Sıçan Optik Sinir içine Enjeksiyon için minimal invaziv Tekniği

Bu prosedürün genel amacı, canlı bir sıçanın optik sinirine ilaç veya kök hücre enjekte etmek için minimal invaziv bir yaklaşım sağlamaktır. Bu, önce farenin uyuşturulması, diseksiyon standına yerleştirilmesi ve gözün manipülasyonu için konjonktivaya bir sütür yerleştirilmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra, ikinci adım, optik siniri ortaya çıkarmak için gözün arkasındaki orbital çıkıntıyı incelemektir.

Daha sonra, cam pipet optik sinire yerleştirilir ve ilaç veya kök hücreler, cerrahi alanın kapatılmasından ve farenin anesteziden canlandırılmasından önce enjekte edilir. Sonuçta, belirli bir süre sonra, sıçan sakrifiye edilir, optik sinir diseke edilir ve cerrahi enjeksiyon veya transplantasyonun etkileri mikroskopi ile görüntülenebilir. Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, bu yaklaşımın minimal invaziv olması ve farenin ihtiyaç duyduğunuz sürece hayatta kalmasına izin vermesidir.

Cerrahi enjeksiyon veya transplantasyonun etkilerini inceleyin. Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir öğrenci teknisyen olan Kate Schwartz olacak. Tüm cerrahi prosedürleri anestezi altında% iki ila% 3 flor ile gerçekleştirin.

Ayak parmağınızı sıkıştırma ve solunum hızı ile uygun anestezi seviyesini onaylayın. Sıçanın bir ayak parmağına tepki olarak yanıp sönmediğini kontrol edin. Çimdiklemek. İşlem sırasında baş hareketini önlemek için hayvanı gerektiği gibi sabitleyin.

Ardından cerrahi göze bir damla lidokain damlatın. Anestezi altındayken kuruluğu önlemek için her 10 dakikada bir suni gözyaşı kullanın. Ameliyat öncesi deri altından kilogram başına 0.01 miligram buprenorfin enjeksiyonu yapın ve daha sonra gerektiğinde her altı ila sekiz saatte bir yapın.

Hayvanı bir ısıtma yastığı ile sıcak tutun. Kafa derisi kürkünü alkolle ıslatın. Gözlere maruz kalmamaya özen gösterin.

Ameliyat sonrası enfeksiyon riskini en aza indirmek için steril aletler ve steril teknik kullandığınızdan emin olun. Daha sonra lateral konjonktivaya dört oh'luk bir sütür yerleştirin ve hafif çekişe izin verecek kadar sütürle bağlayın. Orbital sırtın üzerindeki deride yaklaşık bir inçlik bir kesi yapın.

10 numara neşter kullanarak. Cildi ve alttaki fasyayı geri çekin ve fasyayı dikkatlice inceleyin. Cerrahi bölgeye aşırı kanamayı önlemek için üst orbital kesenin açığa çıkmasına izin vermek için geri çekilmiş cilde bir dikiş yerleştirin.

Fasyayı incelerken kan damarlarını kesmekten kaçının. Konjonktiva üzerinde hafif çekiş ile, gözü aşağı ve yuvadan dışarı çekerek, üstün orbital kas ortaya çıkacaktır. Optik siniri açığa çıkarmak için, retroorbital yağın çıkarılması ve bu kasın kesilmesi gerekir.

Yağ atılabilir ve enjeksiyondan sonra değiştirilmemelidir. Bu noktadan itibaren, optik sinir fasyası, dura ile sarılmış kan damarları ile birlikte optik sinirin kendisinin bir demeti olarak görünür olmalıdır. Daha derin diseksiyon yapmak için, piercingi daha az travmatik hale getirmek için neşter veya 31 gauge eğimli bir iğne kullanarak DRA'da küçük bir kesi yapın, stabilite sağlamak için 50 ila 100 mikron çapında çekilmiş bir cam mikro pipet hazırlayın.

Mikro pipeti bir mikro manipülatöre monte edin ve 20 cc'lik plastik bir şırıngaya takın. Cam pipete boya yüklenmeden önce ve sonra 0,5 mikrolitre metil mavisi çözeltisi ile birlikte 0,5 ila bir mikrolitre sulandırılmış boncukları veya kök hücreleri mikropipet retrogradına çekin. Bir cc'lik bir şırınga ve 30 gauge bir iğne kullanarak, mikro pipetin ucunu çentikli duranın hemen üzerindeki optik sinirin üzerine indirin.

Cam ucun optik sinire küçük ama hızlı bir hareketi, pistona yavaş ve sabit bir basınç uygularken en az hasara neden olur. Evans mavisi boyası, enjekte edilen optik sinirin alanını vurgulamalıdır. Boya, subaraknoid boşlukta dışarı sızmadan optik sinir içinde lokalize kalmalıdır.

Kök hücre enjeksiyonunun ne zaman tamamlandığını belirlemek için Evan'ın Mavi Boyasının ikinci bandını takip edin. Optik sinire gerekli hacim enjekte edildiğinde, pistonu bırakın. Enjeksiyon tamamlandığında mikro pipetin geri çekilmesi üzerine yüksek basınç çıkışını önlemek için mikro pipeti beş dakika boyunca optik sinirin içinde sabit tutun.

Mikro pipeti, hemostaz sağlamak için kullanılan pamuk uçlarıyla birlikte çıkarın. Cildi 3.0 ipek ile dikin ve konjonktival dikişi çıkarın. Anesteziden çıkana kadar fareleri bir ısıtma yastığı üzerinde sıcak tutun.

Sternal yaslanmayı sürdürmek için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar bir hayvanı gözetimsiz bırakmayın. Hayvan aşırı uyuşukluk, ataksi veya zor nefes alma dahil olmak üzere ağrı belirtileri gösteriyorsa, günde üç defaya kadar intramüsküler buprenorfin ile uygun analjezi uygulayın. Deneyden sonra, sıçanlar sakrifiye edildi ve paraaldehit ile perfüze edildi.

Optik sinirler dikkatlice diseke edildi ve kriyostat kesiti için monte edildi, burada gösterilen Evan'ın mavi boyasının enjekte edildiği daha düşük güçte bir sıçan deliği optik sinirinin bir örneğidir. Bölgeyi görselleştirmek için ok, enjeksiyonun kesin konumunu tanımlar. Bu diseksiyon, boyanın gelişmesinden sonra sinirden aşağı sınırlı difüzyonu ile belirtildiği gibi enjeksiyondan sonraki birkaç gün içinde yapıldı.

Bu teknik, rejeneratif nöroloji alanındaki araştırmacıların, optik siniri yeniden üretmenin ve demiyelinizan hastalığın bu sıçan modelinde potansiyel olarak kaybedilen görüşü geri kazanmanın yeni yollarını keşfetmelerinin yolunu açtı.