Fotoçevrim sonra Floresans Bozunma kullanarak Oturma balığı Embriyolar protein stabilitesi ölçümü (FDAP)

Aşağıdaki deneyin genel amacı, canlı zebra balığı embriyolarında hücre içi ve hücre dışı protein stabilitesini ölçmektir. Bu, ilgilenilen bir proteinin foto dönüştürülebilir bir floresan proteini ile etiketlenmesi ve mRNA'nın enjekte edilmesi, füzyonun yanı sıra bir floresan boyanın zebra balığı embriyolarına kodlanmasıyla elde edilir. Daha sonra, foto dönüştürülebilir füzyon proteini, proteini etiketleyen nabız ile foto dönüştürülür.

Bu örnekte, füzyon proteini salgılanır, daha sonra hücre içi ve hücre dışı foto dönüştürülmüş floresan yoğunluğundaki bozunma zaman içinde izlenir ve füzyon proteininin hücre içi ve hücre dışı yarı ömürlerini belirlemek için katlanarak azalan bir fonksiyonla donatılır. Sonuçlar, zaman içinde floresan sinyalindeki bozulmaya bağlı olarak foto dönüştürülebilir füzyon proteinlerinin in vivo stabilitesini göstermektedir. Bu yöntem, hücre ve gelişim biyolojisi alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Örneğin, stabilitenin protein dağılımını ve kullanılabilirliğini nasıl etkilediği. FD DP verilerinin analizi için EP yazılımımızı kullanıyoruz. EP, web sayfamızda ücretsiz olarak mevcuttur: İlgilenilen yeşilden kırmızıya dönüştürülebilir bir füzyon proteinini kodlamada kapaklı mRNA oluşturduktan sonra, yaklaşık 31 hücre evresindeki zebra balığı embriyosunu yaklaşık sekiz mililitre embriyo ortamı içeren beş santimetre çapında bir cam veya agar gülü kaplı plastik Petri kabına aktarın.

Tabağa iki mililitre önceden hazırlanmış ve çözülmüş pro nay stok çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında beş ila 10 dakika inkübe edin. Bir cam hoparlörü embriyo ortamı ile doldurun ve embriyoları havaya veya plastiğe maruz bırakmaktan kaçınırken, Petri kabını ortama daldırırken eğerek embriyoları behere aktarın. Embriyolar beherin dibine yerleştikten sonra, ortamın çoğunu dökün ve dikkatlice değiştirmek için taze ortam kullanın.

Taze ortamın hafif dönmesi, embriyoların zayıflamış koronlarını kaybetmesine neden olacaktır. Yıkamayı tekrarladıktan sonra, kaplanmış embriyoları agaroz kaplı bir enjeksiyon kabına aktarmak için alevli uçlu bir cam PE pipeti kullanın. Daha sonra, mRNA ve boyanın eşit dağılımını sağlamak için mRNA'yı ve üç kilodaltonluk Alexa 4 88 DExT Strand konjugatını doğrudan hücrenin merkezine enjekte edin.

Bölünme başladıktan sonra, enjekte edilen embriyoları, embriyo, orta ile doldurulmuş altı kuyulu plastik bir tabağın% bir ila 2'lik agaroz kaplı bir kuyucuğuna aktarın ve embriyolar stereo mikroskopla geç küre aşamasına ulaşana kadar karanlıkta 28 santigrat derecede inkübe edin, bir ila beş sağlıklı embriyoyu tanımlayın ve bunları tabaktan çıkarmak için alevli uçlu bir cam PE pipeti kullanın. Embriyoları, bir x danios embriyo ortamında yaklaşık bir mililitre erimiş% 1 düşük erime noktalı aros içeren bir mikro santrifüj tüpüne yavaşça çıkarın. Daha sonra, embriyoları bir miktar aros ile birlikte pipete geri çekin.

Ardından aroları ve embriyoları yavaşça kapağın üzerine çıkarın. Bir cam alt tabağın bardağı. Cam pipeti yeniden kullanmak için, embriyo ortamını hızlı bir şekilde yukarı ve aşağı pipetleyerek ve aros katılaşmadan önce hızlı bir şekilde çalışarak tıkanmayı önlemek için kalan aroları temizleyin.

Embriyoları, hayvan direği stereo mikroskop altında kapak camına bakacak şekilde konumlandırmak için metal bir prob kullanın. Embriyoların pozisyonlarını izleyin ve agarro sertleşene kadar gerektiği gibi yeniden ayarlayın. Agarro katılaştığında, cam alt tabağı doldurmak için bir x danios embriyo ortamı kullanın.

Foto dönüştürmeye hazırlanmak için, inkübatörü 28 santigrat dereceye ayarlayın ve sahne farklı embriyo pozisyonlarına hareket ederken objektif ile kapak camı arasındaki yağ filminin kırılmamasını sağlamak için objektifin üzerine büyük bir damla daldırma yağı koyun. Güvenli bir şekilde görüntüleme sırasında, sahne hareket ettiğinde çanak kaymaması için cam alt çanağı sahneye yerleştirin. Konfokal mikroskobun yazılım paketinde daha sonra, her embriyonun konumunu tanımlayın.

Her embriyo için Z derinliğini ayarlayın ve hem 4 88 hem de 5 43 nanometre lazerleri kullanarak her embriyoda kabaca aynı düzlemi hedeflemeye çalışın. Fotoğraf öncesi dönüştürme görüntüleri elde edin. Ardından, konfokal mikroskop yazılımını, önceden tanımlanmış konumların her birini uygun görüntüleme koşullarıyla görüntüleyecek şekilde yapılandırın.

Her 10 veya 20 dakikada bir veya beş saatlik bir zaman kursunda füzyon proteini anahtarını 10 x objektife dönüştürün ve embriyo gruplarını iki dakika boyunca% 100 çıktıda yaklaşık 300 ila 400 nanometre filtreli cıva lambasından gelen UV ışığına maruz bırakın. Fotoğraf dönüştürmeden sonra tek tip fotoğraf dönüştürmeyi teşvik etmek için odağı Z ekseni boyunca kaydırın. Hemen 25 x veya 40 x hedefine geri dönün ve önceden tanımlanmış konumların hala doğru olduğunu onaylayın.

Foto dönüştürme sırasında çanak değiştiyse, embriyoların konumlarını yeniden tanımlayın. Görüntüleme zaman seyrini başlatın ve beş saat boyunca çalışmasına izin verin. Her embriyo için fotoğraf dönüşümü ile görüntülemenin başlaması arasında geçen süreye dikkat edin.

Ara sıra deneyi kontrol edin ve Danielle'in ortamının seviyesini izleyin, gerekirse daha fazlasını ekleyin. Her embriyodan zaman kursu veri setlerini görsel olarak inceleyerek başlayın. Görüntüleme sırasında ölen, önemli ölçüde değişen, çok düşük foto dönüştürülmüş sinyal seviyelerine sahip olan veya olağandışı görünen ve hareket etmeyi ve bölünmeyi durduran hücre bölgelerini içeren embriyolardan veri kümelerini atın.

Python tabanlı yazılım paketini kullanan PI F DAP, kesinlikle hücre içi olan Alexa 4 88 sinyalini kullanarak bir maske oluşturur. Hücre içi ve hücre dışı foto dönüştürülmüş sinyali ayırmak için, hücre içi piksellerin dikkate alınmasını önlemek için maskeyi ilgili kırmızı kanal görüntüsüne uygulayın. Ortalama hücre içi yoğunluğu ölçmek için ortalama hücre dışı yoğunluğu hesaplarken, maskeyi ters çevirin, oluşturulan maskelenmiş görüntüleri görüntüleyin ve bunları görsel olarak inceleyin ve maskelerin hücre içi boşluktan doğru bir şekilde ayırt etmediği veri kümelerini atın.

Her görüntü için ortalama hücre dışı ve hücre içi floresan yoğunluklarını hesaplamak için PI F DAP'ı kullanın. Daha sonra floresan verilerini burada gösterildiği gibi metin protokolündeki yönergelere göre yerleştirin ve hücre dışı ve hücre içi proteini hesaplayın. Yarısı, temizleme oranından tau yaşar.

Constance K şaşı, zebra balığı embriyogenezi sırasında mis endodermal genlerin ekspresyonunu indükleyen salgılanan bir proteindir. Bu deneyde, embriyolara Alexa 4 88 dekstran ve mRNA kodlayan şaşı DENDRA two ile birlikte enjekte edildi ve F DAP testine tabi tutuldu. Burada gösterildiği gibi, hücre dışı fotoğrafa dönüştürülen sinyal yoğunluğu zamanla azalır.

PI F dap kullanılarak, 23 embriyodan hücre dışı yoğunluk profilleri oluşturuldu ve veriler birinci dereceden bir temizleme modeli ile donatıldı. Sonuçlar, 116 dakikalık ortalama bir yarı ömür tau'sunu göstermektedir. Benzer yoğunluk profilleri ve protein.

Görüntüleme arasındaki aralıklar 10 veya 20 dakika olduğunda yarılanma ömürleri elde edildi. Fotoğraf ağartmanın veya yanlışlıkla fotoğraf dönüştürmenin yoğunluk değişikliklerine önemli ölçüde katkıda bulunmadığını öne sürüyor. Bu videoyu izledikten sonra, fotoğraf dönüştürme işleminden sonra floresan bozunmasının nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.

İn vivo ölçmek için. Canlı zebra balığı embriyolarında foto dönüştürülebilir füzyon proteinlerinin yarı ömürleri.