Name: Nöromusküler Kavşak: Ölçme Synapse Boyut, Konfokal Floresan Mikroskobu kullanılarak sinaptik Protein Yoğunluk Parçalanma ve Değişiklikler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 18 s
Description: Öğrenin konfokal floresan mikroskobu ile sinaptik parametreleri ölçme yöntemini. Fare kaslarından sinaps boyutu, parçalanma ve postsinaptik protein yoğunluğunu nicel olarak değerlendirin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi [570930] tarafından desteklenmiştir. Görüntüleme, Bosch Enstitüsü Gelişmiş Mikroskopi Tesisi'nde gerçekleştirildi. Çalışmalarına atıfta bulunulan laboratuvarın eski üyelerine, bu yöntemlerin geliştirilmesine katkılarından dolayı teşekkür edilir.

<ol><li>Schmidt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuregulin%2FErbB+regulate+neuromuscular+junction+development+by+phosphorylation+of+%CE%B1-dystrobrevin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Neuregulin/ErbB regulate neuromuscular junction development by phosphorylation of α-dystrobrevin.</a> J Cell Biol. 195, 1171-1184 (2011).</li>
<li>Amenta, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biglycan+is+an+extracellular+MuSK+binding+protein+important+for+synapse+stability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Biglycan is an extracellular MuSK binding protein important for synapse stability.</a> J Neurosci. 32, 2324-2334 (2012).</li>
<li>Samuel, M. A., Valdez, G., Tapia, J. C., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrin+and+Synaptic+Laminin+Are+Required+to+Maintain+Adult+Neuromuscular+Junctions%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Agrin and Synaptic Laminin Are Required to Maintain Adult Neuromuscular Junctions.</a> PLOS ONE. 7, e46663(2012).</li>
<li>Valdez, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+age-related+changes+in+mouse+neuromuscular+synapses+by+caloric+restriction+and+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+%28USA%29%22%5BJournal%5D)">Attenuation of age-related changes in mouse neuromuscular synapses by caloric restriction and exercise.</a> Proc Natl Acad Sci (USA). 107, 14863-14868 (2010).</li>
<li>Yampolsky, P., Pacifici, P. G., Witzemann, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+muscle-driven+synaptic+remodeling+in+the+neuromuscular+junction+after+denervation%29%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential muscle-driven synaptic remodeling in the neuromuscular junction after denervation).</a> Eur J Neurosci. 31, 646-658 (2010).</li>
<li>Li, Y., Lee, Y., Thompson, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+Aging+Mouse+Neuromuscular+Junctions+Are+Explained+by+Degeneration+and+Regeneration+of+Muscle+Fiber+Segments+at+the+Synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Changes in Aging Mouse Neuromuscular Junctions Are Explained by Degeneration and Regeneration of Muscle Fiber Segments at the Synapse.</a> J Neurosci. 31, 14910-14919 (2011).</li>
<li>Zhu, H., Bhattacharyya, B. J., Lin, H., Gomez, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+IP3R1+receptors+amplify+physiological+and+pathological+synaptic+calcium+signals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle IP3R1 receptors amplify physiological and pathological synaptic calcium signals.</a> J Neurosci. 31, 15269-15283 (2011).</li>
<li>Valdez, G., Tapia, J. C., Lichtman, J. W., Fox, M. A., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shared+resistance+to+aging+and+ALS+in+neuromuscular+junctions+of+specific+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Shared resistance to aging and ALS in neuromuscular junctions of specific muscles.</a> PLoS ONE. 7, e34640(2012).</li>
<li>Perez-Garcia, M. J., Burden, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+MuSK+Activity+Delays+Denervation+and+Improves+Motor+Function+in+ALS+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">Increasing MuSK Activity Delays Denervation and Improves Motor Function in ALS Mice.</a> Cell reports. 2, 1-6 (2012).</li>
<li>Klooster, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle-specific+kinase+myasthenia+gravis+IgG4+autoantibodies+cause+severe+neuromuscular+junction+dysfunction+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Muscle-specific kinase myasthenia gravis IgG4 autoantibodies cause severe neuromuscular junction dysfunction in mice.</a> Brain. 135, 1081-1101 (2012).</li>
<li>Pratt, S. J., Shah, S. B., Ward, C. W., Inacio, M. P., Stains, J. P., Lovering, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+in+vivo+injury+on+the+neuromuscular+junction+in+healthy+and+dystrophic+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of in vivo injury on the neuromuscular junction in healthy and dystrophic muscles.</a> J Physiol. 591, 559-570 (2013).</li>
<li>Landis, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+call+for+transparent+reporting+to+optimize+the+predictive+value+of+preclinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research.</a> Nature. 490, 187-191 (2012).</li>
<li>Gervásio, O. L., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+ratio+of+rapsyn+to+ACh+receptor+stabilizes+postsynaptic+receptors+at+the+mouse+neuromuscular+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Increased ratio of rapsyn to ACh receptor stabilizes postsynaptic receptors at the mouse neuromuscular synapse.</a> J Physiol. 562, 673-685 (2005).</li>
<li>Gervásio, O. L., Armson, P. F., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+increase+in+the+amount+of+rapsyn+per+acetylcholine+receptor+promotes+postsynaptic+receptor+packing+and+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Developmental increase in the amount of rapsyn per acetylcholine receptor promotes postsynaptic receptor packing and stability.</a> Dev Biol. 305, 262-275 (2007).</li>
<li>Brockhausen, J., Cole, R. N., Gervásio, O. L., Ngo, S. T., Noakes, P. G., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+agrin+increases+postsynaptic+ACh+receptor+packing+by+elevating+rapsyn+protein+at+the+mouse+neuromuscular+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Neural agrin increases postsynaptic ACh receptor packing by elevating rapsyn protein at the mouse neuromuscular synapse.</a> Dev Neurobiol. 68, 1153-1169 (2008).</li>
<li>Cole, R. N., Reddel, S. W., Gervásio, O. L., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-MuSK+patient+antibodies+disrupt+the+mouse+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Anti-MuSK patient antibodies disrupt the mouse neuromuscular junction.</a> Ann Neurol. 63, 782-789 (2008).</li>
<li>Morsch, M., Reddel, S. W., Ghazanfari, N., Toyka, K. V., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+Specific+Kinase+autoantibodies+cause+synaptic+failure+through+progressive+wastage+of+postsynaptic+acetylcholine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Muscle Specific Kinase autoantibodies cause synaptic failure through progressive wastage of postsynaptic acetylcholine receptors.</a> Exp Neurol. 237, 237-286 (2012).</li>
<li>Cole, R. N., Ghazanfari, N., Ngo, S. T., Gervasio, O. L., Reddel, S. W., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient+autoantibodies+deplete+postsynaptic+Muscle+Specific+Kinase+leading+to+disassembly+of+the+ACh+receptor+scaffold+and+myasthenia+gravis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Patient autoantibodies deplete postsynaptic Muscle Specific Kinase leading to disassembly of the ACh receptor scaffold and myasthenia gravis in mice.</a> J Physiol. 588, 3217-3229 (2010).</li>
<li>Viegas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passive+and+active+immunization+models+of+MuSK-Ab+positive+myasthenia%3A+Electrophysiological+evidence+for+pre+and+postsynaptic+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Passive and active immunization models of MuSK-Ab positive myasthenia: Electrophysiological evidence for pre and postsynaptic defects.</a> Exp Neurol. 234, 506-512 (2012).</li>
<li>Morsch, M., Reddel, S. W., Ghazanfari, N., Toyka, K. V., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyridostigmine+but+not+3%2C4-diaminopyridine+exacerbates+ACh+receptor+loss+and+myasthenia+induced+in+mice+by+Muscle+Specific+Kinase+autoantibody%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Pyridostigmine but not 3,4-diaminopyridine exacerbates ACh receptor loss and myasthenia induced in mice by Muscle Specific Kinase autoantibody.</a> J Physiol. 591, 2747-2762 (2013).</li>
<li>Ghazanfari, N., Morsch, M., Reddel, S. W., Liang, S. X., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+Specific+Kinase+autoantibodies+suppress+the+MuSK+pathway+and+ACh+receptor+retention+at+the+mouse+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Muscle Specific Kinase autoantibodies suppress the MuSK pathway and ACh receptor retention at the mouse neuromuscular junction.</a> J Physiol. 592, 2881-2897 (2014).</li>
<li>Cheng, A., Morsch, M., Murata, Y., Ghazanfari, N., Reddel, S. W., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+of+age-associated+changes+to+the+mouse+neuromuscular+junction+and+the+protective+effects+of+voluntary+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Sequence of age-associated changes to the mouse neuromuscular junction and the protective effects of voluntary exercise.</a> PLoS One. 8, e67970(2013).</li>
<li>Schaefer, A. M., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+compensatory+subpopulation+of+motor+neurons+in+a+mouse+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">A compensatory subpopulation of motor neurons in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis.</a> J Comp Neurol. 490, 209-219 (2005).</li>
<li>Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+bioscience+research+reporting%3A+the+ARRIVE+guidelines+for+reporting+animal+research%5BTitle%5D)+AND+%22PLos+Biol%22%5BJournal%5D)">Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research.</a> PLos Biol. 8, e1000412(2010).</li>
<li>Shimizu, S. Routes of Administration. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShimizu%2C+S+%22The+Laboratory+Mouse%22">The Laboratory Mouse</a>. Hedrich, H. J., Bullock, G. , Elsevier. (2004).</li>
<li>Chiasson, R. B. Laboratory anatomy of the white rat. , Brown. Dubuque, Iowa. (1988).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> J. Vis. Exp. (65), e3564(2012).</li>
<li>Mitra, A. K., Stroud McCarthy, M. P., M, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structure+of+the+nicotinic+acetylcholine+receptor+and+location+of+the+major+associated+43-kD+cytoskeletal+protein%2C+determined+at+22A+by+low+dose+electron+microscopy+and+x-ray+diffraction+to+12.5A%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structure of the nicotinic acetylcholine receptor and location of the major associated 43-kD cytoskeletal protein, determined at 22A by low dose electron microscopy and x-ray diffraction to 12.5A.</a> J Cell Biol. 109, 755-774 (1989).</li>
<li>Paas, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopic+evidence+for+nucleation+and+growth+of+3D+acetylcholine+receptor+microcrystals+in+structured+lipid-detergent+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl+Acad.+Sci.+%28USA%29%22%5BJournal%5D)">Electron microscopic evidence for nucleation and growth of 3D acetylcholine receptor microcrystals in structured lipid-detergent matrices.</a> Proc. Natl Acad. Sci. (USA). 100, 11309-11314 (2003).</li>
<li>Samson, A. O., Scherf, T., Eisenstein, M., Chill, J. H., Anglister, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+for+acetylhcoline+receptor+inhibition+by+%CE%B1-neurotoxins+and+species-specific+resistance+to+%CE%B1-bungarotoxin+revealed+by+NMR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The mechanism for acetylhcoline receptor inhibition by α-neurotoxins and species-specific resistance to α-bungarotoxin revealed by NMR).</a> Neuron. 35, 319-332 (2002).</li>
<li>Ghazanfari, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+Specific+Kinase%3A+Organiser+of+synaptic+membrane+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Muscle Specific Kinase: Organiser of synaptic membrane domains.</a> Int J Biochem Cell Biol. 43, 295-298 (2011).</li>
<li>Ghazanfari, N., Morsch, M., Tse, N., Reddel, S. W., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+%CE%B22-adrenoceptor+agonist%2C+albuterol%2C+in+a+mouse+model+of+anti-MuSK+myasthenia+gravis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Effects of the β2-adrenoceptor agonist, albuterol, in a mouse model of anti-MuSK myasthenia gravis.</a> PLoS ONE. 9, e87840(2014).</li>
<li>Prakash, Y. S., Miller, S. M., Huang, M., Sieck, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+of+diaphragm+neuromuscular+junctions+on+different+fibre+types%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Morphology of diaphragm neuromuscular junctions on different fibre types.</a> J Neurocytol. 25, 88-100 (1996).</li>
<li>Salpeter, M. M., Harris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+and+turnover+rate+of+acetylcholine+receptors+throughout+the+junction+folds+at+a+vertebrate+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Distribution and turnover rate of acetylcholine receptors throughout the junction folds at a vertebrate neuromuscular junction.</a> J Cell Biol. 96, 1781-1785 (1983).</li>
<li>Soper, S. A., Nutter, H. L., Keller, R. A., Davis, L. M., Shera, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+photophysical+constants+of+several+fluorescent+dyes+pertaining+to+ultrasensitive+fluorescence+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+Photobiol%22%5BJournal%5D)">The photophysical constants of several fluorescent dyes pertaining to ultrasensitive fluorescence spectroscopy.</a> Photochem Photobiol. 57, 972-977 (1993).</li>
<li>Panchuk-Voloshina, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alexa+dyes%2C+a+series+of+new+fluorescent+dyes+that+yield+exceptionally+bright%2C+photostable+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Alexa dyes, a series of new fluorescent dyes that yield exceptionally bright, photostable conjugates.</a> J Histochem Cytochem. 47, 1179-1188 (1999).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir mali çıkarları olmadığını beyan ederler.

Burada anlatılan protokoller güvenilir ölçmek ve normal yaşlanma ve hastalık halleri dahil olmak üzere koşulları bir dizi, karşısında NMJ özelliklerinde değişiklikler ölçmek için bize sağlamıştır. tr için açıklanan yöntemler NMJ görüntüleri araştırmacılar öncesi ve postsinaptik uzmanlık alanı ve sinaptik örtüşme / uyum alanı karşılaştırmak sağlayacak karşıya. Pre-ve postsinaptik proteinler enine optik bölümleri kullanan ikinci protokol, nispi yoğunluğu karşılaştırmak için tercih edilir. Üçüncü protokol özellikle postsin...

nöromüsküler bileşke (NMJ) sinir sistemi ve iskelet kası arasındaki iletişimi aracılık kritik röle sinaps olduğunu. Her gönüllü hareket için gereklidir. Floresan mikroskobu uzun NMJ 1-3 fare transgenlerin etkilerini incelemek veya kemirgen NMJs 4-11 yaş üzerine, diyet, egzersiz ve hastalığın etkilerini karşılaştırmak için kullanılır olmuştur. Bu tür çalışmalar NMJ fizyolojisi ve patofizyolojisi hakkında bize çok şey öğretti, ama farklı parametreler (örneğin, AChR alanı, plak alan, çevre uzunluğu, parçalanma endeksleri) sık sık zor bu çalışmaların bulgularını karşılaştırmak yapmak bildirildi. Klinik öncesi araştırmacılar, özellikle hastalığın 12 kemirgen modellerinde yapılan çalışmalarda, tekrarlanabilir göstermek edebilmek için giderek artan bir beklenti var. Burada anlatılan protokoller, gelişimsel, fizyolojik ve patofizyolojik ch araştırıldı çalışmaların bir dizi rafine edilmişNMJ için anges. Bu tür çalışmalar fare motor son plak sinaptik uzmanlık alanı ve postsinaptik uzmanlık 13-15 içinde sinaptik proteinlerin ambalaj nispi yoğunluk ölçümü gerektirir. Bu yöntemlerin yarar miyasteni gravis, anti-misk bir fare modelinde, son çalışmalar açıklanmaktadır. Anti-MuSK-pozitif myastenia IgG Günlük enjeksiyonları erişkin farelere hastalar bunları 2 hafta içinde 16 zayıf hale gelmesine gravis. Kas (sinir-terminallerinde) sinaptofizin çift etiketli bölümler ve postsinaptik AChRs Konfokal maksimum projeksiyon görüntüleri birincil değişiklik olarak AChR boyama alanında ilerici bir düşüş gösterdi. Düşüş Önemli oranı sinaptik potansiyellerin, sinaptik iletim ve kas zayıflığı 17,18 başarısızlık amplitüdünde benzer düşüşler açıklamak için yeterliydi. Nitel benzer bulgular diğer araştırma grupları tarafından rapor edilmiştir10,19. Aynı NMJ ölçüm yöntemleri beri bu fare modeli 20,21 olarak gravis, anti-MuSK myastenia tedavisinde üç ilaç etkisini değerlendirmek için kullanılmaktadır. Hareketsiz yaşlanma kas bağlantılarının kaybına yol açabilir. fareler yaşlılık içine ilerleme olarak burada açıklanan protokoller, motor endplate&#39;lerin sinir terminali sinaptofizin alanında bir yaşa-bağlı düşüş ortaya koymuştur. Aynı yöntemler gönüllü egzersiz büyük ölçüde diğer gruplar 4 önceki çalışma ile uyumlu presinaptik sinir terminal alanında 22 azalma, önleyebilir ortaya koymuştur. Nöromüsküler bağlantı kaybı da amyotrofik lateral skleroz 9,23 arasında SOD1G93A fare modelinde ortaya çıkar. Yukarıda belirtilen çalışmalar sağlık koşulları çeşitli NMJ öncesi ya da post-sinaptik uzmanlık ya alanında azalmalara neden olabileceğini göstermektedir. Bu bozulmuş sinaptik eğlenceli neden olabilirction nöromüsküler bağlantı tam kaybı habercisi olabilir ya. Üç protokolleri alan ve sinaptik uzmanlık yoğunluğunun nicelendirilmesine izin veren açıklanmaktadır. İlk protokolde amacı floresan mikroskopi kullanılarak, ön ve post-sinaptik uzmanlık ve memeli NMJs bunların uyum alanlarında pratik ve yeniden üretilebilir bir ölçü temin edilmesidir. İki-boyutlu maksimum projeksiyon konfokal görüntüleri ve NIH ImageJ ile görüntü analizi sinaptofizin boyama (sinaptik veziküller), postsinaptik AChRs ve sinaptik çakışma alanının alanında değişiklikleri tespit etmek için kullanılır. Sinaptik uzmanlık alanını ayırt kullanılan görsel bilgiyi maksimize edecek şekilde Konfokal görüntüleme parametreleri (kazanç ve ofset seviyesini) Her NMJ için optimize edilmiştir. Nöromüsküler yetmezliği de postsinaptik ACHR ve / veya diğer sinaptik proteinlerin yoğunluğu değişikliklere neden olabilir. İkinci protokol postsinaptik proteinler gibi göreli yoğunluk değişiklikleri tespit etmek için uygulanabilirmisk, rapsyn, distroglikan, fosforile Src kinaz ve fosforile ACHR 18,21 olarak. Myastenia gravis olarak, postsinaptik membranın içinde ACHR azaltılmış yoğunluğu sinaptik yetmezliği ve kas güçsüzlüğü hemen nedenidir. Üçüncü protokolde ise postsinaptik membran 14,15 içindeki bitişik AChRs yakınında değişiklikleri değerlendirmek için bir flüoresan rezonans enerji transferi (FRET) yöntemi tarif etmektedir. Bu yöntem, floresan-α-bungarotoxin (bgt) ile etiketlenmiş çevre AChRs arasındaki enerji transferi tespit eder. Floresan, verici ve alıcı problar en az 10 nm ayrı olduğunda, FRET yalnızca oluşur. Bu doğrudan sinaptik potansiyellerin genlik ilgili olabilir AChR ambalaj gerginliği (mikroskopik) değişiklikleri ortaya çıkarabilir. Geçtiğimiz on yıl içinde rafine Bu üç protokol de, tutarlı ve tekrarlanabilir bir şekilde NMJ bütünlüğü tamamlayıcı ölçümler ortaya koymaktadır. Standart protokoller a Kullanımınd parametreler memeli NMJ üzerine genler ve çevresel müdahalelerin etkileri karşılaştırılmasını kolaylaştırmalıdır.

<table><tbody><tr><td>Taramalı konfokal mikroskop</td><td>Leica</td><td>DM 2000 ile&nbsp; TCS SP2 sistemi</td><td>Çoğu taramalı konfokal mikroskop uygun olmalıdır.</td></tr><tr><td></td><td>Zeiss</td><td>LSM 510 Meta&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Leica</td><td>SPE-II</td><td></td></tr><tr><td>Alexa555-a-bungarotoksin (kırmızı-BGT)</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>B35451</td><td>AChR'leri etiketlemek için kullanılır</td></tr><tr><td>Alexa647-&alfa;-bungarotoksin (uzak-kırmızı-BGT)</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>B35450</td><td>Uzak kırmızı floresan: göz merceğinden zar zor görünür&nbsp;</td></tr><tr><td>tavşan anti-sinaptofizin</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>18-0130</td><td>Etkili çalışma seyreltmesinde farklı birincil antikor grupları farklılık gösterir</td></tr><tr><td>FITC-anti-rapsyn mab1234</td><td>Milipore</td><td>FCMAB134F</td> FITC-eşek anti-tavşan karşıtı IgG Jackson 711-095-152 ile <td>konjuge monoklonal antikor</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Poliklonal ikincil antikorların kalitesi kaynağa ve partiye</td></tr> <tr><td>göre değişebilirOptimum Kesme Sıcaklığı bileşiği (OTC)</td><td>ProSciTech</td><td>IA018</td><td>Kasların dondurulması ve nbsp için kriyostat gömme matrisi</td></tr><tr><td>DABCO</td><td>Sigma</td><td>10981</td><td>Floroforların fotoağartılmasını yavaşlatan montaj ortamı</td></tr></tbody></table>

nöromusküler kavşak: Ölçme synapse boyut, konfokal floresan mikroskobu kullanılarak sinaptik protein yoğunluk parçalanma ve değişiklikler

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

nöromüsküler bileşke (NMJ) memeli motor nöronların istemli kas kasılması kontrol hangi aracılığıyla, büyük, kolinerjik röle sinaps olduğunu. NMJ yapısal değişiklikler zayıflık, atrofi ve kas lifi hatta ölümle sonuçlanan, nörotransmısyonunun başarısızlıkla sonuçlanabilir. Birçok çalışma, genetik modifikasyon veya hastalık fare NMJ yapısını değiştirebilir nasıl araştırdık. Ne yazık ki, doğrudan genellikle farklı parametreler ve analitik yöntemler istihdam nedeniyle bu çalışmalardan elde edilen bulguları karşılaştırmak zor olabilir. Üç protokolleri burada açıklanmıştır. İlk asetilkolin reseptörü (AChR) alanını ölçmek için maksimum intensite projeksiyon konfokal görüntüleri kullanır son plak ve örten presinaptik sinir terminal sinaptik vezikül boyama alanında bakımından zengin postsinaptik membran alanları. İkinci protokol postsinaptik membranın sinaptik proteinlerin immün için göreli yoğunluklarını karşılaştırır. Üçüncü protocol son plak de postsinaptik AChRs ambalaj değişiklikleri tespit etmek için Floresan Rezonans Enerji Transferi (FRET) kullanır. protokolleri geliştirildi ve çalışmaların bir dizi üzerinde rafine edilmiş. Kalite ve sonuç tutarlılığı etkileyen faktörler tartışılmıştır ve sayısal veriler, sağlıklı, genç, yetişkin farelerde NMJs verilmektedir.

NMJ sinaptik Alanı Ölçümü Alan herhangi bir tahmin sinaptik uzmanlık derecesini tanımlamak için bir sınır çizim dayanır. Sağlıklı genç erişkin kaslarda NMJ görüntüleri ACHR ve sinaptofizin boyama (Şekil 2A ve B) hem de iyi tanımlanmış sınırlar göstermelidir. ACHR ve sinaptofizin hem Floresan yoğunluğu, motor son plağın (Şekil 5A 've B')-peri sinaptik ve sinaptik kısmı arasındaki sınırda keskin yükselir. Bu t...

Nöromüsküler kavşak (NMJ), bazen sinaptik yetmezlikle sonuçlanabilen çeşitli durumlarda değişir. Bu rapor, bu tür yapısal değişiklikleri ölçmek için floresan mikroskobu tabanlı yöntemleri açıklamaktadır.

Nöromusküler Kavşak: Ölçme Synapse Boyut, Konfokal Floresan Mikroskobu kullanılarak sinaptik Protein Yoğunluk Parçalanma ve Değişiklikler

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Bu prosedürün genel amacı, sinaps boyutu, parçalanma ve post sinaptik zardaki proteinlerin nispi yoğunluğu dahil olmak üzere sinaptik parametreleri objektif olarak ölçmektir. Bu, ilk olarak deney hayvanlarından ilgilenilen kasın diseke edilmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra, disseke edilen kas kriyo kesitine alınır ve bölümler floresan mikroskobu için immün boyadır.Daha sonra fos üzerinde, farklı tedavi gruplarından nöromüsküler kavşakların görüntüleri objektif olarak örneklenir ve sinaptik uzmanlıklar için boyamanın nispi yoğunluğu ölçülür. Sonuç olarak, bir tedavinin veya genetik modifikasyonun nöromüsküler kavşağın yapısal organizasyonu üzerindeki etkilerinin tekrarlanabilir kantitatif ölçümleri konfokal mikroskopi ile elde edilir. Bu yöntem, myastenia gravis ve motor nöron hastalığı gibi bozuklukların fare modellerinde nöromüsküler kavşağın yapısındaki değişiklikleri değerlendirmek için konfokal mikroskopi kullanarak standartlaştırılmış objektif protokoller sağlar.Genel olarak, bu yöntemi deneyen kişiler bunu zor bulabilir çünkü NPLS'den konfokal mikroskopta tarafsız ve objektif bir şekilde numune almak planlama gerektirir NPLS'nin örnekleme analizinin tutarlı ve tekrarlanabilir bir şekilde yapılması gerekir ve nplate parametreleri arasındaki hayvandan hayvana değişkenlik bunu zorlaştırabilir. Kriyoseksiyon ve immünofloresan boyamayı izole ettikten sonra, metin protokolüne göre fare nöromüsküler kavşakları veya njs, NMJ parametrelerinin nicelleştirilmesi tamamlanana kadar her birini yalnızca ikinci bir araştırmacı tarafından bilinen rastgele bir sayı ile etiketleyerek slaytları kör edin. Mikroskop tablasına bir slayt yerleştirin ve geniş alan aydınlatması altında görüntülemek için bir trit C filtre seti kullanın.Konfokal iğne deliği 1.0 havadar birime ayarlanmış olarak alanda bir uç plaka görünene kadar alanlar arasında soldan sağa ve geriye doğru kademeli olarak hareket edin ve düşük lazer gücü kullanarak, uç plakadaki trit C kırmızı BGT için kazanç ve ofset seviyelerini optimize edin görüntülenecek. Daha sonra, 488 nanometre lazeri kullanarak, sinaptofini temsil eden uygun C floresansını optimize edin, ardından her optik dilim arasında 0,7 mikronluk bir aralıkla uç plakanın bir Z yığınını toplayın. Görüntüleri, görüntüleme oturumunun tarihini, slaytın kod adını ve uç plakanın numarasını içeren bir dosya adıyla kaydedin.Slayttan veya numuneden 20 uç plaka toplanana kadar az önce gösterilen numune alma ve görüntüleme prosedürünü tekrarlayın. Ardından, aynı konfokal ayarlar altında kalan kodlanmış slaytlar için işlemi tekrarlayın. Kontrol slaytından birkaç resim çekin.Bir Zack açmak için ücretsiz image J yazılımını kullanın ve bir floresan kanalında maksimum projeksiyon görüntüsü hazırlayın. Projeksiyonları, görüntü oturum tarihi, örnek kodu, uç plaka numarası ve floresan kanalı dahil olmak üzere dosya adıyla TIF dosyaları olarak kaydedin. Şimdi Z projeksiyonunu açmak için J görüntüsünü kullanın.Asetilkolin reseptörünü veya A CHR görüntü kanalını seçin ve 24 bit RGB renkli görüntüyü çokgen aracıyla ekranda sekiz bit gri tonlamalı bir görüntüye dönüştürmek için sekiz bit görüntü türünü seçin. Kırmızı BGT boyama kanalında, ilgilenilen uç plakadan kaynaklanmayan herhangi bir lekelenme hariç, ilgilenilen uç plakanın etrafına kaba bir taslak çizin. Görüntüye minimum yoğunluk eşiği uygulamak için görüntü ayarlama eşiğini seçin.Çevredeki arka plan sinyalini alt eşik olarak hariç tutarken A CHR lekeli kısımları izole etmek için eşik seviyesini ayarlayın. Ardından, karşılaştırma için orijinal tam tonlu görüntünün bulunduğu ikinci bir pencere açın. Poligon anahattı hala mevcutken eşik ayarlarını onaylamak için, açılır menüde analiz et, parçacıkları analiz et'i seçin.Piksel sayısı olarak boyut aralığını 50 ila sonsuz olarak belirtin, bu da elektriksel gürültüden kaynaklanan küçük artefaktların seçimini ortadan kaldırır. Fotoğraf çarpanında, gizli supra eşik alanlarının bir listesini ve ikili görüntüde göründükleri gibi numaralandırılmış floresan yoğunluğu değerlerini içeren bir pencere oluşturmak için parçacıkları analiz et'e tıklayın. Toplam uç plaka alanını ölçmek için bu verileri etiketli bir elektronik tabloya kopyalayın.Poligon içinde Ölçümü analiz et'i seçin, A CHR alanları ve yoğunlukları için verileri kopyalayıp etiketli sütunlara sahip bir elektronik tabloya yapıştırın. Sinaptofizin kanalına geçin. Maksimum projeksiyon görüntüsü hazırlayın.Bir ilgi alanı seçin ve minimum yoğunluk eşiğini az önce gösterildiği gibi ayarlayın. Örtüşme alanını ölçmek için aşağıdaki adımları uygulayın. İki kanal görüntüsünü içeren orijinal dosyayı açın ve görüntü yığınlarını seçin.İki ayrı görüntüye bölmek için görüntülere yığınlayın. Görüntü J kolokalizasyon eklentisini kullanarak, eklenti kolokalizasyonunu seçin ve A CHR ve sinir kanalları için daha önce kaydedilen eşik değerlerini ilgili kanal sorgu kutusuna girin. Sonuç, beyaz piksellerde örtüşen bir görüntüdür.Yeni oluşturulan örtüşme görüntüsünü gri tonlama formatına dönüştürün ve yalnızca önceki iki kanalın örtüşme alanına karşılık gelen beyaz pikselleri seçecek olan maksimum değere bir eşik uygulayın. Piksel cinsinden örtüşme alanını temsil eden kolokalizasyonun elde edilen alan değerini elektronik tabloya kaydedin, bir veri elektronik tablosu hazırlayın. Örnek, standart sapmaları ve standart hataları histogram veya dağılım grafikleri olarak hesaplamak ve çizmek anlamına gelir.İstatistiksel testten önce verilerin normal olarak dağılıp dağılmadığını belirlemek için CHR alanlarını dağılım grafikleri veya frekans histogramları olarak çizin ve plaka A'yı seçin. Metin protokolünde belirtildiği gibi immünofloresan boyamayı ve enine kas lifi bölümlerinin görüntülemesini hazırladıktan sonra, orijinal bir görüntü dosyası açın ve A CHR kanalını görüntülerken, kanalları bölmek için görüntü yığınlarını görüntülere yığınlayın, sekiz bit gri tonlama formatını ekrana dönüştürmek için görüntü türünü sekiz bit seçin. Bunu her iki floresan kanalı için de yapın.Görüntü yığınlarını seç, daha önce ayrılmış iki sekiz bitlik görüntüden yeni bir yığın oluşturmak ve açmak için görüntüleri seçer, bu da çokgen aracıyla tek bir pencere içindeki iki floresan kanalı arasında geçiş yapmayı sağlar. A CHR boyamanın sınırının etrafına sıkıca bir çizgi çizin, kapalı alan içindeki A CHR'nin ortalama yoğunluğunu ölçmek için analiz ölçümünü seçin. Çokgen anahattını koruyarak bu değeri etiketli bir elektronik tabloya kopyalayın.İkinci floresan kanalına geçin ve ölçümü analiz et'i seçin. Bu, A CHR boyaması ile tanımlanan sinaptik alan içindeki ilgilenilen protein için ortalama boyamayı verecektir. Görünür uç plaka lekelenmesinden uzak bir alan seçin.Ardından, ortalama arka plan floresan yoğunluğunu ölçmek için analiz ölçüsünü seçin. Diğer floresan kanalları için ölçümü tekrarlayın ve arka plan değerlerini floresan değerleri elektronik tablosuna kopyalayın. A CHR için düzeltilmiş yoğunlukları ve her bir uç plakadaki ilgilenilen proteini elde etmek için ortalama arka plan değerlerini uç plaka değerlerinden çıkarın.Son olarak, burada gösterildiği gibi floresan yoğunluk oranlarını elde etmek için ilgilenilen protein için düzeltilmiş nplate yoğunluk değerlerini düzeltilmiş BGT floresan yoğunluğuna bölün. Hem A CHR hem de sinaptofizin için floresan yoğunluğu, motor uç plakasının PERS sinaptik ve sinaptik kısmı arasındaki sınırda keskin bir şekilde yükselir. Bu tür görüntüler için, minimum bir eşik, uç plakanın A CHR açısından zengin veya sinaptofizin açısından zengin alanını kolayca izole edecektir.Bu şekilde yaşlı farelerde ve bazı hastalık durumlarında gösterildiği gibi, sinaptofizin için uç plaka boyaması daha az yoğun olabilir. Bir CHR küme kenarları bulanık görünebilir ve daha yüksek seviyelerde ekstra sinaptik Otofloresan saçılma grafikleri olabilir, herhangi bir farenin tibiallerinin ön kasının uç plakaları arasında A CHR açısından zengin alanda önemli bir aralık ortaya çıkarır. Bununla birlikte, yüz uç plakası görüntülerinde 15 ila 20 arasında dayanan ortalama A CHR alanı, yedi örnek fare arasında benzerdi Enine kesitlerde, uç plaka achr tipik olarak bir hilal şekli olarak görünür, ancak bu şekil burada gösterildiği gibi genellikle düzensizdir.Burada Sinaptofizin kanalında gösterildiği gibi düşük yoğunluklu arka plan floresansı, genellikle bir CHR boyama yamasının tek bir uç plakayı mı yoksa bitişik kas lifleri üzerinde bulunan iki ayrı uç plakayı mı temsil ettiğini ortaya çıkarır. Ek olarak, rapson, misk ve beta distro glikan gibi birçok sinaptik protein, nplate'de bir CHR ile birlikte lokalize edilir. Bu prosedürü denerken, deneycilerin nplate görüntülerinin örneklenmesi ve analizi sırasında tedavi ve genotip gruplarına karşı kör kalmaları önemlidir.Bu videoyu izledikten sonra, nöromüsküler kavşakların konfokal floresan görüntülerinin nasıl toplanacağını, örnekleneceğini ve analiz edileceğini iyi anlamış olmalısınız. Sonuç olarak, araştırmacılar, farklı tedavi grupları ve genotipler arasında nplate'in farklı yapısal parametrelerini tutarlı ve objektif bir şekilde karşılaştırabilmelidir.

the-neuromuscular-junction-measuring-synapse-size-fragmentation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu protokol, ayrışmış nöronal kültür ve immünsitokimya kullanarak beyin bölümlerinde de sinaps sayısını ölçmek için nasıl ayrıntıları. Kompartman-spesifik antikorların kullanarak, presinaptik terminalleri yanı sıra postsinaptik uzmanlık siteleri etiket. Biz bu belirteçler tarafından oluşturulan sinyaller arasındaki sinaps ko noktaları olarak tanımlar.

Sinapslar miktarının: Synapse Numarası ölçmek için bir İmmünositokimya tabanlı Testi

Kavşaklarda bulunan kümelenmiş nörotransmitter reseptörlerinin bolluğu güçlü sinaptik gücü etkiler. Bu yöntem tek-sinaps çözünürlükte üç boyutlu olarak floresan etiketli nörotransmitter reseptörleri...

Içinde Synaptic florasan Otomatik Sayısallaştırma<em&gt; C. elegans</em

Drosophila nöromüsküler kavşağı (NMJ), sinapsların morfolojisini ve işlevini incelemek için bir model olarak kullanılır. Bu video, araştırmacıların NMJ'yi karakterize etmek için ölçtüğü önemli özellikleri açıklamaktadır. Örnek protokol, nicelemeyi otomatik olarak gerçekleştirebilen bir yazılımı gösterir.

Drosophila Nöromüsküler Kavşak (NMJ) Miktar Tayini: Sinaptik Morfoloji ve Fonksiyonu Değerlendirmek İçin Bir Yöntem

Kaynak: Marinello, M., et al. Kombine konfokal ve süper çözünürlüklü mikroskopi ile farelerde nöromüsküler kavşakların karakterizasyonu. J. Vis. Uzm. (2021)Bu video, presinaptik ve postsinaptik yapıları görselleştirmek ve analiz etmek için konfokal ve süper çözünürlüklü mikroskopi kullanılarak sıçan kas dokusundaki nöromüsküler kavşakların hazırlanmasını, immüno-boyanmasını ve görüntülenmesini göstermektedir.

Kombine Konfokal ve Süper Çözünürlüklü Mikroskopi ile Farelerde Nöromüsküler Kavşakların Karakterizasyonu

Doğru bir şekilde belirlenmesi ve Hipokampal dilimleri ayirt kullanarak sinapslarda analiz için bir protokol bu makalesinde ana hatlarıyla.

Hipokampal kemirgen beyin dilimleri dansitesi Synapse değerlendirilmesi

Bu protokol, primer nöronal kültürlerde protein ko-lokalizasyonunu incelemek için süper çözünürlüklü mikroskopinin nasıl yapılacağını göstermektedir.

Primer Nöronlarda Proteinlerin ve Sinaptik Belirteçlerin Eş Lokalizasyonunun İncelenmesinde Süper Çözünürlüklü Görüntüleme

Nöromüsküler kavşak bileşenlerini doğru bir şekilde tespit edebilme yeteneği, patolojik veya gelişimsel süreçler nedeniyle mimarisindeki değişikliklerin değerlendirilmesinde çok önemlidir. Burada, nicel ölçümler yapmak için kullanılabilecek tam montajlı nöromüsküler kavşakların yüksek kaliteli görüntülerini elde etmek için basit bir yöntemin tam bir açıklamasını sunuyoruz.

Tüm Mount Nöromüsküler Kavşakların İmmünofluoresan ve Morfometrik Analizleri için Tek İskelet Kas Liflerinin Diseksiyonu

Sinaptik iletim için gerekli olan hücre altı olayları görselleştirmek için iki ilgili yöntem tanımlanmıştır. Bu protokoller, in vitro kültürlü nöronların canlı hücre görüntülemesini kullanarak presinaptik kalsiyum akışı ve sinaptik vezikül membran füzyonunun dinamiklerinin gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlar.

Amiyotrofik Lateral Skleroz Modellerinde Sinaptik Fonksiyonların Gerçek Zamanlı Floresan Ölçümü

Bu protokol, SMA ve ColQ ile ilişkili CMS'nin fare modellerindeki patolojik değişiklikleri ölçmek için kullanılan kombine konfokal ve STED mikroskopisi ile nöromüsküler kavşakların morfometrik analizi için bir yöntemi açıklamaktadır.

Farelerde Nöromüsküler Kavşakların Kombine Konfokal ve Süper Redüksiyonlu Mikroskopi ile Karakterizasyonu

DetectSyn, tedaviler veya hastalık durumları arasında göreceli sinaps (sinaptik öncesi ve sonrası) sayısındaki değişiklikleri ölçen tarafsız, hızlı bir floresan testidir. Bu teknik, hem kültürlü nöronlarda hem de sabit dokuda kullanılabilen bir yakınlık ligasyonu tekniği kullanır.

DetectSyn: Sinaps Yoğunluğundaki Değişiklikleri Tespit Etmek için Hızlı, Tarafsız Bir Floresan Yöntemi

Protokol, kesilmiş sinirden fare motor sinir terminallerine floresan kalsiyum boyası yükleme yöntemini açıklar. Ek olarak, konfokal mikroskopi kullanarak periferik sinir uçlarındaki hızlı kalsiyum geçicilerini kaydetmek için benzersiz bir yöntem sunulmuştur.

Konfokal Mikroskopi Kullanılarak Fare Nöromüsküler Kavşağında Yüksek Zamansal Çözünürlükte Kalsiyum Geçici Maddelerinin Kaydı

Öğrenin konfokal floresan mikroskobu ile sinaptik parametreleri ölçme yöntemini. Fare kaslarından sinaps boyutu, parçalanma ve postsinaptik protein yoğunluğunu nicel olarak değerlendirin.

Nöromusküler Kavşak: Ölçme Synapse Boyut, Konfokal Floresan Mikroskobu kullanılarak sinaptik Protein Yoğunluk Parçalanma ve Değişiklikler (Video) | JoVE Journal

Nöromusküler Kavşak: Ölçme Synapse Boyut, Konfokal Floresan Mikroskobu kullanılarak sinaptik Protein Yoğunluk Parçalanma ve Değişiklikler

Daha fazla video keşfet