Çoklu ve tek hücre bazlı küreler tahliller kullanılarak, insan yumurtalık karsinoma hücrelerinde Kök Hücre Özelliklerinin Değerlendirilmesi

Bu prosedürün genel amacı, insan yumurtalık karsinomu hücrelerinin kök hücre özelliklerini çoklu ve tek hücre bazlı küre deneyleri kullanarak değerlendirmektir. Bu, ilk olarak SOX iki raportör RFP lentivirüsü Pur Misin tedavisi ile dönüştürülmüş hücrelerin seçilmesiyle gerçekleştirilir, RFP pozitif ve RFP negatif hücreler izole edilir ve kuyu başına tek veya çok hücreli koloniler olarak gerçeklere göre kaplanır. Daha sonra, birincil küre oluşumu mikroskobik olarak analiz edilir ve daha sonra birincil küre kültürleri, ikincil küre oluşumunun analizi için ayrıştırılır ve yeniden kaplanır.

Sonuç olarak, bu küre tahlilleri, küre oluşturma kapasitesi gösteren varsayılan yumurtalık kanseri kök hücrelerinin oranını hesaplamak için kullanılır. Bu yöntem, kanser kök hücre alanındaki bazı potansiyel kanser kök hücre popülasyonlarının neler olduğu ve tüm tümör torbasındaki sıklığın ne olduğu gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntem, yumurtalık kanseri kök hücre tanımlaması hakkında bilgi sağlayabilse de, kanser kök hücrelerini meme karsinomu gibi diğer katı tümör oluşumlarından izole etmek için de uygulanabilir.

İnsan yumurtalık karsinomu hücrelerinin lentiviral partiküllerle transdüksiyonundan 24 saat sonra, viral süpernatanı çıkarın ve hücreleri PBS kültüründe yıkayın. Hücreler 48 saat boyunca tam ortamda. Daha sonra ortamı değiştirin ve beş gün sonra mililitre piro misin başına 10 mikrogram ekleyin.

Kültürleri ertesi gün birer birer 1000 seyreltme ile kalkan ile muamele edin. Hücreleri PBS'de yıkayın ve daha sonra% 0.05 tripsin EDTA ile ayırın. Üç dakika sonra, reaksiyonu tam ortamla durdurun.

Hücreleri sayın ve 300 kez G ve oda sıcaklığında beş dakika santrifüjleyin. Hücreleri 0.5 ila bir mililitre steril PBS içinde dikkatlice yeniden süspanse edin ve daha sonra elde edilen hücre süspansiyonunu 40 mikrometrelik bir filtreden süzün. Hücreleri mililitre seyreltme başına beş kez 10 ila altı hücreye ayarlayın ve ardından tek hücre bazlı bir küre tahlili için sonraki ultra düşük bağlantılı 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 100 mikrolitre küre ortamı ekleyin.

Plakanın her bir oyuğuna bir hücreyi sıralamak için tek hücre modunu kullanın. Daha sonra kaplama verimliliğini değerlendirmek için hücreleri mikroskobik olarak puanlayın. Hücreleri taze kürelerde, 37 santigrat derecede orta ve günlük temel fibroblast büyüme faktörü ve epidermal büyüme faktörü takviyesi ile% 5 CO2 içinde inkübe edin.

Bir hafta sonra, ışık mikroskobu ile ortaya çıkan tümör kürelerinin sayısını ve floresan mikroskobu ile entegre raportör sistemden gelen floresan sinyalinin varlığını belirleyin. Çapı 100 mikrometreyi aşan küreleri büyük küreler ve çapı 50 ila 100 mikrometreyi aşan küreleri küçük küreler olarak sayın. Hücre kümelerini değil, gerçek küreleri saymaya özen gösterin.

Ardından, geçiş formülüne göre RFP pozitif veya RFP negatif hücreler oluşturan küre oranını hesaplayın. Küreler, her bir kuyucuğun içeriğini ayrı ayrı 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüplerine aktararak başlar. Daha sonra, tüm küreleri topladığınızdan ve hücreleri 300 kez G ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca döndürdüğünüzden emin olmak için her bir kuyuyu PBS ile üç ila beş kez durulayın.

Santrifüjlemeden sonra, snat'ı çıkarın ve peletleri 200 mikrolitre% 0.05 tripsin EDTA'da 37 santigrat derecede yumuşak bir çalkalayıcıda beş dakika boyunca askıya alın. Beş dakika sonra büyük küreler görünmüyorsa, hücre çözeltisini 100 mikrolitrelik bir pipet ucuyla hafifçe tritrate edin ve tripsini etkisiz hale getirmek için 500 mikrolitre tam ortam ekleyin. Hücreleri döndürün, peletleri küre ortamında dikkatlice yeniden süspanse edin ve elde edilen hücre süspansiyonunu az önce derecelendirildiği gibi 40 mikrometrelik bir filtreden boşaltın.

Son olarak, tek hücrelerin seri olarak yeniden kaplanması için, tek hücreleri 100 mikrolitre küre içinde bir birincil küreden tohumlayın, yeni bir ultra düşük ataşman 96 oyuklu plakada kuyu başına orta. Ardından, ikincil kürelerdeki küre oluşturan hücrelerin oranını değerlendirmek için birincil küre tahlili ile aynı formülü kullanın. Çok hücreli kürelerde yapılan tahliller: RFP pozitif insan yumurtalık karsinomu hücrelerinin yaklaşık% 40'ını, RFP negatif hücrelerin sadece% 20'sine kıyasla, birincil küre testinde ayrı bir tümör küresine yol açmıştır.

Şaşırtıcı bir şekilde, hem MGEM hem de D-M-E-M-F 12 tabanlı ortamda daha düşük sayıda plakalanmış hücreden daha fazla sayıda küre sayılır ve bu da kaplama modalitelerinin bu tahlildeki sonuçları oldukça önyargılı hale getirdiğini gösterir. Buna karşılık, hücreler %1 metilselüloz ilavesiyle hareketsiz hale getirildiğinde, küre oluşumunun verimliliği çoğunlukla çok hücreli küre kültürlerindeki hücre yoğunluğundan bağımsızdır. RFP pozitif kürelerden gelen hücrelerin yaklaşık% 35'i, yedi günlük kültürden sonra kırmızı floresan sinyallerini kaybeder, bu da bu hücrelerin farklılaşmaya uğradığını ve hücrelerin% 65'inden fazlasının kendi kendini yenileme kapasitesini gösteren bir RFP sinyalini tuttuğunu gösterir.

Buna karşılık, başlangıçta RFP negatif hücrelerden üretilen kürelerden elde edilen hücreler RFP negatif kalır, bu da bu koşullar altında kök hücre potansiyelini yeniden oluşturamayacaklarını gösterir. Tek hücrelerden üretilen küreler üzerinde gerçekleştirilen floresan mikroskobu, RFP pozitif hücrelerden türetilen tek kürelerin hem RFP pozitif hem de RFP negatif hücreler içerdiğini gösteren bu verileri doğrular. RFP negatif hücrelerden türetilen küreler ise bu prosedürü takiben kırmızı sinyal eksikliğini korur.

Ciddi şekillendirme kapasitesine sahip hücreleri daha fazla karakterize etmek için antikorlar, boyama veya kantitit PCR yoluyla gen ekspresyon analizi gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Bu prosedürü denerken, küre başlatan hücrelerin tümör kök hücre özelliklerini doğrulamak için immünosuprese farelerde in vivo transplantasyon testlerinin yapılması gerektiğini hatırlamak önemlidir.