Topluluk tabanlı Ayar Elde Edilen Örneklerin hızlı Fraksiyonlama ve Tam Kan Bileşenlerinin İzolasyonu

Bu prosedürün genel amacı, hızlı göz geçişini ve tam kan örneklerinin aynı anda işlenmesini sağlayan aerodinamik bir protokol sağlamaktır. Klinik olmayan bir ortamda, D-N-A-R-N-A periferik kan mononükleer hücrelerinin veya pbmc serumunun yüksek kaliteli fraksiyonlarının ve plazma ve kırmızı kan hücrelerinin kalıntı fraksiyonlarının verimli bir şekilde izole edilmesini sağlamak için vakutainer işlemi üst üste binen bir şekilde gerçekleştirilir. İşleme, serum vacutainer'in santrifüjlenmesi, fial tüplerin DNA izolasyonu santrifüjlemesi için vakutainer içeren bir fialden bir alikotun çıkarılması ile başlar.

Daha sonra DNA izolasyonunun tamamlanması, DNA izolasyonundan sonra K iki EDTA vakutainerinden lökosit türevi RNA izolasyonu meydana gelebilir. Her bir vakutainerden gelen kan, ilgili bir filtreden geçirilir ve PBS ile yıkanır, daha sonra fial içeren vakütainere geri dönen bir RNA stabilizasyon ajanı ile muamele edilir. Artık plazma çekilir ve mononükleer tabaka PBS ile yıkanır.

Tüpler dönerken, kalan kırmızı kan hücreleri toplanır ve ayrılan serum alikot edilir. Son olarak, pbmc hücre dondurma ortamında korunur. Sonuç olarak, taze kanın yüksek kaliteli fraksiyonları toplandıktan sonraki iki saat içinde üretilebilir ve tüm tahlil hazır numuneleri iki gün içinde mevcut olabilir.

Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, prosedürlerin klinik olmayan bir ortamda aynı anda gerçekleştirilebilmesi, böylece mikrodizi epigenetik gerçek zamanlı R-T-P-C-R ve akış sitometrisi analizleri dahil olmak üzere çok sayıda alt uygulama için iki gün içinde materyal üretebilmesidir. Prosedürü gösteren, laboratuvar müdürüm Amy Weckl olacak Tam kan örneği işlemeye başlamak için. Tamponların, santrifüjün ve ısı bloğunun hazırlandığından emin olun.

Vakumer teslimat zamanını numune takip sayfasında belgeleyin. Numunelerin alınmasından sonra serum izolasyonunu belgeleyin. Numune kütüğündeki başlatma süresi, fren ve hızlanma kapalıyken yedi mililitrelik serum vakutainerini santrifüjleyerek hemen işlemeye başlayın.

Serum vakutainer santrifüjlenirken 1300 GS dört santigrat derecede 20 dakika boyunca aerosol kapaklı sallanan bir kova rotoru kullanarak. Bir BSL iki hücreli kültür başlığında DNA izolasyonunun başlangıç zamanını belgeleyin. Fial jeli içeren vakum kaplarını beş kez ters çevirin ve vakutainerlerden birinin üstünden iki 20 mikrolitrelik proteaz alikotunun her birine 200 mikrolitre tam kan ekleyin.

Proteaz ve kan mikro santrifüj tüplerini başlıkta bırakın ve vakum kapları içeren çağrının santrifüjlenmesine devam edin. Santrifüjlemeden önce. Kan alımından sonraki iki saat içinde olması gereken PBMC izolasyon başlangıç zamanını belgeleyin.

Halihazırda aerosol geçirmez kaplarda bulunan vakum kaplarını içeren FI çağrısını sekiz ila 10 kez ters çevirin. Daha sonra vakutainer'ı kesme ve hızlanma ile 1600 Gs 22 santigrat derecede 30 dakika santrifüjleyin. Başlıktaki DNA izolasyon örneklerine geri dönün ve proteaz ve kan mikro santrifüj tüplerinin her birine 200 mikrolitre tampon al ekleyin.

Tüpleri kapatın ve başlıktan çıkarın. Sonra onları 15 saniye boyunca girdaplayın. Vorteksleme hemen yanıp söndükten sonra, numuneleri döndürün.

Ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi, DNA Ellucian üzerindeki sütundan ima edilene kadar DNA izolasyonuna devam edin. Katılımcı başına toplam 800 mikrolitre verim için katılımcı başına iki sütundan DNA'yı bir araya getirdi. Lökosit RNA izolasyonunun başlangıç zamanını belgeleyin.

K two EDTA vakutainerinin kauçuk septumunu bir transfer sivri ucu ile delin. K two EDTA tüp sisteminin montajından sonra kılıfı ve vidalı kapağı daha sonra kullanmak üzere saklayın. İğneyi güvenli bir şekilde çıkarmak için metal bir spatulanın ucunu kullanın ve iğneyi 10 mililitrelik boş bir kan alma tüpüne yerleştirin.

Kurulumu tamamlamak için K iki EDTA vakutainer filtre alıcı tüp tertibatını ters çevirin Filtrasyon ve A PBS yıkamasından sonra, yeni bir 10 mililitre şırınga kullanarak üç mililitre RNA stabilizasyon ajanını geri çekin. RNA stabilizasyon ajanının takılı kaldığından emin olarak filtreyi yıkayın. Ardından, pistonu geri çekmeden şırıngayı filtreden çıkarın.

Filtre giriş ve çıkışını, transfer sivri ucundan tutulan kılıf ve vidalı kapak ile kapatın ve filtreyi RNA stabilizasyon maddesi ile doymuş halde bırakın. Filtreyi eksi 80 santigrat derecede, RA izolasyonunun tamamlanması için zaman izin verene kadar en az iki saat saklayın. Vakumlayıcı BSL iki başlığına geri döndüğünde, durdurucuyu çıkarın ve mononükleer katmana yaklaşmadan üst plazma katmanının 1,5 mililitresini çekmek için serolojik bir pipet kullanın.

Plazmayı iki vakutainerden beş mililitrelik bir kriyo şişesine aktarın. Ardından toplanan birimi günlüğe kaydedin. Kalan plazmayı ve mononükleer tabakayı serolojik bir pipet kullanarak 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.

Ardından, konik tüpteki toplam hacmi 15 mililitreye çıkarmak için önceden hazırlanmış bir XPBS ekleyin. Tüpü kapatın ve beş kez ters çevirin. Daha sonra tüpü kırılma ve hızlanma ile 300 GS 22 santigrat derecede 15 dakika santrifüjleyin.

Başlıktaki fial içeren vakum kaplarına geri dönün ve kırmızı kan hücrelerini veya eritrositleri toplayın. Fial jel tabakasının dışını döndürmek ve gevşetmek için beş ve üç çeyrek inçlik bir macun pipeti kullanın ve çıkarın. RBC'leri toplamak ve beş mililitrelik bir kriyo şişesine aktarmak için serolojik bir pipet kullanın.

Ardından ses seviyesini günlüğe kaydedin. Daha sonra, plazma ve RBC kriyo şişelerini kontrollü bir oranlı dondurma kabına aktarın ve eksi 80 santigrat derecede en az 24 saat saklayın. 24 saat sonra, numuneleri bir kriyo kutusuna aktarın ve uzun süreli saklama için eksi 80 santigrat dereceye geri koyun.

Santrifüjleme tamamlandığında, konik tüpü davlumbaza geri koyun ve sıvıyı aspire edin, böylece peleti bozmadan 500 mikrolitre PBS bırakın. Hacmi 10 mililitreye getirmek için bir XPBS ekleyin ve peleti yeniden askıya alın. Tüpü yavaşça kapatın ve beş kez ters çevirin.

Daha sonra numuneyi frenle santrifüjleyin ve 300 GS 22 santigrat derecede 10 dakika hızlanın. Santrifüjlemeden sonra, vakutainerden gelen üst serum tabakasını iki mililitrelik kriyo şişesine ayırın ve hacmi belgeleyin. Dört kriyo şişesi kullanın ve kriyo şişesine 200 mikrolitre alikot edin.

Bir, 1000 mikrolitre, kriyo şişesine, iki. Ardından kalan hacmi kriyo şişelerine bölün, üç ve dört. Kriyo şişelerini bir kriyo kutusuna aktarın ve uzun süreli saklama için eksi 80 santigrat derecede tutun.

Ve dondurucu başlangıç saatini belgeleyin. PBMC izolasyonu ile devam edin. Santrifüjlemeden sonra numuneleri davlumbaza geri döndürerek, peleti bozmadan mümkün olduğunca fazla süpernatan aspire edin.

Peleti 2,5 mililitre PBMC'de askıya alıyoruz. Orta olanı. 2,5 mililitre PBMC ekleyin, DMSO ve RPMI içeren dondurma ortamı iki.

Önceden hazırlanmış hücre çözeltisine orta ve numuneyi nazikçe girdaplayın. Daha sonra 10 mikrolitre hücre çözeltisini bir mikro santrifüj tüpüne alın. Mikro santrifüj tüpüne 10 mikrolitre %0,4'lük trip pan blue lekesi ekleyin ve çözeltiyi birkaç kez pipetleyerek karıştırın.

Daha sonra, karışımın 10 mikrolitresini bir hücre sayma odasına pipetleyin. Slaytı karıştırın ve karıştırdıktan sonra üç dakika içinde hücre sayacına yerleştirin. Yakınlaştırın ve hücrelere odaklanın.

Ardından A-P-B-M-C Sayımı elde etmek için hücre sayısını seçin. Canlı PBMC sayısı mililitre başına 3 milyon hücrenin üzerindeyse, numuneyi mililitre başına en az 3 milyon hücre konsantrasyonunda maksimum beş kriyo şişesine ayırın. Her biri, numune günlüğündeki kriyo şişesi başına hücre sayısını belgeler.

Geçerli PBMC sayısı mililitre başına 3 milyon hücrenin altındaysa nasıl devam edileceğini öğrenmek için ekteki metin protokolüne bakın. Son olarak, kriyo şişelerini kontrollü bir hızlı dondurma kabına aktarın ve en az 24 saat boyunca eksi 80 santigrat dereceye koyun. 24 saat sonra, kriyo şişelerini bir kriyo kutusuna aktarın ve kutuyu uzun süreli saklama için bir sıvı nitrojen tankının buhar fazına yerleştirin.

Dondurucu başlangıç zamanını numune günlüğünde belgeleyin. Lökosit RNA İzolasyonu ve filtre işleme yöntemleri, kapiler elektroforez sonucu ortaya çıkan bu jel görüntüsünü vermiştir. ATT'yi ve 28'i temsil eden minimum bozunma ile iki farklı bant üretildi. ribozomal RNA

Bu prosedürü denerken, doğru kayıtların tutulmasının kritik öneme sahip olduğunu unutmamak önemlidir. Başlangıçta hacim, konsantrasyon, kalite, barkod ve saklama yeri dahil olmak üzere tüm kriyo flakon bilgilerini depolamak için bir veritabanı geliştirmenizi öneririz. Ve örnek organizasyon ile ilgili daha fazla öneri metin protokolünde bulunabilir.