Periferik Kan İnsan alloantijen-özgü T hücrelerinin üretilmesi

Bu prosedürün genel amacı, tanımlanmış bir allo antijen özgüllüğü ile insan T hücrelerini tanımlamak, izole etmek ve klonlamaktır. Bu, ilk olarak yoğunluk gradyan santrifüjleme ile tüm periferik kandan T lenfositlerin izole edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci aşamada, allo antijen spesifik T hücreleri, Fluor dört konjuge peptit, HLA, tetramerler ile işaretlenir ve manyetik ayırma ile zenginleştirilir.

Daha sonra, etiketli T hücreleri, tek hücre akış sitometrisi hücre sıralaması ile izole edilir. Son olarak, tek hücre kültürleri anti CD üç ve anti CD 25 antikorları ile uyarılır. Sonuç olarak, antijene özgü T hücrelerinin allo reaktivitesi akım sitometrik analiz ile değerlendirilebilir.

Bu tekniğin toplu lenfosit stimülasyonu ve sınırlayıcı seyreltme gibi diğer tekniklere göre ana avantajı, bu tekniğin iyi tanımlanmış allo antijenlerine spesifik reaktiviteye sahip T hücresi klonlarının oluşturulmasını sağlamasıdır. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, T hücresi klonlarının kültürlenmesinde ve genişletilmesinde zorluk çekebilirler. Bu, işleme başlamadan önce kültürlerin dikkatli bir şekilde günlük olarak izlenmesini gerektirir.

Dört mililitre oda sıcaklığında yoğunluk gradyanını iki ila dört steril 15 mililitrelik konik santrifüj tüplerine alikot, sağlıklı bir gönüllüden kan içeren bir ila iki doldurulmuş yeşil üst kan alma tüpünün dışını silmek için% 70 etanol kullanır ve daha sonra üst kısımları dikkatlice çıkarın, kanı steril bir 50 mililitre santrifüj tüpüne boşaltın, ve daha sonra her bir toplama tüpünü 10 mililitre PBS ile yeniden canlandırın. Yıkamaları boşaltılmış tam kanla birleştirin ve bir çözeltiyi nazikçe karıştırın, ardından hücreleri, seyreltilmiş kanın toplam iki mililitre hacmi başına 25 mikrolitre insan T hücresi zenginleştirme kokteyli ile inkübe edin. 20 dakika sonra, 10 mililitrelik bir pipet kullanarak, gradyanın yüzeyini bozmamaya dikkat ederek, yoğunluk gradyan ortamının üzerine 10 mililitreye kadar kanı nazikçe katmanlayın.

Hücreleri 10 dakika boyunca santrifüjleyin ve daha sonra lökosit tabakasını yoğunluk gradyanının arayüzünden ve seyreltilmiş plazmayı steril 50 mililitrelik konik bir tüpe dikkatlice aktarmak için beş mililitrelik bir pipet kullanın. Toplanan periferik kan lenfositlerinin hacmini PBS ile 50 mililitreye getirin ve hücre süspansiyonunu yavaşça karıştırın. Sonra hücreleri sayın ve analiz için bir mililitrelik bir alikotu çıkarın.

Daha sonra, hücrelerin resüsünü döndürdükten sonra, peletleri bir mililitre akış sitometrisi tamponunda askıya alın ve 50 mikrolitre seyreltilmiş allo antijen peptidi MHC tetramerini hücre süspansiyonuna karıştırın. Hücreleri steril beş mililitrelik bir tüpe aktarın ve 30 dakika sonra hücreleri iki mililitre tür tampon resüs içinde yıkayın. Damağı 100 mikrolitre sıralama tamponunda askıya alın ve ardından hücreleri 10 mikrolitre biyotin seçim kokteylinde 15 dakika inkübe edin.

Daha sonra, hücreleri 10 dakika boyunca beş mikrolitre manyetik parçacık içinde inkübe edin ve ardından hücre süspansiyonunu 2.5 mililitre sıralama tamponu ile hafifçe karıştırın. Ön zenginleştirme hücrelerinin 100 mikrolitrelik bir analiz alikotunu çıkarın ve ardından tüpü hücre ayırma mıknatısına yerleştirin. Beş dakika sonra, tüpü ve mıknatısı bir arada tutun ve içindekileri beş mililitrelik yeni bir tüpe boşaltın.

Daha sonra tüpü mıknatıstan çıkarın ve hücreleri iki mililitre sıralama tamponunda yıkayın, peleti soğuk sıralama tamponunda yeniden süspanse edin ve hücreleri numune tipi başına iki mililitre soğuk sıralama tamponunda alikot edin. Numuneleri tekrar döndürdükten sonra, peletleri 25 mikrolitre soğuk sıralama tamponunda yeniden askıya alın ve hücreleri 20 dakika boyunca buz üzerinde beş mikrolitre insan FC bloğunda inkübe edin. Daha sonra, tüpleri 20 mikrolitre uygun antikor kokteyli ile inkübe edin.

20 dakika sonra, hücreleri iki mililitre daha soğuk sıralama tamponunda yıkayın ve peletleri mililitre başına bir ila 2 milyon hücrede yeniden süspanse edin. Daha fazla tamponda, daha sonra 100 mikrolitre insan T hücre kültürü ortamını 96 kuyucuklu yuvarlak alt hücre kültürü plakasının her bir oyuğuna alikot edin ve sıralama tamamlanana kadar plakayı buz üzerinde saklayın. Ayırma işleminden sonra, plakayı santrifüjleyin ve ardından hücreleri 37 santigrat derecede% 6 CO2 inkübatöre yerleştirin.

Daha sonra, uygun hacimdeki aktivatör boncuklarını girdaplayarak karıştırın ve uygun hacimdeki boncukları steril beş mililitrelik bir tüpe aktarın. Boncukları mıknatıs üzerinde yıkadıktan sonra, yıkama solüsyonunu boşaltın ve tüpe 0,5 mikrolitre mikro boncuk başına 100 mikrolitre insan T hücresi kültürü ekleyin. Daha sonra 100 mikrolitre aktivatör boncuk süspansiyonunu 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna alikot edin ve hücreleri inkübatöre geri koyun.

Küçük çoğalan hücre kümeleri, hücre izolasyonundan 14 gün sonra, beş ila yedi günlük kültürden sonra mikroskobik olarak gözlemlenebilir. Kültürlerin üst kısmındaki 100 mikrolitre besiyerini dikkatlice 100 mikrolitre taze insan T hücresi kültürü ile değiştirin. Orta büyüklükteki hücre kümeleri, beslenmeden iki ila üç gün sonra mikroskobik olarak görünür olmalıdır: makroskopik olarak, hücre peletleri ortam değişimini takip eden 14 gün boyunca görünür hale gelmelidir.

Hücre izolasyonunu takiben 28 gün sonra, büyüme pozitif kültürlerin 200 mikrolitrelik hacminin tamamını, 200 mikrolitre insan T hücresi kültürü ortamı içeren 48 oyuklu bir doku kültürü plakasının ayrı kuyucuklarına aktarın. Daha sonra 100 mikrolitre insan T hücresi kültür ortamına 12.5 mikrolitre uyarıcı anti CD üç, anti CD 28 mikroboncuk ekleyin ve plakayı yeniden uyarmadan üç ila beş gün sonra inkübatöre geri koyun. Ortam, saman sarısına dönmeye başlamalıdır.

Bu noktada, kültürleri 24 oyuklu bir doku kültürü plakasının ayrı oyuklarına aktarın ve her kültüre 500 mikrolitre insan T hücresi ortamı ekleyin. Son olarak, yeniden stimülasyonu takip eden 10 ila 14 gün sonra, peptitlerinin akış sitometrisi analizi ile allo antijen özgüllüklerini değerlendirmek için her bir T hücresi kültüründen 200 mikrolitre toplayın. MHC Tetramer bağlanması: Allo antijen spesifik T hücrelerinin beklenen verimi, vericiye, kullanılan allo antijenine ve vericideki karşılık gelen reaktif T hücrelerinin sıklığına bağlı olacaktır.

Örneğin, ortalama sağlıklı bir donör, mililitre kan başına 4.500.000 ila 10 milyon lökosit bulundurur ve bunların yaklaşık% 20'si T lenfositleridir. Bu nokta grafikleri, T hücrelerinin bir HLAD dört negatif donörden spesifik bir allo antijenine bağlanmasının ölçülmesinin sonuçlarını göstermektedir. Örneğin, bu deneyde, 4'te bir, 776 allo antijen spesifik T hücresinin frekansı, bu başlangıç hücresi popülasyonundan 20 milyon lökositlik bir başlangıç sayısından sayıldı.

88 ayrı temer etiketli T hücresi izole edilebildi, daha sonra iki tur mikroboncuk stimülasyonu ve kültüründen sonra, mikroskobik bir inceleme ile iki büyüme pozitif kültür tanımlandı ve bunların allo antijen özgüllüğü, A 2 30 48 HLA DR'ye bağlanmaları incelenerek değerlendirildi. Dört tetramer. Bu prosedürü denerken, hücre ölümünü ve kültürlerin aşırı büyümesini önlemek için hücre kültürlerini günlük olarak izlemeyi unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, T hücresi klonları, allojenik ligand tanımanın biyokimyasının incelenmesi ve bunun etkili bağışıklık tepkilerine nasıl dönüştüğü gibi ek soruları yanıtlamak için kullanılabilir.