Entübasyon-aracılı intratrakeal (IMIT) damlatma: A Noninvaziv, Lung-özel Dağıtım Sistemi

Bu prosedürün genel amacı, bakterileri noninvaziv olarak doğrudan farelerin akciğerlerine iletmektir. Bu, önce 150 mikrolitrelik bir hava yastığının gaz geçirmez bir şırıngaya yüklenmesi ve ardından hazırlanan bakteri süspansiyonunun 50 mikrolitresi ile gerçekleştirilir. İkinci adımda, anestezi uygulanmış bir fare, yerleştirmeye yardımcı olmak için bir kılavuz tel kullanılarak 20 gauge bir kateter ile entübe edilir.

Daha sonra basit bir akış ölçer kullanılarak entübasyonun başarısı onaylandıktan sonra, bakteri aşısı kateter yoluyla 22 gauge uzunluğunda künt bir iğne ile doğrudan akciğere verilir. Sonuç olarak, entübasyon aracılı intratrakeal veya atlan aşılama, farelerde alt solunum yolu hastalığını incelemek için kullanılabilir ve üst solunum yolunun eşzamanlı tutulumunu önler. Imit'in internazal aşılama yöntemlerine göre en büyük avantajı, bu tekniğin bir aşının doğrudan akciğerlere doğru ve tekrarlanabilir bir şekilde verilmesine izin vermesidir.

HTE cerrahi olmayan bir teknik olduğundan, cerrahi intratrakeal prosedürlerle ilişkili komplikasyon potansiyelini de azaltır. Bu yöntem, patogenezi incelemek için bakterileri akciğere iletmek için güvenilir bir mekanizma sağlayabilse de, IMA, akciğer hasarını incelemek için çevresel bileşikler, tedavi için terapötiklerin hedef verilmesi ve görüntüleme problarının verilmesi gibi diğer reaktiflerin verilmesine de uygulanabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, entübasyon adımıyla mücadele edeceklerdir, çünkü adım, hayvanın dikkatli bir şekilde konumlandırılmasını ve kılavuz tel yerleştirilmesi için otomatik dürbünü gerektirir.

Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi yararlıdır, çünkü kılavuz telin trakeaya ilk yerleştirilmesinin yeni araştırmacılara kavramsal olarak tanımlanması zordur. Kurulumdan 15 saat önce, üç mililitre et suyu kültürünü tek bir bakteri kolonisi ile aşılayın ve kültürü 37 santigrat derecede ve 200 RPM'de bir çalkalayıcıda büyütün. 15 saat sonra, 1.5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpünde hücrelerin bir mililitresini döndürün ve damağı bir mililitre PBS'de yeniden askıya alın.

Daha sonra, bakteri konsantrasyonunu belirlemek için bir OD 600'de bakteri stok süspansiyonunun bir ila 10 seyreltmesini ölçün. Daha sonra PBS'deki bakteri hücrelerini 50 mikrolitre inokülum başına istenen bakteri konsantrasyonuna seyreltin. HTE kurulumu için fareler, gavaj iğneli fareler tarafından hafifçe anestezi uygulanmış bir fareye% 2'lik bir lidokain çözeltisi uygulanarak IIT için hazırlanır.

Lidokain etkisini gösterirken anesteziye dönüş. Şimdi 150 mikrolitre havayı, 22 gauge uzunluğunda künt bir iğne ile donatılmış 250 mikrolitrelik gaz tipi bir iptal şırıngasına çekin. Ardından, şırınga yüklendiğinde 50 mikrolitre bakteri aşısını çekmek için Teflon pistonu şırınga gövdesi üzerindeki 150 mikrolitre işaretinden 200 mikrolitre işaretine ilerletin.

LA, bir entübasyon platformunda sırtüstü yatıştırılmış bir fare, platforma bağlı bir Velcro şeridine bağlı olmayan bir halka üzerinde hayvanı kesici dişlerden sabitler. Fareyi 45 derecelik bir eğime kaldırın ve ardından baskın elinizle yuvarlanma hareketiyle dili geri çekmek için bir mikro pamuk aplikatörü kullanın. Daha sonra, baskın olmayan el ile, hem dil retraksiyonunu sürdürmek hem de epiglotusu görselleştirmek için speküler bir entübasyon ile uyumlu bir ameliyat otoskopu kullanın.

Daha sonra, baskın elinde 20 gauge kateterden geçirilmiş bir kılavuz tel tutarak, fareyi trakea içinde 10 milimetre derinliğe kadar entübe edin ve otoskopu çıkarın. Kateteri baskın olmayan el ile sabitleyin. Ardından, katetere renkli bir boya içeren 16. şeffaf borunun yem bağlantılı bir uzunluğunu kısaca takın.

Boya, hayvan başarılı bir şekilde entübe edildiğinde hayvanın nefes almasına yanıt olarak hızla ileri geri hareket etmelidir. 22 gauge künt iğneyi katetere yerleştirin ve aşıyı tek bir sıvı hareketiyle doğrudan akciğere dağıtın. Daha sonra iğneyi ve kateteri hemen hayvandan çıkarın ve hayvan anesteziden tamamen iyileşene kadar fareyi izleme ile kafesine geri koyun.

Enfekte akciğer dokusunun bakteri yükünü değerlendirmek için, steril teknik kullanarak akciğerleri çıkarın ve dokuyu steril önceden tartılmış bir ons numune torbasına yerleştirin. Numune torbasını ve akciğerleri tarttıktan sonra, dokuya bir mililitre steril PBS ekleyin ve numune torbasını yeniden satın. Ardından, dokuyu homojenize etmek için 25 mililitrelik serolojik bir pipeti numune torbasının üzerine yavaşça yuvarlayın.

Bağlı dokuyu steril bir polyester duvar tabakası filtresinden çıkarın ve homojenatı bakterileri serbest bırakmak için tritton X 100 ile %1'lik bir son konsantrasyonda işlemden geçirin. Daha sonra, bir UBO 96 oyuklu plakada homojenatın altı kat seri seyreltilmesini gerçekleştirmek için çok kanallı bir pipet kullanın. Ardından, homojenat üçlü 10 mikrolitrelik alikotları bir LBA agar plakasına kaplamak için sekiz kuyulu çok kanallı bir plaka kullanın.

Son olarak, plakaları gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin ve ertesi gün koloni oluşturan birimleri numaralandırın. Bu temsili deneyde aşılanan hayvanların akciğerlerinden geri kazanılan pseudomonas aerogen inoculum'un% 98'inden fazlası ile bakterilerin verilmesi bu yöntemle oldukça verimlidir. Ayrıca, HTE kurulumu, uygulanan aşının konsantrasyonundan bağımsız olarak yüksek oranda tekrarlanabilir.

Damıtılan materyalin IIT yöntemi ile dağılımını görselleştirmek için, aşılama için gösterildiği gibi 50 mikrolitre% 0.1 Kumasi parlak mavi boya akciğerlere verilebilir. Not: Boyanın akciğerin tüm loblarına dağılımı bir kez ustalaştıktan sonra. Bu yöntem iki araştırmacıdan oluşan bir ekiple anestezi, IMA aşılaması ve anesteziden kurtarma dahil olmak üzere ortalama iki ila üç dakikalık bir sürede hızlı bir şekilde gerçekleştirilebilir.

Bu prosedürü denerken, fareyi entübe etmek için ikiden fazla başarısız girişimde bulunmamak önemlidir. Başarısız entübasyon, kateterin trakea yerine yemek borusuna yerleştirilmesinden kaynaklanan potansiyel travmaya neden olabilir. Abs L üç muhafazası gerektirenler de dahil olmak üzere birçok solunum yolu patojeni, bu prosedür güvenlik kabinleri ve ayrıca bir yüz siperi de dahil olmak üzere tam solunum koruması giyen araştırmacılar tarafından gösterildiği gibi gerçekleştirilebildiğinden, imed tarafından etkili bir şekilde verilebilir.

Imit'in, malzemelerin doğrudan farelerin akciğerlerine verilmesi için çok doğru ve verimli bir yöntem olduğunu gösterdik. Bu özellikler, imit'i yüksek oranda tekrarlanabilir model sistemleri gerektiren GLP tipi çalışmalar için çok uygun hale getirir.