Name: Sinir Hücresi Tipleri Yüzey Akış Sitometri Protokolleri ve Hücre içi Antijen Analizleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 5 s
Description: Öğrenin, sinir hücrelerinde yüzey ve hücre içi antijenleri akış sitometrisi ile analiz etme yöntemini. Bu protokol, nörobiyologların çok renkli akış sitometrisi kullanarak spesifik sinir alt popülasyonlarını tanımlamasına yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Araştırma programımız, Alman Araştırma Vakfı'nın (DFG) Emmy Noether Programı, PR1132/3-1 hibesi aracılığıyla finanse edilmektedir. Freiburg Üniversitesi Müller-Fahnenberg Vakfı'nın daha fazla desteği minnetle kabul edilmektedir. Bu çalışma kısmen Alman Araştırma Vakfı'nın (GSC-4, Spemann Graduate School) Mükemmellik Girişimi tarafından desteklenmiştir.

1. Sinir Hücre Hasat <ol><li> Mikroskopla Değerlendirme: <ol><li> Bir deney başlamadan önce, parlak alan veya faz kontrast mikroskobu ile kültür durumunu kontrol edin. NOT: disseksiyonlar elde edilen primer sinir dokusu iken, ilke olarak, eşit mükellef sitometri analizi 14,28 akış, protokolün odak in vitro nöral hücre sistemleri elde edilen hücreler üzerinde olduğuna dikkat edin. </li></ol></li><li> Hücrelerin Toplanması 7: <ol><li> Yavaşça Mg + 2 ile yapışık hücre çanak / şişe, yıkama / Ca2 + serbest fosfat tamponlu tuzlu su (PBS), oda sıcaklığında (örneğin, T75 şişesinin 5 mi, 6-çukurlu plaka için oyuk başına 3 ml veya 10 mi için 10 cm çanak). NOT: PBS protokol boyunca kullanılan Mg 2+ / Ca 2+ ücretsizdir. <ol><li> Video Örneğin,% 80 birbirine karıştığında, SH-SY5Y nöroblastoma hücrelerinin bir T75 şişesinin kullanımı. Durumlarda nerede ek yıkama adımları uygulayınönemli ölçüde çöp kabı içinde mevcuttur. </li><li> Serum albümini içeren PBS 48, Percoll, ya da Ficoll 49 santrifüj gradyanlar ve / veya ticari olarak temin edilebilen boncuklar 50,51 ile yıkama düşünün. Miyelin ve diğer lipid ya da diğer kirletici maddelerin çıkarılması yetişkin birincil doku kaynakları kullanılıyorsa, özellikle önemlidir. </li></ol></li><li> Doku kültürü kabının tüm yüzeyini kaplar, uygun bir hacminde önceden ısıtılmış (37 ° C), tripsin değiştirme ekleyin. NOT: Alternatif, Accutase veya diğer enzimatik sindirim seçenekleri göz önünde bulundurun. Bu kritik adım olumsuz (7 bakınız) yüzey epitop ifadesini etkileyebilir. </li><li> Hücreleri ayırmak için izin vermek için (hücre tipine göre), 5 dakika - 2 37 ° C &#39;de çanak / şişeyi inkübe edin. Yavaşça hücreleri çıkarmak için bir serolojik pipet ile doku kültürü gemi veya gömme dokunun. (Bu gibi daha sonraki aşamada hücre kaybı ve pıhtılaşmayı neden olabilir) sindirim üzerinde kaçının. </li><li> Siki kez akış tamponu (PBS içinde% 2 FBS) hacminin eklenmesiyle tripsin değiştirme uench ve 15 ml konik bir tüp içinde hücreleri toplamak. </li><li> Tek bir hücre süspansiyonu meydana getirmek üzere - (1.000 ul, 100) ya da bir 5 mi serolojik pipet yavaşça mikrolitre pipet kullanılarak bir hücre süspansiyonu çiğnemek. </li><li> 25 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 220 x g&#39;de hücreleri santrifüjleyin. Dikkatle geride bırakarak pelet süpernatant aspire. </li><li> Yeniden askıya pellet (boyutuna bağlı olarak, akış tamponu uygun hacimde bir pelet gibi, SH-SY5Y hücrelerinin bir T75 şişesinin birleşik için tipik bir verim, en az 10 x 10 6 hücre, bu durumda hücreler içinde Akış tamponu, 5 ml) içinde tekrar süspanse edilir. NOT: Daha büyük parçalar veya pıhtılaşma gözlenmesi halinde, 30 ile filtre - 100 mikron örgü. </li></ol></li><li> Hücre sayımı 52: <ol><li> Tr hacminde belli bir oranda bir mikrosantrifüj tüpüne hücre süspansiyonu küçük bir kısım aktarın ve seyreltikypan mavi veya bir hemositometrede transfer veya otomatik hücre sayım sistemi önce alternatif bir canlılığı boya. </li><li> (CFSE etiketi ile devam ise)% 0.1 BSA ile akış tamponu veya PBS uygun hacimde eklenmesiyle, 1 x 10 6 yaşar hücre / ml&#39;lik bir konsantrasyonda hücre süspansiyonu seyreltin. NOT: Propidyum iyodür, 7-aminoactinomycin D, anneksin V ve piyasada mevcut düzeltilebilir canlılığı tahlil kitleri hücrelerin canlılığını değerlendirmek için alternatif seçenekler temsil eder. Daha önce 53 kullanılabilir tarif edildiği gibi aynı zamanda, apoptoz deneyleri kaspaz-3 floresans kullanılmıştır. Floresan kanallar tüm örneklerin dahil halinde sonraki adımlar için seçenekleri sınırlayabilir Bu reaktiflerin tarafından &quot;işgal&quot; olacak. </li></ol></li></ol> CFSE kullanma 2. Hücre içi Boya Etiketleme (Şekil 3) <ol><li> Kolayca kullanılabilen bir arzu stok konsantrasyonu CFSE seyreltin. NOT: Bu deneylerin bir stok konsantrasyonu için0.01 mM kullanılmıştır. Ampirik KAKE optimal çalışma konsantrasyonunu belirlemek. </li><li> 0,1 uM değerinde bir nihai konsantrasyona hücrelerin ml başına 0.01 mM CFSE çözeltisi (Bölüm 1.3.2, PBS +% 0.1 BSA içinde, 1 x 10 6 hücre / ml konsantrasyonda), 10 ul ekle. Kısaca girdap iyice karıştırın. Not: Burada kullanılan CFSE konsantrasyonları boyanın toksikliği hücre dolayısıyla, genel olarak çoğalma deneylerinde uygulanabilir göre daha düşük bir on-kat azdır. Biz hücre canlılığı üzerindeki olumsuz etkilerini gözlemlemek yok. </li><li> Sabit şekilde çalkalanarak (200 rpm) oda sıcaklığında 5 dakika süreyle inkübe edilir. Işıktan koruyunuz. </li><li> Tüplere akış tamponu 5 hacmi eklenerek boya söndürüldü. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 94 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Geride bırakarak pelet süpernatant atın. Akış tamponu, 5 hacim ile hücrelerin yeniden askıya. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 94 x g&#39;de santrifüjleyin. Süpernatant atılır ve 1 x 10 6 hücre konsantrasyonunda akış tamponu içerisinde hücrelerin yeniden askıya /<html> mi. </li><li> Lekeli hücre süspansiyonu ilgi boyanmamış hücrelerin eşit sayıda ekleyin. Antijen boyama protokolü (Bölüm 3) yüzey geçin. </li></ol><img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52241/52241fig3highres.jpg" width="700" /> CFSE, boya etiketleme. SH-SY5Y nöroblastoma hücreleri ile iki hücre hatları arasında farklı CD ​​yüzey antijeni ifade Şekil 3. Algılama önceden etiketlenmiş olan etiketlenmemiş BJ fibroblastlar ile karşılaştırıldığında daha sonra tespit edilebilmesi için CFSE ile. (; Ok uçları = BJ fibroblastlar ok = SH-SY5Y) yüzey işaretleyicileri CD24 ya da CD54 (her ikisi de APC birleşik) ile karıştırılmış numunenin (sağ panel) eş zamanlı boyama hücre çizgileri bağlı CFSE boyama kolaylıkla ayırt edilebilir olduğunu göstermektedir. SH-SY5Y hücrelerinin çoğunluğu CD24 fakat CD54 (ICAM-1) ifade etmektedir. Buna karşılık, BJ fibroblastlar (negatif KAKE) CD54 pozitif ama CD24 için büyük ölçüde olumsuzdur.&quot;Https://www.jove.com/files/ftp_upload/52241/52241fig3highres.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız. 3. Hücre Yüzey Boyama <ol><li> Numunelerin ve kritik kontroller (Tablo 1) olmak üzere Etiket tüpler. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Tüp hayır. </td><td> Örnek adı </td><td> Antijen-florofor </td><td> Seyreltme </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Lekesiz hücreler </td><td> - </td><td></td></tr><tr><td> 2 </td><td> Tek lekeli </td><td> CD24-APC </td><td> 01:50 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> Tek lekeli </td><td> Tuj1-Alexa fluor 488nm </td><td> 1: 2000 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Lekeli Çift </td><td> CD24-APC </td><td> 01:50 </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Tuj1-Alexa fluor 488nm </td><td> 1: 2000 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> Tek lekeli</td><td> İkincil Sadece: Alexa fluor 488nm </td><td> 1: 2000 </td></tr></tbody></table> Tüplerin Tablo 1. L ist deney sitometrisi tipik akış dahil edilecek. Tablo, bu video makalede tarif edilen bir ko-lekeleme deneyi için gerekli örnek tüplerinin en az bir setini göstermektedir. İdeal deney elde edilen sonuçların doğru yorumlanması için gerekli tüm kontrolleri (negatif, pozitif yanı sıra tazminat kontrolleri) içermesi gerekir. <ol start="2"><li> Her bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü (Bölüm 2.7 veya 1.3.2 itibaren) hücre süspansiyonu 100 ul ekle. NOT: Emin 0,1 x 10 6 hücre minimum hücre süspansiyonu 100 ul başına mevcut olduğundan emin olun. </li><li> Uygun seyreltmede örnek flüorofor konjuge antikor ekleyin. NOT: deney öncesinde her antikor için seyreltme çalışma belirleyin. Bir liste için o Tablo 2 bakınızf sinir yüzey antijenleri. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Antijen </td><td> Hücre Tipi </td><td> Referans </td></tr><tr><td> CD15 </td><td> Nöral kök hücreler </td><td> [28, 67] </td></tr><tr><td> CD24 </td><td> Nöronal hücre </td><td> [28, 68] </td></tr><tr><td> CD29 </td><td> Nöral kök hücreler </td><td> [28, 69, 70] </td></tr><tr><td> CD44 </td><td> Glial hücreler </td><td> [25] </td></tr><tr><td> CD49f </td><td> Nöral kök hücreler </td><td> [38] </td></tr><tr><td> CD56 (NCAM) </td><td> Nöronal hücre </td><td> [71] </td></tr><tr><td> CD133 </td><td> Nöral kök hücreler </td><td> [27] </td></tr><tr><td> CD184 </td><td> Nöral kök hücreler ve glial hücreler </td><td> [25] </td></tr><tr><td> CD200 </td><td> Nöronal hücre </td><td> [38] </td></tr><tr><td> CD271 </td><td> Nöral krest kök hücreleri </td><td&gt; [25] </td></tr><tr><td> A2B5 </td><td> Glial hücreler </td><td> [31] </td></tr><tr><td> CORIN </td><td> Dopaminerjik öncüleri </td><td> [35, 36] </td></tr><tr><td> FORSE1 </td><td> Nöral kök hücreler (MGK) </td><td> [72] </td></tr><tr><td> GLAST </td><td> Glial hücreler </td><td> [33] </td></tr><tr><td> NG2 </td><td> Glial hücreler </td><td> [32] </td></tr></tbody></table> Sinir yüzey antijenlerinin Tablo 2. seçilmesi. Bu tabloda, sinir soyu karakterize etmek için kullanılan yüzey antijenleri artan paneli örnek için çeşitli sinir hücresi tipleri tarafından eksprese edildiği yüzey epitoplarının bir listesini sağlar. Bu seçim tam ve bu belirteçlerin çoğu diğer nöral ve nöral olmayan hücrelerin bir dizi ifade olduğunu olmaktan uzak olduğunu unutmayın. Sonuç olarak, çok sayıda markalama kombinasyonları için daha iyi tanımlaması ve belirtilen sinir alt kümeleri izole etmek için gerekli olacaktır. <ol stsanat = &quot;4&quot;&gt; <li> Karanlıkta orbital bir karıştırıcı (200 rpm) üzerinde 30 dakika süreyle inkübe edin. </li><li> Akış tampon yıkama <ol><li> Tüplere akış tamponu 1 ml ilave edilir. 4 ° C de 4 dakika boyunca 380 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Geride bırakarak pelet süpernatant atın. </li></ol></li><li> Tekrar yıkama adımı tekrarlayın. </li><li> İkinci yıkamadan sonra, süpernatant süzün ve 100 ul son hacim olması için akış tamponu içerisinde hücrelerin yeniden askıya. </li><li> Akım sitometri analizi için numune kullanın. Alternatif olarak, Bölüm 4 ve 5 ile devam edin. NOT: Hücreler sıralanır ve kültür sonrası FACS içine geri koymak için ise (yani, fiksasyon veya permeabilization olmadan canlı hücre süspansiyonu), hasat, boyama ve analitik adımlar sırasında aseptik teknikleri uygulamak. </li></ol> 4. Sabitleme ve Permeabilization 38 <ol><li> Sabitleme kullanarak paraformaldehid (PFA): <ol><li> PBS içinde% 2 PFA içeren sabitleme tamponu hazırlayın. <br/&gt; Not: PFA insanlar ve çevre için zararlıdır. Uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın ve yerel yönetmeliklere uygun olarak atık atın. </li><li> Hücre süspansiyonunun 100 ul sabitleme tampon 500 ul ekle. </li><li> Karanlıkta orbital bir karıştırıcı (100 rpm) üzerinde 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li></ol></li><li> PBS yıkama: <ol><li> Tüpüne PBS içinde 1 ml ilave edilir. 4 ° C&#39;de 3 dakika boyunca 380 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Tüp yaklaşık 100 ul bırakarak süpernatant süzün / atın. </li></ol></li><li> Tween-20 ile geçirgenleştirme: <ol><li> PBS içinde% 0.7 Tween-20 içeren permeabilizasyon tampon hazırlayın. </li><li> Hücre süspansiyonunun 100 ul permeabilizasyon tampon maddesi içinde 500 ul ekle. </li><li> Karanlıkta orbital bir karıştırıcı (100 rpm) üzerinde 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li></ol></li><li> (Bölüm 4.2 de tarif edildiği gibi), bir kez PBS ile hücre yıkayın ve tüpler co süpernatanmpletely, geride sadece topak bırakılmıştır. </li></ol> 5. Hücre içi Antijen Boyama 38 (Şekil 4) <ol><li> Birincil antikor çözeltileri hazırlanması: <ol><li> % 1 sığır serum albümin,% 10 serum (örneğin, normal eşek veya keçi serumu) ve% 0.5 Tween-20 ile PBS içinde ihtiva eden seyreltme tamponu içinde primer antikorlar ile seyreltilir. NOT: İkincil antikorlar büyütüldüğü türe bağlı kullanılmak üzere serum seçin. </li><li> Seçenek olarak ise, üreticinin talimatlarına uygun olarak primer antikorun Zenon floresan etiketleme kullanın. <ol><li> Uygun bir seyreltme (20 ul ≤ toplam hacim) PBS içinde birincil antikor 1 ug hazırlayın. </li><li> Antikor çözeltisi Zenon floresan IgG etiketleme reaktifi (Bileşen A) 5 ul ekle. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika süreyle inkübe karışımı. </li><li> Reaksiyon karışımına Zenon bloke belirteci (Bileşen B), 5 ul ekle. </li><li> Kuluçkaya yatmakOda sıcaklığında 5 dakika boyunca bir karışımı. 30 dakika içinde örnek antikor uygulayın. </li></ol></li></ol></li><li> Birincil antikor boyama: <ol><li> Hücre pelet birincil antikor solüsyonu, 100 ul ekleyin ve hafifçe karıştırın çiğnemek. </li><li> Seçenek olarak ise, uygun seyreltme hücre süspansiyonu Zenon fluoresein etiketli antikor ekleyin. </li><li> Işıksız bir orbital bir karıştırıcı (200 rpm) ile 30 dakika süreyle oda sıcaklığında inkübe edin. (Bölüm 4.2 açıklar gibi) PBS ile bir kez hücreleri yıkayın ve arkasında sadece pelet bırakarak, tamamen tüplerin süpernatant kaldırmak. </li></ol></li><li> (Zenon fosforla etiketlenmiş antikorlar için gerekli değildir) sekonder antikor boyama: <ol><li> Uygun bir konsantrasyonda PBS içinde sekonder antikor ile seyreltilir. </li><li> Hücre pelet sekonder antikor çözeltisi 100 ul ekleyin ve hafifçe karıştırın çiğnemek. Karanlıkta bir çalkalama (200 rpm) ile 30 dakika süreyle oda sıcaklığında inkübe edin. </li></ol></li><li> (Bölüm 4.2 açıklandığı gibi) PBS ile numuneleri iki kez yıkayın. </li><li> Akış tamponu ile bir kez yıkayın (Bölüm 3.5). </li><li> Akış tampon yaklaşık 150 ul hücreleri yeniden askıya ve akış sitometresinde analiz. </li></ol><img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52241/52241fig4highres.jpg" width="700" /> Yüzeyi ve hücre içi proteinlerin Şekil 4. Eş-boyama. Veri Flow sitometri ikincil + primer yüzey boyama ile birlikte Zenon floresein-tabanlı hücre içi boyama karşı antikor bazlı arasında bir karşılaştırma örneğidir. Y-ekseni (sol üst kadran) ve x-ekseni (sağ alt kadranda) üzerinde özel pozitifliği sırasıyla map2 ve CD24, lekeli hücreleri gösterir. Ko-boyama işleminden sonra ortak MAP2 ve CD24 ifadesi, üst sağ çeyrek dairesi (sağ panel) &#39;de görülebilir. Ile karşılaştırılmasıAlexa fluor 488.; MAP2-etiketleme verimleri benzer sonuçlar için Zenon floresein (alt) karşı (üst AF488) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52241/52241fig4highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> 6. Akış Sitometrik Analizi <ol><li> Sinyal tespiti için uygun filtreler ile akış sitometresiyle boyama protokolü tamamlanmasından hemen sonra akış sitometrik analiz yapıldı. FL-1 (533/30), FL-2 (585/40), ve FL-4 (675/25) bant geçiren filtreler ile 488 nm mavi ve 640 nm kırmızı lazer kullanın. </li><li> Enkaz ve ölü hücreleri hariç ileri ve yan dağılım dayalı birincil kapıları ayarlayın. </li><li> Yüzey ve tek lekeli kontrolleri kullanarak spektral örtüşme için boyanmamış örnekleri ve tazminat dayalı ≤0.5% intraselüler antijen için ayarlayın floresan kapıları. </li></ol>

Yazarlar herhangi bir potansiyel çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Burada sunulan protokol, insan kök hücrelerinden elde edilen nöral hücre kültürleri için oluşturulmuş, ancak aynı derecede birincil doku ya da nöral hücre hatları dahil olmak üzere, diğer nöral hücre kaynaklarına uygulanabilir. Embriyonik kaynaklardan ek olarak, nöral kök veya progenitor hücreler yetişkin beyin 27 nörojenik bölgelerinden elde edilebilir. Ayrıca, akım sitometri ve FACS olgun nöronlar 54, astroglial 33, mikrogliyal 55, oligodendrositler 56 veya doğum ...

Akım sitometri yoğun içsel dağılım özellikleri, hücre yüzey antijeni ifade ve diğer floresan parametreleri 1-3 vasıtasıyla hücre popülasyonlarının tanımlamak için immünoloji, hematoloji ve onkoloji istismar edilmiştir. Kan soy geliştirme ve hastalık halinde bizim anlayışlar ilk uygulama 4,5&#39;ten sonra bu metodolojinin sürekli arıtma önemli ölçüde bir sonucudur. Akış nicel ve genel analitik potansiyeli artan farkındalık sitometri son zamanlarda kök hücre araştırmalarında da daha yaygın kullanımını teşvik etmiştir ve kısa bir zaman dilimi 6 benzer derin ilerleme sağlayabilir. Ancak, özellikle nöral popülasyonları analiz ve izole etmek için akış sitometri uygulaması uzun zorlu olarak algılanmıştır. Doğal olarak süspansiyonda mevcut hematopoietik hücrelerin aksine, sinir hücresi tipleri, tipik olarak glia ve çeşitli o içerebilir aşırı derecede karmaşık kaynaklardan toplanırTher çevreleyen hücreleri ve aynı zamanda işlem taşıyan nöronların karmaşık bir ağdır. Sonuç olarak, nörobiyoloji günlük araştırma rutinleri onun tam potansiyeline flow sitometri çok yönlülüğünü uygulamak için henüz. Ancak nörobiyolojisinde analitik repertuarın değerli unsuru olarak kabul edilebilir olduğu sürece uygun bir tek hücre süspansiyonu elde edilebilir (ve protokoller bu amaçla 7 için tasarlanmış ve optimize edilmiş) halinde, akış sitometrisi ve floresans ile aktive edilen hücre çeşitleme (FACS) 8-11. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52241/52241fig1highres.jpg" width="600" /> . Fluidik, optik ve elektronik: akım sitometri analizi ve bir akış sitometresinde bileşenlerinin Şekil 1. İlke akış sitometrelerinde üç ana sistemleri içermektedir. Süspansiyon içinde bulunan hücrelerin bir akıcı akış kılıf flui ile gerçekleştirilir (birincil doku ya da in vitro kültürü hazırlanmış)hidrodinamik yoluyla d merkez çekirdek örneği kısıtlayan, odaklama. Optik parçalar uygun dedektör sinyal doğrudan hücrelere ve optik filtrelerin akışı aydınlatmak lazerler oluşmaktadır. elektronik sinyaller, daha sonra bir bilgisayar tarafından işlenir ve veri analizi ve yolluk için bir monitörde görüntülenebilir dönüştürülür tespit ışık sinyalleri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52241/52241fig1highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Bir sitometresinin yapı blokları dahil altta yatan temelleri en azından temel bir anlayış akış sitometri yöntemleri kar Kullanıcılar (inceleme için 12,13 görüyorum; ayrıca bakınız Şekil 1). Bir lazer ışını da &#39;tek dosya&#39; birbiri ardına lazer ışınının geçmesine süspansiyon hücreleri içeren bir hidrodinamik odaklı akışkan akışı ile kesişir. interceptiBu sorgulama alanına ışık saçılması lazer sonuçları ile hücre (veya bu konuda herhangi bir diğer parçacık, sırasıyla) ile. (Parçacık / hücre granulosity yansıtan tarafında dağılım) Dağınık ışık, hem de dik olan doğrultu (parçacık boyutu ile ilişkili ileri dağılım, hem) lazer yönünde devamında tespit edilebilir. Bu Anılan dağılım özellikleri (aynı zamanda veya hücresel enkaz, hava kabarcıkları, vb) bir etiketsiz örnek yaygın ilk yolluk için kullanılan yan dağılım grafiği iki değişkenli ileri saçılma bir sinyal (olay) üretecektir neden özel etiketleme, gerekmez. Uygun lazerler ve karşılık gelen uyarma ve emisyon spektrumu için özel filtreler kullanılarak, bir hücrenin pozitiflik, yoğunluk seviyesinde veya flüoresan işaretler yokluğu için analiz edilebilir. Akış sitometrik uygulamalarının çoğunluğu hücre yüzey antijenleri üzerinden karakterizasyonu üzerine odaklanmıştır. Hematopoietik lineag aksineE, sinir soy yüzey epitop ifade desenleri 5&#39;e göre daha az kapsamlı tanımlanmış kalmıştır. Yüzey antijenleri istismar bir avantajı, canlı hücreler, FACS gibi sıralama paradigmalar hücre tabi olmasıdır. Buna karşılık, hücre içi antijen boyama canlı hücreler gerektiren mansap uygulamaları engelleyen, epitop-antikor etkileşimi aracılık tespit ve permeabilization adımları gerektirir. Dikkat çekici bir şekilde, bu tür yaklaşımlar yine çok nicel deneyleri 14 yanı sıra, RNA ve protein ekspresyonu 15 alt baş analizler için izin verir. Hematoloji, immünoloji ve onkoloji genellikle belirli alt popülasyonlar 16 tanımlamak için birlikte bir düzineden fazla belirteçleri kullandık. Ayrıca, kitle sitometri veya CyTOF geç 30 parametreleri aynı anda 17,18 kadar analiz etmek için kullanılabilir. Nöral kök hücre uygulamaları yanı sıra birincil kültürlerin 14,19,20 hücrelerin heterojen olarak içinIn vitro ortak bir olgudur 21-23 olduğunu. ilgi hedef kitleyi temsil etmeyen hücreler deneysel okuma 24,25 için bir potansiyel karıştırıcı faktör somutlaştırmak. Uygun, heterojen bir hücre süspansiyonu içinde bulunan farklı hücresel alt kümeleri bu çeşitli popülasyonları tanımlamak için kullanılabilir farklı (bilinen veya henüz deşifre edilecek) antijen ifade profilleri, ayı. Biyomedikal uygulamaları kolaylaştırmak, dolayısıyla böylece, hücresel heterojenite çözümünde önemli bir rol oynayabilir ve Flow sitometri (in vitro deneyler, hücre tedavisi) ve en alakalı alt kümesi 24,26 odaklanarak kantitatif okuma optimize. Çeşitli yüzey antijen kombinasyonları özel nöral hücre tiplerinin kantitatif ve izole izin vermek için son birkaç yıl içinde tespit edilmiştir. Bu nöral kök hücreler 27 NSC izolasyonu için CD15 / CD24 / CD29 yüzey antijenlerinin kombinasyonu, differentia zenginleştirilmesi için CD133 içerirTed nöron ve nöral krest hücreleri 28 veya CD15 / CD24 / CD44 / CD184 / CD271, diğer imzalar 29,30 arasında nöral ve glial alt kümeleri 25, izole etmek. Nöronlar ötesinde, gliyal belirteçler A2B5 31, CD44, 25 NG2 32 ve GLAST 33 içerir. Son zamanlarda yayın Parkinson hücre nakli dopaminerjik öncüleri zenginleştirmek için orta beyin tabanının habercisi işaretleyici CORIN 34,35 36 paradigmalar istismar etmiştir. CD molekülleri sadece belirteçler değil, hücre-hücre etkileşimleri ve hücrenin yeteneği fonksiyonel ilgili arabulucular dışı matriks molekülleri ipuçlarını cevap ve büyüme faktörleri 37. Ayrıca sinir soy gelişimini karakterize etmek için kombinasyon CD antijenlerinin cephanelik arttırıcı bir strateji, söz konusu özel bir hücre tipi için bir CD antijeni kombinasyonu için taranması ve tanımlamak için bilinen hücre içi belirteçler kullanmaktır. Biz son zamanlarda böyle bir yaklaşım sömürülen ve CD4 belirledik9f - / CD200 nöral ayırt uyarılmış pluripotent kök hücre kültürü sistemleri 38 nöronal alt kümelerini zenginleştirmek için yeni bir yaklaşım olarak yüksek birleştirici ifade desenleri. Burada, içerir ve ikinci protokolü (ve bunların isteğe bağlı varyasyonlar) &#39;in yüzey boyama ve hücre içi boyama akış sitometrisi ile nöral hücre alt-popülasyonunu tanımlamak için aynı anda kullanılabilir tartışır. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52241/52241fig2highres.jpg" width="300" /> Deneysel protokol seçenekleri Şekil 2. akış diyagramı. Şekil protokolde yer alan önemli adımlardan şematik bir temsilini tasvir etmektedir. İsteğe bağlı adımlar (KAKE boya veya hücre içi antijen etiketleme) açık gri kutular ile gösterilir. Hasattan sonra, bu hücre yüzey boyamadan önce nöral hücre süspansiyonlarının yaşayabilirliği ve hücre sayısını belirlemek için gereklidir. Pozitif olarakde negatif kontroller olarak ilgi örneklere ek olarak dahil edilmesi gerekir. Numuneler akım sitometri ile analiz ve / veya hücre sıralama paradigmalar kullanılabilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52241/52241fig2highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Daha önce hücre içi boyama 38 için ikincil bir antikor ile kombinasyon halinde birincil antikor kullanmış iken, şimdi, böylece hücre manipülasyonu 39 aşamaları azaltarak küçük bir değişikliği gibi floresan Fab parçaları (Zenon etiketleme) yoluyla birincil antikor kovalent olmayan etiketleme getirmektedir. Ayrıca, protokolün çok yönlü bir başka örnek olarak, antijen lekeleme yüzey önce süksinimidil ester (CFSE) karboksifloresan ile bir deney alt-grubun isteğe bağlı bir etiketleme kullanır. Böyle KAKE ön-etiketleme, iki hücre hatları ya da deneysel koşullar hemen doğrudan karşılaştırma (sağlarVs KAKE-etiketli. Tek bir örnek tüpü, değişiklik veya inkübasyon süresi ince farklılıkların azaltılması ve antikor tasarruf içinde) etiketsiz. CFSE, yaygın üreme 41,42 ve Barkod deneylerde 43,44, hücre takibi 40 için kullanılan kurulu bir floresan boya olan. Gerçek sıralama adımlar (FACS, immünomanyetik hücre ayırma veya immunopanning) Bu protokolün bir parçası değil ise Nihayet, prensip olarak, burada açıklanan hasat ve etiketleme işlemleri antijen ya da hücre içi etiketleme-tabanlı uygulamaları sıralama yüzey tabi olabilir verim örnekleri yapmak 15 25,28. Bu makale ile, biz hedefliyoruz: bir olarak hücre içi KAKE boya etiketleme adım 41,45 sunmak, bir hücre içi hedeflerin tespiti için protokol yanı sıra kombine yüzeyi ve hücre içi antijen analizi 38 özetlemek, geçerli bir yüzey antijeni boyama protokolü 25,28 özetlemek com için deneysel seçenekkarşılaştırmalı nöral hücre popülasyonlarının analizleri ve sitometrik analizi (strateji ve veri sunumu 47 yolluk uygun kontrolleri 13,46) akış yaklaşımları özetlemek.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12 (1:1) (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12)</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Life Technologies</a></td><td>11330057</td><td></td></tr><tr><td>Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; içermeyen DPBS</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Life Technologies</a></td><td>14190169</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu, kalifiye, AB onaylı, Güney Amerika menşeli (FBS)</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Life Technologies</a></td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>MEM Esansiyel olmayan amino asitler (100x)</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Life Technologies</a></td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Life Technologies</a></td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>Trypan mavi çözeltisi, 0.4%</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Life Technologies</a></td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td><a href="http://www.carlroth.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Carl Roth</a></td><td>335.3</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini (BSA) Fraksiyon V</td><td><a href="http://www.gelifesciences.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> PAA Laboratories, Coelbe</a></td><td>K41-001</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20 Deterjan</td><td><a href="http://www.merckmillipore.de" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Calbiochem</a></td><td>655205</td><td></td></tr><tr><td>Karboksifloresein süksinimidil ester (CFSE)</td><td><a href="http://www.ebioscience.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> eBioscience</a></td><td>65-0850-84</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td><a href="http://www.applichem.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> AppliChem</a></td><td>A1584</td><td></td></tr><tr><td>Şişe üstü filtreler express plus 0.22 &amp;micro;m, 250 ml</td><td><a href="http://www.millipore.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Millipore</a></td><td>SCGPU02RE</td><td></td></tr><tr><td>Hücre kültürü ile işlem görmüş flasklar (T 25)</td><td><a href="http://www.thermoscientific.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> NUNC</a></td><td>156367</td><td></td></tr><tr><td>Hücre kültürü ile işlem görmüş flasklar (T 75)</td><td><a href="http://www.thermoscientific.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> NUNC</a></td><td>156499</td><td></td></tr><tr><td>Konik tüpler (15 ml)</td><td><a href="http://www.greinerbioone.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Greiner Bio-One</a></td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>Konik tüpler (50 ml)</td><td><a href="http://www.greinerbioone.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Greiner Bio-One</a></td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipeti, cam (150 mm)</td><td><a href="http://www.stein-labortechnik.de" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> STEIN Labortechnik, Remchingen</a></td><td>S03710150</td><td></td></tr><tr><td>Pipet uçları (0.1-10 &amp;micro;l)</td><td><a href="http://www.corning.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Corning</a></td><td>4125</td><td></td></tr><tr><td>Pipet uçları (1-200 &amp;micro;l)</td><td><a href="http://www.corning.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Corning</a></td><td>4126</td><td></td></tr><tr><td>Pipet uçları (100-1000 &amp;micro;l)</td><td><a href="http://www.corning.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Corning</a></td><td>4129</td><td></td></tr><tr><td>Serolojik pipetler, 5 ml</td><td><a href="http://www.corning.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Corning</a></td><td>4051</td><td></td></tr><tr><td>Serolojik pipetler, 10 ml</td><td><a href="http://www.corning.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Corning</a></td><td>4101</td><td></td></tr><tr><td>Serolojik pipetler, 25 ml</td><td><a href="http://www.corning.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Corning</a></td><td>4251</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj tüpleri (0.5 ml)</td><td><a href="http://www.sarstedt.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sarstedt</a></td><td>72,699</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj tüpleri (1.5 ml)</td><td><a href="http://www.greinerbioone.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Greiner Bio-One</a></td><td>616201</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj tüpleri (2.0 ml)</td><td><a href="http://www.sarstedt.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sarstedt</a></td><td>72,695,500</td><td></td></tr><tr><td>Anti-İnsan CD24 APC monoklonal antikor</td><td><a href="http://www.ebioscience.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> eBioscience</a></td><td>17-0247-42</td><td>Çalışma dilüsyonu 1:50</td></tr><tr><td>Anti-İnsan CD54 PE monoklonal antikor</td><td><a href="http://www.ebioscience.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> eBioscience</a></td><td>12-0549-42</td><td>Çalışma dilüsyonu 1:50</td></tr><tr><td>Neuronal Class III &amp;beta;-Tubulin (Tuj1) poliklonal antikor</td><td><a href="http://www.covance.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Covance</a></td><td>PRB-435P</td><td>Çalışma dilüsyonu 1:2,000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Donkey anti Rabbit</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Life Technologies</a></td><td>A21206</td><td>Çalışma dilüsyonu 1:2,000</td></tr><tr><td>Zenon&amp;reg; Fluorescein Rabbit IgG İşaretleme Kiti</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Life Technologies</a></td><td>Z-25342</td><td></td></tr><tr><td>Geliştirilmiş Neubauer sayım odası</td><td><a href="http://www.marienfeld-superior.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Marienfeld</a></td><td>0640010</td><td></td></tr><tr><td>Vorteks</td><td><a href="http://www.scientificindustries.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Scientific Industries</a></td><td>G560E</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer comfort</td><td><a href="http://www.eppendorf.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Eppendorf</a></td><td>5355 000.001</td><td></td></tr><tr><td>Accuri C6 akış sitometresi</td><td><a href="http://www.bdbiosciences.com/instruments/accuri" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Becton Dickinson (BD)</a></td><td>653118</td><td></td></tr><tr><td>Soğutmalı mikrosantrifüj, PerfectSpin 24 R</td><td><a href="http://www.peqlab.de" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Peqlab</a></td><td>91-PSPIN-24R</td><td></td></tr><tr><td>Orbital çalkalayıcı, Unimax 1010</td><td><a href="http://www.heidolph-instruments.de" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Heidolph</a></td><td>543-12310-00</td><td></td></tr><tr><td>Soğutmalı santrifüj, Rotanta 96 RC</td><td><a href="http://www.hettichlab.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Hettich</a></td><td>4480-50</td><td></td></tr><tr><td>Sınıf II Biyolojik güvenlik kabini Safe 2020</td><td><a href="http://www.thermoscientific.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Thermo Scientific</a></td><td>51026640</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; İnkübatörü, Heracell 240i</td><td><a href="http://www.thermoscientific.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Thermo Scientific</a></td><td>51026331</td><td></td></tr><tr><td>Vakum sistemi, Vacusafe comfort</td><td><a href="http://www.integra-biosciences.de" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Integra Biosciences</a></td><td>158320</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop, Axiovert 40 CFL</td><td><a href="http://www.zeiss.de" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Zeiss</a></td><td>451212</td><td></td></tr><tr><td>Pipet kontrolörü, accu-jet pro</td><td><a href="http://www.brand.de" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Brand</a></td><td>26303</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipet, Pipetman neo P20N (2-20 &amp;micro;l)</td><td><a href="http://www.gilson.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Gilson</a></td><td>F144563</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipet, Pipetman neo P200N (20-200 &amp;micro;l)</td><td><a href="http://www.gilson.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Gilson</a></td><td>F144565</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipet, Pipetman neo P1000N (100-1000 &amp;micro;l)</td><td><a href="http://www.gilson.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Gilson</a></td><td>F144566</td><td></td></tr></tbody></table>

sinir hücresi tipleri yüzey akış sitometri protokolleri ve hücre içi antijen analizleri

Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types

Flow sitometri, immünoloji, hematoloji ve onkolojide hücre popülasyonlarını tanımlamak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Burada, nöral hücre tiplerinde farklılaşma (CD) yüzey antijenleri ve hücre içi antijenler kümesinin akış sitometrik analizi için protokollerin ayrıntılı bir tanımını sunuyoruz. Metodolojik prosedürlerin adım adım açıklaması şunları içerir: nöral in vitro kültürlerin toplanması, isteğe bağlı bir karboksifloresein süksinimidil ester (CFSE) etiketleme adımı, ardından konjuge CD antikorları (örneğin, CD24, CD54) ile yüzey antijen boyaması ve ardından birincil / ikincil antikorlar veya floresan etiketli Fab fragmanları (Zenon etiketlemesi) yoluyla intracellar antijen tespiti. Videoda en kritik adımlar gösterilmektedir. Ayrıca, deneysel planlamanın ilkeleri, kritik kontrollerin dahil edilmesi ve akış sitometrik analizinin temelleri (hedef popülasyonun belirlenmesi ve enkazın dışlanması; geçit stratejisi; spektral örtüşme için telafisi), akış sitometrisi konusunda sınırlı ön bilgiye veya özel eğitime sahip nörobiyologların faydasını değerlendirmesini ve bu güçlü metodolojiyi daha iyi kullanmasını sağlamak için kısaca açıklanmıştır.

Burada sunulan protokol yönlü deneysel yaklaşımlar (Şekil 2) sağlar. En kısa versiyonda, yüzey antijenlerinin basit boyama için bir kılavuz olarak kabul edilebilir (1, 3 ve 6 aşamada). Bunu daha karmaşık bir formda, hücre içi antijenlere bir dizi eş-etiketleme paradigmaların bir sayısı (2 ve / veya 4-5 isteğe bağlı aşama) takip edilebilir. Ayrıca, KAKE etiketleme adım hücre-hücre etkileşimi çalışmalarında alt popülasyon...

Nöral hücre tiplerinde yüzey antijenlerinin ve/veya hücre içi antijenlerin akış sitometrik analizi için bir protokolün ayrıntılı bir tanımını sunuyoruz. Nörobiyologların bu güçlü teknolojiden yararlanmalarını sağlamak için deneysel planlamanın kritik yönleri, adım adım metodolojik prosedürler ve akış sitometrisinin temel ilkeleri açıklanmaktadır.

Sinir Hücresi Tipleri Yüzey Akış Sitometri Protokolleri ve Hücre içi Antijen Analizleri

Flow cytometry has been extensively used to define cell populations in immunology, hematology and oncology. Here, we provide a detailed description of ...

Bu prosedürün genel amacı, akış sitometrisi kullanarak nöral hücreler üzerindeki yüzey ve hücre içi antijenlerin ekspresyonunu analiz etmektir. Bu, ilk olarak in vitro kültürlerden veya birincil nöral dokudan nöral hücrelerin toplanmasıyla gerçekleştirilir. Daha sonra, hücrelere isteğe bağlı spesifik olmayan bir hücre içi boyama uygulanır.Daha sonra istenen yüzey antijenleri hemen bir primer antikor ile etiketlenirken, istenen hücre içi antijenler hücresel fiksasyon ve geçirgenlikten sonra etiketlenir. Sonuç olarak, sonuçlar, hücre içi etiket ile tanımlandığı gibi, ilgilenilen belirli nöral alt popülasyonlar üzerinde yüzey antijenlerinin birlikte ekspresyonu için akış sitometrik analizi kullanılarak elde edilebilir. Bu protokol, çok renkli akış sitometrisi ile yüzey ve hücre içi antijenlerin sorgulanması için doku kültüründen türetilmiş nöral hücrelerin nasıl hazırlanacağını gösterecektir.T 75 şişelerinde büyütülen yapışık sinir hücrelerini hasat etmeye başlamak için, hücreleri önce oda sıcaklığında beş mililitre magnezyum ve kalsiyum içermeyen PBS ile bir kez nazikçe yıkayarak hasat edin. Daha sonra, üç mililitre tripsin ikamesi ekleyerek hücreleri şişeden ayırın ve 37 santigrat derecede iki ila beş dakika inkübe edin. Hücre süspansiyonunu birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek hücre kümelerini gevşettikten sonra altı mililitre akış tamponu ekleyerek enzimatik sindirimi söndürün, hücreleri izole etmek için tüm hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın.Tüpü bir santrifüje yerleştirin, hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca döndürün ve hücre içi boya etiketlemesine hazırlık olarak snat'ı aspire edin. Hücre peletini beş mililitre PBS ve% 0.1 BSA ile yeniden askıya alın. Aksi takdirde, standart trian mavisi boyama protokolü ile birlikte beş mililitre akış tamponu ekleyin.Etkili canlı hücre sayısını tahmin etmek için bir hemo sitometre kullanın. Mevcut süspansiyonun hücre konsantrasyonunu, önceki adımda kullanılan aynı tamponla mililitre başına 1 milyon canlı hücreye yeniden ayarlayın. Bu hücreler artık iki boyama seçeneği, bir yüzey antijen antikor boyası veya karboksi floresein ile isteğe bağlı bir floresan hücre içi boyama ve ardından yukarıda belirtilen yüzey antijen boyası için hazırdır.Karboksi floresein CIN ester boyası ile hücre içi etiketleme adımı gerçekleştirmek için önce 10 mikrolitre CFSE stok çözeltisi ekleyin. Her bir mililitre hücre süspansiyonu için, tüpü 200 RPM'de bir çalkalayıcı üzerine yerleştirin ve karışımı beş dakika inkübe edin. Oda sıcaklığında, tüpü doğrudan ışığa maruz kalmaktan koruyarak foto ağartmayı önleyin.Akış tamponu içeren beş hacim serum ekleyerek tüm reaktif olmayan boyaları söndürün ve karıştırmak için birkaç kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Daha sonra hücreleri oda sıcaklığında bir santrifüjde beş dakika boyunca döndürün ve reaktif olmayan boyaların kalıntı izlerini gidermek için süpernatanı aspire edin. Hücre peletini tekrar tekrar yıkayın, beş hacim akış tamponu ile süspanse edin.Hücreler daha sonra SUP natantını atmadan önce oda sıcaklığındaki bir santrifüjde beş dakika boyunca bir kez daha döndürülür. Son olarak, hücre peletini, nihai hücre konsantrasyonu mililitre başına 1 milyon canlı hücre olacak şekilde akış tamponu ile yeniden askıya alın. Çoğullanmış bir deney için, CFSC lekeli hücre süspansiyonuna farklı bir deney koşulundan eşit sayıda boyanmamış ilgili hücre ekleyin.Hücreler artık hücre yüzeyi boyamaya başlamak için antikorlarla yüzey antijen etiketlemesine hazırdır. CFSC etiketli veya etiketsiz 100 mikrolitre hücre süspansiyonunu 1,5 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın. Hücre süspansiyonuna, daha önce antikor titrasyon testleri ile belirlenen bir miktarda flor dört konjuge antikor ekleyin.Tüpü 100 RPM'de oda sıcaklığında bir orbital çalkalayıcıya yerleştirin ve karışımı 30 dakika inkübe edin. Işık yokluğunda, bir mililitre akış tamponu ekleyerek antikor karışımını seyreltin. Hücreleri dört dakika boyunca önceden soğutulmuş dört santigrat derece mikro santrifüjde karıştırmak ve döndürmek için hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin.Bağlanmamış antikorları çıkarmak için supinatı aspire edin ve bu yıkama santrifüjünü ve aspirasyonu tekrarlayın. Bir kez daha adım atın. Reus, hücre peletini daha önce boyanmış hücrelere bir akış tamponu olan 100 mikrolitrede askıya alır.100 mikrolitre hücre süspansiyonuna 500 mikrolitre fiksasyon tamponu ekleyin. Tüpü 100 RPM'de oda sıcaklığında bir orbital çalkalayıcıya yerleştirin ve karanlıkta 15 dakika inkübe edin. Formaldehit, birbirine yakın olan tüm protein ve DNA türlerini çapraz bağlayacak ve canlı olmayan hücre süspansiyonları verecektir.Fiksasyon karışımını bir mililitre PBS ekleyerek seyreltin ve karıştırmak için birkaç kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Daha sonra sabit hücreleri önceden soğutulmuş dört santigrat derece santrifüjde üç dakika boyunca döndürün. Supinatı, sonraki hücre içi antijen etiketlemesi için hücre zarına nüfuz etmek üzere hücre peletinin üzerinde 100 mikrolitre sıvı kalacak şekilde aspire edin.100 mikrolitre hücre süspansiyonuna 500 mikrolitre geçirgenlik tamponu ekleyin. Tüpü 100 RPM'de oda sıcaklığında bir orbital çalkalayıcıya yerleştirin ve karanlıkta 15 dakika inkübe edin. Geçirgenlik karışımını bir mililitre PBS ekleyerek seyreltin, sabit hücreleri üç dakika boyunca önceden soğutulmuş dört santigrat derece santrifüjde karıştırmak ve döndürmek için birkaç kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin.Kuluçkadan önce SUP natantını tamamen aspire edin. Antikoru bir PBS artı %0.5 ara 20 tamponunda seyrelterek bir birincil antikor çalışma stoğu hazırlayın. Bu, %1 BSA %10 eşek serumu veya %10 keçi serumu ile daha da zenginleştirilmiştir.Daha sonra membran geçirgen hücre peletini 100 mikrolitre birincil antikor çalışma stoğu ile yeniden süspanse edin. Tüpü 200 RPM'de oda sıcaklığında bir orbital çalkalayıcıya yerleştirin ve karanlıkta 30 dakika inkübe edin. Birincil antikor karışımını bir mililitre akış tamponu ekleyerek seyreltin.Hücreleri dört dakika boyunca önceden soğutulmuş dört santigrat derece santrifüjde karıştırmak ve döndürmek için birkaç kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Bağlanmamış antikorları çıkarmak için supinatı tamamen aspire edin. Daha sonra, peleti 100 mikrolitre ikincil antikor çalışma stoğu ile yeniden süspanse edin.Işık korumalı oda sıcaklığında inkübasyonu 30 dakika boyunca tekrarlayın. Aynı çalkalayıcıda, bir mililitre akış tamponu ekleyerek ikincil antikor karışımını seyreltin. Tüm bağlanmamış antikorları ortadan kaldırmak için aynı tüp inversiyon karışımını, spin down ve süpernatant çıkarmayı tekrarlayın.Aynı bir mililitrelik yıkama santrifüjleme ve süpernatan çıkarma adımlarını iki kez daha tekrarlayın, ancak yıkama tamponu olarak taze PBS ile. Bunun yerine, sonuç, CFSC hücre dışı veya hücre içi hedefli floresan antikorları veya 150 mikrolitre akış tamponunda etiketlenmiş hücre peleti olan üç yeniden süspansiyonun herhangi bir kombinasyonu ile etiketlenmiş bir temiz hücre peleti olacaktır. Hücre süspansiyonunu akış sitometresine aktarın ve dört katın her biri için uygun lazer uyarma ve emisyon filtresi ayarlarıyla analize başlayın.İleri ve yan saçılma verilerini kılavuz olarak kullanarak, hücre kalıntıları ve ölü hücreler gibi spesifik olmayan veri noktalarını hariç tutmak için akış sitometrisi analiz yazılımı içinde ilk ileri ve yan saçılmayı ayarlayın. Daha sonra, boyanmamış bir hücre süspansiyonundan elde edilen ham verileri negatif kontrol olarak kullanarak, çok renkli arka plan floresansını hesaba katmak için hem hücre dışı hem de hücre içi antijen etiketlerinden pozitif emisyon sinyallerini seçen birden fazla floresan entegrasyon kapısı ayarlayın. Spektral örtüşme efektleri, tek antikor lekeli kontrollerden gelen ham verileri kullanarak floresan kapıları yeniden ayarlar.Çoğullanmış bir faks deneyinde, karboksi floresein etiketleri, bir antikor kullanmadan iki farklı soydan veya deneysel koşullardan hücreler arasında ayrım yapabilen bir temel sinyal olarak kullanılabilir. Örneğin, heterojen bir hücre süspansiyonunda, sadece yeşil kanalda floresan varlığına veya yokluğuna bakarak, CFSC ile etiketlenmiş nöral hücreler ile etiketlenmemiş fibroblastlar arasında hemen ayrım yapılabilir. Ayrıca, CFSE Esther etiketlemesi ile bağlantılı olarak, karışık bir numune içindeki CFSE etiketli ve etiketsiz alt gruplar arasındaki yüzey antijenlerinin diferansiyel ekspresyonunu belirlemek için farklı renklerde floresan antikorlar kullanılabilir.Örneğin, yeşil floresan kanalında CFSE ile işaretlenmiş SHSY beş Y nöroblastom hücresi, yüksek seviyelerde CD 24 yüzey antijenini birlikte eksprese etti, ancak fibroblast markörü CD 54'ü değil. Buna karşılık, CFSC negatif BJ fibroblastları, daha düşük CD 24 seviyeleri ile CD 54 için pozitiftir. Nöral yüzey antijenlerinin analizi, hücre içi antijenlerin antikor bazlı tespiti ile birlikte de gerçekleştirilebilir.Yüzey antijenleri ve hücre içi antijenler için boyanmamış örneklerin ve tek lekeli kontrollerin dahil edilmesi, burada gösterilen nöral belirteç haritası gibi hücre içi antijenlerin birincil artı ikincil antikor bazlı etiketlenmesine bir alternatif olarak kritik öneme sahiptir. Primer antikorun kovalent olmayan floresan etiketlemesi, ko-ekspresyon analizinde karşılaştırılabilir sonuçlar verebilir ve protokolü kısaltır. Bu videoyu izledikten sonra, çeşitli alternatif etiketleme yaklaşımları ve bunların kombinasyonları kullanılarak temel akış sitometrik analizi için sinir hücrelerinin nasıl hazırlanacağını iyi anlamış olmalısınız.

flow-cytometry-protocols-for-surface-intracellular-antigen-analyses

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu video protokolü akış sitometrisi teknolojisi kullanılarak fiziksel (boyutu ve iç boyu) ve floresan özelliklerine bağlı olarak kök sinir hücrelerini yenilenebilir bir kaynaktan (NSC'lerde) den nöronal progenitör hücre üretimi ve daha sonra saflaştırma için yeni bir yöntem gösterilmektedir.

Neuroblast Test: Akım Sitometri Kullanımı Farklılaşan Nöral Kök Hücre Döl nöronal Progenitör Hücrelerinin üretilmesi ve zenginleştirilmesi için bir Testi

Kaynak: Becker-Kojić, Z. A., et. al., Kan Kaynaklı Nöronal Hücrelerin GM İçermeyen Üretimi. J. Vis. Uzm. (2021)Video, floresan mikroskobu için yeniden programlanmış periferik kan hücrelerinden türetilen nöral hücrelerin hazırlanmasına yönelik bir protokolü gösterir ve immünofloresan görüntüleme yoluyla farklı hücre tiplerini ve gelişim aşamalarını gösterir.

Periferik Kan Kaynaklı Hücrelerden Farklılaşan Nöral Hücrelerin İmmünofloresan Mikroskobu 

Kaynak: Hidmark, A. S.,  et al. {{}}Tek Bir Siyatik Sinirlerde ve Dorsal Kök Ganglionunda İmmün Hücrelerin Flow Sitometri Kullanılarak Analizi. J. Vis. Uzm. {{TAG_ 27}} (2017).  Bu video, fare siyatik sinirlerinde ve dorsal kök gangliyonlarında (DRG'ler) bağışıklık hücrelerini analiz etmek için akış sitometrisinin kullanımını göstermektedir. İşlem, bağışıklık hücrelerinin florofor ve biyotin etiketli antikorlarla etiketlenmesini, hücrelerin stabilize edilmesini ve geçirgenleştirilmesini ve...

Fare Sinir Dokularındaki İmmün Hücrelerin Flow Sitometri Kullanılarak Analizi

Son yıllarda, canlı hücre bazlı deneyler, yüzey ve şekilsel antijenlere karşı antikorlar tespit etmek için başarılı bir şekilde kullanılmıştır. Burada, hastaların büyük kuşaklarının analiz sağlayarak sitometri yüksek verimli akışını kullanarak bir yöntem açıklanmaktadır. Yeni antikorların tespiti immün aracılı bozuklukların tanı ve tedavi artıracaktır.

İnsan Serum içinde N-metil-D-aspartat reseptör ya da dopamin-2 reseptör antikorları algılamak üzere yüksek verimli Flow Cytometry hücre bazlı bir deneyde

Bu protokolün amacı, hücre tipine özgü gen ekspresyonunun, epigenetik belirteçlerin ve/veya protein ekspresyonunun sonraki analizi için belirli nöral hücre tiplerini sıralamak için floresanla aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) tekniğini kullanmaktır.

Sıçan beyin dokusunda incelemek için THP kullanılarak hücre-tipi-spesifik gen ifadesi

Fare beyninden veya omurilikten alınan farklı hücre tiplerini aynı anda belirlemek için bir akış sitometri yöntemi sintometri sitometri sitometri sitometrisi sintometrisi sitometri sintometrisi sintometrisi sintometri Bu yöntem, nörodejeneratif hastalıklarda saf hücre popülasyonlarını izole etmek veya karakterize etmek veya viral vektörlerin veya nano partiküllerin in vivo uygulamasında hücre hedeflemesinin kapsamını ölçmek için kullanılabilir.

Farklı Homojenizasyon Yöntemleri ile Fare Beyin/Omurilikten Alınan Çoklu Hücre Tiplerinin Eşzamanlı Akış Sitometrik Karakterizasyonu

Bu el yazması farelerde aktif deneysel deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE) indüklemek için bir protokol sunar. Merkezi sinir sisteminde (CNS) infiltrasyon lenfositlerin izolasyon ve karakterizasyonu için bir yöntem de lenfositler CNS otoimmün hastalığın gelişiminde nasıl rol olduğunu göstermek için sunulmaktadır.

Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit Sırasında Merkezi Sinir Sisteminde Lenfosit Infiltrasyonunun Akış Sitometrik Analizi

İnsan astrosit popülasyonlarını aşağı akış moleküler analizlerinde kullanılmak üzere taze dondurulmuş dokudan zenginleştiren ve izole eden bir yöntem geliştirdik.

Floresan Aktive Edilmiş Çekirdekler Ayıklama Kullanılarak Yetişkin İnsan Astrosit Popülasyonlarının Taze Dondurulmuş Korteksten İzolasyonu

Bu protokol, i) konfokal bir mikroskop, ii) yoğunluk görüntülemesi yapmak için bir floresan aktive hücre sıralayıcısı veya iii) floresan ömür boyu görüntüleme gerçekleştirmek için bir çoklu foton mikroskobu kullanarak otofloresan görüntüleme yoluyla birincil yetişkin fare nöral kök hücre kültürlerinde hücre durumunu tanımlama ve zenginleştirme stratejilerini açıklar.

Nöral Kök Hücre Aktivasyon Durumunun İn Vitro Otofloresan Kullanılarak Sınıflandırılması

Bugüne kadar, tüm ana merkezi sinir sisteminde yerleşik hücre tiplerinin aynı fareden eşzamanlı izolasyonu için protokoller karşılanmamış bir taleptir. Protokol, nöroinflamasyon sırasında karmaşık hücresel ağları araştırmak ve aynı anda gerekli fare sayılarını azaltmak için naif ve deneysel otoimmün ensefalomiyelit farelerinde uygulanabilir bir prosedürü göstermektedir.

Yetişkin Otoimmün Ensefalomiyelit Farelerinden Başlıca Merkezi Sinir Sisteminde Yerleşik Hücre Tiplerinin Eşzamanlı İzolasyonu

Burada, akış sitometrisi kullanarak vGLUT1 pozitif sinapsların ve pHRodo Red etiketli ham sinaptozomların mikroglial yutulmasını ölçmek için iki protokol sunuyoruz.

Akış Sitometrisi Kullanılarak Sinaptik Materyalin Mikroglial Yutulmasının Miktar Tayini

Öğrenin, sinir hücrelerinde yüzey ve hücre içi antijenleri akış sitometrisi ile analiz etme yöntemini. Bu protokol, nörobiyologların çok renkli akış sitometrisi kullanarak spesifik sinir alt popülasyonlarını tanımlamasına yardımcı olur.

Sinir Hücresi Tipleri Yüzey Akış Sitometri Protokolleri ve Hücre içi Antijen Analizleri

Daha fazla video keşfet