Nöromusküler Kavşak: Ölçme Synapse Boyut, Konfokal Floresan Mikroskobu kullanılarak sinaptik Protein Yoğunluk Parçalanma ve Değişiklikler

Bu prosedürün genel amacı, sinaps boyutu, parçalanma ve post sinaptik zardaki proteinlerin nispi yoğunluğu dahil olmak üzere sinaptik parametreleri objektif olarak ölçmektir. Bu, ilk olarak deney hayvanlarından ilgilenilen kasın diseke edilmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra, disseke edilen kas kriyo kesitine alınır ve bölümler floresan mikroskobu için immün boyadır.

Daha sonra fos üzerinde, farklı tedavi gruplarından nöromüsküler kavşakların görüntüleri objektif olarak örneklenir ve sinaptik uzmanlıklar için boyamanın nispi yoğunluğu ölçülür. Sonuç olarak, bir tedavinin veya genetik modifikasyonun nöromüsküler kavşağın yapısal organizasyonu üzerindeki etkilerinin tekrarlanabilir kantitatif ölçümleri konfokal mikroskopi ile elde edilir. Bu yöntem, myastenia gravis ve motor nöron hastalığı gibi bozuklukların fare modellerinde nöromüsküler kavşağın yapısındaki değişiklikleri değerlendirmek için konfokal mikroskopi kullanarak standartlaştırılmış objektif protokoller sağlar.

Genel olarak, bu yöntemi deneyen kişiler bunu zor bulabilir çünkü NPLS'den konfokal mikroskopta tarafsız ve objektif bir şekilde numune almak planlama gerektirir NPLS'nin örnekleme analizinin tutarlı ve tekrarlanabilir bir şekilde yapılması gerekir ve nplate parametreleri arasındaki hayvandan hayvana değişkenlik bunu zorlaştırabilir. Kriyoseksiyon ve immünofloresan boyamayı izole ettikten sonra, metin protokolüne göre fare nöromüsküler kavşakları veya njs, NMJ parametrelerinin nicelleştirilmesi tamamlanana kadar her birini yalnızca ikinci bir araştırmacı tarafından bilinen rastgele bir sayı ile etiketleyerek slaytları kör edin. Mikroskop tablasına bir slayt yerleştirin ve geniş alan aydınlatması altında görüntülemek için bir trit C filtre seti kullanın.

Konfokal iğne deliği 1.0 havadar birime ayarlanmış olarak alanda bir uç plaka görünene kadar alanlar arasında soldan sağa ve geriye doğru kademeli olarak hareket edin ve düşük lazer gücü kullanarak, uç plakadaki trit C kırmızı BGT için kazanç ve ofset seviyelerini optimize edin görüntülenecek. Daha sonra, 488 nanometre lazeri kullanarak, sinaptofini temsil eden uygun C floresansını optimize edin, ardından her optik dilim arasında 0,7 mikronluk bir aralıkla uç plakanın bir Z yığınını toplayın. Görüntüleri, görüntüleme oturumunun tarihini, slaytın kod adını ve uç plakanın numarasını içeren bir dosya adıyla kaydedin.

Slayttan veya numuneden 20 uç plaka toplanana kadar az önce gösterilen numune alma ve görüntüleme prosedürünü tekrarlayın. Ardından, aynı konfokal ayarlar altında kalan kodlanmış slaytlar için işlemi tekrarlayın. Kontrol slaytından birkaç resim çekin.

Bir Zack açmak için ücretsiz image J yazılımını kullanın ve bir floresan kanalında maksimum projeksiyon görüntüsü hazırlayın. Projeksiyonları, görüntü oturum tarihi, örnek kodu, uç plaka numarası ve floresan kanalı dahil olmak üzere dosya adıyla TIF dosyaları olarak kaydedin. Şimdi Z projeksiyonunu açmak için J görüntüsünü kullanın.

Asetilkolin reseptörünü veya A CHR görüntü kanalını seçin ve 24 bit RGB renkli görüntüyü çokgen aracıyla ekranda sekiz bit gri tonlamalı bir görüntüye dönüştürmek için sekiz bit görüntü türünü seçin. Kırmızı BGT boyama kanalında, ilgilenilen uç plakadan kaynaklanmayan herhangi bir lekelenme hariç, ilgilenilen uç plakanın etrafına kaba bir taslak çizin. Görüntüye minimum yoğunluk eşiği uygulamak için görüntü ayarlama eşiğini seçin.

Çevredeki arka plan sinyalini alt eşik olarak hariç tutarken A CHR lekeli kısımları izole etmek için eşik seviyesini ayarlayın. Ardından, karşılaştırma için orijinal tam tonlu görüntünün bulunduğu ikinci bir pencere açın. Poligon anahattı hala mevcutken eşik ayarlarını onaylamak için, açılır menüde analiz et, parçacıkları analiz et'i seçin.

Piksel sayısı olarak boyut aralığını 50 ila sonsuz olarak belirtin, bu da elektriksel gürültüden kaynaklanan küçük artefaktların seçimini ortadan kaldırır. Fotoğraf çarpanında, gizli supra eşik alanlarının bir listesini ve ikili görüntüde göründükleri gibi numaralandırılmış floresan yoğunluğu değerlerini içeren bir pencere oluşturmak için parçacıkları analiz et'e tıklayın. Toplam uç plaka alanını ölçmek için bu verileri etiketli bir elektronik tabloya kopyalayın.

Poligon içinde Ölçümü analiz et'i seçin, A CHR alanları ve yoğunlukları için verileri kopyalayıp etiketli sütunlara sahip bir elektronik tabloya yapıştırın. Sinaptofizin kanalına geçin. Maksimum projeksiyon görüntüsü hazırlayın.

Bir ilgi alanı seçin ve minimum yoğunluk eşiğini az önce gösterildiği gibi ayarlayın. Örtüşme alanını ölçmek için aşağıdaki adımları uygulayın. İki kanal görüntüsünü içeren orijinal dosyayı açın ve görüntü yığınlarını seçin.

İki ayrı görüntüye bölmek için görüntülere yığınlayın. Görüntü J kolokalizasyon eklentisini kullanarak, eklenti kolokalizasyonunu seçin ve A CHR ve sinir kanalları için daha önce kaydedilen eşik değerlerini ilgili kanal sorgu kutusuna girin. Sonuç, beyaz piksellerde örtüşen bir görüntüdür.

Yeni oluşturulan örtüşme görüntüsünü gri tonlama formatına dönüştürün ve yalnızca önceki iki kanalın örtüşme alanına karşılık gelen beyaz pikselleri seçecek olan maksimum değere bir eşik uygulayın. Piksel cinsinden örtüşme alanını temsil eden kolokalizasyonun elde edilen alan değerini elektronik tabloya kaydedin, bir veri elektronik tablosu hazırlayın. Örnek, standart sapmaları ve standart hataları histogram veya dağılım grafikleri olarak hesaplamak ve çizmek anlamına gelir.

İstatistiksel testten önce verilerin normal olarak dağılıp dağılmadığını belirlemek için CHR alanlarını dağılım grafikleri veya frekans histogramları olarak çizin ve plaka A'yı seçin. Metin protokolünde belirtildiği gibi immünofloresan boyamayı ve enine kas lifi bölümlerinin görüntülemesini hazırladıktan sonra, orijinal bir görüntü dosyası açın ve A CHR kanalını görüntülerken, kanalları bölmek için görüntü yığınlarını görüntülere yığınlayın, sekiz bit gri tonlama formatını ekrana dönüştürmek için görüntü türünü sekiz bit seçin. Bunu her iki floresan kanalı için de yapın.

Görüntü yığınlarını seç, daha önce ayrılmış iki sekiz bitlik görüntüden yeni bir yığın oluşturmak ve açmak için görüntüleri seçer, bu da çokgen aracıyla tek bir pencere içindeki iki floresan kanalı arasında geçiş yapmayı sağlar. A CHR boyamanın sınırının etrafına sıkıca bir çizgi çizin, kapalı alan içindeki A CHR'nin ortalama yoğunluğunu ölçmek için analiz ölçümünü seçin. Çokgen anahattını koruyarak bu değeri etiketli bir elektronik tabloya kopyalayın.

İkinci floresan kanalına geçin ve ölçümü analiz et'i seçin. Bu, A CHR boyaması ile tanımlanan sinaptik alan içindeki ilgilenilen protein için ortalama boyamayı verecektir. Görünür uç plaka lekelenmesinden uzak bir alan seçin.

Ardından, ortalama arka plan floresan yoğunluğunu ölçmek için analiz ölçüsünü seçin. Diğer floresan kanalları için ölçümü tekrarlayın ve arka plan değerlerini floresan değerleri elektronik tablosuna kopyalayın. A CHR için düzeltilmiş yoğunlukları ve her bir uç plakadaki ilgilenilen proteini elde etmek için ortalama arka plan değerlerini uç plaka değerlerinden çıkarın.

Son olarak, burada gösterildiği gibi floresan yoğunluk oranlarını elde etmek için ilgilenilen protein için düzeltilmiş nplate yoğunluk değerlerini düzeltilmiş BGT floresan yoğunluğuna bölün. Hem A CHR hem de sinaptofizin için floresan yoğunluğu, motor uç plakasının PERS sinaptik ve sinaptik kısmı arasındaki sınırda keskin bir şekilde yükselir. Bu tür görüntüler için, minimum bir eşik, uç plakanın A CHR açısından zengin veya sinaptofizin açısından zengin alanını kolayca izole edecektir.

Bu şekilde yaşlı farelerde ve bazı hastalık durumlarında gösterildiği gibi, sinaptofizin için uç plaka boyaması daha az yoğun olabilir. Bir CHR küme kenarları bulanık görünebilir ve daha yüksek seviyelerde ekstra sinaptik Otofloresan saçılma grafikleri olabilir, herhangi bir farenin tibiallerinin ön kasının uç plakaları arasında A CHR açısından zengin alanda önemli bir aralık ortaya çıkarır. Bununla birlikte, yüz uç plakası görüntülerinde 15 ila 20 arasında dayanan ortalama A CHR alanı, yedi örnek fare arasında benzerdi Enine kesitlerde, uç plaka achr tipik olarak bir hilal şekli olarak görünür, ancak bu şekil burada gösterildiği gibi genellikle düzensizdir.

Burada Sinaptofizin kanalında gösterildiği gibi düşük yoğunluklu arka plan floresansı, genellikle bir CHR boyama yamasının tek bir uç plakayı mı yoksa bitişik kas lifleri üzerinde bulunan iki ayrı uç plakayı mı temsil ettiğini ortaya çıkarır. Ek olarak, rapson, misk ve beta distro glikan gibi birçok sinaptik protein, nplate'de bir CHR ile birlikte lokalize edilir. Bu prosedürü denerken, deneycilerin nplate görüntülerinin örneklenmesi ve analizi sırasında tedavi ve genotip gruplarına karşı kör kalmaları önemlidir.

Bu videoyu izledikten sonra, nöromüsküler kavşakların konfokal floresan görüntülerinin nasıl toplanacağını, örnekleneceğini ve analiz edileceğini iyi anlamış olmalısınız. Sonuç olarak, araştırmacılar, farklı tedavi grupları ve genotipler arasında nplate'in farklı yapısal parametrelerini tutarlı ve objektif bir şekilde karşılaştırabilmelidir.