Eşzamanlı Elektrofizyolojik Kayıt ve kemirgen Beyindeki inhibitör Ajanların Mikro-enjeksiyon

Bu prosedürün genel amacı, çok birimli nöronal aktiviteyi izlerken nörotransmiterleri sıçan superior colliculus'a mikro enjekte etmek için uygun fiyatlı bir enjeksiyon yolu oluşturmaktır. Bu, önce bir cam kılcal damar ve dikey bir mikro pipet çektirmesi kullanılarak bir cam pipet oluşturularak gerçekleştirilir. İkinci adım, konik olmayan uçtan dışarı çıkan bir tel bölümü ile kılcal damara gümüş bir tel yerleştirmektir.

Daha sonra, cam pipet ile hipodermik bir iğne arasında sıkı bir sızdırmazlık oluşturmak için yapıştırıcı kullanılır. Son adımlar, pipeti mineral yağ ile doldurulmuş ve bir mikro enjektöre sabitlenmiş bir mikro şırıngaya bağlı Chicago gök mavisi renkli bir GABA solüsyonu ile doldurmaktır. Sonuç olarak, erişilebilir ve uygun fiyatlı parçalara sahip bir enjeksiyonun bu yapısı, bir ilacın enjeksiyonundan önce, sırasında ve sonrasında inaktive edilmiş alanın nöronal aktivitesini kaydederken derin beyin yapılarını inaktive etmek için kullanılabilir.

Bu tekniğin, gaz bazlı basınç darbeleri ve fotik enjeksiyon sistemleri gibi diğer mevcut yöntemlere göre birkaç avantajı vardır. Birincisi, aşırı enjeksiyondan kaynaklanan doku hasarını sınırlayan, ilaç dağıtımı üzerinde fonksiyona dayalı kontrole izin veren uygun maliyetli bir yöntem olmasıdır. Bu sistemin sunduğu bir diğer avantaj, nöral deaktivasyonun zamansal bileşeni üzerinde verimli kontrol sağlayan birleşik bir kayıt yeteneğidir.

Kayıt enjeksiyon pipetlerini hazırlamak için, önce bir cop dikey modeli için bir milimetre dış çapa sahip yedi santimetrelik bir kılcal damar çekin. Yedi 20 veya benzeri birim. Isıtıcıyı 18'e ve solenoidi bir sonrakine ayarlayın, eldiven giyerek bir açıklık yapmak için ucu manuel olarak kırın ve mikroskop altında iç çapın 30 ila 40 mikrometre arasında olduğunu doğrulayın.

Bunu vizör cetveli ile ölçün. 0,3 ila 0,6 mega ohm arasında nispeten düşük bir empedans üretecektir. Daha sonra konik olmayan uçtan, pipete yaklaşık yedi santimetre uzunluğunda gümüş bir tel yerleştirin ve pipetten bir ila iki santimetre sarkıtın.

Bu fazla teli kılcal damara dik olarak bükün. Ardından, 30 gauge hipodermik bir iğne alın ve şafta esnek plastik yapıştırıcı uygulayın. Ardından iğneyi yavaşça pipetin içine sokun.

Mümkün olduğunca. Pipet ve iğne arasındaki bağlantı noktasında bir sızdırmazlık oluşturmak için daha fazla yapıştırıcı ekleyin. Pipet ucu yukarı bakacak şekilde düzeneğin yaklaşık 12 saat kurumasını bekleyin.

Anestezi uyguladıktan ve fareyi stereotaksik bir çerçeveye koyduktan sonra, oftalmik merhem sürün ve başını temizleyin. Lokal anestezi uyguladıktan ve cerrahi anestezi düzlemini onayladıktan sonra, 10 numara neşter bıçağı kullanarak kafa derisini medyan boyunca keserek devam edin. Bu, koronal ve sagital sütürleri ortaya çıkaracaktır.

Daha sonra cerrahi bir spatula kullanarak Lambda ve bgma anatomik referanslarını belirleyin. Kafanın konumunu, bu yer işaretleri aynı yatay düzlemde aynı hizada olacak şekilde ayarlayın. Sonra sıfır, bgma üzerinde cam tüp gibi ince sert bir işaretçi.

Ardından, bgma'dan gelen koordinatları kullanarak tüpün konumunu ilgilenilen bir konuma ayarlayın. Kraniotomi için hedef alanın etrafına bir kare çizmek için sharpie'yi kullanın. Şimdi cerrahi sterilize matkapla, işaretler boyunca kemiği yavaşça çıkarın.

Mümkün olduğunca az basınç uygulayarak başlayın ve kemik inceldiğinde sürtünme nedeniyle kafa kaynaklı doku hasarını önlemek için matkabı hareket ettirin, kare bölümü cımbızla dikkatlice çıkarın. Enjeksiyon ileriye doğru nüfuz edeceği için Dora MA'nın çıkarılmasına gerek yoktur. Açıkta kalan korteksi beyin omurilik sıvısı ile sulanmış halde tutun.

Enjeksiyonu önce beş ila 10 mikrolitrelik şırıngayı mineral yağ ile doldurarak hazırlayın. Daha sonra, ilgilenilen ilacı fizyolojik tuzlu su içinde bir boya ile hazırlayın. Burada% 0.5 Chicago gök mavisi 300 mikromolar gaba ile karıştırılır.

Şimdi enjeksiyon pipetini, önce bir mililitrelik bir şırıngayı hazırlanmış bir çözelti ile yükleyerek ve ardından pipeti yüklemek için şırıngayı kullanarak doldurun. Şırıngayı çıkarırken, piston üzerinde hafif bir basınç uygulayın, böylece bir vakum çözeltiyi enjeksiyon yolundan çıkarmaz. Olası sızıntı noktalarında sızan sıvıyı kontrol edin.

Fazla sıvıyı temizleyin ve sızıntı olup olmadığını tekrar kontrol edin. Şimdi, mineral yağ içeren mikro şırıngayı enjeksiyon yoluna takın. Ardından fazla çözeltiyi silin.

Gazlı bez ile. Enjeksiyon ucunu kontrol edin. İçinden küçük damla çözelti akıtmak mümkün olmalıdır, aksi takdirde bloke edilir veya şimdi enjektörü bir mikro pompa sistemine güvenli bir şekilde monte edin.

Daha sonra enjeksiyon yolunun konumunu hedef koordinatlara getirin ve elektrodu, görsel uyarılmış potansiyellerin kaydedilmesiyle tanımlanabilen üst kolusa indirin. Elektrot indirilirken, tıkanmayı önlemek için düşük bir enjeksiyon hızı uygulayarak küçük bir pozitif basınç uygulayın. Yapıya ulaşıldığında enjeksiyonu durdurun.

Enjeksiyonu yerleştirdikten sonra, kurumayı önlemek için açıkta kalan korteksi ılık agar ile örtün. Elektrotun son yerleştirilmesinden sonra, elektrodu çevreleyen dokunun stabilizasyonuna izin vermek için 30 dakika bekleyin. Daha sonra, üst kolonusta nöronal aktivitenin aktivasyonu olana kadar dakikada 40 nanolitre oranında 400 ila 800 nanolitre çözelti enjekte edin, elektrot inhibitör çözeltinin enjeksiyonu sırasında sivri uçlarda bir azalma göstermelidir.

Süperior kolusta görsel olarak uyarılmış potansiyeller elde edildi. Gaba enjeksiyonu üzerine kontralateral göze 300 milisaniyelik bir flaşın ardından, bir flaş uyaranına yanıt olarak ani aktivite 45 ila 60 dakika boyunca bastırıldı. Bu prosedüre katılırken, yükleme sırasında sızıntı olup olmadığını kontrol etmek ve ilaç çözeltisinin enjeksiyon ucundan serbestçe aktığını doğrulamak önemlidir.