TIRFM ve pH-duyarlı GFP-sondalar SH-SY5Y Nöroblastom Hücrelerinde nörotransmitter Vesikül Dynamics değerlendirin: Hücre Görüntüleme ve Veri Analizi

Bu prosedürün genel amacı, pH'a duyarlı problar ve toplam iç yansıma floresan mikroskobu veya çim toprağı kullanarak nöroblastom hücrelerinde nörotransmitter vezikül dinamiklerini araştırmaktır. Bu, ilk olarak hücrelerin cam örtü fişleri üzerine kaplanması ve bunların, seçici olarak sinaptik vezikülleri hedef alan, genetik olarak kodlanmış pH'a duyarlı floresan vezikül füzyonu ve geri dönüşüm probları ile kesilmesiyle gerçekleştirilir. Protein ekspresyonu 24 ila 48 saat içinde beklenir.

İkinci adım, vezikül dinamiklerini toplam iç yansıma mikroskobu ile kaydetmektir. Bu adım, deneyin başarısı için özellikle kritiktir ve çim konfigürasyonunun nasıl elde edileceğine dair adım adım bir açıklama sağlanır. Önümüzdeki. Doğru çim konfigürasyonuna ulaşıldığında, sıralı görüntüler bazal koşullarda veya uyarılmış koşullarda yazılım tarafından otomatik olarak kaydedilebilir.

Son adım, ticari yazılım veya ev yapımı algoritmalar kullanarak görüntüleri işlemek ve videolardan veri çıkarmaktır. Sonuç olarak, vezikül füzyonundan plazma zarına türetilen floresan sinyalindeki değişiklikleri kaydetmek için çim mikroskobu kullanmak. Füzyon olaylarının sıklığı ve vezikül füzyonunun modu hakkında bilgi edinmek mümkündür.

Bu tekniğin, örneğin elektromikroskopi ve elektrofizyoloji gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, vezikül dinamiklerini tespit etmek için gereken hem özel hem de geçici çözümü sağlamasıdır. Gerçekten de, bu teknikle elde edilen yüksek kontrastlı görüntüler, tek veziküllerden gelen sinyallerin tespit edilmesine izin verir. Ucuz temel görüntü elde etme analizi, dinamikleri tespit etmek için gerekli olan geçici çözümü sağlar.

Bu yöntem, belirli bir sinaptik proteinin bisiklet dinamikleri üzerindeki rolünü veya sinaptik iletimlere etki eden ilaçların etki mekanizmasını anlamak gibi sinir bilimi alanındaki önemli bir soruyu yanıtlamaya yardımcı olabilir. Genel olarak, bu konuda yeni olan bireyler, bu analizle mücadele ediyoruz çünkü vezikülü takip etmek ve PROE Sinyalinin dalgalanmasını kaydetmek için tamamen otomatik prosedürler her zaman mevcut değildir. İlk olarak, patojenik mutant veya sinaptik proteinin Nevo transmitter vezikül salınımı üzerindeki etkisini araştırmaya karar verdiğimizde bu yöntem fikri aklımıza geldi.

Mevcut yöntemler yeterince kapsamlı değildi, bu nedenle uygun çözeltiye ulaşmak için bu tekniği nöroblastom hücre hattı SH SY beşte kurmaya karar verdik. Bu yöntemin görsel gösterimi, dördüncü katman yapılandırmasının nasıl elde edileceği ve Videolardan nicel verilerin nasıl çıkarılacağı gibi bazı önemli adımlar olarak kritik öneme sahiptir, ancak daha anlaşılır ve ikna edici olabilirken, kelime kullanarak açıklamak kritik öneme sahiptir. Görselleştirilirse.

Çim görüntülemeyi gerçekleştirmek için, metin protokolünde belirtildiği gibi motorlu bir ters mikroskop, lazer kaynağı ve çim kaydırıcısını ayarlayın. Çim aydınlatması elde etmek için. Kesilmiş hücrelerin bulunduğu cam kapağı çıkarın ve uygun görüntüleme odasına yerleştirin.

Hazneyi birleştirin ve camın ortasına 500 mikrolitre Krebs zil çözeltisi ekleyin. Ardından objektifin üzerine yağ ekleyin. Görüntüleme odasını mikroskobun tablasına yerleştirin ve objektifi cam kapak kaymasının altına yerleştirin.

Güvenli kapağı s'nin üzerine yerleştirinampepi floresan modunda. Kapak kızağına odaklanın ve yazılım kontrolü altında oda merkezine yerleştirilen transfekte edilmiş hücreleri seçin. Canlı modda çim aydınlatmasına geçin.

Çim konfigürasyonunu ayarlamak için, objektiften çıkan kirişin numune kapağı üzerindeki konumunu kontrol edin. Işın objektif merceğin merkezine yerleştirildiğinde, çim numune kapağının merkezinde bir nokta görünür ve hücre epi floresan modunda görüntülenir. Kritik açıya ulaşmak için, çim kaydırıcısındaki açı ayar vidasını kullanarak odaklanılan noktayı Y yönünde hareket ettirin.

Işın, numune düzlemi üzerinde kritik açıdan daha büyük bir açıyla birleştiğinde, nokta kaybolur ve numune kapağının ortasında düz, ince odaklanmış bir çizgi belirgindir. Çim açısına ince ayar yapmak için bir hücre örneği kullanın. Videodaki floresan görüntüsünü izleyin.

Bu aşamada, epi floresan benzeri bir görüntü hala görülebilir. Çim durumu elde edilene kadar vidayı yavaşça hareket ettirin. Burada hücrenin yalnızca bir optik düzlemi odaktadır ve bu da yüksek kontrastlı düz bir görüntü elde edilmesini sağlar.

Örnek görüntüleme gerçekleştirmek için, tek kanallı hızlandırılmış deneyi uygun pozlama süreleri 40 ila 80 milisaniye arasında olacak şekilde ayarlayın. Bir veya iki hertz örnekleme frekansında görüntüler elde edin. 500 mikrolitre Krebs zil çözeltisi ekleyin ve hücreleri çim mikroskobu modunda kaydedin.

Dinlenme durumunun sıralı görüntüleri zamandan tasarruf edin. Aynı hücreye odaklanın ve aynı dinlenme koşulları altında kayıt yapın. Beş çerçeveden sonra, beş mikrolitre potasyum klorür Krebs zil çözeltisi ekleyin ve potasyum klorürü haznede tutun.

Zaman kazanın. Uyarılmış durumun sıralı görüntüleri. Film boyunca görüntünün floresan yoğunluğu, ilgilenilen bir bölgedeki niceleme veya yatırım getirisi için bir dizi floresan yoğunluğu makrosu kullanın.

Bunu yapmak için önce zaman sıralı görüntüleri açın. Makro menüsüne gidin ve sıra floresan yoğunluğunu seçin. Analiz penceresinde gezinin.

ROI'yi seçmek için menüdeki seçim araçlarından birini seçin. ROI'yi oluşturmak için, hücre zarının lekesiz bölgelerine üç ROI yerleştirin. Arka plan RO'su için, fotoğraf ağartmasını değerlendirmek ve füzyon olay analizi eşiğini belirlemek için bu arka plan yatırım getirisini kullanıyorum.

ROI'ler seçiliyken Tamam'ı tıklayın. Film boyunca her bir ROI'nin ortalama floresan yoğunluğunu otomatik olarak hesaplayın, daha fazla analiz için verileri bir elektronik tablo programına aktarın. Foto ağartmayı değerlendirmek için floresan yoğunluğu gülünü açın.

Arka plan ROI'leri, her karedeki floresan yoğunluk değerlerini başlangıç yoğunluk değerine normalleştirir ve değerlerin ortalamasını alır. Ortalama verileri vurgulayın ve grafik menü seçeneklerini kullanarak bir çizgi grafiği oluşturun. Veri analizi menüsünden, çizim analizi iletişim kutusunu açmak için trend çizgisini seçin.

Regresyon türünü üstel regresyon olarak ayarlayın. Ardından grafikte ekran denklemini seçin. Grafik penceresinde üstel denklem görünür ve parametre değerleri otomatik olarak atanır.

Metin protokolünde açıklandığı gibi yoğunluk değerlerine üstel düzeltmeyi uyguladıktan sonra, normalleştirilmiş ve düzeltilmiş bir arka plan açarak eşiği ayarlayın. ROI daha sonra ortalama floresan sinyalini ve standart sapmasını hesaplar. Ortalama değer artı üç standart sapma birimi eşiği temsil eder.

Füzyon olaylarını seçmek için. İlk olarak, zaman sıralı görüntüleri görüntü analiz yazılımı ile açın, aktif görüntü dizisine bir Gauss filtresi uygulayın. Nesneleri sayma aracını veya pikselleri tanımlanmış bir aralıkta ortalama floresan yoğunluğuna sahip bir nesnenin seçilmesine izin veren bir makroyu kullanarak görüntüleri analiz edin.

Eşik işlevini kullanarak yoğunluk aralığını manuel olarak ayarlayın, bir makro uygulayın, nesneleri yalnızca belirli kriterlere uyan nesneleri seçecek şekilde filtreleyin. İlk önce görünüm için aralıklar seçeneğini uygulayın. En-Boy özelliği, nesneye eşdeğer elipsin ana ekseni ile ikincil ekseni arasındaki oranı bildirir.

En boy için yeterli değerler en az bir ve en fazla 2,3'tür. Daha sonra çap kriteri için aralıkları uygulayın Piksel cinsinden çap raporları, iki derecelik aralıklarla ölçülen, ana hatları çizilen iki noktayı birleştiren ve nesnenin OID'sinden geçen çapların ortalama uzunluğudur. Ardından, görüntüleme nesnelerini seçin.

Seçilen nesneler, analizde çim mikroskobu görüntü ipucuna üst üste bindirilmiş olarak görünecektir, yalnızca floresan yoğunluğunda kısa bir geçici artış gösteren noktalar ve hemen ardından belirgin bir sinyal kaybı olan noktalar. Seçilen vezikül etrafında radyal olarak yaklaşık bir nokta çapında bir ROI oluşturmak için dairesel seçimi manuel olarak kullanın. ROI seçiliyken, film boyunca her bir ROI'nin ortalama floresan yoğunluğunu hesaplayın.

Her deneysel ROI'de ölçülen floresan değişikliklerinin zaman seyrini bir elektronik tabloya aktarın, her karedeki yoğunluk değerini ilk floresan yoğunluğuna normalleştirmek için devam edin. Daha önce olduğu gibi, her karedeki yoğunluk değerlerine üstel düzeltmeyi uyguladıktan sonra, füzyon olaylarının toplam sayısını, her füzyonun meydana geldiği zamanı ve floresan tepe noktasının genliğini hesaplamak için elektronik tablo veya matematik paketleri kullanarak mantıksal fonksiyonlar uygulayın. Plazma zarına vezikül füzyonu olarak eşiği aşan floresan yoğunluğunun arttığını ve ortaya çıkan zirveyi bir füzyon olayı olarak varsayalım.

Tepe genişliğini, her tepe noktasının son ve ilk X değeri arasındaki fark olarak hesaplayın. Daha sonra bu değeri örnekleme frekansı üzerinden bir ile çarpın. Bu değeri, vezikül, yeniden asitleşme ve geri dönüşümden önce plazma zarında vezikül füzyonu ve yapışma zamanı olarak düşünün.

Ardından, eğrinin altındaki tüm hücre alanını eşik değerin üzerindeki değerlerin toplamı olarak hesaplayın. Bu değeri net floresan değişimi olarak düşünün Spontan veya uyarılmış sinaptik aktiviteye bağlı kayıt süresi boyunca, tepe yüksekliğini her bir tepe noktasının maksimum y değeri ile eşik arasındaki fark olarak hesaplayın ve bu değeri füzyon tipinin göstergesi olarak kabul edin. Tüm hücre analizinde, hücrede meydana gelen füzyon olaylarının toplam sayısı ve sıklığı dinlenme koşullarında analiz edilir.

Veziküller bazen plazma zarına yaklaşır ve floresan yoğunluk grafiğinde onunla birleşir. Bu, sekreter uyaranının uygulanmasından sonra eşik üzerinde floresan yoğunluğunun ani bir değişikliği ile yansıtılır. Floresan yoğunluğu profil grafiğinde aniden değişken floresan yoğunluğunun farklı tepe noktaları belirir.

Potasyum stimülasyonundan sonra tepe sayısı ve yüksekliğindeki artışa dikkat edin. Tek tepe analizinde, her bir füzyon olayı analiz edilir. İki parametre ölçülür.

Plazma zarına vezikül, yapışma ve füzyon zamanına karşılık gelen tepe genişliğinin yanı sıra tepe füzyon mekanizmasını yansıtan tepe yüksekliği. Potasyum depolarizasyonu altında, tepe yüksekliği ve genişliği artar ve motor vezikül füzyonundaki bir değişikliği plazma zarına yansıtır. Bu işleme katılırken, bu kutunun tekniğinin sadece plazma zarında veya bu işlemin hemen ardından meydana gelen olayın görselleştirilmesine izin verebileceğini unutmamak önemlidir.

Zengin bir mikroskopi gibi başka bir yöntem, içselleştirilmiş bisikletlerin kaderi, hücrelerin içindeki proteinler gibi ek soruları cevaplamak için yapılabilir. Bu teknik, hücresel biyoloji ve fizyoloji alanında çalışan araştırmacıların, kişisel zarda meydana gelen ve vezikal Ekzositoz, hücre matrisi baskısı ve iyon akışları gibi dinamik olayları incelemelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, dördüncü katman konfigürasyonun nasıl elde edileceğini, dikey dinamiklerin nasıl kaydedileceğini ve verilerin nasıl analiz edileceğini iyi anlamış olmalısınız.