Name: Topluluk tabanlı Ayar Elde Edilen Örneklerin hızlı Fraksiyonlama ve Tam Kan Bileşenlerinin İzolasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Öğrenin, topluluk tabanlı ayar elde edilen örneklerin hızlı fraksiyonlama yöntemiyle tam kan bileşenlerinin izolasyonunu. Santrifügasyon ve RNA stabilizasyonu kullanılarak DNA, RNA, plazma ve PBMC elde edilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Henriette Mair-Meijers'e ayrıntılara gösterdiği paha biçilmez özen ve kan alımlarının işlenmesine ayrılan saatler için teşekkür ederiz. Natalie Jameson Kiesling'in grafik tasarım uzmanlığı için minnettarız. Ayrıca, burada adı geçen üreticilerin (Qiagen (Valencia, CA), BD Biosciences (San Jose, CA), Life Technologies (Grand Island, NY)) ürünlerinin kullanımını açıklandığı şekilde yayınlama onayını da takdir ediyoruz. Bu çalışma için finansman, Ulusal Sağlık Enstitüleri ödül numaraları DA022720, RC1MH088283 ve DA022720-05-S1 tarafından cömertçe sağlandı.

<ol><li>Hernandez, M. E., Martinez-Fong, D., Perez-Tapia, M., Estrada-Garcia, I., Estrada-Parra, S., Pavon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+effect+of+selective+serotonin-reuptake+inhibitors+on+lymphocyte+subsets+in+patients+with+a+major+depressive+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Neuropsychopharmacol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the effect of selective serotonin-reuptake inhibitors on lymphocyte subsets in patients with a major depressive disorder.</a> Eur Neuropsychopharmacol. 20, 88-95 (2010).</li>
<li>Weigelt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TREM-1+and+DAP12+expression+in+monocytes+of+patients+with+severe+psychiatric+disorders+EGR3%2C+ATF3+and+PU.1+as+important+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Immun%22%5BJournal%5D)">TREM-1 and DAP12 expression in monocytes of patients with severe psychiatric disorders EGR3, ATF3 and PU.1 as important transcription factors.</a> Brain Behav Immun. 25, 1162-1169 (2011).</li>
<li>Robertson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+subset+differences+in+patients+with+chronic+fatigue+syndrome%2C+multiple+sclerosis+and+major+depression%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte subset differences in patients with chronic fatigue syndrome, multiple sclerosis and major depression.</a> Clin Exp Immunol. 141, 326-332 (2005).</li>
<li>Rotter, A., Asemann, R., Decker, A., Kornhuber, J., Biermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orexin+expression+and+promoter-methylation+in+peripheral+blood+of+patients+suffering+from+major+depressive+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22J+Affect+Disord%22%5BJournal%5D)">Orexin expression and promoter-methylation in peripheral blood of patients suffering from major depressive disorder.</a> J Affect Disord. 131, 186-192 (2011).</li>
<li>Klengel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allele-specific+FKBP5+DNA+demethylation+mediates+gene-childhood+trauma+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Allele-specific FKBP5 DNA demethylation mediates gene-childhood trauma interactions.</a> Nat Neurosci. 16, 33-41 (2013).</li>
<li>Segman, R. H., Shefi, N., Goltser-Dubner, T., Friedman, N., Kaminski, N., Shalev, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+blood+mononuclear+cell+gene+expression+profiles+identify+emergent+post-traumatic+stress+disorder+among+trauma+survivors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Peripheral blood mononuclear cell gene expression profiles identify emergent post-traumatic stress disorder among trauma survivors.</a> Mol Psychiatry. 10, 500-513 (2005).</li>
<li>Smith, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cohort+Profile%3A+Generation+Scotland%3A+Scottish+Family+Health+Study+%28GS%3ASFHS%29.+The+study%2C+its+participants+and+their+potential+for+genetic+research+on+health+and+illness%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">Cohort Profile: Generation Scotland: Scottish Family Health Study (GS:SFHS). The study, its participants and their potential for genetic research on health and illness.</a> Int J Epidemiol. 42, 689-700 (2013).</li>
<li>Mallone, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+preservation+of+peripheral+blood+mononuclear+cells+for+analysis+of+islet+antigen-reactive+T+cell+responses%3A+position+statement+of+the+T-Cell+Workshop+Committee+of+the+Immunology+of+Diabetes+Society%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Isolation and preservation of peripheral blood mononuclear cells for analysis of islet antigen-reactive T cell responses: position statement of the T-Cell Workshop Committee of the Immunology of Diabetes Society.</a> Clin Exp Immunol. 163, 33-49 (2011).</li>
<li>Duvigneau, J. C., Hartl, R. T., Teinfalt, M., Gemeiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delay+in+processing+porcine+whole+blood+affects+cytokine+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Delay in processing porcine whole blood affects cytokine expression.</a> J Immunol Methods. 272, 11-21 (2003).</li>
<li>Debey, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+different+isolation+techniques+prior+gene+expression+profiling+of+blood+derived+cells%3A+impact+on+physiological+responses%2C+on+overall+expression+and+the+role+of+different+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacogenomics+J%22%5BJournal%5D)">Comparison of different isolation techniques prior gene expression profiling of blood derived cells: impact on physiological responses, on overall expression and the role of different cell types.</a> Pharmacogenomics J. 4, 193-207 (2004).</li>
<li>Uddin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+and+immune+function+profiles+associated+with+posttraumatic+stress+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Epigenetic and immune function profiles associated with posttraumatic stress disorder.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 9470-9475 (2010).</li>
<li>Kessler, R. C., Wang, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+descriptive+epidemiology+of+commonly+occurring+mental+disorders+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Public+Health%22%5BJournal%5D)">The descriptive epidemiology of commonly occurring mental disorders in the United States.</a> Annu Rev Public Health. 29, 115-129 (2008).</li>
<li>Qiagen. QIAamp® DNA Mini and Blood Mini Handbook. , Valencia, California, USA. Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.qiagen.com/us/resources/resourcedetail?id=67893a91-946f-49b5-8033-394fa5d752ea">https://www.qiagen.com/us/resources/resourcedetail?id=67893a91-946f-49b5-8033-394fa5d752ea</a> (2010).</li>
<li>Thermo Scientific. NanoDrop 1000 Spectrophotometer. , Waltham, Massachusetts, USA. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.nanodrop.com/Library/nd-1000-v3.8-users-manual-8">http://www.nanodrop.com/Library/nd-1000-v3.8-users-manual-8</a> (2010).</li>
<li>Life Technologies. LeukoLOCK™ Total RNA Isolation System. , Grand Island, New York, USA. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.ambion.com/techlib/misc/leuko_iso.pdf">http://www.ambion.com/techlib/misc/leuko_iso.pdf</a> (2011).</li>
<li>Life Technologies. Countess™ Automated Cell Counter. , Grand Island, New York, USA. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.lifetechnologies.com/content/dam/LifeTech/migration/files/cell-analysis/pdfs.par.5257.file.dat/mp10227-countess">http://www.lifetechnologies.com/content/dam/LifeTech/migration/files/cell-analysis/pdfs.par.5257.file.dat/mp10227-countess</a> (2009).</li>
<li>Life Technologies. Alternative Protocol for Extraction of RNA from Cells Captured on LeukoLOCK™ Filters Using TRI Reagent®. , Grand Island, New York, USA. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/nucleic-acid-purification-and-analysis/rna-protocol/alternative-protocol-extraction-of-rna-from-cells-captured-on-leukolock-filters-using-tri-reagent.html">http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/nucleic-acid-purification-and-analysis/rna-protocol/alternative-protocol-extraction-of-rna-from-cells-captured-on-leukolock-filters-using-tri-reagent.html</a> (2011).</li>
<li>Life Technologies. DNA-free™ Kit. , Grand Island, New York, USA. Available from:
 <a target="_blank" href="http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/cms_055739.pdf">http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/cms_055739.pdf</a> (2012).</li>
<li>Agilent Technologies. Agilent RNA 6000 Nano Kit Guide. , Santa Clara, California, USA. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.genomics.agilent.com/files/Manual/G2938-90034_KitRNA6000Nano_ebook.pdf">http://www.genomics.agilent.com/files/Manual/G2938-90034_KitRNA6000Nano_ebook.pdf</a> (2006).</li>
<li>Koenen, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLC6A4+methylation+modifies+the+effect+of+the+number+of+traumatic+events+on+risk+for+posttraumatic+stress+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Depress+Anxiety%22%5BJournal%5D)">SLC6A4 methylation modifies the effect of the number of traumatic events on risk for posttraumatic stress disorder.</a> Depress Anxiety. 28, 639-647 (2011).</li>
<li>Walsh, K., Uddin, M., Soliven, R., Wildman, D. E., Bradley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associations+between+the+SS+variant+of+5-HTTLPR+and+PTSD+among+adults+with+histories+of+childhood+emotional+abuse%3A+Results+from+two+African+American+independent+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J+Affect+Disord%22%5BJournal%5D)">Associations between the SS variant of 5-HTTLPR and PTSD among adults with histories of childhood emotional abuse: Results from two African American independent samples.</a> J Affect Disord. 161, 91-96 (2014).</li>
<li>Bustamante, A. C., et al. Childhood maltreatment is associated with epigenetic differences in hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis genes in the Detroit Neighborhood Health Study. American Association of Physical Anthropologists 82nd Annual Meeting, Knoxville, TN, , Comprehensive Psychiatry. (2013).</li>
<li>Sipahi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+epigenetic+variation+of+DNA+methyltransferase+genes+is+associated+with+vulnerability+to+post-traumatic+stress+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Psychol+Med%22%5BJournal%5D)">Longitudinal epigenetic variation of DNA methyltransferase genes is associated with vulnerability to post-traumatic stress disorder.</a> Psychol Med. 44, 3165-3179 (2014).</li>
<li>Uddin, M., Koenen, K. C., Aiello, A. E., Wildman, D., de los Santos, R., Galea, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+and+inflammatory+marker+profiles+associated+with+depression+in+a+community-based+epidemiologic+sample%5BTitle%5D)+AND+%22Psychol+Med%22%5BJournal%5D)">Epigenetic and inflammatory marker profiles associated with depression in a community-based epidemiologic sample.</a> Psychol Med. 41, 997-1007 (2011).</li>
<li>Uddin, M., et al. Post-traumatic stress disorder is associated with immunosenescent T cell phenotypes in the Detroit Neighborhood Health Study. 3rd North American Congress of Epidemiology, Montreal, QC, , (2011).</li>
<li>Uddin, M., et al. Post-traumatic stress disorder is associated with immunosenescent T cell phenotypes in the Detroit Neighborhood Health Study. 101st Annual Conference of the American Psychopathological Association, New York, NY, , (2011).</li>
<li>Uddin, M. Biological signatures of post-traumatic stress disorder in the Detroit Neighborhood Health Study. 9th International Conference on Urban Health, New York Academy of Medicine, , (2010).</li>
<li>Aiello, A. E. Cytomegalovirus antibodies as a marker of immunosenescence in the Detroit Neighborhood Health Study. 9th International Conference on Urban Health, New York Academy of Medicine, , (2010).</li>
<li>Bustamante, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBustamante%2C+AC+%22Distinct+gene+expression+profiles+characterize+lifetime+PTSD+and+childhood+maltreatment+in+the+Detroit+Neighborhood+Health+Study%22">Distinct gene expression profiles characterize lifetime PTSD and childhood maltreatment in the Detroit Neighborhood Health Study</a>. , International Society for Traumatic Stress Studies. Philadelphia, PA. (2013).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olduğunu beyan ederim.

Biz başarıyla Detroit Mahalle Health Study 1.600&#39;den fazla tam kan örnekleri işlemek için uygulanmış bir aerodinamik protokol tanımlanmıştır. Bu tekniklerin birçok mevcut literatürde mevcut olmasına rağmen, her adım arasında tam zamanlı değişiklikler dahil olmak üzere adım adım derleme başarıyla aşağı geniş bir uygulama yelpazesi ile biyolojik örneklerin çeşitli üretir optimize edilmiş, verimli protokol yansıtır, DNA metilasyonu, mRNA ifade ve immünolojik analizi dahil. Bu örnekler zaten ulusal toplantılarda 11...

Birden fazla çalışmalar ve zihinsel (veya diğer) 1-4 Hastalıkları olmadan bireyler arasında kanda gen ifadesinin, DNA metilasyonu ve hücre alt kümesi farklılıkları nitelendirmiştir. Ancak bu çalışmalar, hastalıkla ilişkili farklar, hastaların tedaviye arayan olan hastalıkların genellikle daha ağır olmaları büyütülür olabilecek olan klinik elde edilmiştir. Nedeniyle "omik" yaklaşımlara gelişmeler, geçmiş on hastalık prevalansının toplum tabanlı tahminleri sağlamak amacıyla, topluluk ve / veya epidemiyolojik ayarlarından 5-7 den biyolojik numune alma ilgi bir patlama ve daha geniş bir resim gördü Bu zihinsel ve / veya bedensel hastalıkların çevresel belirleyicileri. Bu bağlamda önemli bir zorluk toplanan numunelerin hızlı işlem için bir gerekliliktir. Tek-çekirdekli hücreleri, frequentl anahtar bağışıklık sistemi bileşenlerinin Parçalanmay, bir bireyin sağlık, toplama 8-10 2 saat sonra geri kazanım önemli bir azalma ile birlikte kan alımı üzerine hemen başlar değerlendirmek için kullanılan. Bu zorluğu gidermek için, insan tam kan birden fazla bileşen aynı anda büyük bir metropol bölgesinde yaşayan deneklerin evlerine elde edilen örneklerden izole edildiği optimize edilmiş bir protokol mevcut. Protokolü derlenmesi ve gelecek teknikler daha izolasyonu için izin halinde tüm "ekstra" fraksiyonların depolama dahil olmak üzere güncel teknikler, modifikasyonu üzerine kuruludur / analiz eder. Alternatif yöntemler veya kitleri burada açıklanan bireysel yöntemlerle, bu ana hatları yerine kullanılabilir ise bir yüksek verimli bir şekilde numune işleme için güvenilir ve etkili bir yol olduğu kanıtlanmıştır. Yüksek kaliteli parçalar (PBMC, DNA serumu ve RNA) taze kan, 2 gün (Şekil 1 içinde mevcut olabilir 2 toplama saat ve deney için hazır numuneler içinde üretilebilir). Bu protokol toplum konut, Detroit Mahalle Sağlık Çalışmasında test için Detroit kentinin yetişkin sakinleri alınan örneklerin verimli işlenmesini sağlamak için geliştirilmiştir (DNHS; DA022720, RC1MH088283, DA022720-05-S1), bir toplum tabanlı post-travmatik stres bozukluğu (TSSB) ve diğer ruhsal hastalıkların sosyal ve biyolojik belirleyicileri çalışma. Detroit TSSB yaygınlığı iki ulusal ortalamanın 11,12 daha fazladır. Bu popülasyonda TSSB biyolojik belirleyicileri belirlenmesi, bu kentsel nüfus ve diğer yüksek risk gruplarında (örneğin, askeri gazileri dönen), hem bozukluktan muzdarip olanlar yardım etmek uygun farmakolojik ve / veya bilişsel-davranışçı müdahaleler geliştirmek için yardımcı olabilir. Daha önce Detroit, Michigan Wayne State Üniversitesi'nde bulunan Laboratuvarımız, çeşitli türetilen taze doku örnekleri ele bizim uzmanlık dayalı işlenmesine için seçildikaynakların, gerekliliği toplama 2 saat içinde numune işleme başlamak için, ve tahsilat sitelere bizim yakınlık. Ancak bu eşsiz fırsat, hedefimiz her örnekten DNA, RNA, serum ve periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC'ler) büyük verim (örnek toplama 5 dalgaların üzerinde N = 1639 numunelerin toplam) için işleme optimize etmek oldu. Burada özetlenen işlemler dolayısıyla mikrodizide epigenetik, gerçek zamanlı RT-PCR dahil aşağı uygulamaların çok sayıda için malzeme (ortalama verim için bakınız Tablo 1) başlangıç ​​üreten bir klinik olmayan bir ortamda eş zamanlı olarak gerçekleştirilen ve analizler akım sitometri edilebilir. <img alt="figür 1" src="/files/ftp_upload/52227/52227fig1highres.jpg" width="700"> Şekil 1. Genel iş akışı. Burada gösterilen genel işlem rıza partic belirlenmesi kan örnekleri elde lojistik içerirkan ipants kendisini çizin. Yüksek kaliteli, fraksiyonlar (periferal kan tek-çekirdekli hücreleri PBMC DNA, serum, ve RNA), taze tam kan toplama 2 saat içinde üretilebilir ve deney için hazır numuneleri 2 gün içinde mevcut olabilir. Örnekler hemen test edilmesi değildir Dahası, bu metod ile hazırlanan fraksiyonlar, uzun süreli depolama için uygundurlar. Burada özetlenen tüm zaman çizelgesi tek bir gün (~ 5 saat toplam) tamamlanmış olabilir. Bununla birlikte, böyle bir gün, özellikle teknikleriyle büyük deneyim ile tek bir teknisyen için son derece emek-yoğun olacaktır. Böylece, en az iki teknisyen arasındaki Gün 1 prosedürleri bölünmesi ve Gün 2. RNA işleme tamamlayarak tavsiye <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52227/52227fig1highres.jpg" target="_blank">bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

<table><tbody><tr><td>QIAamp DNA Kan Mini Kiti</td><td>Qiagen</td><td>51104</td><td>Gün 1: DNA izolasyonu</td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin (PBS)</td> <td>Sigma</td><td>P5493-1L</td><td>Gün 1: PBMC izolasyonu</td></tr><tr><td>5 &frac34; &rdquo; Pasteur pipetleri</td><td>Fisher</td><td>13-678-6A</td><td>1. Gün: PBMC izolasyonu</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS), ısıyla inaktive</td><td>edilmiş Yaşam Teknolojileri</td><td>10082147</td><td>1. Gün: PBMC izolasyonu</td></tr><tr><td>Dimetil Sülfoksit (DMSO)</td> <td>Sigma</td><td>D8418-500ml</td><td>1. Gün: PBMC izolasyonu</td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640, sıvı</td><td>Invitrogen</td><td>11875119</td><td>1. Gün: PBMC izolasyonu</td></tr><tr><td>%0.4 tripan mavisi lekesi&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td>Gün 1: PBMC izolasyonu</td></tr><tr><td>Kontes Hücre Sayma Odası</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td>Gün 1: PBMC izolasyonu</td></tr><tr><td>Kontes Otomatik Hücre Sayacı veya mikroskop ve hemositometre gibi hücre sayma cihazı</td><td>Invitrogen</td><td>C10281</td><td>Gün 1: PBMC izolasyonu</td></tr><tr><td>LeukoLOCK Fraksiyonlama ve Stabilizasyon Kiti&nbsp;</td><td>Ambion</td><td>1933</td><td>Gün 1: Lökosit RNA izolasyonu</td></tr><tr><td>25&nbsp; G x 5/8 inç iğneler</td><td>Becton Dickinson</td><td>305122</td><td>1. Gün: Lökosit RNA izolasyonu</td></tr><tr><td>Şırıngalar (5&nbsp; ml)</td><td>Becton Dickinson</td><td>309646</td><td>1. ve 2. Gün: Lökosit RNA izolasyonu</td></tr><tr><td>Denatüre Edici Lizis Solüsyonu&nbsp;</td><td>Ambion</td><td>8540G</td><td>Gün 2: Lökosit RNA izolasyonu</td></tr><tr><td>5&nbsp; M NaCl</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>24740011</td><td>2. Gün: Lökosit RNA izolasyonu</td></tr><tr><td>TRI Reaktifi</td><td>Ambion</td><td>9738</td><td>2. Gün: Lökosit RNA izolasyonu</td></tr><tr><td>Bromo-3-kloro-propan (BCP)</td> <td>Sigma</td><td>B-9673</td><td>2. Gün: Lökosit RNA izolasyonu</td></tr><tr><td>spin kartuşları&nbsp;</td><td>Ambion</td><td>10051G</td><td>Gün 2: Lökosit RNA izolasyonu</td></tr><tr><td>0.1&nbsp; mM EDTA</td><td>Ambion</td><td>9912</td><td>2. Gün: Lökosit RNA izolasyonu</td></tr><tr><td>DNA'sız Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1960</td><td>2. Gün: DNaz tedavisi</td></tr><tr><td>RNA 6000 Merdiveni&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>5067-1529</td><td>2. Gün: Biyoanalizör analizi</td></tr><tr><td>RNA 6000 Nano Seri II Kiti&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>5067-1511</td><td>Gün 2: Biyoanalizör analizi</td></tr><tr><td>RNaseZAP</td><td>Ambion</td><td>AM8782</td><td>Gün 2: Biyoanalizör analizi</td></tr><tr><td>Etanol >%99</td> <td>Sigma</td><td>E7023-500ml</td><td></td></tr><tr><td>İzopropanol >%99&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>I9516-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Nükleaz içermeyen ultra saf su&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>9938</td><td></td></tr><tr><td>Pipet uçları (nükleaz içermez)</td><td>Eppendorf</td><td>22491253</td><td></td></tr><tr><td>Pipetleyici (serolojik)</td><td>Eppendorf</td><td>2223020-4</td><td></td></tr><tr><td>Pipetleyiciler (1&nbsp; altındaki hacimler için; ml)</td><td>Eppendorf</td><td>3120000-054</td><td></td></tr><tr><td>Pipetler (serolojik)</td><td>Fisher</td><td>13-678-27E</td><td></td></tr><tr><td>Kontrollü oranlı dondurma kapları</td><td>Nalgene</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>Cryobox'lar (2&nbsp; ml ve 5&nbsp; ml kriyoviyaller ve 1.5&nbsp; ml mikrosantrifüj tüpleri)</td> <td>Fisher</td><td>03-395-464</td><td></td></tr><tr><td>Test tüpü rafı</td><td>Thermo Scientific</td><td>14-804-134</td><td></td></tr><tr><td>15&nbsp; ml polipropilen tüpler</td><td>Fisher</td><td>14-959-49D</td><td></td></tr><tr><td>1.5&nbsp; ml ve 0.65 mikrosantrifüj tüpleri</td><td>Fisher</td><td>07-200-534 ve 07-200-185</td><td></td></tr><tr><td>2&nbsp; ml ve 5&nbsp; ml kriyovialler</td><td>Fisher</td><td>10-500-26 ve 10-269-88F&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>8&nbsp; ml CPT vacutainer</td><td>BD Biosciences</td><td>362761</td><td>2 tüp</td></tr><tr><td>6&nbsp; ml K < alt > 2 < / alt> EDTA vacutainer</td><td>BD Biosciences</td><td>367863</td><td>2 tüp</td></tr><tr><td>8.5 & nbsp; ml SST vacutainer</td><td>BD Biosciences</td><td>367988</td><td>1 tüp</td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>Fisher</td><td>2215365</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj tüpleri için ısıtma bloklu kuru banyo inkübatörü</td><td>Fisher</td><td>11-715-1250</td><td></td></tr><tr><td>Hücre kültürü davlumbazı içinde kullanım için filtrasyon/vakum sistemi</td><td>Fisher</td><td>01-257-87</td><td></td></tr><tr><td>Aerosol geçirmez kapaklı mikrosantrifüj tüpleri için sabit açılı rotor</td><td>Eppendorf</td><td>22637002</td> 16 x 125&nbsp <td></td></tr><tr><td>için döner kova rotorlu ve aerosol geçirmez kapaklı soğutmalı santrifüj; mm vakumlar ve 15&nbsp; ml polipropilen tüpler</td><td>Eppendorf</td><td>22628157</td><td>2, birinin soğutulmasına gerek yoktur</td></tr><tr><td>Nanodrop 2000 (küçük hacimlerin doğruluğu için önerilir) veya başka bir spektrofotometrik cihaz</td><td>Fisher</td><td>13-400-411</td><td></td></tr><tr><td>Agilent Biyoanalizör</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2940CA</td><td></td></tr><tr><td>Sıvı nitrojen tankı</td><td>Thermo Scientific</td><td>11-676-56</td><td></td></tr><tr><td>Keskin alet kabı</td><td>Fisher</td><td>22-037-970</td><td></td></tr><tr><td>Biyolojik atık kabı</td><td>Thermo Scientific</td><td>1223P52</td><td></td></tr><tr><td>Biyogüvenlik Seviyesi 2&nbsp; sertifikalı hücre kültürü başlığı</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-261-315</td><td></td></tr></tbody></table>

topluluk tabanlı ayar elde edilen Örneklerin hızlı fraksiyonlama ve tam kan bileşenlerinin İzolasyonu

Rapid Fractionation and Isolation of Whole Blood Components in Samples Obtained from a Community-based Setting

Olmayan bir klinik ortamda toplanması ve tam kan örneklerinin işlenmesi ve önceden var olan koşullar olmaksızın, hem toplum içinde yaşayan bireylerin değerlendirmek için eşsiz bir fırsat sunuyor. Bu örneklerin hızlı işlenmesi önemli hücresel bileşenlerin bozulmasını önlemek için önemlidir. Eş zamanlı periferik kan mononükleer hücre (PBMC), DNA yöntemleri burada Dahil, RNA ve işleme ile bir metropol boyunca katılımcılara rıza evlerinde yapılan tek bir kan beraberlik serum izolasyonu, toplama 2 saat içinde başlamıştır. Biz 1600 üzerinde kan örnekleri sonradan başarılı DNA metilasyonu, genotipleme, gen ifadesinde kullanılan ve akış sitometri analizleri olmuştur verimli tutarlı, yüksek kaliteli malzeme, işlemek için bu teknikleri kullandık. Kullanılan yöntemlerden bazıları standart; tarif edildiği şekilde bir araya getirildiğinde, ancak, bunlar popülasyon ve / veya Topluma katılımcı örnekler etkili olarak işlenmesini sağlarNormalde bir klinik ortamda değerlendirilecek olmaz dayalı çalışmalar. Bu nedenle, bu protokol, genel nüfusun temsilcisi (ve buna bağlı veriler) örnekleri elde etmek için bir potansiyele sahiptir.

Bu genel prosedür geni mikrodizi ve RT-PCR analizi ile ifade epigenetik değişiklikler saptanması ve hücre altküme varyasyonlar da dahil olmak üzere alt uygulamaların pek analiz için yüksek kaliteli malzeme üretmek gereklidir. Tablo 1 maddelerin ortalama verimini ve kalitesini gösterir süreçlerin her birinden. 3 lökosit RNA izolasyonu ve filtre işleme yöntemlerinin kaliteli çıktı bir örnek teşkil Şekil. Şekil 3 üst soldaki görüntü kapiler elektroforez kaynaklanan jel gör...

Daha fazla analiz için çeşitli bileşenler elde etmek üzere tam kanın işlenmesi için bir metodolojinin ana hatlarını çiziyoruz. Klinik olmayan bir ortamda tam kan örneklerinin hızlı, yüksek verimli eş zamanlı işlenmesini sağlayan kolaylaştırılmış bir protokolü optimize ettik.

Topluluk tabanlı Ayar Elde Edilen Örneklerin hızlı Fraksiyonlama ve Tam Kan Bileşenlerinin İzolasyonu

Collection and processing of whole blood samples in a non-clinical setting offers a unique opportunity to evaluate community-dwelling individuals both ...

Bu prosedürün genel amacı, hızlı göz geçişini ve tam kan örneklerinin aynı anda işlenmesini sağlayan aerodinamik bir protokol sağlamaktır. Klinik olmayan bir ortamda, D-N-A-R-N-A periferik kan mononükleer hücrelerinin veya pbmc serumunun yüksek kaliteli fraksiyonlarının ve plazma ve kırmızı kan hücrelerinin kalıntı fraksiyonlarının verimli bir şekilde izole edilmesini sağlamak için vakutainer işlemi üst üste binen bir şekilde gerçekleştirilir. İşleme, serum vacutainer'in santrifüjlenmesi, fial tüplerin DNA izolasyonu santrifüjlemesi için vakutainer içeren bir fialden bir alikotun çıkarılması ile başlar.Daha sonra DNA izolasyonunun tamamlanması, DNA izolasyonundan sonra K iki EDTA vakutainerinden lökosit türevi RNA izolasyonu meydana gelebilir. Her bir vakutainerden gelen kan, ilgili bir filtreden geçirilir ve PBS ile yıkanır, daha sonra fial içeren vakütainere geri dönen bir RNA stabilizasyon ajanı ile muamele edilir. Artık plazma çekilir ve mononükleer tabaka PBS ile yıkanır.Tüpler dönerken, kalan kırmızı kan hücreleri toplanır ve ayrılan serum alikot edilir. Son olarak, pbmc hücre dondurma ortamında korunur. Sonuç olarak, taze kanın yüksek kaliteli fraksiyonları toplandıktan sonraki iki saat içinde üretilebilir ve tüm tahlil hazır numuneleri iki gün içinde mevcut olabilir.Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, prosedürlerin klinik olmayan bir ortamda aynı anda gerçekleştirilebilmesi, böylece mikrodizi epigenetik gerçek zamanlı R-T-P-C-R ve akış sitometrisi analizleri dahil olmak üzere çok sayıda alt uygulama için iki gün içinde materyal üretebilmesidir. Prosedürü gösteren, laboratuvar müdürüm Amy Weckl olacak Tam kan örneği işlemeye başlamak için. Tamponların, santrifüjün ve ısı bloğunun hazırlandığından emin olun.Vakumer teslimat zamanını numune takip sayfasında belgeleyin. Numunelerin alınmasından sonra serum izolasyonunu belgeleyin. Numune kütüğündeki başlatma süresi, fren ve hızlanma kapalıyken yedi mililitrelik serum vakutainerini santrifüjleyerek hemen işlemeye başlayın.Serum vakutainer santrifüjlenirken 1300 GS dört santigrat derecede 20 dakika boyunca aerosol kapaklı sallanan bir kova rotoru kullanarak. Bir BSL iki hücreli kültür başlığında DNA izolasyonunun başlangıç zamanını belgeleyin. Fial jeli içeren vakum kaplarını beş kez ters çevirin ve vakutainerlerden birinin üstünden iki 20 mikrolitrelik proteaz alikotunun her birine 200 mikrolitre tam kan ekleyin.Proteaz ve kan mikro santrifüj tüplerini başlıkta bırakın ve vakum kapları içeren çağrının santrifüjlenmesine devam edin. Santrifüjlemeden önce. Kan alımından sonraki iki saat içinde olması gereken PBMC izolasyon başlangıç zamanını belgeleyin.Halihazırda aerosol geçirmez kaplarda bulunan vakum kaplarını içeren FI çağrısını sekiz ila 10 kez ters çevirin. Daha sonra vakutainer'ı kesme ve hızlanma ile 1600 Gs 22 santigrat derecede 30 dakika santrifüjleyin. Başlıktaki DNA izolasyon örneklerine geri dönün ve proteaz ve kan mikro santrifüj tüplerinin her birine 200 mikrolitre tampon al ekleyin.Tüpleri kapatın ve başlıktan çıkarın. Sonra onları 15 saniye boyunca girdaplayın. Vorteksleme hemen yanıp söndükten sonra, numuneleri döndürün.Ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi, DNA Ellucian üzerindeki sütundan ima edilene kadar DNA izolasyonuna devam edin. Katılımcı başına toplam 800 mikrolitre verim için katılımcı başına iki sütundan DNA'yı bir araya getirdi. Lökosit RNA izolasyonunun başlangıç zamanını belgeleyin.K two EDTA vakutainerinin kauçuk septumunu bir transfer sivri ucu ile delin. K two EDTA tüp sisteminin montajından sonra kılıfı ve vidalı kapağı daha sonra kullanmak üzere saklayın. İğneyi güvenli bir şekilde çıkarmak için metal bir spatulanın ucunu kullanın ve iğneyi 10 mililitrelik boş bir kan alma tüpüne yerleştirin.Kurulumu tamamlamak için K iki EDTA vakutainer filtre alıcı tüp tertibatını ters çevirin Filtrasyon ve A PBS yıkamasından sonra, yeni bir 10 mililitre şırınga kullanarak üç mililitre RNA stabilizasyon ajanını geri çekin. RNA stabilizasyon ajanının takılı kaldığından emin olarak filtreyi yıkayın. Ardından, pistonu geri çekmeden şırıngayı filtreden çıkarın.Filtre giriş ve çıkışını, transfer sivri ucundan tutulan kılıf ve vidalı kapak ile kapatın ve filtreyi RNA stabilizasyon maddesi ile doymuş halde bırakın. Filtreyi eksi 80 santigrat derecede, RA izolasyonunun tamamlanması için zaman izin verene kadar en az iki saat saklayın. Vakumlayıcı BSL iki başlığına geri döndüğünde, durdurucuyu çıkarın ve mononükleer katmana yaklaşmadan üst plazma katmanının 1,5 mililitresini çekmek için serolojik bir pipet kullanın.Plazmayı iki vakutainerden beş mililitrelik bir kriyo şişesine aktarın. Ardından toplanan birimi günlüğe kaydedin. Kalan plazmayı ve mononükleer tabakayı serolojik bir pipet kullanarak 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.Ardından, konik tüpteki toplam hacmi 15 mililitreye çıkarmak için önceden hazırlanmış bir XPBS ekleyin. Tüpü kapatın ve beş kez ters çevirin. Daha sonra tüpü kırılma ve hızlanma ile 300 GS 22 santigrat derecede 15 dakika santrifüjleyin.Başlıktaki fial içeren vakum kaplarına geri dönün ve kırmızı kan hücrelerini veya eritrositleri toplayın. Fial jel tabakasının dışını döndürmek ve gevşetmek için beş ve üç çeyrek inçlik bir macun pipeti kullanın ve çıkarın. RBC'leri toplamak ve beş mililitrelik bir kriyo şişesine aktarmak için serolojik bir pipet kullanın.Ardından ses seviyesini günlüğe kaydedin. Daha sonra, plazma ve RBC kriyo şişelerini kontrollü bir oranlı dondurma kabına aktarın ve eksi 80 santigrat derecede en az 24 saat saklayın. 24 saat sonra, numuneleri bir kriyo kutusuna aktarın ve uzun süreli saklama için eksi 80 santigrat dereceye geri koyun.Santrifüjleme tamamlandığında, konik tüpü davlumbaza geri koyun ve sıvıyı aspire edin, böylece peleti bozmadan 500 mikrolitre PBS bırakın. Hacmi 10 mililitreye getirmek için bir XPBS ekleyin ve peleti yeniden askıya alın. Tüpü yavaşça kapatın ve beş kez ters çevirin.Daha sonra numuneyi frenle santrifüjleyin ve 300 GS 22 santigrat derecede 10 dakika hızlanın. Santrifüjlemeden sonra, vakutainerden gelen üst serum tabakasını iki mililitrelik kriyo şişesine ayırın ve hacmi belgeleyin. Dört kriyo şişesi kullanın ve kriyo şişesine 200 mikrolitre alikot edin.Bir, 1000 mikrolitre, kriyo şişesine, iki. Ardından kalan hacmi kriyo şişelerine bölün, üç ve dört. Kriyo şişelerini bir kriyo kutusuna aktarın ve uzun süreli saklama için eksi 80 santigrat derecede tutun.Ve dondurucu başlangıç saatini belgeleyin. PBMC izolasyonu ile devam edin. Santrifüjlemeden sonra numuneleri davlumbaza geri döndürerek, peleti bozmadan mümkün olduğunca fazla süpernatan aspire edin.Peleti 2,5 mililitre PBMC'de askıya alıyoruz. Orta olanı. 2,5 mililitre PBMC ekleyin, DMSO ve RPMI içeren dondurma ortamı iki.Önceden hazırlanmış hücre çözeltisine orta ve numuneyi nazikçe girdaplayın. Daha sonra 10 mikrolitre hücre çözeltisini bir mikro santrifüj tüpüne alın. Mikro santrifüj tüpüne 10 mikrolitre %0,4'lük trip pan blue lekesi ekleyin ve çözeltiyi birkaç kez pipetleyerek karıştırın.Daha sonra, karışımın 10 mikrolitresini bir hücre sayma odasına pipetleyin. Slaytı karıştırın ve karıştırdıktan sonra üç dakika içinde hücre sayacına yerleştirin. Yakınlaştırın ve hücrelere odaklanın.Ardından A-P-B-M-C Sayımı elde etmek için hücre sayısını seçin. Canlı PBMC sayısı mililitre başına 3 milyon hücrenin üzerindeyse, numuneyi mililitre başına en az 3 milyon hücre konsantrasyonunda maksimum beş kriyo şişesine ayırın. Her biri, numune günlüğündeki kriyo şişesi başına hücre sayısını belgeler.Geçerli PBMC sayısı mililitre başına 3 milyon hücrenin altındaysa nasıl devam edileceğini öğrenmek için ekteki metin protokolüne bakın. Son olarak, kriyo şişelerini kontrollü bir hızlı dondurma kabına aktarın ve en az 24 saat boyunca eksi 80 santigrat dereceye koyun. 24 saat sonra, kriyo şişelerini bir kriyo kutusuna aktarın ve kutuyu uzun süreli saklama için bir sıvı nitrojen tankının buhar fazına yerleştirin.Dondurucu başlangıç zamanını numune günlüğünde belgeleyin. Lökosit RNA İzolasyonu ve filtre işleme yöntemleri, kapiler elektroforez sonucu ortaya çıkan bu jel görüntüsünü vermiştir. ATT'yi ve 28'i temsil eden minimum bozunma ile iki farklı bant üretildi. ribozomal RNA.Bu prosedürü denerken, doğru kayıtların tutulmasının kritik öneme sahip olduğunu unutmamak önemlidir. Başlangıçta hacim, konsantrasyon, kalite, barkod ve saklama yeri dahil olmak üzere tüm kriyo flakon bilgilerini depolamak için bir veritabanı geliştirmenizi öneririz. Ve örnek organizasyon ile ilgili daha fazla öneri metin protokolünde bulunabilir.

rapid-fractionation-isolation-whole-blood-components-samples-obtained

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Bu video, trombosit sayımı taraması, kanın toplanması ve santrifüjlenmesi ve trombositlerin izole edilmesi yoluyla yüksek kaliteli Trombositten Zengin Plazmanın (PRP) hazırlanmasını göstermektedir. Bu PRP, doku yenilenmesi ve iyileşmesi için terapötik uygulamalarda kullanılır.

İnsan Periferik Kanından Trombositten Zengin Plazma Hazırlanması

Kan lökositleri ve trombosit bireyin genel bioenergetic sağlığının bir belirteci olarak kullanılır ve bu nedenle patolojik süreçlerin ve tedavilerin etkisini izlemek için bir potansiyele sahip olabilir. Burada mitokondriyal fonksiyonu ve bu hücrelerde oksidatif patlama izole etmek ve ölçmek için bir yöntem tarif eder.

İnsan lökosit ve trombosit İzolasyonu ve Değerlendirme Protokolleri: Biyoenerji ve Oksidatif Burst

Lökosit-Trombositten Zengin Fibrin (L-PRF), benzersiz fibrin mimarisine, zenginleştirilmiş trombositlere ve bol miktarda büyüme faktörüne sahip otolog trombosit konsantrelerinin FDA onaylı bir preparatını temsil eder. Burada, L-PRF'nin hasta başı üretimi için bir protokol sunmanın yanı sıra, tek eksenli test ve sütür tutma gücü testi dahil olmak üzere mekanik özelliklerini değerlendiriyoruz.

Lökosit-trombosit Zengin Fibrin, Yeni Bir Biyomateryalinin Karakterizasyonu

Endotelyal Ata Hücreler (EPC'ler) önemlisi, iskemik dokuların neovaskülarizasyonu katılmaktadırlar. Bu yöntem, periferal kandan alınan insan EPC izolasyonunu, hem de kalp cerrahi hastalarında serum örneklerinde karşı göç potansiyelinin belirlenmesi açıklanmaktadır.

Kalp Damar Cerrahisi sonra serum Örnekleri etkilenerek Sağlıklı Gönüllüler ve Bunların Göçmen Potansiyelden Endotel Ata Hücreleri İzolasyon

Burada, plazma zarı, sitoplazma ve yüksek hızlı Santrifüjü kullanmanıza gerek kalmadan U937 hücrelerinin mitokondri izole etmek için bir protokol mevcut. Bu tekniği yoluyla protein yerelleştirme immunoblotting sonraki incelenmesi için hücre altı fraksiyonları arındırmak için kullanılabilir.

Yüksek hızlı Santrifüjü yokluğunda U937 hücrelerinin hücre ayırma

Bu protokol, çevirisel biyobelirteç analizi için kullanılabilecek klinik çalışma alanında yüksek kaliteli PBMC ve plazma biyosampllerinin klinik olarak uygulanabilir hazırlanmasını detaylandırır.

Biyobelirteç Analizi için Klinik Çalışma Alanlarında Tek Bir Kan Çekiminden Periferik Kan Mononükleer Hücre Peletleri ve Plazma Hazırlanması

Periferik kan mononükleer hücrelerinin Sézary Sendromu tanısı alan hastalardan elde edilen tam kandan izole edilmesi, ardından CD4 + T hücrelerinin seçimi, forbol12-miristat13-asetat ve A23187 iyonofor ile uyarılmaları ve transkriptomik profilleme için RNA'nın hazırlanması için basit bir protokol sunuyoruz.

Transkriptomik Profilleme için İnsan Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinin ve CD4 + T hücrelerinin Sézary Sendromu Hastalarından İzole Edilmesi

Bu protokol, nötrofillerin tam kan, buffy coats veya lökferez zarlarından izole edilmesinin, iyi verim, yüksek saflık ve minimum hücre aktivasyonu elde edilmesinin bir yöntemini detaylandırmaz. Yüksek kaliteli/saflıkta nötrofil preparatı elde etmek için gradyan saflaştırma, kırmızı kan hücresi (RBC) sedimilasyonu ve RBC lizizini kullanıyoruz.

İnsan Nötrofillerinin Tam Kan ve Buffy Coats'tan İzolasyonu

Sıvı biyopsi, onkoloji translasyonel çalışmalarına yaklaşımımızda devrim yarattı ve örnek toplama, kalite ve depolama, başarılı klinik uygulaması için çok önemli adımlardı. Burada, çoğu translasyonel araştırma laboratuvarında uygulanabilecek aşağı akış dolaşımsız DNA uygulamaları için standartlaştırılmış ve doğrulanmış bir protokolü açıklıyoruz.

Aşağı Akış Dolaşımsız DNA Uygulamaları için Standartlaştırılmış Bir Sıvı Biyopsi Preanalitik Protokolü

Bu protokol, biyobankacılık ve diğer amaçlar için insan periferik kan mononükleer hücrelerini izole etmek için yüksek verimli otomasyonla uyumlu bir yöntemi detaylandırır.

İnsan Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinin Buffy Coats'tan Yüksek Verimli İmmünomanyetik Boncuk Ayırma ile İzole Edilmesi

Öğrenin, topluluk tabanlı ayar elde edilen örneklerin hızlı fraksiyonlama yöntemiyle tam kan bileşenlerinin izolasyonunu. Santrifügasyon ve RNA stabilizasyonu kullanılarak DNA, RNA, plazma ve PBMC elde edilir.

Topluluk tabanlı Ayar Elde Edilen Örneklerin hızlı Fraksiyonlama ve Tam Kan Bileşenlerinin İzolasyonu

Daha fazla video keşfet