Name: Çoklu ve tek hücre bazlı küreler tahliller kullanılarak, insan yumurtalık karsinoma hücrelerinde Kök Hücre Özelliklerinin Değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Keşfedin, insan yumurtalık karsinoma hücrelerinde kök hücre özelliklerini tek ve çok hücreli küre tahlilleriyle değerlendirme yöntemini. Bu teknik, kanser kök hücrelerinin doğru tanımlanması için güvenilir sonuçlar sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Baden-Württemberg Stiftung (Yetişkin Kök Hücreler Programı II) tarafından C.L.'ye verilen bir hibe ile desteklenmiştir. Makalenin eleştirel girdisi ve incelemesi için Dr. Martina Konantz'a teşekkür ederiz. DBM FACS Tesisinden (Basel Üniversite Hastanesi) Emmanuel Traunecker ve Toni Krebs'e FACS sıralamasındaki yardımları için teşekkür ederiz.

OVCAR-3 insan yumurtalık karsinoma hücrelerinde 1. Üretim Stabil Lentivirüsler Sox2 düzenleyici bölge, haberci yapı İçeren kalıt <ol><li> Tarif 10,21 bir Sox2 düzenleyici bölgesini tanıyan bir raportör yapısı ile HEK 293T paketleme hücre hattı transfekte edilmesiyle lentiviral parçacıkları oluşturur. Not: raportör yapısının ayrıca ileride tdTomato floresan protein ProteoTuner kalkan sisteminin dengesizleşmesine alanı içerir. Shield1 böylece floresan proteini 22 aşağılamak için proteasom engelleyen istikrarsızlaştırma etki bağlanır. </li><li> 24 saatlik bir süre boyunca, lentiviral parçacıklarla OVCAR-3 hücreleri nakletmek. Daha sonra, viral süpernatant kaldırmak ve tam ortamda fosfat tamponlu tuz (PBS) ve kültürlenmiş hücreleri yıkayın (RPMI, 100 U / ml penisilin / ml streptomisin, 100 ug,% 10 FBS ile takviye edilmiş). </li><li> 48 saat sonra, 10 ug / ml puromycin kültürlere ilave edildi ve uygun bir şekilde kalıt aktarımlı hücrelerin seçimine izin vermek için 5 gün için muhafaza edilmiştir. </li></ol> Hücre Sorting ve Kaplama 2. Hazırlık <ol><li> 1 at Shield1 ekleyin: hücre sıralama öncesinde 1,000 seyreltme 24 saat. Negatif kontrol olarak Shield1 tedavisi (Şekil 1) bir stably transduse OVCAR-3 hücreleri kullanır. Şişeden aspire ortam, 3 dakika boyunca% 0.05 tripsin-EDTA ile hücreler 1 x hücrelerin PBS ile yıkayın ve trypsinize. </li><li> 5 dakika - (25 ° C 15) oda sıcaklığında 300 xg&#39;de hücre sayıları, santrifüj hücreleri saymak, (yukarıya bakınız) tam orta kullanarak tripsin durdurun. </li><li> Durusu süpernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri dikkatli bir 0,5-1 ml steril PBS. </li><li> Tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için 40 mikron hücre süzgeç kapağı filtresi kullanın. </li><li> Ml başına 5000000 hücrelere hücre sayımı ayarlayın. </li><li> , MEGM büyüme faktörleri, sitokinler ve ek takviye (100 ul ortam ultra düşük bağlanma, 96 gözlü levhalar küreler hazırlanmasıB-27, heparin-sodyum; ya da büyüme faktörleri, sitokinler ve ek B-27, ya da% 1 metilselüloz eklenmeden heparin-sodyum ile desteklenmiş DMEM / F12), aynı zamanda Tablo 1 e bakınız. İsteğe bağlı olarak mümkün kontaminasyon riskini en aza indirmek için, 100 U / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin bir konsantrasyonda ortam antibiyotik ekleyin. </li><li> Sıralama TTT + ve yukarıda hazırlanan 96 oyuklu plakalara RFP- hücreleri, oyuk başına 1 hücre (tek hücre bazlı küreler deneyi), sırasıyla oyuk başına 100 hücre (çoklu hücre bazlı küreler deneyi). 100 μ meme, kılıf basıncı 20 psi ve verim maskesi 0, saflık maskesi 32, faz maskesi 16: Tek hücreli modu, kurulum sırala kullanarak (Malzeme) sıralama ticari olarak temin hücre sıralayıcı gerçekleştirin. </li><li> Mikroskopik olarak (tek bir hücre bazlı deney için) hücreler içeren kuyu puanlama ile ve çoklu hücre bazlı tahlilde (bireysel çukurlarındaki hücre saymak suretiyle kaplama verimlilik değerlendirmek; Şekil 2, </strong&gt;). </li><li> Orta alanda standart koşullar altında kuluçkaya bırakılır, 37 ° C&#39;de ve% 5 CO2 (bileşim için adım 2.6). Günlük bFGF (20 ng / ml) ve EGF (20 ng / ml), Supplement. </li><li> Bir hafta sonra, entegre muhabiri sisteminden floresan sinyal tespit etmek 4X veya 10X büyütme ve floresan mikroskop ile standart mikroskop kullanılarak tümör küreler ortaya çıkan numaralarını saymak. &quot;Küçük&quot; küreler olarak 100 mikron (Şekil 3) - çapı 50 ile &quot;büyük&quot; küreler olarak 100 mikron aşan bir çapa sahip küreler ve küreler Kont. Gerçek küreler saymak ve kümeler hücre değil emin olun. NOT: Tek hücre bazlı deneylerde küre oluşumu kültür 10 (7 karşı) gün sonra mikroskopik olarak puan daha kolaydır. </li><li> TTT + küre-oluşturucu hücre ve tek bir hücre bazlı deneylerde, sırasıyla RFP- hücreleri (her bir deney için, bir 96-yuvalı plaka) ve çok hücre-ba oranını hesaplamakShaw ve arkadaşları tarafından sunulan sed küreler deneyler (her bir deney için, bir oyuk). 16 Not: küre oluşturan hücrelerin (%) = (küre sayısı) / (tohumlanmıştır hücre sayısı) oranı 100 x </li></ol> Kürelerin 3. Seri Pasajlanması <ol><li> Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de uygun bir steril tüp ve santrifüj her bir oyuğa içeriğini yerleştirin. Çok hücre tabanlı küreler tahliller için, birlikte iyi biri küreler toplamak. PBS ve uzun santrifüj 2 dakika ile 5 kez - KUYU 3 yıkayın. Tek hücre tabanlı küreler tahliller için, bireysel küreler toplamak. Nedeniyle hücrelerin düşük sayıda, santrifüjleme ve yıkama adımları için 1.5 ml tüpler kullanmaktadır. </li><li> % 0.05 tripsin-EDTA, 200 ul süpernatan ve tekrar süspansiyon pelet çıkarın. </li><li> Optimal hücre ayrılmasını sağlamak amacıyla, yumuşak bir çalkalayıcı içinde 5 dakika için 37 ° C &#39;de bir hücre süspansiyonu inkübe edilir. Alt hücre ölümü oranı cep hattı için trypsinization zaman Optimize: hiçbir büyük olursaküreler yavaşça 100 ul pipet kullanarak görünür çiğnemek olduğunu. Durumunda büyük küreler, hala mevcut başka bir 3 dakika tripsin ile kuluçkaya ve daha sonra toz haline getirme adıma geçin. Tek durumunda hücre tabanlı deneyler trypsinization adımı sırasında canlı hücrelerin optimum hücre verimi için zaman optimize etmek emin olun. </li><li> Tripsin inaktive tek hücre tahlilleri, ilave bir 2 dakika boyunca santrifüj halinde, 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de 500 ul komple ortam ve santrifüj ekleyin. </li><li> Küreler orta dikkatle süpernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri çıkarın. </li><li> Bir tek hücre süspansiyonu elde etmek için 40 mikron hücre süzgeç kapağı filtresi kullanın. </li><li> TTT + ve çoklu hücre-bassed deneylerde RFP- hücrelerin kullanılması durumunda, analiz akış sitometresi aracılığı ile her bir göze daha sonra süspansiyon içinde flüoresan hücrelerin yüzdesini değerlendirmek. </li><li> Yukarıda ayrıntılı olarak açıklandığı gibi hazırlanan tek hücre seri şarjı tahlilleri, tohum oyuk başına 1 hücre, bir ultra düşük bağlanma, 96 oyuklu bir plakaya için. Tek bir kişi alandan yaklaşık 20 ayrı kuyu tohum. Çoklu hücre bazlı primer kürelerin şarjı tahlilleri için, tohum hücreleri yeni bir 96 oyuklu bir plakaya birinci küre bir kuyudan elde edilen ve mikroskopi ile hücre sayıları ertesi gün sayısı. </li><li> Adım 2.11 tarif edilen formüle göre ikincil küreler tahlillerinde küre oluşturan hücrelerin oranını değerlendirmek. </li></ol> 4. Sonuç Analizi <ol><li> Bağımsız üçlü olarak yapılan deneylerden elde edilen sonuçları analiz ve iki taraflı Student t-testi istatistiksel analiz için normal dağılıma değerleri ve aksi Mann-Whitney-Testleri analiz için kullanabilirsiniz. </li></ol>

<ol><li>Pardal, R., Clarke, M. F., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applying+the+principles+of+stem-cell+biology+to+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Applying the principles of stem-cell biology to cancer.</a> Nat Rev Cancer. 3 (12), 895-902 (2003).</li>
<li>Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells%2C+cancer%2C+and+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stem cells, cancer, and cancer stem cells.</a> Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).</li>
<li>Ahmed, N., Abubaker, K., Findlay, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+cancer+stem+cells%3A+Molecular+concepts+and+relevance+as+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Aspects+Med%22%5BJournal%5D)">Ovarian cancer stem cells: Molecular concepts and relevance as therapeutic targets.</a> Mol Aspects Med. 39, 110-125 (2014).</li>
<li>Silva, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aldehyde+dehydrogenase+in+combination+with+CD133+defines+angiogenic+ovarian+cancer+stem+cells+that+portend+poor+patient+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Aldehyde dehydrogenase in combination with CD133 defines angiogenic ovarian cancer stem cells that portend poor patient survival.</a> Cancer Res. 71 (11), 3991-4001 (2011).</li>
<li>Kryczek, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+aldehyde+dehydrogenase+and+CD133+defines+ovarian+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Expression of aldehyde dehydrogenase and CD133 defines ovarian cancer stem cells.</a> Int J Cancer. 130 (1), 29-39 (2012).</li>
<li>Stewart, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+heterogeneity+and+instability+of+human+ovarian+tumor-initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Phenotypic heterogeneity and instability of human ovarian tumor-initiating cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (16), 6468-6473 (2011).</li>
<li>Ginestier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALDH1+is+a+marker+of+normal+and+malignant+human+mammary+stem+cells+and+a+predictor+of+poor+clinical+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome.</a> Cell Stem Cell. 1 (5), 555-567 (2007).</li>
<li>Chang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALDH1+expression+correlates+with+favorable+prognosis+in+ovarian+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Mod+Pathol%22%5BJournal%5D)">ALDH1 expression correlates with favorable prognosis in ovarian cancers.</a> Mod Pathol. 22 (6), 817-823 (2009).</li>
<li>Cannistra, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD44+variant+expression+is+a+common+feature+of+epithelial+ovarian+cancer%3A+lack+of+association+with+standard+prognostic+factors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">CD44 variant expression is a common feature of epithelial ovarian cancer: lack of association with standard prognostic factors.</a> J Clin Oncol. 13 (8), 1912-1921 (1995).</li>
<li>Bareiss, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX2+expression+associates+with+stem+cell+state+in+human+ovarian+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">SOX2 expression associates with stem cell state in human ovarian carcinoma.</a> Cancer Res. 73 (17), 5544-5555 (2013).</li>
<li>Pham, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX2+expression+and+prognostic+significance+in+ovarian+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Gynecol+Pathol%22%5BJournal%5D)">SOX2 expression and prognostic significance in ovarian carcinoma.</a> Int J Gynecol Pathol. 32 (4), 358-367 (2013).</li>
<li>Lengerke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+embryonic+stem+cell+marker+SOX2+in+early-stage+breast+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Expression of the embryonic stem cell marker SOX2 in early-stage breast carcinoma.</a> BMC Cancer. 11, 42(2011).</li>
<li>Lapidot, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+initiating+human+acute+myeloid+leukaemia+after+transplantation+into+SCID+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice.</a> Nature. 367 (6464), 645-648 (1994).</li>
<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).</li>
<li>Dontu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+propagation+and+transcriptional+profiling+of+human+mammary+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells.</a> Genes Dev. 17 (10), 1253-1270 (2003).</li>
<li>Shaw, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+detailed+mammosphere+assay+protocol+for+the+quantification+of+breast+stem+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mammary+Gland+Biol+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">A detailed mammosphere assay protocol for the quantification of breast stem cell activity.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 17 (2), 111-117 (2012).</li>
<li>Leis, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox2+expression+in+breast+tumours+and+activation+in+breast+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Sox2 expression in breast tumours and activation in breast cancer stem cells.</a> Oncogene. 31 (11), 1354-1365 (2012).</li>
<li>Higgins, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+tumor+stem+cell+multipotency+correlates+with+nanog+expression+and+extent+of+passaging+in+human+glioblastoma+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Brain tumor stem cell multipotency correlates with nanog expression and extent of passaging in human glioblastoma xenografts.</a> Oncotarget. 4 (5), 792-801 (2013).</li>
<li>Wang, Y. J., Bailey, J. M., Rovira, M., Leach, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphere-forming+assays+for+assessment+of+benign+and+malignant+pancreatic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Sphere-forming assays for assessment of benign and malignant pancreatic stem cells.</a> Methods Mol Biol. 980, 281-290 (2013).</li>
<li>Li, Y. F., Xiao, B., Tu, S. F., Wang, Y. Y., Zhang, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+and+identification+of+colon+cancer+stem+cell-derived+spheres+from+the+Colo205+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Braz+J+Med+Biol+Res%22%5BJournal%5D)">Cultivation and identification of colon cancer stem cell-derived spheres from the Colo205 cell line.</a> Braz J Med Biol Res. 45 (3), 197-204 (2012).</li>
<li>Wu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+two+novel+phenotypically+distinct+breast+cancer+cell+subsets+based+on+Sox2+transcription+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Signal%22%5BJournal%5D)">Identification of two novel phenotypically distinct breast cancer cell subsets based on Sox2 transcription activity.</a> Cell Signal. 24 (11), 1989-1998 (2012).</li>
<li>Banaszynski, L. A., Chen, L. C., Maynard-Smith, L. A., Ooi, A. G., Wandless, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid%2C+reversible%2C+and+tunable+method+to+regulate+protein+function+in+living+cells+using+synthetic+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A rapid, reversible, and tunable method to regulate protein function in living cells using synthetic small molecules.</a> Cell. 126 (5), 995-1004 (2006).</li>
<li>Kawase, Y., Yanagi, Y., Takato, T., Fujimoto, M., Okochi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+multipotent+adult+stem+cells+from+the+skin%3A+transforming+growth+factor-beta+%28TGF-beta%29+facilitates+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of multipotent adult stem cells from the skin: transforming growth factor-beta (TGF-beta) facilitates cell growth.</a> Exp Cell Res. 295 (1), 194-203 (2004).</li>
<li>Walia, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+breast+epithelial+marker+hCLCA2+promotes+epithelial-to-mesenchymal+transition+and+indicates+higher+risk+of+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Loss of breast epithelial marker hCLCA2 promotes epithelial-to-mesenchymal transition and indicates higher risk of metastasis.</a> Oncogene. 31 (17), 2237-2246 (2012).</li>
<li>Leung, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-small+cell+lung+cancer+cells+expressing+CD44+are+enriched+for+stem+cell-like+properties%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Non-small cell lung cancer cells expressing CD44 are enriched for stem cell-like properties.</a> PLoS One. 5 (11), e14062(2010).</li>
<li>Bertolini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+tumorigenic+lung+cancer+CD133%2B+cells+display+stem-like+features+and+are+spared+by+cisplatin+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Highly tumorigenic lung cancer CD133+ cells display stem-like features and are spared by cisplatin treatment.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16281-16286 (2009).</li>
<li>Ma, L., Lai, D., Liu, T., Cheng, W., Guo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem-like+cells+can+be+isolated+with+drug+selection+in+human+ovarian+cancer+cell+line+SKOV3%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochim+Biophys+Sin+%28Shanghai%29%22%5BJournal%5D)">Cancer stem-like cells can be isolated with drug selection in human ovarian cancer cell line SKOV3.</a> Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 42 (9), 593-602 (2010).</li>
<li>Wang, H., Zhang, Y., Du, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+and+breast+cancer+spheres+are+similar+in+transcriptomic+features+and+sensitive+to+fenretinide%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Ovarian and breast cancer spheres are similar in transcriptomic features and sensitive to fenretinide).</a> Biomed Res Int. 2013, 510905(2013).</li>
<li>Du, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+and+mechanisms+of+anti-CD44+monoclonal+antibody+A3D8+on+proliferation+and+apoptosis+of+sphere-forming+cells+with+stemness+from+human+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Gynecol+Cancer%22%5BJournal%5D)">Effects and mechanisms of anti-CD44 monoclonal antibody A3D8 on proliferation and apoptosis of sphere-forming cells with stemness from human ovarian cancer.</a> Int J Gynecol Cancer. 23 (8), 1367-1375 (2013).</li>
<li>Xiang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-17+produced+by+tumor+microenvironment+promotes+self-renewal+of+CD133+cancer+stem-like+cells+in+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Interleukin-17 produced by tumor microenvironment promotes self-renewal of CD133 cancer stem-like cells in ovarian cancer.</a> Oncogene. , (2013).</li>
<li>Liu, T., Cheng, W., Lai, D., Huang, Y., Guo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+primary+ovarian+cancer+cells+in+different+culture+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Oncol+Rep%22%5BJournal%5D)">Characterization of primary ovarian cancer cells in different culture systems.</a> Oncol Rep. 23 (5), 1277-1284 (2010).</li>
<li>Soritau, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+chemoresistance+and+tumor+sphere+formation+as+a+laboratory+model+for+peritoneal+micrometastasis+in+epithelial+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Rom+J+Morphol+Embryol%22%5BJournal%5D)">Enhanced chemoresistance and tumor sphere formation as a laboratory model for peritoneal micrometastasis in epithelial ovarian cancer.</a> Rom J Morphol Embryol. 51 (2), 259-264 (2010).</li>
<li>Shi, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+cancer+stem+cell-like+cells+from+human+epithelial+ovarian+carcinoma+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Identification of cancer stem cell-like cells from human epithelial ovarian carcinoma cell line.</a> Cell Mol Life Sci. 67 (22), 3915-3925 (2010).</li>
<li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+ovarian+cancer-initiating+cells+from+primary+human+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of ovarian cancer-initiating cells from primary human tumors.</a> Cancer Res. 68 (11), 4311-4320 (2008).</li>
<li>Liang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hypoxic+microenvironment+upgrades+stem-like+properties+of+ovarian+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">The hypoxic microenvironment upgrades stem-like properties of ovarian cancer cells.</a> BMC Cancer. 12, 201(2012).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Küreler kültürleri kanser kök hücre potansiyeli tahlil, insan tümör hücrelerinin 15,25,26 geniş bir kök-benzeri hücreler için zenginleştirmek için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Bu kültür koşulları altında, kendini yenileme yeteneğinden yoksun kanser hücreleri ayırt etmek ve en sonunda hücre ölümü beklenmektedir. Başlangıçta hücre kümeleri veya özellikle ilköğretim tayinlerde bile tümör küre oluşturabilir rağmen, onlar yüzünden kendini yenileyen özellikleri eksikliği seri şarjı üzerine küre oluşturan...

Over karsinomlarının heterojen hücre karışımlarından oluştuğuna ve konvansiyonel sitotoksik tedavilerden sonra hastalığın başlaması, sürdürülmesi ve nüksetmesinden sorumlu "kanser kök hücreleri" (CSC'ler) olarak adlandırılan hücreleri barındırdığına dair artan kanıtlar vardır1-3. Bu nedenle, over CSC'lerini hedef alan moleküler stratejilerin geliştirilmesi önemli bir hedeftir ve over kanseri hastalarının tedavisini iyileştirmeyi vaat etmektedir.
CSC'lerin moleküler özelliklerinin anlaşılması için bir ön koşul, CSC olmayanlardan güvenilir bir şekilde izole edilmeleridir. Bununla birlikte, yumurtalık CSC'lerinin tanımlanması zor görünmektedir. CD133 ekspresyonu ve aldehit dehidrojenaz (ALDH) aktivitesi4,5'in yumurtalık CSC'lerini işaretlemek için bildirilmiş olsa da, bazı veriler bu belirteçlerin kararsız olduğunu göstermektedir6. Tutarlı bir şekilde, yumurtalık kanserinde, örneğin meme karsinomu7 dışında, ALDH1 ekspresyonu olumlu sonuç8 ile ilişkilidir ve önerilen kök hücre belirteci CD44 varyantının ekspresyonu prognostik değere sahip değildir9. Daha yakın zamanlarda, embriyonik kök hücre proteini SOX2'nin ekspresyonunun yumurtalık karsinomuhücrelerine 10 saplılık kazandırdığını ve yüksek SOX2 ekspresyonunun klinik olarak agresif over ve meme karsinomları11,12 ile ilişkili olduğunu gösterdik. Bu nedenle, bu raporda, varsayılan yumurtalık CSC'lerini izole etmek için bir yöntem olarak, ekspresyonu bir SOX2 düzenleyici bölge tarafından kontrol edilen bir kırmızı floresan proteini (RFP) içeren bir lentiviral raportör yapısı kullanıyoruz.
Tanım olarak, CSC'ler hem kendini yenileyebilir hem de farklılaşabilir, bu da tüm tümör hücresi tiplerine yol açar. Varsayılan CSC popülasyonlarının in vivo olarak gerçekleştirilen fonksiyonel testlerde analiz edilmesi gerekir. Açık nedenlerden dolayı, insan hücrelerinde bu tür fonksiyonel testler, çoğunlukla insan tümör hücrelerinin immüno-baskılanmış farelere naklini içeren ksenogreft testleriyle sınırlıdır10,13.
Alternatif bir in vitro yöntem, ilk olarak nöral hücrelerdeki kök potansiyeli değerlendiren bir vekil test olarak sözde nörosfer testini bildiren Brent Reynolds ve Sam Weiss tarafından önerildi14. Dontu ve meslektaşları daha sonra bu testin meme hücrelerinde kök hücre potansiyelinin değerlendirilmesi için kullanıldığını doğruladılar15,16. Burada, insan meme hücreleri, epidermal büyüme faktörü (EGF), bazik fibroblast büyüme faktörü (bFGF), B-27 ve heparin ile desteklenmiş serumsuz besiyerinde farklı sayılarda kaplandı ve küre oluşumu mikroskopi ile skorlanmadan önce yedi ila on gün boyunca yapışık olmayan koşullar altında kültürlendi. Hücre sayıları, büyüme ortamı ve takviyelerde bazı ayarlamalar yapılan bu protokolü takiben, birkaç grup meme17, beyin18, pankreas19 ve kolon20 tümörleri gibi çeşitli kanser türlerinden in vitro kök hücre potansiyelini araştırmıştır. Over karsinomunda, yakın zamanda küre testinin fizibilitesini bildirdik ve sonuçlarını in vivo murin ksenogreft modellerinde toplananlarla karşılaştırdık10. Kök hücre proteini SOX2'nin aşırı ekspresyonunun hem in vitro küre oluşumunu hem de insan yumurtalık karsinomu hücrelerinin in vivo tümörojenitesini arttırdığını bulduk10. Bununla birlikte, küre başlatan hücrelerin frekansı, in vivo10 ölçülen tümör başlatan hücrelerin frekansından daha yüksekti, bu da küre testinin teknik nedenlerden dolayı yanlış pozitif sonuçlara yol açabileceğini veya alternatif olarak in vivo testin verimsiz olabileceğini ve yanlış negatif sonuçlarla sonuçlanabileceğini düşündürmektedir.
Bu raporda, çok hücreli yumurtalık küreleri testlerini daha detaylı analiz ediyor, literatürde bulunan farklı protokolleri gözden geçiriyor ve bunları tek hücre bazlı bir testle karşılaştırıyoruz. Tek hücre bazlı tahlilin, hücreleri hareketsiz hale getirmek için kültürlere metilselüloz eklenmedikçe, kaplanmış hücrelerin yoğunluğundan büyük ölçüde etkilenebilen çok hücreli bazlı tahlillerden daha doğru ve tekrarlanabilir sonuçlar sağladığını gösteriyoruz. Bununla birlikte, tek hücre bazlı tahlillerde de, in vivo tümör başlatma potansiyelinden daha yüksek frekansta in vitro küre başlatma potansiyeli gözlenir.

<table><tbody><tr><td>Düşük bağlantı plakası</td><td>Corning</td><td>3474</td><td></td></tr><tr><td>MEGM</td><td>Lonza</td><td>CC-3151</td><td></td></tr><tr><td>İnsülin</td><td>Lonza</td><td>CC-4136</td><td>SingleQuots&trade; Kit</td></tr><tr><td>Hidrokortizon</td><td>Lonza</td><td>CC-4136</td><td>SingleQuots&ticaret; Kit</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Lonza</td><td>CC-4136</td><td>SingleQuots&ticaret; Kit</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma</td><td>E9644</td><td>uç konsantrasyonu: 20 ng/ml</td></tr><tr><td>FGF</td><td>PeproTech</td><td>100-18B</td><td>uç konsantrasyonu: 20 ng/ml</td></tr><tr><td>B-27</td><td>Invitrogen/ Gibco</td><td>17504-044</td><td>uç konsantrasyonu: 1X</td></tr><tr><td>Heparin-Natrium-25000 IE</td><td>Ratiopharm</td><td>N68542.02</td><td>seyreltme 1:1.000</td></tr><tr><td>Kalem/Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Gibco</td><td>10500-064</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>21875-034</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s PBS (1X)</td> <td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Shield1</td><td>Clontech</td><td>632189</td><td>seyreltme 1: 1.000</td></tr><tr><td>DMEM / F12</td><td>Gibco</td><td>21041-025</td><td></td></tr><tr><td>DMEM / F12 (toz)</td> <td>Gibco</td><td>42400-010</td><td></td></tr><tr><td>Metil selüloz</td><td>Sigma</td><td>M0387</td><td></td></tr><tr><td>Puromisin dihidroklorür</td><td>Uygulaması</td><td>A2856</td><td></td></tr><tr><td>Hücresi sıralayıcı</td><td>BD</td><td></td><td>Aria III hücre sıralayıcı</td></tr><tr><td>FACS analizörü</td><td>BD</td><td></td><td>Accuri c6 akış sitometresi</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus</td><td></td><td>IX50 Osiris</td></tr></tbody></table>

Çoklu ve tek hücre bazlı küreler tahliller kullanılarak, insan yumurtalık karsinoma hücrelerinde kök hücre Özelliklerinin değerlendirilmesi

Evaluation of Stem Cell Properties in Human Ovarian Carcinoma Cells Using Multi and Single Cell-based Spheres Assays

Yıllar süren araştırmalar, yumurtalık kanserlerinin, geleneksel kemoterapileri takiben tümör başlangıcı, bakımı ve nüksünden sorumlu olan "kanser kök hücreleri" (CSC'ler) olarak adlandırılan bir alt popülasyonu içeren heterojen bir hücre karışımını barındırdığını göstermektedir. Bu nedenle yumurtalık CSC'lerinin tanımlanması önemli bir hedeftir. CSC potansiyelini in vitro olarak değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan bir yöntem, hücrelerin büyüme faktörleri ile desteklenmiş serum içermeyen ortamda yapışık olmayan kültür koşulları altında kaplandığı ve küre oluşumunun birkaç gün sonra puanlandığı küre testidir. Burada, insan yumurtalık kanseri küreleri tahlilleri için şu anda mevcut protokolleri gözden geçiriyoruz ve yaygın olarak kullanılan çok hücreli bazlı tahliller ile tek hücreli kaplamaya dayalı daha doğru bir sistem arasında yan yana bir analiz gerçekleştiriyoruz. Sonuçlarımız, hem çok hücreli hem de tek hücreli küre tahlillerinin in vitro küre oluşumunu araştırmak için kullanılabileceğini göstermektedir. Daha zahmetli ve pahalı tek hücre bazlı tahliller, tek tek hücrelerin fonksiyonel değerlendirmesi için daha uygundur ve genel olarak daha doğru sonuçlara yol açarken, çok hücreli bazlı tahliller, kaplanmış hücrelerin yoğunluğundan güçlü bir şekilde etkilenebilir ve önceden titrasyon deneyleri gerektirebilir. Çok hücreli bazlı tahlillere metilselüloz takviyesi, mekanik artefaktları azaltmak için etkili bir şekilde kullanılabilir.

Geleneksel küreler deneylerinde, RFP + OVCAR-3 hücrelerinin genel RFP- hücrelerin% 20, yaklaşık% 40, birincil küreler deneyi (Şekil 4A) &#39;de tek bir tümör alanına yol açmıştır. Ayrıca, RFP + hücreleri tarafından oluşturulan küreleri RFP- hücrelerden oluşan daha büyük boyutta olmuştur. Tek bir hücre bazlı deneylerde kaplama olduğunda, TTT + hücreleri aynı zamanda, yukarıda sonuçları teyit RFP- hücrelerden daha fazla küreler oluşturulur. Bununla birlikte, çok hücre bazlı ta...

İn vitro küre testleri, kanser kök hücrelerini tanımlamak için yaygın olarak kullanılır. Burada tek ve çok hücreli küre tahlillerini karşılaştırıyoruz. Daha zahmetli tek hücre bazlı tahliller veya metilselüloz takviyesi daha doğru sonuçlar verirken, sıvı ortamda gerçekleştirilen çok hücreli bazlı tahliller hücre yoğunluğundan büyük ölçüde etkilenebilir.

Çoklu ve tek hücre bazlı küreler tahliller kullanılarak, insan yumurtalık karsinoma hücrelerinde Kök Hücre Özelliklerinin Değerlendirilmesi

Years of research indicates that ovarian cancers harbor a heterogeneous mixture of cells including a subpopulation of so-called &#8220;cancer stem ...

Bu prosedürün genel amacı, insan yumurtalık karsinomu hücrelerinin kök hücre özelliklerini çoklu ve tek hücre bazlı küre deneyleri kullanarak değerlendirmektir. Bu, ilk olarak SOX iki raportör RFP lentivirüsü Pur Misin tedavisi ile dönüştürülmüş hücrelerin seçilmesiyle gerçekleştirilir, RFP pozitif ve RFP negatif hücreler izole edilir ve kuyu başına tek veya çok hücreli koloniler olarak gerçeklere göre kaplanır. Daha sonra, birincil küre oluşumu mikroskobik olarak analiz edilir ve daha sonra birincil küre kültürleri, ikincil küre oluşumunun analizi için ayrıştırılır ve yeniden kaplanır.Sonuç olarak, bu küre tahlilleri, küre oluşturma kapasitesi gösteren varsayılan yumurtalık kanseri kök hücrelerinin oranını hesaplamak için kullanılır. Bu yöntem, kanser kök hücre alanındaki bazı potansiyel kanser kök hücre popülasyonlarının neler olduğu ve tüm tümör torbasındaki sıklığın ne olduğu gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntem, yumurtalık kanseri kök hücre tanımlaması hakkında bilgi sağlayabilse de, kanser kök hücrelerini meme karsinomu gibi diğer katı tümör oluşumlarından izole etmek için de uygulanabilir.İnsan yumurtalık karsinomu hücrelerinin lentiviral partikül

evaluation-stem-cell-properties-human-ovarian-carcinoma-cells-using

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Bu video protokolü neurosphere tahlil kültürü yöntemi kullanılarak insan glioblastoma mutliforme cerrahi rezeksiyon (GBM) tümör dokusu hücreleri gibi izolasyon ve kök genişlemesi göstermektedir.

Neurosphere Testi İnsan Glioblastoma Multiforme Tümör Hücreleri İzolasyon ve Genişleme

Üç boyutlu heterotipik<em&gt; In Vitro</emYumurtalık Kanseri Başlatma ve İlerleme sırasında Stromal-Epitel Etkileşimleri&gt; Modelleme

Periton mezotel zarının içine yumurtalık kanseri hücre işgali zamanla dinamik bir süreçtir. Gerçek zamanlı analiz kullanarak, bir küremsi-mezotel hücresi eş-kültür modelinde, yumurtalık kanseri hücrelerinin invaziv kapasitesi metastatik işlemini düzenleyen faktörleri bakış açıları sağlayan, uzun süreler boyunca ölçülebilir.

Real Time Mezotelyal Hücrelerinin Yumurtalık Kanseri Sferoid Ek ve Invasion Değerlendirilmesi

Kanser kök hücreleri (rulmanları) nedeniyle kemoterapi direncinin tümör nüks sorumlu tutulmaktadır. Biz seçimi ve yumurtalık kanseri hücre hatları CSCS genişlemesi için bir protokol optimize ettik. Kemoterapötik Sisplatin ile hücrelerin tedavisi ve biz yapışmayan CSC kültürler için zenginleştirmek medyayı teşvik kök hücre kültürleme tarafından.

İnsan Hücre Lines Kemorezistans Yumurtalık Kanser Kök Hücreleri Zenginleştirme

Yüzen mamosfer tahlilleri, süspansiyon koşullarında hayatta kalan ve farelere implante edildiğinde gelişmiş tümör oluşumu gösteren kök benzeri meme kanseri hücrelerinin alt kümesini araştırabilir.  Bu protokol, kök ile ilişkili transkripsiyonel manzaranın analizini kolaylaştırırken, in vivo tümörijenez için bir vekil olan küre oluşturma yeteneğinin uygun bir in vitro ölçümünü sağlar.

İnsan Göğüs Kanseri dokuları ve hücre hatlarından gelen Mammosphere Oluşumu Testi

Pankreas kanseri kök hücreleri (CSC'ler), CSC biyolojisini incelemek için güçlü bir araç olan ve yeni CSC hedefleme tedavileri geliştirmek için ilk adım olarak hizmet edebilen ankrajdan bağımsız küre kültürü tekniği kullanılarak in vitro olarak genişletilebilir. Burada pankreatik CSC'lerin genişletilmesi, analizi ve hedeflenmesi için metodoloji sağlanmaktadır.

Pankreas Kanseri Yeni Tedavi Stratejileri Geliştirme Hücre Özellikleri Kök incelenmesi

Kemik sarkomlarda kanser kök hücrelerinin varlığı (rulmanları) son zamanlarda onların patogenezi ile bağlantılı olmuştur. Bu makalede, yapışmayan koşullarda büyümeye CSCS yeteneğini kullanılarak geleneksel osteosarkoma (OS) insan biyopsilerinden elde edilen birincil hücre kültürlerinden CSCS izole sunulmuştur.

Kanser kurulması İnsan Konvansiyonel Osteosarkom Hücre Kültürleri Kök

Bu protokol, ilacın belirlenmesi için, hastanın türetildiği kürlerin oluşumunu, proliferasyonun ölçülmesi, sitotoksisite testi, akış sitometri, immünofluoresesans boyama ve konfoksel görüntüleme gibi aşağı akış analizini açıklar. anti-neoplastik terapötik olarak adayların potansiyeli. Bu protokol her hasta ve hastalığın aşaması için spesifik ilaçların tanımlanması ile hassas ilacı destekler.

Fizyolojik hasta, kanser kök hücrelerini hedef alan anti-neoplastik Ilaç taraması için 3B kürler türetilmiştir

Bu metodolojinin amacı, kanser hücre hatlarındaki kanser kök hücrelerini (CSC) ve primer insan tümör örneklerini küre oluşturma protokolü ile sağlam bir şekilde, fonksiyonel tahliller ve akış sitometrisi ve Batı ile henotypik karakterizasyon kullanarak tanımlamaktır. Leke.

Jinekolojik ve Meme Kanseri Tümörlerinden Kanser Kök Hücre Kürelerinin Alınması

Yumurtalık kanseri kök hücreleri (OKSK) kanserin başlamasından, nüksetmesinden, terapötik direncinden ve metastazından sorumludur. OCSC vasküler nişinin, OKSC'lerin kendi kendini yenilemesini teşvik ettiği ve kemorezistansa yol açtığı düşünülmektedir. Bu protokol, in vitro olarak tekrarlanabilir bir OCSC vasküler niş model oluşturmak için temel sağlar.

Üç Boyutlu Eş-Kültür Sistemi Kullanılarak Yumurtalık Kanseri Kök Benzeri Hücrelerin Anjiyogenetik Özelliklerinin Değerlendirilmesi, NICO-1

Bu protokol, Caco2 kolon adenokarsinom hücrelerinden üç boyutlu küreseller üretmek ve yetiştirmek için yeni, sağlam ve tekrarlanabilir bir kültür sistemi sunar. Sonuçlar, kemoterapiye yanıt da dahil olmak üzere kanser kök hücre biyolojisini incelemek için bu yaklaşımın uygunluğu için ilk kavram kanıtını sağlar.

Kolon Kanseri Kök Hücrelerini İncelemek İçin Üç Boyutlu Bir Küresel Model

Keşfedin, insan yumurtalık karsinoma hücrelerinde kök hücre özelliklerini tek ve çok hücreli küre tahlilleriyle değerlendirme yöntemini. Bu teknik, kanser kök hücrelerinin doğru tanımlanması için güvenilir sonuçlar sunar.

Çoklu ve tek hücre bazlı küreler tahliller kullanılarak, insan yumurtalık karsinoma hücrelerinde Kök Hücre Özelliklerinin Değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal

Çoklu ve tek hücre bazlı küreler tahliller kullanılarak, insan yumurtalık karsinoma hücrelerinde Kök Hücre Özelliklerinin Değerlendirilmesi

Daha fazla video keşfet