Küresellerde Memeli Hücrelerinin Büyük ölçekli Genişleme için sürekli Beslenme ile Besin Yönetmeliği

Bu işlemin genel amacı, kontrollü besin koşulları altında çok sayıda hücreyi kültürlemektir. Bir hücre kültürü laboratuvarında bulunan geleneksel ekipmanı kullanarak. İlişkili algoritmalar, besin maddelerinin deneysel aralıklar içinde kontrolüne ve manipülasyonuna izin verir.

Bu yöntem, büyük ölçekli hücre kültürü uygulamaları için temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. İnsan hücresel tedavileri gibi. Bu tekniğin temel avantajı, besin ve gazların eşit dağılımı ile hücrelerin büyük ölçekte tesis kültürüdür.

Bu, statik veya toplu beslenen hücre kültürlerinden daha yüksek hücre yoğunluklarına izin verir, verimi artırır ve hücre kaybını azaltır. Bu, çoğu hücre kültürü laboratuvarında yaygın olarak bulunan ekipmanla yapılabilir. Bu yöntemin görsel gösterimi, yeni araştırmacılar için yararlı olabilir, çünkü kullanılan bu tekniklerin, steril koşullar altında belirli bir sırayla önceden oluşturulması gereken çok sayıda adım nedeniyle ustalaşması zor olabilir.

Besleme sistemi için gerekli olan beş ana bileşeni toplayın. Orta boy bir rezervuar, peristaltik pompa, karıştırılmış biyoreaktör, atık rezervuarı ve özel tasarlanmış boru numune alma seti. Bir litrelik cam şişe kullanarak orta rezervuarı oluşturun.

İki litrelik bir cam şişe kullanarak atık haznesi. 250 mL hacimli bir cam reaktör kullanılarak karıştırılmış biyoreaktör. Ortam değişimini kontrol etmek için dijital bir peristaltik pompa veya sekiz kanallı pompa kafasına sahip benzer bir pompa kullanın.

Rezervuarı ve modifiye edilmiş biyoreaktör kapaklarını sert ve otoklavlanabilir plastikten monte edin. Steril filtreler aracılığıyla havalandırma sağlamak ve rezervuarlar ile biyoreaktörler arasında orta transfere izin vermek için paslanmaz çelik boru geçiş portları ile. Gözenekli cam havalandırma tüplerinden imal edilmiş bir çıkış borusunu modifiye edilmiş karıştırılmış süspansiyon biyoreaktör kapağına takın.

Poliviniliden florür boru konektörlerinden ve dayanıklı peristaltik pompa borularından otoklavlanabilir perfüzyon boru setlerini birleştirin. Bölümün uzunluğu, farklı bileşenler arasındaki mesafeye bağlıdır. Besleme hattını iki boru çapı kullanarak monte edin.

Biyoreaktörden orta rezervuara olan mesafeyi kapsayacak birincil boru için L/S 14'ü kullanın. Uygun PVDF adaptörlerini kullanarak, pompa bölümü için boru uzunluğunun ortasına L/S 13 boruluk bir sıralama uzunluğu yerleştirin. Daha kısa pompa bölümü borusunun her iki tarafında iki parça L/S 14 boruyu birleştirmek için standart PVDF hortum dikenli boru adaptörlerini kullanın.

Daha büyük çaplı L/S 16 boru kullanarak atıkların uzaklaştırılması için kesit boru bölümünü monte edin ve pompalama bölümü için ortasına L/S 14 borunun kısa bir bölümünü yerleştirin. Bu, PVDF hortum dikenli adaptörler kullanılarak besleme hattı tertibatı ile aynı şekilde yapılır. Seti üç kısa L/S 14 boru uzunluğundan oluşturarak boru setinin son bileşenini monte edin.

T tipi bir HVDF konektörü ve iki boru uzunluğunda iki küçük hortum kelepçesi ile birbirine bağlanır. Numune düzeneğini, biyoreaktörün kapağına takılı paslanmaz çelik numune konektörüne bağlayın. Sterilizasyondan sonra, kenetlenmiş uzunluklardan birine gaz tahliyesi için steril bir gaz filtresi takılacaktır.

Diğeri steril bir numune alma şırıngasına bağlantı için kullanılır. Numune alma düzeneğini, metin protokolünde açıklandığı gibi deneye başlamadan önce biyoreaktöre bağlıyken otoklavlayın. Sürekli besleme sürecini bozmadan biyoreaktörden gerektiği gibi steril numuneler toplamak için bu düzeneği kullanın.

Döner şişenin, orta tankın, atık kaplarının ve numune portlarının kapaklarındaki uygun yerlere steril havalandırma delikleri takın. Hücreleri metin protokolünde açıklandığı gibi kültürleyin ve hasat edin. Hücrelerin bir biyogüvenlik kabininde iki ila üç dakika boyunca tripsin içinde oda sıcaklığında inkübe etmesine izin verin ve ardından bunları konik bir tüpe toplayın.

Daha sonra küçük bir hücre örneği toplanır ve tripan mavisi ile boyanır. Metin protokolünde açıklandığı gibi tripan mavisi boyama ile bir mikroskop ve standart hemositometre kullanarak hücre yoğunluğunu sayın. Her koşul için steril karıştırılmış süspansiyon biyoreaktörlerine istenen sayıda toplam hücre ekleyin.

İstenen toplam kültür hacmine ulaşmak için ortamı bir pipet kullanarak karıştırılmış süspansiyon biyoreaktörüne ekleyin. Karıştırılmış süspansiyon biyoreaktörünü hücrelerle birlikte bir hücre kültürü inkübatörü içindeki bir karıştırma plakasına taşıyın. Biyoreaktörlerdeki kültür hücreleri, 37 santigrat derecede, %5 karbondioksit, %100 bağıl nem ve sferoidlerin oluşmasına izin vermek için 70 rpm'lik bir karıştırma hızıyla üç gün boyunca beslenmeden yapılır.

Küresel oluşumundan sonra, karıştırılmış süspansiyon biyoreaktörünü inkübatörden çıkarın. Sürekli besleme sistemi bileşenlerini bir biyolojik güvenlik kabininde birleştirin. Önce taze bir orta hazneyi istenen kültür ortamıyla doldurun ve ardından besleme hattının bir tarafına bağlayın.

Ayrıca taze orta rezervuarın steril bir filtre ile uygun şekilde havalandırıldığından emin olun. Ortamı biyoreaktöre girmeden önce filtrelemek için biyoreaktör giriş portunda steril bir filtre değiştirilmelidir. Atık hattını orta atık rezervuarına bağlayın ve atık rezervuarının steril bir filtre ile uygun şekilde havalandırıldığından emin olun.

Karıştırılmış süspansiyon biyoreaktörünü, sferoid oluşumu ile aynı kültür parametrelerini kullanarak inkübatörün içindeki karıştırma plakasına koyun. Taze orta boy rezervuarı yakındaki bir mini buzdolabına koyun. Besleme hatlarının, kapıların kapanmasını engellemeden buzdolabından çıkabildiğinden emin olun.

Besleme hatlarının buzdolabının veya inkübatörün kapıları tarafından sıkıştırılmaması da çok önemlidir. Atık ortam rezervuarı, inkübatörün dışındaki tezgah üstüne uygun bir yere yerleştirilebilir. Kalan boru uçlarını inkübatöre geçirin ve besleme hattını biyoreaktörün giriş portundaki filtreye bağlayın.

Ardından atık hattını çıkış borusu portuna bağlayın. Daha sonra, besleme ve atık hatlarının pompa bölümünü pompa kafasına yerleştirin, böylece besleme hatları ortamı taze ortam rezervuarından karıştırılmış süspansiyon biyoreaktörüne pompalayacak ve atık hatları ortamı biyoreaktörden pompalayacak ve atık ortam rezervuarına ortam. Metin protokolünde açıklandığı gibi ayarlanmış ilerleme hızı denklemini kullanarak ilerleme hızını hesaplayın.

Kültürde istenen glikoz konsantrasyonunu korumak için gereken besleme hızını tahmin etmek için büyüme hızı tahmini ve orta glikoz ölçümleri ile birlikte hücre sayımı bilgileriyle en son numuneyi kullanın. Hesaplanan besleme hızına göre pompa hızını ayarlayın. İlerleme hızı hesaplamasını tekrarlayın ve her örnekleme noktası için pompa hızını ayarlayın.

Statik karıştırılmış süspansiyon biyoreaktörleri ve sürekli beslenen karıştırılmış süspansiyon biyoreaktör kültürü yöntemleri kullanılarak Beta-TC6 insülinoma sferoid kültürlerinden orta glikoz ölçümleri gösterilmiştir. Standart yüksek glikozlu ortam ile besleme. Sürekli besleme, glikoz dalgalanmalarını ortadan kaldırabilir, ancak ortamdaki ortalama glikoz seviyeleri kültür periyodu boyunca önemli ölçüde değişir ve fizyolojik aralığın çok üzerindedir.

Ayarlanan besleme, dalgalanmaları ortadan kaldırmanın yanı sıra, kültür periyodu boyunca glikoz konsantrasyonlarını fizyolojik seviyelere yakın tutabilir. Burada, 21 günlük kültür periyodu boyunca hücre sayısında kat değişikliği olarak rapor edilen hücre büyümesi, düzenli ortam değişiklikleri, sabit besleme hızı karıştırılmış süspansiyon biyoreaktör kültürleri ve ayarlanmış besleme hızı karıştırılmış süspansiyon biyoreaktör kültürleri ile karıştırılmış süspansiyon biyoreaktör kültürleri ile karşılaştırılmıştır. Bu prosedürü takiben, yeni hücre hatları için besin gereksinimleri veya spesifik deneysel sonuçlar gibi ek soruları yanıtlamak için değişen koşullar gibi diğer yöntemler de önceden oluşturulabilir.

Geliştirildikten sonra, bu teknik, hücre biyolojisi alanındaki araştırmacıların, kanserli veya diğer bozuklukları olan insanlardan alınan hücrelerdeki metabolik gereksinimleri keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, kültür koşullarını daha iyi kontrol etmek ve hücre verimini en üst düzeye çıkarmak için bir bolluk hücre kültürü sisteminin nasıl monte edileceğini iyi anlamış olmalısınız. İnsan hücreleriyle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman kan yoluyla bulaşan patojenlerden korunma gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.