Name: Doğru Algılama Fare B Lineage Hücreleri IgE-ifade (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Keşfedin fare B hücrelerinde IgE üreten hücreleri tespit etme yöntemini. Tripsin tedavisi ve akış sitometrisi kullanarak yüzey bağlı IgE'yi ayıklayıp gerçek IgE üreten hücreleri doğru şekilde analiz edin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

DRW NIH hibe AI089972 ve AI113217 tarafından ve Mukozal İmmünoloji Çalışmaları Ekibi tarafından desteklenen ve Burroughs Wellcome Fonu Tıbbi Bilimciler için Kariyer Ödülü tutar.

NOT: Burada açıklanan tüm deneyler Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) kurallarına uygun olarak ve Hayvancılık Araştırma Hastanesi Çocuk (ARCH), Boston, Mass tarafından onayladı. Reaktifler 1. Hazırlık <ol><li> 1,000x, IL-4 Stok: H 2, O ya da% 0.1 bovin serum albümini (BSA) içinde 20 ug / ml olacak şekilde seyreltin, IL-4, sitokin. -20 ° C&#39;de 1.5 ml mikrosantrifüj tüplerine ve saklamak için 200 ul alikolar içinde dağıtın. </li><li> 1,000x anti-CD40: 4 ° C &#39;de, 1.0 mg / ml arasında, mağazada üreticisinden elde edilir. </li><li> B hücre uyarılmasını ortamı: RPMI-1640 ortamı içinde 425 ml&#39;lik, ekleme 75 taze çözülmüş fetal buzağı serumu mi (FCS), 1.0 M HEPES tamponunda, 5 ml L-glutamin stokunun 10 mi, 5 ml Penisilin: Streptomisin stoku, 5 2-merkaptoetanol mi Asgari Temel Ortam Aslî Olmayan Amino Asitler (MEM-NEAA) ve 3.5 ul. Bir haftaya kadar 4 ˚C Ortamı tutun. IL-4 (20 ng / ml) ve anti-CD40 (1.0 ug / ml), kullanılmadan hemen önce eklemesadece gerekli ortamın hacmi. </li><li> % 2 FCS-FACS Tampon: 1x PBS 490 ml FCS, 10 ml ilave edilir. 4 ° C&#39;de tutun. </li><li> 2x tripsin-EDTA çözeltisi: 1x PBS, 20 ml 10 x tripsin-EDTA stok çözeltisi (5.0 gr, tripsin, litre başına 2.0 g EDTA) 5 ml seyreltin. Mağaza tripsin-EDTA 2x 4 ° C&#39;de alikotları çalışma. Kullanmadan önce oda sıcaklığına ısınmasına izin verin. </li><li> Cenin buzağı serumu: en fazla iki hafta boyunca 4 ° C&#39;de eritilmiş FCS tutun. Sitoplazmik boyama prosedürü önce buz 15 dk yerleştirin. </li><li> Nötr-tamponlu formalin:% 10 formalin solüsyonu (% 3.7 paraformaldehid) hazırlayın. Formalin toksik ve uygun KKD giyerek bu nedenle laboratuar davlumbaz altında tutun. Bir kimyasal depolama kabini oda sıcaklığında saklayın formalin. </li><li> Metanol: -20 ° C&#39;de saklayın mutlak metanol (% 100) hücreleri geçirgenleştirildi hazır olana kadar. Bu, metanol yanıcı ve uygun bir dondurucuda saklanabilir gerektiğine dikkat ediniz. </li></ol> 2.Saflaştırılması ve B hücrelerinin aktivasyonu <ol><li> Taze hasat fare dalak kaynaktan, dikkatli bir şekilde 3 ml lik bir enjektör pistonuna sahip 70 mikron hücre süzgecinden organı basarak tek bir hücre süspansiyonu hazırlanır. 15 ml konik santrifüj tüpü içinde, 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de 1x 10 ml PBS hücrelerin ve santrifüj toplar. </li><li> 5 dakika boyunca alyuvar parçalanması Tamponu, 1 ml yüzer madde ve tekrar süspansiyon pelet süzün. 5 dakika boyunca 300 xg&#39;de 13.5 1x PBS ml ve santrifüj ile nötralize edin. </li><li> (İsteğe bağlı) Manyetik üreticinin talimatlarına göre MACS arıtma protokolü takip edilerek, boncuklar, anti-CD45R (B220) ile B hücreleri -etiketli ayırın. </li><li> 37 ° C &#39;de, IL-4 (20 ng / ml) ve 5 gün boyunca bir anti-CD40 (1.0 ug / ml) ihtiva eden ısıtılmış B hücre uyarılmasını ortam içinde 1.0 x 10 6 hücre / ml&#39;de, saflaştırılmış B hücrelerini stimüle eder. 6 oyuklu bir kültür plakasına (4 mL) içinde 2 kuyu ayrılmıştır kültür 8 ml ile başlar. </li><li> Cultu edin1.0 x 10 6 hücre / ml&#39;de korumak için günlük olarak tekrar. Diğer kuyulara bölme ve taze IL-4 ve anti-CD40 ihtiva eden B hücre uyarılmasını ortamı ile kültür seyreltilerek konsantrasyonu ayarlayın. </li></ol> 3. tripsinizasyonu, Fiksasyon ve Permeabilization <ol><li> Trypsinization <ol><li> 5 dakika boyunca 300 xg&#39;de, 15 ml konik tüp içinde santrifüj kültür hücrelerinin kadar 1.0 x 10 7 toplayın, ve süpernatant süzün. </li><li> Hücre toplama ortamından artık proteinin ayrılması için 10 ml PBS ile yıkayın. Santrifüj adımı tekrarlayın ve süpernatant süzün. </li><li> (Yaklaşık 100 ul) boşaltılarak sonra rezidüel hacim hücre pelletini. </li><li> Dikkatlice hücreler, oda sıcaklığında,% 0.1 (2x) tripsin-EDTA, 800 ul ilave edin. Konik tüp tarafında aşağı 45 ° açıyla yavaşça koyun. </li><li> Tüp kapatın ve sıvı tüp 5-6 kez uzunluğu boyunca uzanan bu yüzden tüp eğerek hafifçe karıştırıns. Bir tel, beyaz bir çökelti çözeltisi içinde meydana gelebilir. Bir dakika altındaki trypsinization zamanı sınırlayın. </li><li> Soğuk FCS, 1 ml tripsinizasyon reaksiyonu söndürün. Hemen soğuk PBS 10 ml ilave etmek suretiyle FCS ile seyreltilir. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj, ardından süpernatan süzün ve buz tüpleri döndürür. </li></ol></li><li> Tespit <ol><li> Boşaltılarak sonra rezidüel hacim hücrelerin tekrar. Gerekirse, soğuk PBS ile 100 ul hacmi getirmek. </li><li> Bir çeker ocak içinde, hücrelere% 10 nötr tamponlu formalin çözeltisi 800 ul ve yukarı ve aşağı pipetleme ve. Tüp formalin ilavesi üzerine sıcak olacak. 10 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edilir. </li></ol></li><li> Permeabilizasyon <ol><li> Hafif sallayarak hızında bir tezgah üstü vorteks karıştırıcı ayarlayın. </li><li> 10 ml&#39;lik bir serolojik pipet içine soğuk (-20 ° C) metanol içinde 9 ml çizin. </li><li> Vorteks mikser üzerinde hücreleri içeren tüp tutun ve yavaşça sallıyor başlangıçg kadar hücre. </li><li> Tüp hala çok titriyor metanol sürekli karıştırma olduğunu iken hücreleri üzerine damla damla düşer, böylece tüp soğuk metanol ekleyin. Metanol ilk 2 ml sonra dağıtma hızı yavaş bir akışla kadar arttırılabilir. </li><li> 30 dk permeabilization tamamlamak için tüp buz üzerinde bekletin. Seçenek olarak ise, hücreler, bir aya kadar -20 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. </li></ol></li></ol> IgG1 ve IgE sınıf değiştirme 4. Floresan Boyama <ol><li> Santrifüj 5 dakika boyunca 300 xg&#39;de örnek ve metanol çözüm süzün. Beyaz bir çökelti hücreleri ile pelet olabilir. </li><li> 5 dakika Hücreleri yıkamak için 300 x g&#39;de oda sıcaklığında PBS 1x ve santrifüj 10 ml ilave edilir. Kez tekrarlayın. Not: oda sıcaklığı PBS ile pelet yıkanması adım 4.1 sonra oluşabilecek ekstra çökelti çözer. </li><li> % 2 FCS-FACS tamponu 10 ml ek yıkama yapın. </li><li> Yuvarlak tabanlı plaka 96 çukurlu numuneleri dağıtmave 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj. Süpernatant süzün ve buz üzerinde tabak koydu. </li><li> Aşağıdaki antikor seyreltmeleri ile oyuk başına% 2 FCS-FACS tamponu 60 ul Leke: Anti-IgM RPE / Cy7, 1: 200, anti-lgG1 PE, 1: 600, anti-IgE FITC, 1: 100, Anti- CD45R (B220) PerCP Cy5.5 @, 1: 200 </li><li> Boyama 5 dakika sonra, 300 x g, 5 dakika boyunca% 2 FCS-FACS tamponu ve santrifüj 150 ul plakayı yıkayın. </li><li> 5 ml&#39;lik bir FACS tüpü içine, bir 40 um naylon hücre süzgecinden% 2 FCS-FACS tamponu ve pipet 400 ul içinde süspanse. </li></ol> 5. Aşağıdaki Yolluk Strateji kullanın: <ol><li> FSC / SSC arsa (Şekil 1) bulunan patlatma lenfosit nüfus CD45R (B220) pozitif hücreleri izole. </li><li> B220 pozitif hücrelerden, ilgili popülasyonları ortaya IgE ve IgG1 arsa kullanın. </li></ol>

<ol><li>Chaudhuri, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+the+immunoglobulin+heavy+chain+class+switch+recombination+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Evolution of the immunoglobulin heavy chain class switch recombination mechanism.</a> Advances in immunology. 94, 157-214 (2007).</li>
<li>Gould, H. J., Sutton, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IgE+in+allergy+and+asthma+today%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">IgE in allergy and asthma today.</a> Nature reviews. Immunology. 8, 205-217 (2008).</li>
<li>Winter, W. E., Hardt, N. S., Fuhrman, S. Immunoglobulin E. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 124 (9), 1382-1385 (2000).</li>
<li>Ozcan, E., Notarangelo, L. D., Geha, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+immune+deficiencies+with+aberrant+IgE+production%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Primary immune deficiencies with aberrant IgE production.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 122, 1054-1062 (2008).</li>
<li>Bacharier, L. B., Geha, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+IgE+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+allergy+and+clinical+immunology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of IgE regulation.</a> The Journal of allergy and clinical immunology. 105, 547-558 (2000).</li>
<li>Yokota, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+species+of+human+Fc+epsilon+receptor+II+%28Fc+epsilon+RII%2FCD23%29%3A+tissue-specific+and+IL-4-specific+regulation+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Two species of human Fc epsilon receptor II (Fc epsilon RII/CD23): tissue-specific and IL-4-specific regulation of gene expression.</a> Cell. 55 (4), 611-618 (1988).</li>
<li>Boboila, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+end-joining+catalyzes+class+switch+recombination+in+the+absence+of+both+Ku70+and+DNA+ligase+4%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Alternative end-joining catalyzes class switch recombination in the absence of both Ku70 and DNA ligase 4.</a> The Journal of experimental medicine. 207, 417-427 (2010).</li>
<li>Nimmerjahn, F., Ravetch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fcgamma+receptors+as+regulators+of+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Fcgamma receptors as regulators of immune responses.</a> Nature reviews. Immunology. 8 (1), 34-47 (2008).</li>
<li>Callen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((53BP1+mediates+productive+and+mutagenic+DNA+repair+through+distinct+phosphoprotein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">53BP1 mediates productive and mutagenic DNA repair through distinct phosphoprotein interactions.</a> Cell. 153 (6), 153-1280 (2013).</li>
<li>Wesemann, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+IgH+isotype-switched+B+cells+to+functional-grade+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Reprogramming IgH isotype-switched B cells to functional-grade induced pluripotent stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13745-13750 (2012).</li>
<li>Wesemann, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immature+B+cells+preferentially+switch+to+IgE+with+increased+direct+S%C2%B5+to+S%CE%B5+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Immature B cells preferentially switch to IgE with increased direct Sµ to Sε recombination.</a> The Journal of experimental medicine. 208 (13), 2733-2746 (2011).</li>
<li>Zarrin, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evolutionarily+conserved+target+motif+for+immunoglobulin+class-switch+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+immunology%22%5BJournal%5D)">An evolutionarily conserved target motif for immunoglobulin class-switch recombination.</a> Nature immunology. 5, 1275-1281 (2004).</li>
<li>Fan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+class-specific+polyclonal+antibody-based+indirect+competitive+ELISA+for+detecting+fluoroquinolone+residues+in+milk%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Zhejiang+University.+Science.+B%22%5BJournal%5D)">Development of a class-specific polyclonal antibody-based indirect competitive ELISA for detecting fluoroquinolone residues in milk.</a> Journal of Zhejiang University. Science. B. 13 (7), 545-554 (2012).</li>
<li>Perez, O., Krutzik, P., Nolan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+kinase+signaling+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology+%28Clifton%2C+N.J.%29%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of kinase signaling cascades.</a> Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 263, Clifton, NJ. 67-94 (2004).</li>
<li>Jamur, M., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+fixatives+for+immunostaining%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology+%28Clifton%2C+N.J.%29%22%5BJournal%5D)">Cell fixatives for immunostaining.</a> Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 588, 55-61 (2010).</li>
<li>Ishizaka, T., Ishizaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+passive+sensitization.+IV.+Dissociation+of+IgE+molecules+from+basophil+receptors+at+acid+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology+%28Baltimore%2C+MD.+%3A+1950%29%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of passive sensitization. IV. Dissociation of IgE molecules from basophil receptors at acid pH.</a> Journal of immunology (Baltimore, MD. : 1950). 112 (3), 1078-1084 (1950).</li>
<li>Erazo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+Maturation+Program+of+the+IgE+Response+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Unique Maturation Program of the IgE Response In Vivo.</a> Immunity. 26, 191-203 (2007).</li>
<li>Xiong, H., Dolpady, J., Wabl, M., Curotto de Lafaille, M. A., Lafaille, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+class+switching+is+required+for+the+generation+of+high+affinity+IgE+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Sequential class switching is required for the generation of high affinity IgE antibodies.</a> Journal of Experimental Medicine. 209, 353-364 (2012).</li>
<li>Yang, Z., Sullivan, B., Allen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+in+vivo+detection+reveals+that+IgE%28%2B%29+B+cells+are+restrained+by+an+intrinsic+cell+fate+predisposition%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Fluorescent in vivo detection reveals that IgE(+) B cells are restrained by an intrinsic cell fate predisposition.</a> Immunity. 36 (5), 857-872 (2012).</li>
<li>Berkowska, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+IgE%28%2B%29+B+cells+are+derived+from+T+cell-dependent+and+T+cell-independent+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+allergy+and+clinical+immunology%22%5BJournal%5D)">Human IgE(+) B cells are derived from T cell-dependent and T cell-independent pathways.</a> The Journal of allergy and clinical immunology. , (2014).</li>
<li>He, J. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distinctive+germinal+center+phase+of+IgE%2B+B+lymphocytes+limits+their+contribution+to+the+classical+memory+response%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">The distinctive germinal center phase of IgE+ B lymphocytes limits their contribution to the classical memory response.</a> The Journal of experimental medicine. 210 (12), 2755-2771 (2013).</li>
<li>Keegan, A., Fratazzi, C., Shopes, B., Baird, B., Conrad, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+new+rat+anti-mouse+IgE+monoclonals+and+their+use+along+with+chimeric+IgE+to+further+define+the+site+that+interacts+with+Fc+epsilon+RII+and+Fc+epsilon+RI%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+immunology%22%5BJournal%5D)">Characterization of new rat anti-mouse IgE monoclonals and their use along with chimeric IgE to further define the site that interacts with Fc epsilon RII and Fc epsilon RI.</a> Molecular immunology. 28 (10), 1149-1154 (1991).</li>
</ol>

Yazarların herhangi bir açıklaması yoktur.

Anti-CD40 ve IL-4 ile kültürde fare dalak B hücreleri uyarımı IgG1 ve IgE 5, T yardımcı tip 2 (Th2) etkileşimi teşvik edici sınıf değiştirme simule eder. B hücreleri, toplam splenositler 12 ya da saflaştırılmış ve splenik B hücrelerinin 11 bağlamında CSR etkinleştirilebilir. Protokol (adım 2.3) de belirtildiği gibi, B hücresi zenginleştirme isteğe bağlıdır, ve yararlı olurdu olmadığını belirlemek için deneyci takdirine bağlıdır. CD45R (B220) kullanılarak B hücrelerinin pozitif...

Fare ve insan immünoglobulin ağır zinciri (IgH) sınıf anahtarı rekombinasyon (CSR) sırasında, IgH, sabit bölge ekzon (Cμ) silindi ve aşağı doğru sabit bölge eksonların çeşitli kümelerinin bir (Cı lH ler) (örneğin, Cγ değiştirilir μ Ig sınıflarına (örneğin, IgG, IgE ya da IgA) üretimine IgM üretimi ile ilgili bir anahtar elde Cε ve Ca&#39;sına). CSR CH s, 1 her bir grubu için 5 &#39;bölgesinde yer 1-10 kb sekansları anahtarı (s) bölgeleri içinde gerçekleşir. Aktivasyon Bağlı Sıtıdın Deaminaz (AID) enzim sitidinin deaminasyon etkinliği yoluyla CSR başlatır. IgE allerjik hastalık 2 anahtar arabulucu ve IgE üretilen ve atopik hastalığı için yeni tedavi yaklaşımları kapılarını açabilir düzenlenir nasıl büyük bir anlayıştır. Farelerde ve insanlarda olarak IgE, en sıkı bir şekilde düzenlenmiş Ig izotiptir. IgE normal tim düzeyleri binlerce tespit edilires diğer IgH daha az 3 isotypes, ama çok hastalık durumlarında 4 yükselmiş olabilir. Bununla birlikte, IgE CSR tam olarak anlaşılamamıştır. B hücrelerinin in vitro aktivasyonu, IL-4, anti-CD40 veya LPS ile kombinasyon halinde her iki IgG1 ve IgE 5 CSR indükler kullanılmıştır. Aktive B hücreleri çözünebilir IgE CSR sonra kültür salgılanan bağlayan düşük afiniteli IgE reseptörü FcεRII / CD23 2,6, ifade eder. Akış sitometrisi ile analiz, bu nedenle, reseptör bağlı IgE lekesi ile B hücreleri benzer endojen IgE 7 sentezleyen B hücreleri için. O fare B biliniyor olsa da hücreler IgG1 sınıf anahtarlama ölçümü ile müdahale görünmüyor deneyimlerimiz düşük afinite IgG reseptörü FcγRIIB1 (CD32) 8, ifade eder. Kültür içinde, B hücresi aktivasyonu sonrası IgE geçiş ölçüm Ancak, spesifik olmayan yüzeyine bağlı IgE analizi gizleyebilir. Yaygın boyama yöntemleriyle olmayan IgE ifade eden hücreler IgE için pozitif leke. Burada özetlenen fareler 9 arası gerçek IgE ifade B hücreleri KSS tahlilleri yapmak ve tespit etmek için kullanılmıştır bir stratejidir - 11. Tripsin ile aktive B hücrelerinin tedavisi, ortak bir laboratuar reaktif protein sindirimi, cytophylic ve membran hem de bağlı yüzey Ig kaldırır. Sitoplazmik IgE için sonraki permeabilization ve boyama, böylece gerçek IgE üreten hücreleri ortaya koymaktadır.

<table><tbody><tr><td>Anti-Fare IgE FITC</td><td>BD Pharmingen</td><td>553415</td><td>klonu R35-72</td></tr><tr><td>Sıçan Anti-Fare IgG1 PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>550083</td><td>klonu A85-1</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>BDH</td><td>BDH1135-4LP</td><td>-20 ve derecede tutun; C</td></tr><tr><td>Falcon Hücre Süzgeci 40 & m Naylon</td><td>Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Hücre Süzgeci 70 & m Naylon</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Hu / Mo CD45R (B220) PerCP-Cy5.5</td><td>eBioscience</td><td>45-4052-82</td><td>klon RA3-6B2</td></tr><tr><td>anti-Fare / Sıçan CD40</td><td>eBioscience</td><td>16-0402-85</td><td>klon HM40-3</td></tr><tr><td>RPMI Orta 1640</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td> <td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>MEM-NEAA (100x)</td> <td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (10x)</td><td>Lifetechnologies (Corning)</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>MACS CD45R (B220) mikro boncuklar&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-049-501</td><td></td></tr><tr><td>MACS arıtma kolonu</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>IL-4</td><td>PeproTech</td><td>214-14</td><td>Suda veya% 0.1 BSA</td></tr><tr><td>Formalin Çözeltisi, Nötr Tamponlu,% 10</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA Çözeltisi (10x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4174-100 ml</td><td>5.0 g Tripsin, 2.0 g EDTA&#8226; Litre başına 4 Na% 0.9 NaCl</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0781-100 ml</td><td>10.000 U Penisilin; 10 mg / ml Streptomisin (100x)</td></tr> <tr><td>L-Glutamin 200 mM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol (% 99)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>M6250-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>Kırmızı hücre lizis tamponu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>Sıçan Anti-Fare IgM RPE/Cy7</td><td>SouthernBiotech</td><td>1140-17</td><td>klon 1B4B1</td></tr><tr><td>HyClone Fetal Buzağı Serumu</td><td>Termo</td><td>SH30910.03</td><td></td></tr><tr><td>B hücreli Stimülasyon ortamı</td><td></td><td></td><td>B hücre stimülasyon ortamı, fetal buzağı serumu (%15), 20 mM HEPES, 1x MEM-NEAA, 2.0 mM L-glutamin, &nbsp; 1x Penisilin-Streptomisin (Penisilin: 100 U/ml, Streptomisin: 100 & mikro; g / ml), Beta-merkaptoetanol (7 & mikro; L/L), IL-4 (20 ng/ml) ve anti-CD40 (1 & mikro; g/ml)</td></tr></tbody></table>

doğru algılama fare b lineage hücreleri ige-ifade

Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells

B lenfosit immünoglobulin ağır zinciri (IgH) sınıf anahtarı rekombinasyon (CSR) ilk olarak, IgM IgA, IgE ve IgG olarak diğer IgH izotiplerinden geçer ifade edildiği bir süreçtir. In vitro IgH CSR ölçümü, moleküler ve hücresel immünoloji yönlerine DNA yeniden birleştirmesinden ve onarım kadar biyolojik süreçlerin bir dizi çalışma için bir temel yöntem. In vitro CSR deney aktive B hücreleri üzerindeki akış sitometrik ölçüm yüzey Ig ifade içerir. IgA ve IgG alt sınıflarının ölçümü kolay olmakla birlikte, bu yöntemle IgE ölçümü, çözünür IgE FcεRII bağlanma nedeniyle sorunludur / CD23 aktive B hücrelerinin yüzeyi üzerinde ifade edilmiştir. Burada kültür CSR geçirmiş fare B hücreleri, IgE üreten doğru bir şekilde ölçülmesi için benzersiz bir işlem tarif eder. yöntem cy ile sağlanan B tipi hücrelerin IgE üreten tespiti için izin hücre yüzeyleri üzerindeki IgE-CD23 komplekslerinin tripsin-sebepli bölünme dayanırtoplasmic lekelenmesi. Bu prosedür IgE KSS akış sitometri analizi için uygun bir çözüm sunuyor.

Bu prosedür başarıyla fare B hücrelerinde IgE CSR çalışma uygulamaya konmuştur. Daha önce tarif edildiği gibi 11 CSR ölçüm etkinliği tespit etmek için, anti-CD40 ve IL-4 ile birlikte fare dalak B hücreleri stimüle. Stimülasyon beş gün sonra, hücreler toplandı ve protokol floresan-etiketli IgM, IgG1, IgE ve B220 (CD45R) antikorlar ile, yukarıda tarif edilen ve lekeli kullanılarak işlenmiştir. (Şekil 1), IgE + hücrelerin net bir nüfusu temiz tripsin tedavi (Şekil 2a) olmadan ay...

Farelerde sınıf anahtarı rekombinasyonunun in vitro analizi, B hücrelerinin yüzeyindeki Fc reseptörlerine bağlı sitofilik IgE molekülleri nedeniyle zordur. Sitoplazmik floresan boyama için fiksasyon ve geçirgenlikten önce yüzeye bağlı IgE'nin tripsin aracılı bölünmesini kullanarak IgE tespiti için bir yöntem tarif ediyoruz.

Doğru Algılama Fare B Lineage Hücreleri IgE-ifade

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, IgE salgılanan diğer IgE izotiplerini eksprese eden gerçek IgE hücrelerini B hücrelerinden ayırt etmektir. İn vitro sınıf değiştirme testleri sırasında, B hücre yüzey proteinlerine bağlanır, bu da IgE'ye sınıf geçişini ölçme yeteneğini gizler. Amaç, analizden önce reseptöre bağlı IgE moleküllerinin, endojen olarak üretilen hücre içi immünoglobulin moleküllerini olduğu gibi bırakırken hücre yüzey proteinlerini spesifik olarak parçalamayan tripsin kullanılarak çıkarılmasıyla elde edilir.İkinci olarak, B hücreleri formin ile sabitlenerek hücre içi proteinler açığa çıkarılır ve hücrelere metanol ile nüfuz eder. Daha sonra, hücreler hücre içi immünoglobulinleri ortaya çıkarmak için floresan etiketli antikorlarla boyanır. Sonuçlar, belirgin bir IgE pozitif B hücresi popülasyonunu göstermektedir.Akış sitometrisi analizine dayalı olarak tripsin kullanılıyorsa, IgE üreten hücreleri tespit etmenin zorluğu nedeniyle IgE biyolojisi üzerine yapılan çalışmalar sınırlı kalmıştır. Bu yöntem, bu ilginç molekülü anlamamızı hızlandırmak için laboratuvarların kolayca benimseyebileceği erişilebilir bir çözüm sunar. Bu teknik, reseptöre bağlı IgE'nin etkisini ortadan kaldırmak için mevcut yöntemlere göre avantajlıdır.Örneğin, yüzey IgE'yi anti IgE antikorları ile bloke etmekten daha az maliyetlidir ve asit yıkama işleminden daha bağışlayıcıdır. Bu yöntem, fare B hücresi sınıfının analiz edilmesi konusunda fikir verebilse de, gerçek boyamadan önce tripsin ile IgE tedavisine geçmek, yeni hasat edilmiş bir fare dalağından yüzey proteinlerinin çıkarılmasını gerektiren diğer protokollere de uygulanabilir. Tek hücreli bir süspansiyon hazırlayın.Üç mililitrelik bir şırınganın pistonunu kullanarak organı 70 mikronluk bir hücre süzgecinden hafifçe bastırın. Hücreleri, 10 mililitre bir XPBS içeren 15 mililitrelik konik bir santrifüj tüpünde toplayın. Daha sonra, hücreleri dört santigrat derecede beş dakika boyunca 300 Gs'de santrifüjleyin.Supra natanı boşaltın ve peleti bir mililitre kırmızı kan hücresi parçalama tamponunda yeniden süspanse edin. 13.5 mililitre bir XPBS ile nötralize etmeden önce parçalanma reaksiyonunun beş dakika gitmesine izin verin. Daha sonra hücreleri beş dakika boyunca 300 Gs'de tekrar santrifüjleyin ve peleti kalan hacimde yeniden süspanse edin.Şimdi hücrelere IL four ve anti CD 40 içeren sıcak B hücresi stimülasyon ortamı ekleyin. Altı kuyulu bir kültür plakasının iki kuyucuğuna bölünmüş sekiz mililitrelik bir kültürle başlayın ve hücreleri beş gün boyunca 37 santigrat derecede uyarın. Hücreleri mililitre başına 1 milyonda tutmak için kültürü günlük olarak kontrol edin.Kültürleri diğer oyuklara bölerek ve B hücresi stimülasyonu ile seyrelterek bir konsantrasyon ayarlayın. Taze IL four ve anti CD 40 içeren ortam. 15 mililitrelik konik bir tüpte 10 milyona kadar uyarılmış B hücresi toplamakla başlayın.Daha sonra bunları beş dakika boyunca 300 Gs'de santrifüjleyin ve artık proteini hücre toplama ortamından çıkarmak için süpernatanı boşaltın. B hücrelerini 10 mililitre PBS ile yıkayın, ardından başka bir santrifüjleme ve snat boşaltımı yapın Boşalttıktan sonra, hücre peletini yaklaşık 100 mikrolitrelik kalan hacimde yeniden askıya alın ve EDTA'da 800 mikrolitre oda sıcaklığında% 0.1 oranında dikkatlice ekleyin. Çözeltiyi tüpün yan duvarı boyunca yavaşça ekleyin.Bir eğim ekleyin, ardından tüpü kapatın ve sıvıyı tüpün uzunluğu boyunca hafifçe çalıştırın. Bir dakika içinde çözeltide beş veya altı kez lifli beyaz bir çökelti oluşabilir. Reaksiyonu bir mililitre soğuk FCS ile söndürün.Hücreleri buz üzerinde tutun. Şimdi hala hayattalar ve yeni yüzey proteinlerini ifade edebiliyorlar. Hemen 10 mililitre soğuk PBS ekleyerek FCS'yi seyreltin.Yüzen kalıntıları bir pipetle temizleyin. Hücreleri dört santigrat derecede döndürün. Snat hemen boşaltın ve kalan hacimdeki hücreleri yeniden askıya alın.Gerekirse, hacmi 100 mikrolitreye çıkarın, soğuk PBS ile 800 mikrolitre% 10 nötr tamponlu formin pipetinde bir çeker ocakta hızlı bir şekilde ilerleyin, karışım yukarı ve aşağı tüp, karıştırıldıktan sonra ısınmaya başlayacaktır, hücreleri fiksatifte 10 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Bu arada, hafif bir sallama hızında bir tezgah üstü girdap karıştırıcı kurun ve metanolü kullanım için eksi 20 santigrat dereceye kadar soğutun. Hücreler kuluçka işlemi bittiğinde.Serolojik bir pipete dokuz mililitre metanol çekin. Daha sonra, metanolü damla damla eklerken tüpü nazikçe açın. İki mililitre metanol dağıttıktan sonra, yavaş bir akışa kadar yavaş bir şekilde hızlandırın.Şimdi hücrelere nüfuz etmesi için tüpü 30 dakika buz üzerinde bekletin. Alternatif olarak, hücreler bir aya kadar negatif 20 santigrat derecede saklanabilir. Önce perme hücrelerini santrifüjleyerek ve metanolü boşaltarak boyama prosedürüne başlayın.Beyaz bir çökelti hücrelerle peletlenebilir. Daha sonra hücreleri 10 mililitre oda sıcaklığında bir XPBS santrifüjleme ve boşaltma ile karıştırarak yıkayın. Bu yıkama adımını iki kez gerçekleştirin.Ardından, 10 mililitre% 2 FCS faks, tampon ve yeniden askıya alma ile ek bir yıkama yapın. Kalan hacimdeki pelet, numuneyi 96 kuyulu yuvarlak bir alt plakanın bir kuyucuğuna yükleyerek devam eder. Birçok numune tipik olarak paralel olarak işlenir.Bir plaka döndürücü kullanarak 20 ila 50 mikrolitre yükleyin, hücreleri beş dakika boyunca 300 Gs'de santrifüjleyin. Sonra snat'ı boşaltın ve plakayı buzun üzerine koyun. Şimdi hücreleri her bir kuyucuğa boyayın, dört farklı antikor içeren 60 mikrolitre% 2 FCS faks tamponu ekleyin.Lekelerden sonra hücrelerin leke içinde beş dakika kuluçkaya yatmasına izin verin. 150 mikrolitre% 2 FCS faks tampon kürkü ekleyerek hücreleri yıkayın. Daha sonra plakayı daha önce olduğu gibi santrifüjleyin, ardından çözeltiyi boşaltın ve hücreleri tekrar askıya alın.400 mikrolitre %2 FCS faks arabelleği kullanın. Şimdi hücreleri 40 mikronluk bir naylon hücre süzgecinden geçirerek faks kapısı için beş mililitrelik bir faks tüpüne pipetleyin. Hücreler önce B olarak da bilinen CD 45 R pozitif hücreleri, F-S-C-S-S-C grafiğindeki patlatma lenfosit popülasyonundan iki 20 pozitif hücreyi, ardından B'den iki 20 pozitif hücreyi izole ederek izole eder.Bu prosedürü kullanarak karşılık gelen popülasyonları ortaya çıkarmak için IgE ve IgG bir grafiği kullanın. IgE'ye sınıf değiştirme rekombinasyonu, patlatma lenfositlerine dayalı bir geçit stratejisi kullanılarak fare B hücrelerinde incelenmiştir. IgE pozitif hücrelerin net bir popülasyonu, hücrelerin tripsini olmadan temiz bir şekilde ayırt edilemedi, fiksasyondan önce tripsin ve geçirgenlik, yüzeye bağlı IgE'nin çıkarılması nedeniyle IgE üreten hücrelerin ayrılmasını sağladı.Bu boyama tekniği, uygun şekilde yapıldığı takdirde yaklaşık bir saat içinde yapılabilir. Formalin ve metanol ile çalışmak tehlikeli olabilir. Bu nedenle, bu işlem yapılırken her zaman bir fuma kullanılmalı ve her zaman uygun kişisel koruyucu ekipman kullanılmalıdır.

detection-of-true-ige-expressing-mouse-b-lineage-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu prosedür, tespiti ve izolasyonu stimülasyon üzerine IL-17 aktif salgılar fare Th17 lökositlerin açıklamaktadır.

Canlı Fare IL-17 salgılayan T Hücreler Algılama ve İzolasyonu

Dermatitis herpetiformis (DH) IgA ve epidermal transglutaminaz (ETG) arasında otoimmün bir reaksiyon ile karakterize kronik inflamatuar bir durumdur. DH gluten duyarlı ve / veya çölyak hastaların çok küçük bir kısmında gelişir. Bu çalışmanın sonuçları, DH de Rhesus maymun konak idiyopatik dermatit semptomları ile geliştirebilir göstermektedir.

Nadir bir Case IgA ve Doku Transglutaminaz 2 Antikorlar Epidermal Transglutaminaz tanınması Rhesus Dermatit

Bu videoda, fare dalağında in situ interferon-gama (IFN-γ) sekresyonunu görselleştirmek için bir görüntüleme yöntemi gösterilmektedir. Bakteriyel enfeksiyon ve T hücreleri ve doğal öldürücü hücreler içinde IFN-γ birikiminin indüklenmesini takiben, dalak fareden alınır. Doku kesitleri elde edildikten sonra, hücrelerin içindeki IFN-γ'yi görselleştirmek için immün boyama yapılır.

Murin Lenfoid Organlarında İnterferon-Gama Sekresyonunun Tanımlanması için Test

Burada, farklı fare dokuları içindeki IL-22 üreten hücreleri görselleştirmek için bir transgenik raportör fare modelini açıklıyoruz. Bu yöntem, faredeki diğer sitokinlerin veya salgı proteinlerinin yerini izlemek için kullanılabilir.

Raportör fareler kullanılarak IL-22 eksprese eden lenfositlerin Görselleştirme

Bu yazıda, biz T-bağımlı ve T-bağımsız immünglobulin (Ig) izotip yanıt ELISA kullanarak farelerde karakterize için bir protokol tanımlamak. Bu yöntem tek başına veya kullanılabilir akış ile birlikte sitometresi araştırmacılar T-bağımlı ve bağımsız T antijen bağışıklama takip farelerde B hücre-aracılı Ig izotip yanıtlarında farkları belirlemek için izin verir.

Timus bağlı ve timus bağımsız immünglobulin izotip yanıt Immunosorbent Assay enzim bağlı kullanarak farelerde karakterizasyonu

Bu çalışmada, biz bir roman ve lenfositlerin izolasyonu için etkili iletişim kuralı Peyer's yamalar (PPs), daha sonra in vivo ve in vitro fonksiyonel deneyleri için hem de akış sitometrik çalışmalar foliküler t kullanılabilir sunmak yardımcı ve germinal Merkez B hücreleri.

Humoral bağışıklık çözülen anahtar oyuncular: gelişmiş ve lenfosit yalıtım antikorundan Peyer's yamalar iletişim kuralından en iyi duruma getirilmiş

Burada, duvar ikincil lenfoid organlarda sitokin Interferon gama salgılama hücrelerin içinde situ lokalizasyonu görselleştirmek için basit bir Konfokal görüntüleme yöntemi açıklanmaktadır. Bu protokol, farklı dokularda diğer sitokinlerin görselleştirilmesi için uzatılabilir.

Listeria monocytogenes enfeksiyonu sonrasında Mouse dalağında In situ Interferon gama üretiminin görüntülenmesi

Biz GFP etiketli γδ IELS görselleştirmek için bir yöntem açıklamak, ters dönen disk konfoksel mikroskobu tarafından murine ince bağırsak intravital görüntüleme kullanarak. Bu teknik, 4 h 'ye kadar mukoza içindeki canlı hücrelerin takibini sağlar ve çeşitli bağırsak immün-epitelyal etkileşimleri araştırmak için kullanılabilir.

Murine Ince bağırsak INTRAEPİTELYAL lenfosit intravital görüntüleme

Bu makalede, influenza virüs enfeksiyonunun fare modelinde Tfh ve GC B yanıtını değerlendirme protokolleri açıklanmaktadır.

Farelerde grip A Virüs Enfeksiyonu Sırasında T Foliküler Yardımcı Hücrelerin ve Germinal Merkez Yanıtının Değerlendirilmesi

Tip 2 inflamasyonda rol oynayan Grup 2 doğuştan gelen lenfoid hücreler (ILC2'ler), esas olarak helmint enfeksiyonuna, alerjik hastalıklara, metabolik homeostaza ve doku onarımına yanıt olarak katılır. Bu çalışmada, ILC2'leri murin burun mukozasından izole etmek ve CD226 ekspresyonunu saptamak için bir prosedür gösterilmiştir.

CD226 Ekspresyonunu Saptamak için Grup 2 Doğuştan Gelen Lenfoid Hücrelerin Fare Burun Mukozasından İzolasyonu

Keşfedin fare B hücrelerinde IgE üreten hücreleri tespit etme yöntemini. Tripsin tedavisi ve akış sitometrisi kullanarak yüzey bağlı IgE'yi ayıklayıp gerçek IgE üreten hücreleri doğru şekilde analiz edin.

Doğru Algılama Fare B Lineage Hücreleri IgE-ifade

Daha fazla video keşfet