Sinir Hücresi Tipleri Yüzey Akış Sitometri Protokolleri ve Hücre içi Antijen Analizleri

Bu prosedürün genel amacı, akış sitometrisi kullanarak nöral hücreler üzerindeki yüzey ve hücre içi antijenlerin ekspresyonunu analiz etmektir. Bu, ilk olarak in vitro kültürlerden veya birincil nöral dokudan nöral hücrelerin toplanmasıyla gerçekleştirilir. Daha sonra, hücrelere isteğe bağlı spesifik olmayan bir hücre içi boyama uygulanır.

Daha sonra istenen yüzey antijenleri hemen bir primer antikor ile etiketlenirken, istenen hücre içi antijenler hücresel fiksasyon ve geçirgenlikten sonra etiketlenir. Sonuç olarak, sonuçlar, hücre içi etiket ile tanımlandığı gibi, ilgilenilen belirli nöral alt popülasyonlar üzerinde yüzey antijenlerinin birlikte ekspresyonu için akış sitometrik analizi kullanılarak elde edilebilir. Bu protokol, çok renkli akış sitometrisi ile yüzey ve hücre içi antijenlerin sorgulanması için doku kültüründen türetilmiş nöral hücrelerin nasıl hazırlanacağını gösterecektir.

T 75 şişelerinde büyütülen yapışık sinir hücrelerini hasat etmeye başlamak için, hücreleri önce oda sıcaklığında beş mililitre magnezyum ve kalsiyum içermeyen PBS ile bir kez nazikçe yıkayarak hasat edin. Daha sonra, üç mililitre tripsin ikamesi ekleyerek hücreleri şişeden ayırın ve 37 santigrat derecede iki ila beş dakika inkübe edin. Hücre süspansiyonunu birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek hücre kümelerini gevşettikten sonra altı mililitre akış tamponu ekleyerek enzimatik sindirimi söndürün, hücreleri izole etmek için tüm hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın.

Tüpü bir santrifüje yerleştirin, hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca döndürün ve hücre içi boya etiketlemesine hazırlık olarak snat'ı aspire edin. Hücre peletini beş mililitre PBS ve% 0.1 BSA ile yeniden askıya alın. Aksi takdirde, standart trian mavisi boyama protokolü ile birlikte beş mililitre akış tamponu ekleyin.

Etkili canlı hücre sayısını tahmin etmek için bir hemo sitometre kullanın. Mevcut süspansiyonun hücre konsantrasyonunu, önceki adımda kullanılan aynı tamponla mililitre başına 1 milyon canlı hücreye yeniden ayarlayın. Bu hücreler artık iki boyama seçeneği, bir yüzey antijen antikor boyası veya karboksi floresein ile isteğe bağlı bir floresan hücre içi boyama ve ardından yukarıda belirtilen yüzey antijen boyası için hazırdır.

Karboksi floresein CIN ester boyası ile hücre içi etiketleme adımı gerçekleştirmek için önce 10 mikrolitre CFSE stok çözeltisi ekleyin. Her bir mililitre hücre süspansiyonu için, tüpü 200 RPM'de bir çalkalayıcı üzerine yerleştirin ve karışımı beş dakika inkübe edin. Oda sıcaklığında, tüpü doğrudan ışığa maruz kalmaktan koruyarak foto ağartmayı önleyin.

Akış tamponu içeren beş hacim serum ekleyerek tüm reaktif olmayan boyaları söndürün ve karıştırmak için birkaç kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Daha sonra hücreleri oda sıcaklığında bir santrifüjde beş dakika boyunca döndürün ve reaktif olmayan boyaların kalıntı izlerini gidermek için süpernatanı aspire edin. Hücre peletini tekrar tekrar yıkayın, beş hacim akış tamponu ile süspanse edin.

Hücreler daha sonra SUP natantını atmadan önce oda sıcaklığındaki bir santrifüjde beş dakika boyunca bir kez daha döndürülür. Son olarak, hücre peletini, nihai hücre konsantrasyonu mililitre başına 1 milyon canlı hücre olacak şekilde akış tamponu ile yeniden askıya alın. Çoğullanmış bir deney için, CFSC lekeli hücre süspansiyonuna farklı bir deney koşulundan eşit sayıda boyanmamış ilgili hücre ekleyin.

Hücreler artık hücre yüzeyi boyamaya başlamak için antikorlarla yüzey antijen etiketlemesine hazırdır. CFSC etiketli veya etiketsiz 100 mikrolitre hücre süspansiyonunu 1,5 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın. Hücre süspansiyonuna, daha önce antikor titrasyon testleri ile belirlenen bir miktarda flor dört konjuge antikor ekleyin.

Tüpü 100 RPM'de oda sıcaklığında bir orbital çalkalayıcıya yerleştirin ve karışımı 30 dakika inkübe edin. Işık yokluğunda, bir mililitre akış tamponu ekleyerek antikor karışımını seyreltin. Hücreleri dört dakika boyunca önceden soğutulmuş dört santigrat derece mikro santrifüjde karıştırmak ve döndürmek için hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin.

Bağlanmamış antikorları çıkarmak için supinatı aspire edin ve bu yıkama santrifüjünü ve aspirasyonu tekrarlayın. Bir kez daha adım atın. Reus, hücre peletini daha önce boyanmış hücrelere bir akış tamponu olan 100 mikrolitrede askıya alır.

100 mikrolitre hücre süspansiyonuna 500 mikrolitre fiksasyon tamponu ekleyin. Tüpü 100 RPM'de oda sıcaklığında bir orbital çalkalayıcıya yerleştirin ve karanlıkta 15 dakika inkübe edin. Formaldehit, birbirine yakın olan tüm protein ve DNA türlerini çapraz bağlayacak ve canlı olmayan hücre süspansiyonları verecektir.

Fiksasyon karışımını bir mililitre PBS ekleyerek seyreltin ve karıştırmak için birkaç kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Daha sonra sabit hücreleri önceden soğutulmuş dört santigrat derece santrifüjde üç dakika boyunca döndürün. Supinatı, sonraki hücre içi antijen etiketlemesi için hücre zarına nüfuz etmek üzere hücre peletinin üzerinde 100 mikrolitre sıvı kalacak şekilde aspire edin.

100 mikrolitre hücre süspansiyonuna 500 mikrolitre geçirgenlik tamponu ekleyin. Tüpü 100 RPM'de oda sıcaklığında bir orbital çalkalayıcıya yerleştirin ve karanlıkta 15 dakika inkübe edin. Geçirgenlik karışımını bir mililitre PBS ekleyerek seyreltin, sabit hücreleri üç dakika boyunca önceden soğutulmuş dört santigrat derece santrifüjde karıştırmak ve döndürmek için birkaç kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin.

Kuluçkadan önce SUP natantını tamamen aspire edin. Antikoru bir PBS artı %0.5 ara 20 tamponunda seyrelterek bir birincil antikor çalışma stoğu hazırlayın. Bu, %1 BSA %10 eşek serumu veya %10 keçi serumu ile daha da zenginleştirilmiştir.

Daha sonra membran geçirgen hücre peletini 100 mikrolitre birincil antikor çalışma stoğu ile yeniden süspanse edin. Tüpü 200 RPM'de oda sıcaklığında bir orbital çalkalayıcıya yerleştirin ve karanlıkta 30 dakika inkübe edin. Birincil antikor karışımını bir mililitre akış tamponu ekleyerek seyreltin.

Hücreleri dört dakika boyunca önceden soğutulmuş dört santigrat derece santrifüjde karıştırmak ve döndürmek için birkaç kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Bağlanmamış antikorları çıkarmak için supinatı tamamen aspire edin. Daha sonra, peleti 100 mikrolitre ikincil antikor çalışma stoğu ile yeniden süspanse edin.

Işık korumalı oda sıcaklığında inkübasyonu 30 dakika boyunca tekrarlayın. Aynı çalkalayıcıda, bir mililitre akış tamponu ekleyerek ikincil antikor karışımını seyreltin. Tüm bağlanmamış antikorları ortadan kaldırmak için aynı tüp inversiyon karışımını, spin down ve süpernatant çıkarmayı tekrarlayın.

Aynı bir mililitrelik yıkama santrifüjleme ve süpernatan çıkarma adımlarını iki kez daha tekrarlayın, ancak yıkama tamponu olarak taze PBS ile. Bunun yerine, sonuç, CFSC hücre dışı veya hücre içi hedefli floresan antikorları veya 150 mikrolitre akış tamponunda etiketlenmiş hücre peleti olan üç yeniden süspansiyonun herhangi bir kombinasyonu ile etiketlenmiş bir temiz hücre peleti olacaktır. Hücre süspansiyonunu akış sitometresine aktarın ve dört katın her biri için uygun lazer uyarma ve emisyon filtresi ayarlarıyla analize başlayın.

İleri ve yan saçılma verilerini kılavuz olarak kullanarak, hücre kalıntıları ve ölü hücreler gibi spesifik olmayan veri noktalarını hariç tutmak için akış sitometrisi analiz yazılımı içinde ilk ileri ve yan saçılmayı ayarlayın. Daha sonra, boyanmamış bir hücre süspansiyonundan elde edilen ham verileri negatif kontrol olarak kullanarak, çok renkli arka plan floresansını hesaba katmak için hem hücre dışı hem de hücre içi antijen etiketlerinden pozitif emisyon sinyallerini seçen birden fazla floresan entegrasyon kapısı ayarlayın. Spektral örtüşme efektleri, tek antikor lekeli kontrollerden gelen ham verileri kullanarak floresan kapıları yeniden ayarlar.

Çoğullanmış bir faks deneyinde, karboksi floresein etiketleri, bir antikor kullanmadan iki farklı soydan veya deneysel koşullardan hücreler arasında ayrım yapabilen bir temel sinyal olarak kullanılabilir. Örneğin, heterojen bir hücre süspansiyonunda, sadece yeşil kanalda floresan varlığına veya yokluğuna bakarak, CFSC ile etiketlenmiş nöral hücreler ile etiketlenmemiş fibroblastlar arasında hemen ayrım yapılabilir. Ayrıca, CFSE Esther etiketlemesi ile bağlantılı olarak, karışık bir numune içindeki CFSE etiketli ve etiketsiz alt gruplar arasındaki yüzey antijenlerinin diferansiyel ekspresyonunu belirlemek için farklı renklerde floresan antikorlar kullanılabilir.

Örneğin, yeşil floresan kanalında CFSE ile işaretlenmiş SHSY beş Y nöroblastom hücresi, yüksek seviyelerde CD 24 yüzey antijenini birlikte eksprese etti, ancak fibroblast markörü CD 54'ü değil. Buna karşılık, CFSC negatif BJ fibroblastları, daha düşük CD 24 seviyeleri ile CD 54 için pozitiftir. Nöral yüzey antijenlerinin analizi, hücre içi antijenlerin antikor bazlı tespiti ile birlikte de gerçekleştirilebilir.

Yüzey antijenleri ve hücre içi antijenler için boyanmamış örneklerin ve tek lekeli kontrollerin dahil edilmesi, burada gösterilen nöral belirteç haritası gibi hücre içi antijenlerin birincil artı ikincil antikor bazlı etiketlenmesine bir alternatif olarak kritik öneme sahiptir. Primer antikorun kovalent olmayan floresan etiketlemesi, ko-ekspresyon analizinde karşılaştırılabilir sonuçlar verebilir ve protokolü kısaltır. Bu videoyu izledikten sonra, çeşitli alternatif etiketleme yaklaşımları ve bunların kombinasyonları kullanılarak temel akış sitometrik analizi için sinir hücrelerinin nasıl hazırlanacağını iyi anlamış olmalısınız.