Eşzamanlı Elektrofizyolojik Kayıt ve kemirgen Beyindeki inhibitör Ajanların Mikro-enjeksiyon

Bu prosedürün genel amacı, çoklu ünite nöronal aktiviteyi izlerken sıçan superior kollikulusuna nörotransmitterlerin mikroenjeksiyonunu yapmak için uygun maliyetli bir enjeksiyon yolu oluşturmaktır. Bu işlem, öncelikle bir cam kılcal boru ve dikey bir mikro pipet çekici kullanılarak cam bir pipet oluşturularak gerçekleştirilir. İkinci adım, bir gümüş telin, telin bir bölümü konik olmayan uçtan dışarı çıkacak şekilde kılcal borunun içine yerleştirilmesidir.

Ardından, cam pipet ile hipodermik iğne arasında sızdırmaz bir mühür oluşturmak için yapıştırıcı kullanılır. Son adımlar, pipetin Chicago gökyüzü mavisi renkli bir GABA solüsyonu ile doldurulması, mineral yağı ile doldurulmuş bir mikro şırıngaya bağlanması ve bir mikro enjektöre sabitlenmesidir. Nihayetinde, erişilebilir ve uygun maliyetli parçalarla yapılan bu enjektör düzeneği, bir ilaç enjeksiyonu öncesinde, sırasında ve sonrasında inaktive edilen bölgenin nöronal aktivitesi kaydedilirken derin beyin yapılarını inaktive etmek için kullanılabilir.

Bu tekniğin, gaz tabanlı basınç darbeleri ve fotik enjeksiyon sistemleri gibi mevcut diğer yöntemlere göre birkaç avantajı vardır. Bunlardan biri, aşırı enjeksiyondan kaynaklanan doku hasarını sınırlayan ve ilaç iletimi üzerinde fonksiyonel tabanlı kontrol sağlayan maliyet etkin bir yöntem olmasıdır. Bu sistemin sunduğu bir diğer avantaj ise, nöral deaktivasyonun zamansal bileşeni üzerinde etkili kontrol sağlayan kombine kayıt yeteneğidir.

Kayıt enjeksiyon pipetlerini hazırlamak için, öncelikle bir cop dikey model için bir milimetre dış çapında yedi santimetrelik bir kapiler çekin. Seven 20 veya benzeri bir ünite kullanın. Isıtıcıyı 18'e ve solenoidi bire ayarlayın; ardından, eldiven giymiş halde, bir açıklık oluşturmak için ucu manuel olarak kırın ve iç çapın 30 ile 40 µm arasında olduğunu mikroskop altında doğrulayın.

Bunu vizör cetveli ile ölçün. Bu işlem, 0,3 ila 0,6 mega ohm arasında nispeten düşük bir empedans sağlayacaktır. Ardından, konik olmayan uçtan, yaklaşık yedi santimetre uzunluğunda gümüş bir teli pipete yerleştirin ve telin bir ila iki santimetresini pipetin dışında bırakın.

Bu fazla teli kapilerle dik açı yapacak şekilde bükün. Ardından, 30 gauge'lik bir hipodermik iğne alın ve gövdeye esnek plastik yapıştırıcı uygulayın. Sonra iğneyi yavaşça pipete yerleştirin.

Mümkün olduğu ölçüde, pipet ile iğne arasındaki birleşim yerinde sızdırmazlık sağlamak için daha fazla yapıştırıcı ekleyin. Pipet ucu yukarıya bakacak şekilde, düzeneği yaklaşık 12 saat boyunca kurumaya bırakın.

Sıçan anestezi edildikten ve stereotaksik çerçeveye yerleştirildikten sonra, oftalmik pomad uygulayın ve başını temizce tıraş edin. Lokal anestezik uygulayıp cerrahi anestezi düzlemini onayladıktan sonra, 10 numara bistüri ucu kullanarak kafa derisini median hat boyunca insize edin. Bu işlem, koronal ve sagital sütürleri açığa çıkaracaktır.

Ardından cerrahi bir spatula kullanarak Lambda ve bgma anatomik referanslarını belirleyin. Bu işaretçiler aynı yatay düzlemde olacak şekilde başın konumunu ayarlayın. Daha sonra, cam tüp gibi ince ve sert bir işaretleyiciyi bgma üzerine sıfırlayın.

Ardından, bgma'dan alınan koordinatları kullanarak tüpün konumunu ilgilenilen bölgeye göre ayarlayın. Kraniyotomi için hedef alanın etrafına keçeli kalemle bir kare çizin. Şimdi, cerrahi olarak sterilize edilmiş matkapla, işaretler boyunca kemiği yavaşça çıkarın.

Kemik inceldiğinde sürtünmeye bağlı kafa kaynaklı doku hasarını önlemek için mümkün olduğunca az basınç kullanarak başlayın ve matkabı hareket ettirmeye devam edin; ardından kare kesiti cımbızla dikkatlice çıkarın. Enjeksiyon ileride buradan geçeceği için Dora MA'nın çıkarılmasına gerek yoktur. Açığa çıkan korteksi serebrospinal sıvı ile irige tutun.

Enjekte edilecek maddeyi hazırlamak için öncelikle beş ila 10 µL'lik şırıngayı mineral yağ ile doldurun. Ardından, incelenecek ilacı bir boya ile birlikte fizyolojik salin içerisinde hazırlayın. Burada %0,5 Chicago sky blue, 300 µM gaba ile karıştırılmıştır.

Şimdi, önce bir mililitrelik bir şırıngayı hazırlanmış solüsyonla doldurup ardından şırıngayı kullanarak pipeti doldurarak enjeksiyon pipetini doldurun. Şırıngayı çıkarırken, vakumun enjeksiyon yolundan solüsyonu çekmemesi için piston üzerinde hafif bir basınç uygulayın. Olası sızıntı noktalarında sıvı kaçağı olup olmadığını kontrol edin.

Fazla sıvıyı bir pamuklu çubukla temizleyin ve sızıntı olup olmadığını yeniden kontrol edin. Şimdi, mineral yağı içeren mikro şırıngayı enjeksiyon yoluna takın. Ardından, fazla çözeltiyi silerek temizleyin.

Gazlı bez ile. Enjeksiyon ucunu kontrol edin. İçinden küçük çözelti damlalarının akması mümkün olmalıdır, aksi takdirde uç tıkanmıştır veya şimdi enjektörü bir mikro pompa sistemine güvenli bir şekilde monte edin.

Ardından, enjeksiyon yolunun konumunu hedef koordinatlara taşıyın ve elektrodu, görsel uyarılmış potansiyellerin kaydedilmesi yoluyla tanımlanabilen superior colliculus'a indirin. Tıkanmayı önlemek için, elektrot indirilirken düşük bir enjeksiyon hızıyla küçük bir pozitif basınç uygulayın. Hedef yapıya ulaşıldığında enjeksiyonu durdurun.

Enjeksiyon yapıldıktan sonra, kurumayı önlemek için açıkta kalan korteksi sıcak agar ile kapatın. Elektrodun son yerleşiminden sonra, elektrodun etrafındaki dokunun stabilize olması için 30 dakika bekleyin. Ardından, superior colus'ta nöronal aktivasyon gerçekleşene kadar, dakikada 40 nanolitre hızla 400 ila 800 nanolitre çözelti enjekte edin; inhibitör çözeltinin enjeksiyonu sırasında elektrot spike'larda bir azalma göstermelidir.

Süperiyor kolus'ta görselle uyarılmış potansiyeller elde edildi. GABA enjeksiyonu sonrası kontralateral göze 300 milisaniyelik bir flaş uygulamasının ardından, flaş stimülasyonuna yanıt olarak gelişen spike aktivitesi 45 ila 60 dakika boyunca baskılandı. Bu prosedür gerçekleştirilirken, yükleme sırasında sızıntı olup olmadığının kontrol edilmesi ve ilaç solüsyonunun enjeksiyon ucundan serbestçe akıp akmadığının doğrulanması önemlidir.