Name: TIRFM ve pH-duyarlı GFP-sondalar SH-SY5Y Nöroblastom Hücrelerinde nörotransmitter Vesikül Dynamics değerlendirin: Hücre Görüntüleme ve Veri Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: Öğrenin, TIRFM ve pH-duyarlı GFP-sondalar kullanarak SH-SY5Y nöroblastom hücrelerinde nörotransmitter vezikül dinamiklerini nasıl değerlendireceğinizi. Bu yöntem, sinaptik iletim mekanizmalarını anlamak için güçlü bir çerçeve sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Eliana Di Cairano (Post-doktora bursu) ve Stefania Moretti (doktora bursu) destek için Universita degli Studi di Milano kabul etmek istiyorum. Bu çalışma CP Üniversitesi Araştırma Programı PUR tarafından desteklenen PHluorin inşa Dr. Dotti Francesco veri analizi konusunda yardım almak için, ve teknik yardım için Silvia Marsicano için biz, Prof. Jeremy M. Henley, Biyokimya Okulu, Bristol, Birleşik Krallık Üniversitesi teşekkür etmek istiyorum.

1. Hücre Kültürü ve transfeksiyonu <ol><li> SH-SY5Y hücre kültürü Not: denemeleri, insan nöroblastom SH- SY5Y (ATCC # CRL-2266) 15 kullanılarak yapılmıştır. SH-SY5Y hücreleri değişken kümeleri ve diğer yapışıcı hücreler bir karışımı olarak büyür. Sıkıca TIRFM için çok önemlidir cam kapak, bağlı büyümeye hücreleri için protokol (hücre yoğunluğu, yarma oranı, vb.) Rapor talimatları izleyin. <ol><li> Başlamadan önce, laminer akış biyo-güvenlik kabini altında, steril fosfat tamponlu salin çözeltisi (PBS) ve kültür ortamının elverişli hacmi oluşturmak. <ol><li> 150 mM NaCI, 24 mM fosfat tampon maddesi, pH 7.4 konsantrasyonları ile PBS, 50 ml olun. Çözüm Filtre. </li><li> Yüksek glukoz,% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu (FBS), penisilin (100 U / ml), streptomisin (100 ug / ml), L-glutamin (Dulbecco&#39;nun modifiye edilmiş Eagle ortamında (DMEM) hücre ortamı 50 ml yapmak 2 mM) vesodyum piruvat (1 mM). Çözüm Filtre. </li></ol></li><li> Tam büyüme ortamı çıkarın ve 3 ml PBS ile hücrelerin yıkayın. </li><li> 37 ° C&#39;de 5 dakika boyunca (6 cm Petri için)% 0.05 tripsin etilendiamintetraasetik asit, 2 ml (EDTA) ile inkübe hücreleri,% 5 CO2 ve pipet kullanarak hücreleri ayırmak. </li><li> DMEM 2 ml ilave etmek suretiyle deaktive tripsin ve 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile hücreler toplanır. </li><li> Tek bir hücre süspansiyonu içine hücreleri dağıtmak için aşağı yeterince Süpernatantı pelet DMEM 1 ml ekleyin ve çözüm yukarı pipet ve. </li><li> Tam orta 3 ml içeren yeni 6 cm çapında Petri kabındaki 4: Onlara 1 Böl. % 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C&#39;de, 6 cm çapında Petri tabaklarında kültür içinde hücreleri koruyun. Haftada bir kez alt-kültür ya da 80 kapalı ne zaman - yüzey alanının% 90. </li></ol></li><li> Görüntüleme için SH-SY5Y hücre kaplama <ol><li> TIRFM deneyleri için, levhaCam kapakların üzerine hücreler. İstihdam cam 0.17 ± 0.005 mm kalınlığında ve 1,5255 ± 0.00015 kırılma indeksi ile kapsar. Başlamadan önce, aşağıdaki gibi cam lamelleri hazırlamak: <ol><li> Temiz cam% 90 etanol, O / N kapsar. </li><li> Damıtılmış su (damıtılmış su üç değişiklik) içinde iyice yıkayın. Kuru cam bir kurutma fırınında kapsar. </li><li> Talep cam Petri kapları içinde kapsamaktadır ve 3 saat boyunca 200 ° C&#39;de önceden ısıtılmış bir fırın içinde sterilize edilir. </li></ol></li><li> Transfeksiyondan bir önceki gün, 3.5 cm Petri için, her lamel kültür ortamının 1 ml ilave edilir ve bir% 5 CO2 inkübatörde 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 1.1.5, komple ortam içinde 1 ml hücre pelletini askıya ve sayısı - adımda 1.1.3 tarif edildiği gibi hücreler tripsinize. De / 3 x 10 5 hücre elde etmek için her bir Petri kabına ekleyin hücre süspansiyonu doğru hacim hesaplanır. Bu yoğunluk optimum hücre büyümesi ve etkili transfeksiyon için gereklidir. 37 ° C&#39;de inkübe edin% 5 CO2 inkübatöründe O / N. </li></ol></li><li> Polietilenimin SH-SY5Ytransfection (PEI) Not: sinaptik kesecikler dinamikleri görselleştirmek için, synapto-pHluorin içeren pCB6 vektörü kullanılmıştır. synapto-pHluorin yeşil floresan proteini (GFP), 16 ve yapı da, yaygın olarak nöronlar 9 içinde sinaptik vezikül özelliklerinin incelenmesi için kullanılmıştır edilmiştir 2. sinaptobrevin veziküler membran proteini, bir pH&#39;a duyarlı varyantın çerçeve füzyonu ile oluşturuldu. <ol><li> Transfeksiyon başlamadan önce, aşağıdaki çözümlerden 10 ml yapmak. 1 ay gibi maksimal olarak çözüm tutun. <ol><li> 150 mM NaCI çözeltisi olun. 0.01 N HCI ile pH 5.5&#39;e ayarlayın. </li><li> 150 mM NaCI çözeltisi içinde% 10 polietilenimin (25 kDa lineer PEI) bir PEI solüsyonu yapın. Çözeltinin pH değeri 8.8&#39;e yükselir. 0.01 N HCI ile 7.8&#39;e pH ayarlayın. </li></ol></li><li> Sonra kaplama 24 saat, orta kaldırmak ve 1.5 ml yenilemetam bir ortam. % 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C&#39;de hücreler tutun. </li><li> Laminer akış biyo-güvenlik kabini altında, 1.5 ml mikrofüj tüpü içinde, 150 mM NaCI çözeltisi 25 ul ve 3.5 cm&#39;lik bir Petri tabağı başına PEI solüsyonu 100 ul plasmid DNA 3 mikrogram ekleyin. </li><li> Vorteks 10 sn için, daha sonra oda sıcaklığında 30 dakika boyunca DNA / PEI karışımı inkübe edilir. </li><li> Dikkatle hücreleri ile lamelleri içeren Petri kabı DNA / PEI karışımı ekleyin ve hafifçe eşit Petri kabındaki reaktif dağıtmak için sallayın. </li><li> 4 saat sonra ortam değiştirme ve bir% 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C&#39;de hücreler O / N inkübe edin. Transfeksiyondan sonra 48 saat - görüntüleme deneyleri 24 gerçekleştirin. </li></ol></li></ol> Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskopi 2. Hücre Görüntüleme (TIRFM) <ol><li> Görüntüleme set-up <ol><li> Şekil 1&#39;de açıklanan set-up ile TIRF görüntüleme gerçekleştirin. Bu ters bir motorlu içermektedirmikroskop (Şekil 1, ek A), lazer kaynağı (Şekil 1, ek B) ve TIRF-kaymak (Şekil 1, ek C). Bir yüksek sayısal açıklık (NA 1.45 Alpha Planı-Fluar) 100X yağı, daldırma hedefi ile TIRFM aydınlatma ulaşır. </li><li> TIRFM aydınlatma için, bir çok çizgi (458/488/514 nm) 100 mW argon-iyon lazeri kullanır. Bir tek modlu optik fiber kullanılarak, TIRF kaydırıcı yoluyla, ışın yoluna doğrusal polarize ışığı lazer tanıtmak. Yansıyan ışık huzmesi yolunun aydınlık alan diyafram düzlemine TIRF sürgüsünü yerleştirin. <ol><li> Geniş alan aydınlatma için, geleneksel cıva kısa ark lambası HBO beyaz ışığa mikroskop bağlayabilirsiniz. Sürgünün bir kutuplaşma-muhafaza, çift prizma TIRF aydınlatma ve beyaz ışığın eşzamanlı kombinasyonunu sağlar. </li></ol></li><li> Bir uyarım filtre (genişlik 488/10 nm) lazer ışığı filtre lazer yoluna yerleştirilen bir filtre tekerleği üzerine monte edilmiştir. Kullanmakyüksek hız, program kontrollü, kapak, lazer aydınlatma hızlı şekilde kontrol etmek için. PHluorin analizi için, bir grup 525/50 nm emisyon filtresi geçmek monte. Görüntü ProPlus yazılımı ile soğutulmuş Hızlı CCD kamera dijital fotoğraf (512 x 512 piksel) yakalayın. </li></ol></li><li> TIRF aydınlatma sağlanması (Şekil 2) <ol><li> Lazerler, bilgisayar, kamera, filtre tekerleği, ve deklanşör kontrolörleri açın; Daha sonra, lazerler ısınmak ve stabilize etmek gerekiyor gibi deney başlamadan önce 20 dakika bekleyin. </li><li> Görüntüleme önce, aşağıdaki çözümlerden elverişli hacmi oluşturmak. <ol><li> 1.2 mM KH 2 PO 4, 25 mM 4- (2-Hidroksietil) piperazin-1-etansülfonik asit (HEPES) (tamponlanmış 125 mM NaCI, 5 mM KCI, 1.2 mM MgSO4, Krebs (KRH) çözeltisi 50 ml yapmak pH 7.4), 2 mM CaCl2 ve 6 mM glükoz. </li><li> 80 mM NaCI, 50 mM KCI, 1.2 mM MgSO4, 1.2 mM KH 2 PO 4&#39;te KCI-KRH çözeltisi (pH 7.4), 10 ml yapmak25 mM HEPES, 2 mM CaCl2 ve 6 mM glukoz (pH 7.4&#39;e tamponlanmış). </li></ol></li><li> Transfekte hücreler cam kapağını çıkarın ve uygun görüntüleme odasının takın. Odasına monte ve cam merkezinde KRH çözeltisi 500 ul ekleyin. </li><li> Amaç üzerinde yağ ekleyin. Mikroskop sahnede görüntüleme odasına yerleştirin ve cam lamel altında hedefi yerleştirin. Numune üzerinde güvenli kapağı yerleştirin. </li><li> Epifloresans modunda, lamel (üst yüzey) üzerinde durulacak ve oda merkezinde yer transfekte hücreleri seçin. Olan flüoresan sinyal açıkça 80 msn altında bir pozlama süresi ile kaydedilebilir hücreleri seçin. </li><li> Yazılım kontrolü altında, canlı modda TIRF aydınlatma geçiş. </li><li> TIRF yapılandırmasını ayarlamak için, numune kapağı (Şekil 2B) hakkında, objektif dışarı çıkar ışınının konumunu kontrol edin. Kiriş t merkezinde konumlandırılmış zamanO objektif lens (sol Şekil 2A), bir nokta (sol, Şekil 2B) TIRF örnek kapağının ortasında görünür ve hücre Epifloresans modunda görüntülü (birkaç odak düzlemleri, yüksek eşiğe Şekil 2C, sol) . </li><li> Kritik açı ulaşmak için, Y yönünde odaklı noktaya taşımak (ileri veya geri Şekil 2B, merkezi) TIRF kaymak (Şekil 1C) üzerindeki açı ayar vidası kullanarak. Kiriş (sağ Şekil 2A) kritik açıdan daha büyük bir açıyla örnek uçakta yakınsar zaman, nokta kaybolur ve düz, ince, odaklı çizgi (sağ Şekil 2B) örnek kapak ortasında açıktır. </li><li> Ince ayar yapmak için TIRF açısı hücre örneği (Şekil 2C) kullanın. Bu aşamada, bir Epifloresans-benzeri görüntü hala görülebilir, video floresan görüntü izleyin. Yavaşça, TIRF con kadar vidayı hareketkoşul elde edilir: hücrenin, sadece tek bir optik odak düzlemi (yani, kapak astar ile temas halinde, plazma zarı), bu (sağ, Şekil 2C), yüksek kontrastlı bir düz görüntü ile sonuçlanan bulunmaktadır. </li></ol></li><li> Örnek görüntüleme <ol><li> Tek kanallı time-lapse deney ayarlayın. Photobleaching en aza indirmek için, düşük pozlama süresi ve yüksek kazanç kullanarak görüntüyü yakalamak. 80 msn - Uygun pozlama süreleri 40 arasındadır. 2 Hz örnekleme frekansında - 1 görüntüleri edinin. Vesikül kinetik yüksek frekansta (10 Hz) daha iyi takdir örnekleme olabilir. gözlem düzenli süresi genellikle 2 dakika olduğunu. </li><li> TIRFM modunda KRH çözümü ve kayıt hücrelerinin 500 ul ekleyin. Bu dinlenme durumdur. Zaman sıralı görüntüleri kaydedin. </li><li> Dinlenme aynı koşullar (lazer gücü, zaman pozlama, çerçeve sayısı) altında aynı hücrede ve kayıt odaklanın. Beş kare sonra, KCl-KRH çözeltisi 500 ul ekleyin ve odasında KCI tutun.Bu uyarılmış bir durumdur; Zaman sıralı görüntüleri kaydetmek. </li></ol></li></ol> 3. Görüntü Analizi ve Veri İşleme NOT: görüntüleri analiz etmek, makro görüntü analiz yazılımı mevcut fonksiyonlarına göre, laboratuvarda geliştirilmiştir; benzer makro çevrimiçi (Malzeme ve Ekipmanları Tablo sağlanan URL) bulunmaktadır. <ol><li> Floresans yoğunluğu ölçümü <ol><li> Film boyunca, görüntünün ilgi (ROI) bir bölgede floresan yoğunluğu ölçümü için bir &quot;Dizi floresan yoğunluğu&quot; makro kullanın. </li><li> Zaman sıralı görüntüleri açın. Makro menüsüne gidin ve &#39;Sıra floresan yoğunluğu&#39; seçeneğini seçin. &#39;Analiz&#39; penceresinde &quot;yatırım getirisi seçin&quot; görünür. </li><li> Yatırım getirisi oluşturmak için menüden seçim araçlarından birini seçin. Noktalar (arka plan ROI) olmadan hücre zarının bölgelerde 3 ROI&#39;leri yerleştirin. Thi İstihdams &quot;arka plan ROI&quot; photobleaching değerlendirmek ve füzyon olay analizi (Şekil 3A) eşiğini ayarlamak için. </li></ol></li><li> Photobleaching düzeltme ve eşik tayini (Şekil 3B) <ol><li> Photobleaching değerlendirmek için, floresan yoğunluğu satırları &quot;arka plan ROI&quot;, (Şekil 3BA) açın. İlk yoğunluk değerine (F0) (F / F0) (Şekil 3BB) her çerçeve içinde floresan yoğunluğu değerleri Normale. Değerlerinin ortalamasını alın. </li><li> Ortalama verileri vurgulayın ve grafik menü seçeneklerini kullanarak bir çizgi grafiği oluşturmak. </li><li> Veri analizi menüsünden, arsa analizi iletişim kutusunu açmak için &quot;eğilim çizgisi&quot; seçeneğini seçin. Regresyon türünü seçin. Set &quot;üstel&quot; regresyon. Sonra &quot;grafik ekran denklemi&quot; seçeneğini seçin. Grafik penceresinde, üstel denklem görünür ve parametre değerleri otomatik, (Şekil 3BC atanır </strong&gt;). </li><li> Aşağıdaki gibi her çerçeve içinde yoğunluk değerlerine üstel düzeltme uygulayın: Fn (düzeltilmiş) Fn / exp = (-n * a) Fn = çerçeve n ölçülen deneysel floresan yoğunluğu; n = kare sayısı; nedeniyle photobleaching için yoğunluk kaybı oranını ifade eden = ağartma faktörü (sabit; &#160; Şekil 3BD). </li><li> Eşiğini ayarlamak için, bir normalize ve düzeltilmiş &quot;arka plan yatırım getirisi&quot; açmak ortalama floresan sinyali ve standart sapma (SD) hesaplayın. 3 SD artı ortalama değer eşiği (Şekil 3BE) temsil eder. Veri analizi için bu eşiği kullanın. </li></ol></li><li> Yarı otomatik bir prosedür kullanılarak füzyon etkinlikleri seçimi <ol><li> Görüntü analiz yazılımı ile zaman-ardışık görüntüleri açın. Aktif görüntü dizisine bir Gauss filtre uygulayın. </li><li> Seçim yapmanızı sağlar aracı &quot;nesneleri saymak&quot; veya makro kullanarak görüntüleri analizolan piksel bir tanımlanmış aralık içinde ortalama floresan yoğunluğu sahip bir nesne. Elle, eşik işlevini kullanarak aralığı yoğunluğunu ayarlayın (bar menüsüne gidin, set ölçü → eşik ilgi alanı vurgulamak için). Yeterli eşik yerel floresan arka plan sinyali üzerinde% 30. </li><li> Bir makro aşağıdaki kriterleri karşılayan tek nesneleri seçmek için &quot;nesneleri Filtreler&quot; Uygula: <ol><li> Yönü için aralıkları seçeneğini (min ve max dahil) uygulayın. Aspect ana eksene ve nesneye elips eşdeğer küçük ekseni arasındaki oranı bildirir. Aspect her zaman ≥1. Yeterli değerler dk = 1, max = 3 bulunmaktadır. </li><li> Çapı aralıkları uygulayın. Çapı iki derecelik aralıklarla iki anahat noktaları birleştirme ve nesnenin sentroidinden geçerek ölçülen çap ortalama uzunluğu bildirir. Piksel aralığı ayarlayın (veya mikron, bir kalibre sistemi kullanıyorsanız). </li><li> Başlangıçtaki optimal aralık tanımlali deneyler: manuel ilgi noktalar seçin ve ardından arsa profil işlevini kullanarak kendi çapını ölçün. </li></ol></li><li> &quot;Görüntüleme nesnelerini&quot; seçiniz: Seçilen nesneleri TIRFM görüntü (Şekil 4B) üst üste görünür. </li><li> Analizinde yalnızca kısa (1-3 kare) göstermek noktalar hemen sinyali (geçici noktalar) belirgin bir kayıp tarafından takip floresan yoğunluğunda geçici artış, ekleyin. Seçilen vezikül / noktalar (deneysel ROI) etrafında yaklaşık bir-nokta çapı radyal bir yatırım getirisi oluşturmak için dairesel bir seçim İstihdam. Bu adımı el gerçekleştirin. </li><li> ROI&#39;ları seçili, film boyunca her ROI ortalama floresan yoğunluğu hesaplayın. </li></ol></li><li> Veri analizi (Şekil 3C-D) <ol><li> Bir e-tabloya her &quot;deneysel ROI&quot; ölçülen floresan değişikliklerin zaman seyrini İhracat; (Şekil 3DA). İlk floresan yoğunluğu (F / F0), (Şekil 3dB) her çerçeve içinde yoğunluk değerini Normale. </li><li> Adım 3.2.4 (Şekil 3Dc) bildirildiği gibi, her karede yoğunluk değerlerine üstel düzeltme uygulayın. </li><li> Füzyon toplam olay sayısı (pik sayısı), her füzyon meydana zamanı (tepe genişliği) ve floresan tepe (pik yüksekliği ve AUC) genlik hesaplamak için elektronik tablo veya matematik paketleri kullanarak mantıksal fonksiyonlar uygulanır. Mantıksal formüller kullanılarak füzyon olayı analizinin bir örneği Şekil 3DD ve 3DE bildirilmiştir. </li><li> Plazma zarı vezikül füzyon olarak eşiğini (3SD ± ortalama arka plan floresan yoğunluğu) aşan floresan yoğunluğu artışı ve bir füzyon olayı olarak ortaya çıkan zirve varsayalım. </li><li> Son ve her tepe ilk x değeri arasındaki fark olarak pik genişliği hesaplayın. 1 / (örnekleme frekansı) için bu değer çarpın. Bu değer a düşününvezikül yeniden asitlenme ve geri dönüşüm (Şekil 3DD) önce plazma membran vezikül füzyon ve yapışma zamanı. </li><li> Eşiğin üzerinde değerler toplamı olarak bütün hücre AUC hesaplayın. Nedeniyle spontan (dinlenme) kayıt süresince net floresan değişikliği veya uyarılmış (uyarılmış) sinaptik aktivite olarak bu değeri düşünün. </li><li> Her tepe ve eşik maksimum y değeri arasındaki fark olarak pik yüksekliği hesaplayın. Füzyon türü (genel ort tek eşzamanlı / sıralı füzyon veya geçici vs tam füzyon) bu değeri olarak gösterge düşünün. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+synaptic+vesicle+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The synaptic vesicle cycle.</a> Annu. Rev. Neurosci. 27, 509-547 (1146).</li>
<li>Denk, W., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photon+upmanship%3A+why+multiphoton+imaging+is+more+than+a+gimmick%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick.</a> Neuron. 18 (3), 351-357 (1997).</li>
<li>Helmchen, F., Svoboda, K., Denk, W., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dendritic+calcium+dynamics+in+deep-layer+cortical+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo dendritic calcium dynamics in deep-layer cortical pyramidal neurons.</a> Nat Neurosci. 2 (11), 989-996 (1999).</li>
<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">The green fluorescent protein.</a> Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).</li>
<li>Matz, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+proteins+from+non+bioluminescent+Anthozoa+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent proteins from non bioluminescent Anthozoa species.</a> Nat Biotechnol. 17 (10), 969-9673 (1999).</li>
<li>Ribchester, R. R., Mao, F., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+measurements+of+activity-dependent+membrane+recycling+in+motor+nerve+terminals+of+mammalian+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Optical measurements of activity-dependent membrane recycling in motor nerve terminals of mammalian skeletal muscle.</a> Proc Biol Sci. 255 (1342), 61-66 (1994).</li>
<li>Polo-Parada, L., Bose, C. M., Landmesser, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+transmission%2C+vesicle+dynamics%2C+and+transmitter+release+machinery+at+NCAM-deficient+neuromuscular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Alterations in transmission, vesicle dynamics, and transmitter release machinery at NCAM-deficient neuromuscular junctions.</a> Neuron. 32 (5), 815-828 (2001).</li>
<li>Gaffield, M. A., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+synaptic+vesicle+exocytosis+and+endocytosis+with+FM+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging synaptic vesicle exocytosis and endocytosis with FM dyes.</a> Nat Protoc. 1 (6), 2916-2921 (2006).</li>
<li>Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Methods Cell. Biol. 89, 169-221 (2008).</li>
<li>Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Use+of+pHluorins+for+Optical+Measurements+of+Presynaptic+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">The Use of pHluorins for Optical Measurements of Presynaptic Activity.</a> Biophys. J. 79, 2199-2208 (2000).</li>
<li>Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+for+the+cell+biologist%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist.</a> J. Cell Sci. 123, 3621-3628 (2010).</li>
<li>Wyatt, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balice-Gordon+R.J.+Heterogeneity+in+Synaptic+Vesicle+Release+at+Neuromuscular+Synapses+of+Mice+Expressing+SynaptopHluorin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Balice-Gordon R.J. Heterogeneity in Synaptic Vesicle Release at Neuromuscular Synapses of Mice Expressing SynaptopHluorin.</a> J. Neurosci. 28 (1), 325-335 (2008).</li>
<li>Tsuboi, T., Rutter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+forms+of+%22kiss-and-run%22+exocytosis+revealed+by+evanescent+wave+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiple forms of "kiss-and-run" exocytosis revealed by evanescent wave microscopy.</a> Curr Biol. 13, 563-567 (2003).</li>
<li>Miloso, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+Acid-Induced+Neuritogenesis+of+Human+Neuroblastoma+SH-SY5Y+Cells+Is+ERK+Independent+and+PKC+Dependent%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Retinoic Acid-Induced Neuritogenesis of Human Neuroblastoma SH-SY5Y Cells Is ERK Independent and PKC Dependent.</a> J. Neurosci. Res. 75, 241-252 (2004).</li>
<li>Jaskolski, F., Mayo-Martin, B., Jane, D., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamin-dependent+Membrane+Drift+Recruits+AMPA+Receptors+to+Dendritic+Spines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Dynamin-dependent Membrane Drift Recruits AMPA Receptors to Dendritic Spines.</a> J Biol Chem. 284 (18), 12491-12503 (2009).</li>
<li>Treccani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+and+corticosterone+rapidly+increase+the+readily+releasable+pool+of+glutamate+vesicles+in+synaptic+terminals+of+prefrontal+and+frontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Stress and corticosterone rapidly increase the readily releasable pool of glutamate vesicles in synaptic terminals of prefrontal and frontal cortex.</a> Mol Psychiatry. 19 (4), 433-443 (1038).</li>
<li>D'Amico, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+surface+density+of+the+glutamate+transporter+EAAC1+is+controlled+by+interactions+with+PDZK1+and+AP2+adaptor+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">The surface density of the glutamate transporter EAAC1 is controlled by interactions with PDZK1 and AP2 adaptor complexes.</a> Traffic. 11 (11), 1455-1470 (2010).</li>
<li>Perego, C., Di Cairano, E. S., Ballabio, M., Magnaghi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurosteroid+allopregnanolone+regulates+EAAC1-mediated+glutamate+uptake+and+triggers+actin+changes+in+Schwann+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Neurosteroid allopregnanolone regulates EAAC1-mediated glutamate uptake and triggers actin changes in Schwann cells.</a> J Cell Physiol. 227 (4), 1740-1751 (2012).</li>
<li>Bergeron, A., Pucci, L., Bezzi, P., Regazzi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+synaptic-like+microvesicles+exocytosis+of+B-cells+using+a+live+imaging+technique%5BTitle%5D)+AND+%22PlosOne%22%5BJournal%5D)">Analysis of synaptic-like microvesicles exocytosis of B-cells using a live imaging technique.</a> PlosOne. 9, e87758(2014).</li>
<li>Encinas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+treatment+of+SH-Sy5Y+cells+with+retinoic+acid+and+brain-derived+neurotrophic+factor+gives+rise+to+fully+differentiated%2C+neutrophic+factor-dependent%2C+human+neuron-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Sequential treatment of SH-Sy5Y cells with retinoic acid and brain-derived neurotrophic factor gives rise to fully differentiated, neutrophic factor-dependent, human neuron-like cells.</a> J. Neurochem. 75 (3), 991-1003 (2000).</li>
<li>Kume, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dibutyryl+cyclic+AMP+induces+differentiation+of+human+neuroblastoma+SH-SY5Y+cells+into+a+noradrenergic+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Dibutyryl cyclic AMP induces differentiation of human neuroblastoma SH-SY5Y cells into a noradrenergic phenotype.</a> Neurosci Lett. 443 (3), 199-203 (2008).</li>
<li>Diaspro, A., Chirico, G., Usai, C., Ramoino, P., Dobrucki, J. Photobleaching. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDiaspro%2C+A+%22Handbook+of+Biological+Confocal+Microscopy%22">Handbook of Biological Confocal Microscopy</a>. Pawley, J. B. , Springer-Verlag New York, Inc.. New York. 690-699 (2006).</li>
<li>Rossano, A. J., Chouhan, A. K., Macleod, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+pH-indicators+reveal+activity-dependent+cytosolic+acidification+of+Drosophila+motor+nerve+termini+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded pH-indicators reveal activity-dependent cytosolic acidification of Drosophila motor nerve termini in vivo.</a> J Physiol. 591 (7), 1691-1706 (2013).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Bu kağıt görüntüye bir protokol sunar ve floresan cDNA-kodlanmış vektörler ve TIRFM kullanarak, salgılayan hücrelerde veziküller dinamiklerini analiz. TIRFM başarılı görüntüleme anahtar unsurları vezikül serbest bırakılması ve geri dönüşüm genetik olarak kodlanmış optik göstergelerle hücresel modeli ve hücre transfeksiyon seçim vardır. TIRFM ideal bir cam kapak yapışık büyüyen ve membran ve füzyon etkinlikleri sabit görüntülenmesine olanak vermek üzere yeteri kadar düz hücreler için uygundur...

Nöronlar arasındaki sinaptik iletim Kimyasal sinir sisteminde iletişimin önemli bir mekanizmadır. Bu presinaptik yerinde vezikül füzyon ve alma dinamik bir döngüsü boyunca nörotransmitterlerin salınımı üzerine dayanır. Vezikül dinamikleri katılan proteinlerin çoğu tespit edilmiştir; Ancak, fenomen kendi özel katkısı 1 netleştirilmelidir. Bizim anlayış kısmen egzo / endositoz için en yaygın kullanılan testler her zaman en uygun olmadığı gerçeği ile sınırlıdır. Çeşitli vezikül füzyon ile ilgili çalışmalar ve dinamikleri elektrofizyolojik teknikler güveniyor. Bu teknik, optimum zamansal çözünürlük sağlar ve plazma membran veziküller ilk füzyon araştırmak için mükemmel ama presinaptik işlevini destekleyen yatan moleküler olayların birçok algılayamıyor. Elektron mikroskobu, diğer tarafta, en iyi morphologica sağlarNumuneler analiz edilmek üzere tespit edilmelidir, çünkü her tekil adım, ancak olayın dinamik yönü l açıklama yakalanan edilemez. floresan moleküler sondalar geliştirme 4-6 gelişmeler ile birlikte yeni optik kayıt teknikleri 2,3, gelişi, böylece sinaptik yapısı ve işlevi hakkında bilgi yeni seviyeleri sağlayan, canlı hücrelerde ekzositik süreçlerin görselleştirme sağlar. İlk çalışmalar sömürülen aktivite bağımlı stiril boyalar (FM1-43 ve ilgili organik boyalar) 7,8. Devlet-sanat görüntüleme teknikleri lümen veziküller proteinler 9 gergin Yeşil Floresan Protein (GFP) (pHluorin) pH-duyarlı varyantlarını kullanır. Bu sondalar, normalde düşük olması nedeniyle lümen pH veziküllerde mevcut olduğunda kapatılır. Plazma membranı ile füzyon sonra, kese iç nötr hücre dışı alanı, pH maruz<html> aniden artar pHluorin proton-bağımlı söndürme rahatlatır ve floresan sinyal hızla görünür. PHluorin değişim floresan artar izleyerek, füzyon olayı daha hızlı olduğu için, membran vezikül füzyon ölçülerek analiz edilebilir. Yüzey pHluorin-etiketli moleküller endocytosed olduğundan, floresans sinyali, daha sonra, bu nedenle, aynı yapı vezikül 9 dönüştürülmesi izlemek için de kullanılabilir, bazal seviyeye döner. Vezikül etiketli pH sensörü sadece gerçekten plazma zarı ile sigorta bu keseciklerin görselleştirme sağlarken, yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlükte görüntüleme ayrıntıları egzo / endositik süreçlerinde adımları açıklamak için gereklidir. Gerekli uzay-zamansal çözünürlük sağlayan optik bir tekniktir toplam iç yansıma floresan mikroskobu (TIRFM), floresan mikroskobu 10 bir uygulamadır. &quot;&gt; Toplam iç yansıma ışık yolu kritik açıdan daha büyük bir olay açısı ile cam kapak-kayma ulaşır cam kapak-slip ve örnek. Arasındaki arayüzde meydana, uyarma ışık numune içine iletilir ama değil Tamamen geri yansıtılır. Bu koşullar altında, ara yüzeyde genliği azalan bir ışık dalga formları altında ve kaybolan alan yoğunluğunun bir penetrasyon derinliği ile (arabiriminden mesafe ile katlanarak çürürken. daha az bir optik yoğunluk (örnek) ile ortam içinde ilerleyen daha uzakta sınırından bu GFP yapılar ile transfekte edilen hücrelerde. değil iken, yaklaşık 100 nm) kapak-slip en yakın olan sadece flüoroforlar uyarılırken, bu derinlik, plazma zarı üzerinde ifade edilen proteinlerin veya veziküler yapılarda tekabül Hücre iç flüoroforlar heyecanlı olamaz gibi, arka plan floresan minimize, ve bir görüntü çok yüksek sinyal / arka plan sıçan olduğunu. yaklaşanio 11 oluşturulur. Birkaç özellikler veziküller dinamikleri izlenmesi için seçim TIRFM tekniği yapmak. Mükemmel kontrast ve yüksek sinyal-gürültü oranı tek kesecikler kaynaklanan çok düşük sinyallerin algılanmasını sağlar. Her çerçeve çip tabanlı görüntü elde etme derece dinamik süreçleri tespit etmek için gerekli zamansal çözünürlük sağlar. Son olarak, numune başka düzlemde ışık hücrelerin minimal maruz güçlü fototoksisite azaltır ve uzun ömürlü time-lapse kayıt 12 sağlar. Veri analizi, bu tekniğin en zorlu ve önemli yönü kalır. vezikül füzyon izlemek için en basit yol, zaman 13 üzerine, hücre yüzeyinde raportör flöresan protein birikimini ölçmektir. Yanı sıra füzyon artar, net floresan sinyal arttıkça. Bununla birlikte, bu yöntem özellikle büyük hücreler ve dinlenme koşulları işlemi göz ardı edilebilir,endositoz ve photobleaching süreçleri nedeniyle kese ekzositoz için floresan yoğunluğu artışı telafi çünkü. Alternatif bir yöntem, tek tek her füzyon olayı 14 takip etmektir. Bu ikinci yöntem çok hassastır ve füzyon mekanizmaları hakkında önemli ayrıntıları ortaya çıkarabilir. Tamamen otomatik prosedürler veziküller takip etmek ve onların floresan sinyallerin dalgalanmasını kayıt her zaman mevcut değildir çünkü Ancak, tek olayların manuel seçimi gerektirir. Vezikül dinamikleri Gözlem yüksek frekansta örnekleme hücreleri gerektirir. Bu pek elle analiz edilebilir veri büyük miktarda üretir. Bu çalışmanın her iki öneri, laboratuarda geliştirilmiş bir işlem verilerini analiz etmek için SH-5YSY nöroblastom hücre çizgisinde taban ve uyarılmış olan nörotransmitter salimim izlenmesi için TIRFM görüntüleme tekniği optimize etmek ve tanımlamak için, adım adım bir Bütün hücre ve tek vezikül seviyelerde aktivite göstermez.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Ekipman</td></tr><tr><td>Axio Observer Z1</td><td><a href="http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/light-microscopes/axio-observer-for-biology.html#introduction" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Zeiss</a></td><td>491912-9850-000</td><td>ters mikroskop</td></tr><tr><td>Multiline Argon Laser Lasos 77</td><td><a href="http://www.lasos.com/products/argon-ion-laser" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Lasos</a></td><td>00000-1312-752</td><td>çok hatlı (458/488/514 nm), 100&amp;nbsp;mW argon-iyon lazeri</td></tr><tr><td>Laser TIRF slider</td><td><a href="http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/imaging-systems/single-molecular-imaging-laser-tirf-3.html" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Zeiss</a></td><td>423681-9901-000</td><td></td></tr><tr><td>100X Objektif</td><td><a href="https://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&amp;amp;p=us&amp;amp;f=o&amp;amp;a=v&amp;amp;m=a&amp;amp;id=421190-9900-000&amp;amp;ss=1" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Zeiss</a></td><td>421190-9900-000</td><td>Yağlı, NA 1.45 Alpha-Plan</td></tr><tr><td>CCD Kamera RetigaSRV Fast 1394</td><td><a href="http://www.qimaging.com/products/datasheets/Retiga-SRV.pdf" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> QImaging</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SmartShutter özellikli LAMBDA 10-3 optik filtre değiştirici</td><td><a href="http://www.sutter.com/IMAGING/lambda103.html" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sutter Instrument Company</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Yazılım</td></tr><tr><td>Image ProPlus 6.3 Yazılımı</td><td><a href="http://www.mediacy.com/index.aspx?page=IPP" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Media Cybernetics</a></td><td></td><td>nokta seçimi, ROI seçimi, floresan yoğunluğu belirleme</td></tr><tr><td>Excel</td><td><a href="http://office.microsoft.com/it-it/excel/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Microsoft</a></td><td></td><td>fotoblöçing düzeltmesi, tüm hücre ve tek vezikül analizleri</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 4.00</td><td><a href="http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> GraphPad Software, Inc.</a></td><td></td><td>istatistiksel analiz</td></tr></tbody></table>

tirfm ve ph-duyarlı gfp-sondalar sh-sy5y nöroblastom hücrelerinde nörotransmitter vesikül dynamics değerlendirin: hücre görüntüleme ve veri analizi

TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis

Sinaptik veziküller füzyon ve alma dinamik bir döngüsü boyunca kimyasal sinaps nörotransmitterlerin bırakın. Gerçek zamanlı olarak sinaptik aktivite izleme ve tek kese düzeyinde egzo-endositozun farklı adımlar diseksiyon sağlık ve hastalık sinaptik fonksiyonlar anlamak için çok önemlidir. Doğrudan sinaptik veziküllerin ve Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu (TIRFM) hedeflenen pH duyarlı problar vezikül dinamiklerini takip etmek gerekli uzay-zamansal çözünürlük sağlayan genetik olarak kodlanmış. toplam iç yansıma tarafından oluşturulan kaybolan alan sadece egzo-endositoz süreçler gerçekleşecek tam olarak nerede, hücreler uygun olan cam kapak üzerinde ince bir tabaka (&lt;150 nm) yerleştirilen fluorophores heyecanlandırmak olabilir. Elde edilen yüksek kontrastlı görüntüler ideal izleme veziküller ve füzyon olayları kantitatif analiz için uygundur. Bu protokolde, SH-SY5Y insan neuroblastoma hücreleri nedeniyle düz yüzeyin, TIRFM ile tek vezikül seviyesinde nörotransmitter salimim çalışmak için değerli bir model ve dağılmış veziküllerin varlığı olarak önerilmektedir. Yapışkan hücreler gibi SH-SY5Y büyüyen ve synapto-pHluorin ile transfekte edilmesine yönelik yöntemler TIRFM ve görüntüleme gerçekleştirmek için teknik olarak, hem de temin edilmiştir. Son olarak, seçmek saymak ve tam hücre ve tek kese seviyelerinde füzyon olayları analiz etmeyi amaçlayan bir strateji sunulmaktadır. Görüntüleme işlemi ve veri analizi yaklaşımı doğrulamak için, pHluorin-etiketli kesecikler dinamikleri dinlenme altında analiz edilir ve koşulları (potasyum konsantrasyonları depolarizan) uyarılır. Membran depolarizasyon füzyon olgulannın sıklığını arttırır ve bütün hücre kaydedilen net floresans sinyalinin paralel bir zam neden olur. Tek vezikül analizi füzyon olayı davranışı (yüksek tepe yükseklik ve genişlik) değişiklikleri gösterir. Bu veriler inci öneririzpotasyum depolarizasyon bir büyük nörotransmitter salınımını uyarır, aynı zamanda vezikül füzyon ve geri dönüşüm mekanizmasını değiştiren sadece. Uygun floresan prob ile, bu teknik yapıcı ve uyarımlı sekresyon mekanizmaları incelemek için farklı hücresel sistemlerde kullanılabilecektir.

Tarif TIRF görüntüleme ve veri analizi prosedürleri hücresel sistemlerde veziküller dinamikleri üzerinde çalışmak üzere tasarlanmıştır. Bu teknik, füzyon olayları ve nörotransmiter vezikül dinamikleri 17 molekülleri ve uyuşturucu sinyal etkisini belirlemek için de kullanılabilir. GFP etiketli plazma membran proteinleri kullanılarak, TIRFM analizi glial GFP-etiketli glutamat taşıyıcılar ve epitel hücreleri 18,19 kurucu kaçakçılığı karakterize etmek için kullanılmıştır. R...

Bu makale, bir sinaptobrevin2-pHluorin yapısı ve Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu kullanarak nöroblastom hücrelerinde nörotransmitter vezikül dinamiklerini araştırmak için bir yöntem sağlar. Görüntü işleme ve veri analizi için geliştirilen strateji de raporlanmaktadır.

TIRFM ve pH-duyarlı GFP-sondalar SH-SY5Y Nöroblastom Hücrelerinde nörotransmitter Vesikül Dynamics değerlendirin: Hücre Görüntüleme ve Veri Analizi

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real ...

Bu prosedürün genel amacı, pH'a duyarlı problar ve toplam iç yansıma floresan mikroskobu veya çim toprağı kullanarak nöroblastom hücrelerinde nörotransmitter vezikül dinamiklerini araştırmaktır. Bu, ilk olarak hücrelerin cam örtü fişleri üzerine kaplanması ve bunların, seçici olarak sinaptik vezikülleri hedef alan, genetik olarak kodlanmış pH'a duyarlı floresan vezikül füzyonu ve geri dönüşüm probları ile kesilmesiyle gerçekleştirilir. Protein ekspresyonu 24 ila 48 saat içinde beklenir.İkinci adım, vezikül dinamiklerini toplam iç yansıma mikroskobu ile kaydetmektir. Bu adım, deneyin başarısı için özellikle kritiktir ve çim konfigürasyonunun nasıl elde edileceğine dair adım adım bir açıklama sağlanır. Önümüzdeki. Doğru çim konfigürasyonuna ulaşıldığında, sıralı görüntüler bazal koşullarda veya uyarılmış koşullarda yazılım tarafından otomatik olarak kaydedilebilir.Son adım, ticari yazılım veya ev yapımı algoritmalar kullanarak görüntüleri işlemek ve videolardan veri çıkarmaktır. Sonuç olarak, vezikül füzyonundan plazma zarına türetilen floresan sinyalindeki değişiklikleri kaydetmek için çim mikroskobu kullanmak. Füzyon olaylarının sıklığı ve vezikül füzyonunun modu hakkında bilgi edinmek mümkündür.Bu tekniğin, örneğin elektromikroskopi ve elektrofizyoloji gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, vezikül dinamiklerini tespit etmek için gereken hem özel hem de geçici çözümü sağlamasıdır. Gerçekten de, bu teknikle elde edilen yüksek kontrastlı görüntüler, tek veziküllerden gelen sinyallerin tespit edilmesine izin verir. Ucuz temel görüntü elde etme analizi, dinamikleri tespit etmek için gerekli olan geçici çözümü sağlar.Bu yöntem, belirli bir sinaptik proteinin bisiklet dinamikleri üzerindeki rolünü veya sinaptik iletimlere etki eden ilaçların etki mekanizmasını anlamak gibi sinir bilimi alanındaki önemli bir soruyu yanıtlamaya yardımcı olabilir. Genel olarak, bu konuda yeni olan bireyler, bu analizle mücadele ediyoruz çünkü vezikülü takip etmek ve PROE Sinyalinin dalgalanmasını kaydetmek için tamamen otomatik prosedürler her zaman mevcut değildir. İlk olarak, patojenik mutant veya sinaptik proteinin Nevo transmitter vezikül salınımı üzerindeki etkisini araştırmaya karar verdiğimizde bu yöntem fikri aklımıza geldi.Mevcut yöntemler yeterince kapsamlı değildi, bu nedenle uygun çözeltiye ulaşmak için bu tekniği nöroblastom hücre hattı SH SY beşte kurmaya karar verdik. Bu yöntemin görsel gösterimi, dördüncü katman yapılandırmasının nasıl elde edileceği ve Videolardan nicel verilerin nasıl çıkarılacağı gibi bazı önemli adımlar olarak kritik öneme sahiptir, ancak daha anlaşılır ve ikna edici olabilirken, kelime kullanarak açıklamak kritik öneme sahiptir. Görselleştirilirse.Çim görüntülemeyi gerçekleştirmek için, metin protokolünde belirtildiği gibi motorlu bir ters mikroskop, lazer kaynağı ve çim kaydırıcısını ayarlayın. Çim aydınlatması elde etmek için. Kesilmiş hücrelerin bulunduğu cam kapağı çıkarın ve uygun görüntüleme odasına yerleştirin.Hazneyi birleştirin ve camın ortasına 500 mikrolitre Krebs zil çözeltisi ekleyin. Ardından objektifin üzerine yağ ekleyin. Görüntüleme odasını mikroskobun tablasına yerleştirin ve objektifi cam kapak kaymasının altına yerleştirin.Güvenli kapağı s'nin üzerine yerleştirinampepi floresan modunda. Kapak kızağına odaklanın ve yazılım kontrolü altında oda merkezine yerleştirilen transfekte edilmiş hücreleri seçin. Canlı modda çim aydınlatmasına geçin.Çim konfigürasyonunu ayarlamak için, objektiften çıkan kirişin numune kapağı üzerindeki konumunu kontrol edin. Işın objektif merceğin merkezine yerleştirildiğinde, çim numune kapağının merkezinde bir nokta görünür ve hücre epi floresan modunda görüntülenir. Kritik açıya ulaşmak için, çim kaydırıcısındaki açı ayar vidasını kullanarak odaklanılan noktayı Y yönünde hareket ettirin.Işın, numune düzlemi üzerinde kritik açıdan daha büyük bir açıyla birleştiğinde, nokta kaybolur ve numune kapağının ortasında düz, ince odaklanmış bir çizgi belirgindir. Çim açısına ince ayar yapmak için bir hücre örneği kullanın. Videodaki floresan görüntüsünü izleyin.Bu aşamada, epi floresan benzeri bir görüntü hala görülebilir. Çim durumu elde edilene kadar vidayı yavaşça hareket ettirin. Burada hücrenin yalnızca bir optik düzlemi odaktadır ve bu da yüksek kontrastlı düz bir görüntü elde edilmesini sağlar.Örnek görüntüleme gerçekleştirmek için, tek kanallı hızlandırılmış deneyi uygun pozlama süreleri 40 ila 80 milisaniye arasında olacak şekilde ayarlayın. Bir veya iki hertz örnekleme frekansında görüntüler elde edin. 500 mikrolitre Krebs zil çözeltisi ekleyin ve hücreleri çim mikroskobu modunda kaydedin.Dinlenme durumunun sıralı görüntüleri zamandan tasarruf edin. Aynı hücreye odaklanın ve aynı dinlenme koşulları altında kayıt yapın. Beş çerçeveden sonra, beş mikrolitre potasyum klorür Krebs zil çözeltisi ekleyin ve potasyum klorürü haznede tutun.Zaman kazanın. Uyarılmış durumun sıralı görüntüleri. Film boyunca görüntünün floresan yoğunluğu, ilgilenilen bir bölgedeki niceleme veya yatırım getirisi için bir dizi floresan yoğunluğu makrosu kullanın.Bunu yapmak için önce zaman sıralı görüntüleri açın. Makro menüsüne gidin ve sıra floresan yoğunluğunu seçin. Analiz penceresinde gezinin.ROI'yi seçmek için menüdeki seçim araçlarından birini seçin. ROI'yi oluşturmak için, hücre zarının lekesiz bölgelerine üç ROI yerleştirin. Arka plan RO'su için, fotoğraf ağartmasını değerlendirmek ve füzyon olay analizi eşiğini belirlemek için bu arka plan yatırım getirisini kullanıyorum.ROI'ler seçiliyken Tamam'ı tıklayın. Film boyunca her bir ROI'nin ortalama floresan yoğunluğunu otomatik olarak hesaplayın, daha fazla analiz için verileri bir elektronik tablo programına aktarın. Foto ağartmayı değerlendirmek için floresan yoğunluğu gülünü açın.Arka plan ROI'leri, her karedeki floresan yoğunluk değerlerini başlangıç yoğunluk değerine normalleştirir ve değerlerin ortalamasını alır. Ortalama verileri vurgulayın ve grafik menü seçeneklerini kullanarak bir çizgi grafiği oluşturun. Veri analizi menüsünden, çizim analizi iletişim kutusunu açmak için trend çizgisini seçin.Regresyon türünü üstel regresyon olarak ayarlayın. Ardından grafikte ekran denklemini seçin. Grafik penceresinde üstel denklem görünür ve parametre değerleri otomatik olarak atanır.Metin protokolünde açıklandığı gibi yoğunluk değerlerine üstel düzeltmeyi uyguladıktan sonra, normalleştirilmiş ve düzeltilmiş bir arka plan açarak eşiği ayarlayın. ROI daha sonra ortalama floresan sinyalini ve standart sapmasını hesaplar. Ortalama değer artı üç standart sapma birimi eşiği temsil eder.Füzyon olaylarını seçmek için. İlk olarak, zaman sıralı görüntüleri görüntü analiz yazılımı ile açın, aktif görüntü dizisine bir Gauss filtresi uygulayın. Nesneleri sayma aracını veya pikselleri tanımlanmış bir aralıkta ortalama floresan yoğunluğuna sahip bir nesnenin seçilmesine izin veren bir makroyu kullanarak görüntüleri analiz edin.Eşik işlevini kullanarak yoğunluk aralığını manuel olarak ayarlayın, bir makro uygulayın, nesneleri yalnızca belirli kriterlere uyan nesneleri seçecek şekilde filtreleyin. İlk önce görünüm için aralıklar seçeneğini uygulayın. En-Boy özelliği, nesneye eşdeğer elipsin ana ekseni ile ikincil ekseni arasındaki oranı bildirir.En boy için yeterli değerler en az bir ve en fazla 2,3'tür. Daha sonra çap kriteri için aralıkları uygulayın Piksel cinsinden çap raporları, iki derecelik aralıklarla ölçülen, ana hatları çizilen iki noktayı birleştiren ve nesnenin OID'sinden geçen çapların ortalama uzunluğudur. Ardından, görüntüleme nesnelerini seçin.Seçilen nesneler, analizde çim mikroskobu görüntü ipucuna üst üste bindirilmiş olarak görünecektir, yalnızca floresan yoğunluğunda kısa bir geçici artış gösteren noktalar ve hemen ardından belirgin bir sinyal kaybı olan noktalar. Seçilen vezikül etrafında radyal olarak yaklaşık bir nokta çapında bir ROI oluşturmak için dairesel seçimi manuel olarak kullanın. ROI seçiliyken, film boyunca her bir ROI'nin ortalama floresan yoğunluğunu hesaplayın.Her deneysel ROI'de ölçülen floresan değişikliklerinin zaman seyrini bir elektronik tabloya aktarın, her karedeki yoğunluk değerini ilk floresan yoğunluğuna normalleştirmek için devam edin. Daha önce olduğu gibi, her karedeki yoğunluk değerlerine üstel düzeltmeyi uyguladıktan sonra, füzyon olaylarının toplam sayısını, her füzyonun meydana geldiği zamanı ve floresan tepe noktasının genliğini hesaplamak için elektronik tablo veya matematik paketleri kullanarak mantıksal fonksiyonlar uygulayın. Plazma zarına vezikül füzyonu olarak eşiği aşan floresan yoğunluğunun arttığını ve ortaya çıkan zirveyi bir füzyon olayı olarak varsayalım.Tepe genişliğini, her tepe noktasının son ve ilk X değeri arasındaki fark olarak hesaplayın. Daha sonra bu değeri örnekleme frekansı üzerinden bir ile çarpın. Bu değeri, vezikül, yeniden asitleşme ve geri dönüşümden önce plazma zarında vezikül füzyonu ve yapışma zamanı olarak düşünün.Ardından, eğrinin altındaki tüm hücre alanını eşik değerin üzerindeki değerlerin toplamı olarak hesaplayın. Bu değeri net floresan değişimi olarak düşünün Spontan veya uyarılmış sinaptik aktiviteye bağlı kayıt süresi boyunca, tepe yüksekliğini her bir tepe noktasının maksimum y değeri ile eşik arasındaki fark olarak hesaplayın ve bu değeri füzyon tipinin göstergesi olarak kabul edin. Tüm hücre analizinde, hücrede meydana gelen füzyon olaylarının toplam sayısı ve sıklığı dinlenme koşullarında analiz edilir.Veziküller bazen plazma zarına yaklaşır ve floresan yoğunluk grafiğinde onunla birleşir. Bu, sekreter uyaranının uygulanmasından sonra eşik üzerinde floresan yoğunluğunun ani bir değişikliği ile yansıtılır. Floresan yoğunluğu profil grafiğinde aniden değişken floresan yoğunluğunun farklı tepe noktaları belirir.Potasyum stimülasyonundan sonra tepe sayısı ve yüksekliğindeki artışa dikkat edin. Tek tepe analizinde, her bir füzyon olayı analiz edilir. İki parametre ölçülür.Plazma zarına vezikül, yapışma ve füzyon zamanına karşılık gelen tepe genişliğinin yanı sıra tepe füzyon mekanizmasını yansıtan tepe yüksekliği. Potasyum depolarizasyonu altında, tepe yüksekliği ve genişliği artar ve motor vezikül füzyonundaki bir değişikliği plazma zarına yansıtır. Bu işleme katılırken, bu kutunun tekniğinin sadece plazma zarında veya bu işlemin hemen ardından meydana gelen olayın görselleştirilmesine izin verebileceğini unutmamak önemlidir.Zengin bir mikroskopi gibi başka bir yöntem, içselleştirilmiş bisikletlerin kaderi, hücrelerin içindeki proteinler gibi ek soruları cevaplamak için yapılabilir. Bu teknik, hücresel biyoloji ve fizyoloji alanında çalışan araştırmacıların, kişisel zarda meydana gelen ve vezikal Ekzositoz, hücre matrisi baskısı ve iyon akışları gibi dinamik olayları incelemelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, dördüncü katman konfigürasyonun nasıl elde edileceğini, dikey dinamiklerin nasıl kaydedileceğini ve verilerin nasıl analiz edileceğini iyi anlamış olmalısınız.

tirfm-ph-sensitive-gfp-probes-to-evaluate-neurotransmitter-vesicle

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Etiketleme tarafından superecliptic pHluorin membran reseptörlerinin ekstraselüler domain ve görüntüleme kültürlü fare nöronları bu füzyon reseptörleri, biz doğrudan plazma membran reseptörlerinin bireysel veziküler ekleme olayları oluşturulabiliyor. Bu teknik, plazma membran reseptör ekleme düzenleyen moleküler mekanizmalarının aydınlatılmasına vesile olacaktır.

Görüntüleme İlköğretim Kültürlü Fare Nöronlar içinde Plazma Membran Reseptör Yerleştirme pHluorin etiketli

Bu video, nöronal veziküllerin hareketlerini görselleştirmek için belirli floresan proteinlerle nasıl etiketlendiğini gösterir. İlk olarak, bir floresan proteini kodlayan bir plazmit, bir transfeksiyon ajanı ile inkübe edilir ve daha sonra bir nöron kültürüne sokulur. Daha sonra, veziküllerin hareketini izlemek için nöronların görüntüleri elde edilir ve analiz edilir.

Floresan Görüntüleme Kullanılarak Nöronlardaki Vezikül Motilitelerinin Görselleştirilmesi

Kaynak: Daniele, F., et. al SH-SY5Y Nöroblastom Hücrelerinde Nörotransmitter Vezikül Dinamiklerini Değerlendirmek için TIRFM ve pH'a duyarlı GFP probları: Hücre Görüntüleme ve Veri Analizi. J. Vis. Uzm. (2015). Bu video, florofor etiketli sinaptik vezikülleri görselleştirmek için toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskobu kullanılarak insan nöroblastom hücrelerinin görüntülenmesini göstermektedir. Hücreler ilk olarak epifloresan modunda odaklanır. Daha sonra, zarın yakınındaki floroforları...

Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu Kullanılarak Hücre Görüntüleme

Kaynak: Lacin, E., et al. Nörotransmiterlerin In Vivo'da Optik Tespiti için Hücre Tabanlı Nörotransmitter Floresan Mühendislik Raportörlerinin (CNiFER'ler) Yapımı. J. Vis. Uzm. (2016)Bu video, fare korteksine önceden enjekte edilmiş özel raportör hücreleri olan hücre bazlı nörotransmitter floresan mühendislik raportörleri (CNiFER'ler) kullanarak in vivo nörotransmitter salınımını görüntülemek için bir tekniği göstermektedir. İki fotonlu bir mikroskop altına yerleştirilen fare, floresan emisyonu...

Hücre Bazlı Nörotransmitter Floresan Mühendislik Raportörleri Kullanılarak Nörotransmitter Salınımının Görüntülenmesi

pH'ya duyarlı bir florofor ile bir membran proteinin hücre dışı alanını Etiketleme, superecliptic pHluorin (SEP), hücre içi lokalizasyonu, sentezleme ve trafik saptanmasına olanak sağlamaktadır. Görüntüleme toplam iç yansıma floresan mikroskobu (TIRFM) proteinleri Eylül-etiketli periferal ER ve plazma membranı protein seviyelerinin ölçümü sağlar.

pHluorin etiketli Reseptör kullanarak Subselüler Yerelleşme ve Ticareti Monitör

Membran kaçakçılığının araştırılması, nöronal işlevleri anlamada çok önemlidir. Burada, nöronlarda vezikül hareketliliğini ölçmek için bir yöntem sunuyoruz. Bu, sinir sistemindeki zar ticaretinin miktarına uyarlanabilen uygun bir yöntemdir.

Floresan Probları Kullanan Kültürlü Nöronlarda Endozom ve Lizozom Hareketlerinin Nicelendirilmesi

Sinaptik vezikül endositoz sinaptik vezikül protein ile erimiş pHluorin ışık mikroskobu ve elektron mikroskobu vezikül Alım tarafından algılanır.

Sinaptik vezikül endositoz kültürlü Hipokampal nöronlar içinde ölçme

Biz optik bir tahlil sinaptik vezikül (SV) kültürlü nöronlarda geri dönüşüm için açıklar. Bu iletişim kuralı bir presynaptic işaret ve protein ilgi ifade etmek için çift transfection ile birleştirerek presynaptic siteleri, onların sinaptik vezikül kapasitesi geri dönüşüm bulun ve faiz protein rolünü belirlemek için bize izin verir.

Sinaptik vezikül Presynaptic protein Overexpressing kültürlü nöronlarda geri dönüşüm için optik bir tahlil

Nörodejeneratif hastalıklar düzensiz mikroglia fonksiyonları ile ilişkilidir. Bu makalede, iPSC-makrofajlar tarafından nöroblastom hücrelerinin fagositozunun in vitro bir tahlili özetlenen bir makale verilmiştir. Nicel mikroskopi okumaları hem canlı hücre zaman atlamalı görüntüleme hem de sabit hücreli yüksek içerikli görüntüleme için açıklanmıştır.

İPSC-Makrofajlar tarafından Ölü Nöroblastom Hücrelerinin Fagositozu için İn vitro Nicel Görüntüleme Tahlili

Sinaptik iletim için gerekli olan hücre altı olayları görselleştirmek için iki ilgili yöntem tanımlanmıştır. Bu protokoller, in vitro kültürlü nöronların canlı hücre görüntülemesini kullanarak presinaptik kalsiyum akışı ve sinaptik vezikül membran füzyonunun dinamiklerinin gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlar.

Amiyotrofik Lateral Skleroz Modellerinde Sinaptik Fonksiyonların Gerçek Zamanlı Floresan Ölçümü

Zebra balığı larva nöromüsküler kavşağı, sinaptik fizyolojiyi incelemek için çekici bir modeldir. Elektrofizyoloji ve optik görüntüleme dahil olmak üzere birçok deneysel tekniğe uygundur. Burada, dik bir epifloresan mikroskobu altında pHluorin bazlı bir prob kullanarak sinaptik iletimi görüntülemek için bir protokol açıklıyoruz.

Diseke Larva Zebra Balığının Nöromüsküler Kavşağında Sinaptik Vezikül Geri Dönüşümünün Canlı Görüntülenmesi

Öğrenin, TIRFM ve pH-duyarlı GFP-sondalar kullanarak SH-SY5Y nöroblastom hücrelerinde nörotransmitter vezikül dinamiklerini nasıl değerlendireceğinizi. Bu yöntem, sinaptik iletim mekanizmalarını anlamak için güçlü bir çerçeve sunar.

TIRFM ve pH-duyarlı GFP-sondalar SH-SY5Y Nöroblastom Hücrelerinde nörotransmitter Vesikül Dynamics değerlendirin: Hücre Görüntüleme ve Veri Analizi (Video) | JoVE Journal

TIRFM ve pH-duyarlı GFP-sondalar SH-SY5Y Nöroblastom Hücrelerinde nörotransmitter Vesikül Dynamics değerlendirin: Hücre Görüntüleme ve Veri Analizi

Daha fazla video keşfet