Nöroprotektif Stratejileri Tedavi Faktörleri teslimi için tasarlandı Erişkin Kök Hücre Yüksek Verimli Karakterizasyonu

Bu prosedürün genel amacı, yüksek içerikli bir tarama veya HCS sistemi kullanarak genetik olarak tasarlanmış kök hücreleri hızlı bir şekilde karakterize etmektir. Bu, önce 96 oyuklu bir plaka için deneyler tasarlayarak ve hazırlayarak ve daha sonra tasarlanmış kök hücrelerin farklı popülasyonlarını kaplayarak gerçekleştirilir. Daha sonra, yüksek içerikli tarama sistemi canlı hücre görüntüleme için hazırlanır ve daha sonra istenen zaman dilimi için hızlandırılmış görüntüleme başlatılır.

Daha sonra hızlandırılmış görüntüleme tamamlandıktan sonra, kültür plakası, hücre proliferasyonunu karakterize etmek için propidyum iyodür, hücre ölümü için boyama veya KI 67 immün etiketleme gibi hücre boyama prosedürleri için hazırlanır. Son olarak, 96 kuyulu plaka, floresan görüntüleme ve görüntü elde etme için yüksek içerikli tarama sistemine yeniden yüklenir. Sonuç olarak, görüntü analiz yazılımı, farklı hücre büyüme parametrelerinin belirlenmesi için veri analizi yapmak için kullanılır.

Bu metodoloji, kök hücre farklılaşmasını uyaran faktörlerin tanımlanması ve karakterizasyonu gibi kök hücre biyolojisi alanındaki temel konuların ele alınmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin etkileri, hücre tiplerinin in vivo olarak kullanılmadan önce karakterize edilmesinin önemi nedeniyle hücre bazlı terapötik stratejilere doğru uzanır. Bu yöntem, hücre davranışları hakkında bilgi sağlayabilir ve kültürde iyi büyüyen hemen hemen tüm diğer hücre tiplerine uygulanabilir.

Ek olarak, bu yaklaşımlar potansiyel olarak zebra balığı larvaları gibi tüm organizmalar üzerinde kullanılabilir. Başlamak için, burada gösterildiği gibi, steril bir kültür başlığı altında incelenecek farklı substratları ve hücre tiplerini özetleyen 96 oyuklu plakanın bir haritasını oluşturun. Farklı alt tabakalara ve 96 oyuklu bir plakaya sahip bir iş istasyonu hazırlayın.

Haritaya göre her birine 100 mikrolitre substrat çözeltisi ekleyin. Daha sonra, kapağı kapatmak için bir perfil şeridi kullanın ve fare mezenkimal kök hücrelerini izole ettikten ve metin protokolüne göre lentiviral vektörlerle enfekte ettikten sonra gece boyunca dört santigrat derecede saklayın, substrat çözeltilerini 96 kuyucuklu plakadan çıkarın ve kuyucukları iki kez yıkamak için yaklaşık 200 mikrolitre steril PBS kullanın. Son durulama 200 mikrolitre hücre kültürü ortamında çıkarıldıktan sonra plakayı 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte bir hücre kültürü inkübatöründe dengeleyin.

Bu arada, steril koşullar altında, MSC'leri önce şişeden şartlandırılmış ortam olarak adlandırılan büyüme ortamını toplayarak hasat edin, 15 mililitrelik konik bir tüpe. Daha sonra şişeye sekiz mililitre steril PBS ekleyin ve tamponu aspire etmeden önce hafifçe döndürün Hücreleri şişeden ayırmak için bir mililitre% 0.05 tripsin ve% 0.01 EDTA çözeltisi ekleyin. Hücreler ayrıldığında, hücre süspansiyonunu toplamadan ve hücreleri oyuk başına yaklaşık 300 hücrede yeniden kaplamadan önce sekiz mililitre şartlandırılmış ortam ekleyin.

Metin protokolüne göre, hücreler inkübe edilirken MSC'lerin substrata yapışmasına izin vermek için plakayı iki saat inkübe edin. HCS sistemini başlatın ve dengelenmesi için iki saat bekleyin. Çevre kontrol cihazını 37 santigrat dereceye ayarlayın ve havada% 5 karbondioksit içeren karışık gaz silindirini, sabit bir hava kaynağı sağlayan çevre odası olan HCS sistemine dikkatlice açın.

Daha sonra, iki saatlik inkübasyon süresinden sonra, 96 oyuklu plakayı inkübatörden çıkarın ve doğrudan HCS sisteminin çevre odasına yerleştirin. Plakanın 30 dakika dengelenmesine izin verdikten sonra, plaka ayarlarını yapılandırmak için yazılımı başlatın. Görüntüleme parametreleri ayarlandıktan sonra, metin protokolüne göre, kuyu dibine odaklanmak için lazer otofokus kullanın ve optimize edilmiş bir odak düzlemi bulmak için birden fazla bölgeden ve birden fazla kuyudan test görüntüleri alın.

Odak oluşturulduktan sonra, 60 kuyunun tamamı için 48 saat boyunca her beş dakikada bir görüntü yakalamaya başlayın. Deney sonunda, 96 oyuklu plakayı steril koşullar altında HCS sisteminden çıkarın, her kuyucuktan şartlandırılmış ortam numuneleri toplayın ve bunları yeni bir 96 kuyulu plakaya aktarın. Bu örnekler daha sonra bir ELIZA'nın bir KI 67 hücre proliferasyon testi gerçekleştirmesi için kullanılabilir.

Hücre kültürlerini bir dakika durulamak için 0.1 molar fosfat tamponu kullanın. Yıkamayı tekrarladıktan sonra, fiksasyonu takiben kültürleri sabitlemek için oda sıcaklığında 20 dakika boyunca %4 para formaldehit veya PFA kullanın. PFA'yı çıkarın ve kuyucukları her biri yedi dakika boyunca üç kez durulamak için PBS'yi kullanın.

Hücreleri metin protokolüne göre bloke ettikten sonra, her birine 100 mikrolitre primer antikor solüsyonu uygulayın. Plakayı iyice örtün ve gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Hücreleri yedi dakika boyunca üç kez yıkadıktan sonra.

Her yıkama için ikincil antikor uygulayın. Hücreleri karanlığa yerleştirin ve üç yıkamanın ardından 90 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Plakayı örtün ve görüntülemeye kadar dört santigrat derecede saklayın.

Otomatik görüntüleme yapmak için, immün etiketli plakayı HCS sistemine yükleyin ve plakanın 20 dakika boyunca dengelenmesine izin verin. HCS sistem görüntü alma ve analiz yazılımını açın. 10 x objektif için çekim ayarlarını, bir kamera bükme ve iki kazanç ayarını kullanarak seçin.

Hücrelerin bulunduğu Z düzlemini bulmak için otomatik pozlama işlevini kullanın ve burada gösterilen analiz için ilgilenilen her dalga boyu için ofseti hesaplayın. DAP, EGFP ve S3 için görüntü yakalayın. Negatif kontrol kuyularının görüntü alımı için sinyal göstermediği maksimum yoğunluk seviyesini seçin. Pozitif kuyucuklar için aynı eşik ayarlarını kullanın.

Son olarak, görüntü analizi yapmadan önce görüntüleri yakalayın ve bir veritabanına kaydedin. Metin protokolüne göre, burada gösterildiği gibi, beş farklı MSC alt tipi popülasyonu, bu şekilde farklı substratlarla önceden kodlanmış 96 Kuyu doku kültürü plakasına, çoğalan hücreleri tanımlayan anti KI 67'ye kaplandı ve DAPI, farklı substratların burada gösterildiği gibi tasarlanmış MSC'lerin farklı popülasyonlarının çoğalmasını etkileyip etkilemediğini değerlendirmek için kullanıldı, Çoğalan MSC'lerin yüzdelerinde farklılıklar olmasına rağmen, tüm substratlar her MSC alt tipi için önemli hücre proliferasyonunu destekledi. Bu grafik, bir popülasyondaki ölü hücreleri tanımlayan propidyum iyodür veya PI boyamalı hücrelerin yüzdesinin, incelenen tüm substratlarda düşük olduğunu, çoğu hücreyi öldüren% 70 etanol ile muamele edilen hücrelerin, yüksek oranda PI etiketlemesi sergilediğini ve MSC'lerin farklı substratlar üzerindeki davranışını araştırmak için pozitif bir kontrol görevi gördüğünü göstermektedir.

29 saatlik bir süre boyunca hücre göçü, hızlandırılmış dijital mikroskopi kullanılarak analiz edildi. Birinci ve ikinci hücre için geçiş yolu sırasıyla yeşil ve mavi çizgiyle işaretlenir. Burada gösterildiği gibi, MSC'lerin tüm alt tipleri, hücre dışı matris, kaplanmış yüzeyler üzerinde en hızlı göç oranını ve kaplanmamış polistiren yüzeylerde en yavaş migrasyon oranını göstermiştir.

Bu prosedürü denerken, 96 kuyulu plaka gibi çok kuyulu bir plaka formatı için deneyi dikkatli bir şekilde planlamayı ve tasarlamayı unutmamak önemlidir. Eliza S gibi diğer yöntemler, geliştirildikten sonra mühendislik kök hücreleri tarafından terapötik faktörlerin üretimi ve salgılanması ile ilgili ek soruları yanıtlamak için kondisyon ortamında gerçekleştirilebilir. Yüksek içerikli tarama prosedürleri, kök hücre biyolojisi ve ilaç keşfi alanlarındaki araştırmacıların karmaşık biyolojik sistemleri yüksek verimli bir şekilde keşfetmelerinin yolunu açmıştır.