaj Aktivasyon Farklı Modu analiz için Doğru ve Hızlı Yöntem

İnsan ve fare beyin dokusu için üre / tiyoüre / SDS tamponu kullanılarak ortak bir protein ekstraksiyon protokolü sağlar: 2D-dige ve mini 2DE immunoblotting kendi müteakip özellik tayini ile protein indentification. Bu yöntem, insan biyopsi ve deneysel modellerden gerçekleştirilen daha güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için bir olanak sağlar.

Konsensus Beyin kaynaklı protein, 2D-DIGE ve Mini 2DE İmmünoblotting Hem kullanma İnsan ve Kemirgen Beyin proteomun Çalışmaları Ekstraksiyon Protokolü

Burada, iki çift proteomik teknikleri, yani Elektroforez (2DE) ve kütle spektrometrisi (MS) 2 boyutlu, diferansiyel primer örnekleri, iki veya daha fazla grup arasından / translasyon sonrası modifiye edilmiş proteinler olarak ifade teşhis edilmesi için bir protokol açıklar. Bu yaklaşım, birbirine işlevsel deneyler ile, prognostik parametreler / terapötik hedeflerin tanımlanması ve karakterizasyonu sağlar.

Protein fonksiyonu için bir 2DE-Jel Spot: Kronik Lenfositik Lösemide HS1 öğrendim Ders

Metabolik yeniden programlama, M1 ve M2 makrofaj polarizasyonu için bir özellik ve önkoşuldur. Bu el yazması, fare kemik iliği türevli makrofajlarda glikoliz ve mitokondriyal fonksiyonun temel parametrelerinin ölçümü için bir testi açıklamaktadır. Bu araç, belirli faktörlerin makrofajın metabolizmasını ve fenotipini nasıl etkilediğini araştırmak için uygulanabilir.

Gerçek zamanlı Ekstrasellüler Flux Analizi Polarize M1 ve M2 Kemik İliği-türevli Makrofagların Metabolik Karakterizasyonu

Bu iletişim kuralı ayırmak ve karakterize bir araştırmacı doku yerleşik sağlar makrofajlar içinde çeşitli metabolik bozuklukların diyet kaynaklı modellerinden çıkarılan iltihaplı dokulara hallmark.

Yalıtım, karakterizasyonu ve obezite ile ilgili iltihap tarafından etkilenen dokular makrofajlar arıtma

Burada, kütle spektrometresi (ayırmak ve bir iyi ve tekrarlanabilir 2DE desen sunar insan hipofiz adenom doku Proteom tanımlamak için MS) ile birleştiğinde bir iki boyutlu Jel Elektroforez (2DE) mevcut. Çoğu protein her 2DE yerde karmaşık kanser Proteom yüksek-duyarlı MS kullanımı ile analiz ederken gözlenir.

İnsan hipofiz adenom doku Proteom analizi için kütle spektrometresi yöntemleri ile birleştiğinde iki boyutlu Jel Elektroforez

Biz insan makrofajlar proteomik imzaları elde edilir ve bu düşük oksijen çevre makrofaj polarizasyon üzerindeki etkisinin belirlenmesi için geçerli bir iletişim kuralı mevcut.

Düşük oksijen ortamı altında insan makrofaj polarizasyon proteomik analizi

Protein katabolizmindeki biyolojik ritimleri otofaji ve fare karaciğerinde proteozom yoluyla ölçme protokolümüzü tanımlıyoruz.

Otophagic ve Proteasomal Akı'da Diurnal Ritimlerin Ölçülmesi

Burada, kitle spektrometresi bazlı proteomik enfeksiyon sırasında konak ve patojen arasındaki etkileşimin profilini çıkarmak için bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, tek bir deneyde hem konakçının (örneğin, makrofajlar) hem de patojenin (örneğin Cryptococcus neoformans)protein bolluğundaki değişiklikleri ölçmek için etiketsiz niceleme kullanır.

Keşif Odaklı Konak-Patojen Etkileşimleri için Etiketsiz Nicel Proteomik İş Akışı

Keşfedin, 2D diferansiyel jel elektroforezi ile insan M1 ve M2 makrofajlarının proteomik profillerini analiz etme yöntemini. Bu hassas teknik, sadece beş mikrogram protein ile protein farklılıklarını tespit eder.

2D Elektroforez ile Makrofagların proteomik Profil

Daha fazla video keşfet