Floresan DNA için Basit Bir Yöntem In Situ Ezilmiş Kromozomlar için Hibridizasyon

Bu prosedürün genel amacı, hetero kromatik dizileri mitotik kromozomlara eşlemek için DNA in situ hibridizasyonunu kullanmaktır. Bu, yıldız drosophila larvalarında veya başka bir ilgilenilen dokuda üçüncü beyinlerin ilk diseksiyonu ile gerçekleştirilir. İkinci adım, dokuyu bir kapak fişi üzerine sabitlemektir.

Daha sonra, doku kapak kayması ile bir slayt arasında ezilir. Kromozomları hibridizasyona hazırlamak için son adım, kısa sentezlenmiş oligo problarını ezilmiş dokuya hibritlemektir. Sonuç olarak, kromozomlar üzerindeki oligo problara eşlik eden dizilerin lokalizasyonunu göstermek için floresan mikroskobu kullanılır.

Bu yöntemin mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı basitliğidir. Diğer kromozom ve C iki hibridizasyon yöntemlerinin çoğu, pahalı ve dağınık olabilen büyük miktarlarda form amid içeren yıkamaları içerir. Yöntemimiz IDE yıkama formu gerektirmez, bu da onu daha ucuz, daha temiz ve daha hızlı bir teknik haline getirir.

Bu yöntem, drosophila beyinlerinin somatik kromozomları üzerindeki dizileri görünür bir şekilde haritalamak için basit bir yol sağlasa da, farklı organizmalardaki farklı dokulardan alınan diğer kromozom türleri üzerindeki dizileri haritalamak için de kullanılabilir. Yapılacak her slayt için dört veya beş doku hazırlayın, ancak beyin diseksiyonları için daha fazla değil. Dolaşan üçüncü instar larvalarını seçerek ve bunları bir XPBS damlasında toplayarak başlayın.

Aşırı kalabalık olmayan toplayacak şişeleri seçin. Diseksiyon kapsamı altında, ağız kancalarını tutmak için ultra ince cımbız ve vücudun uzunluğunun üçte ikisini tutmak için başka bir çift kullanın. Ardından beyni, ventral gangliyonları, tükürük bezlerini ve sindirim sisteminin parçalarını ortaya çıkarmak için ağız kancalarını nazikçe çekin.

Daha sonra, beyni ve ventral gangliyonları diğer dokulardan uzaklaştırın ve bunları plastik bir plaka üzerinde bir XPBT damlasına aktarın. Nasia testis diseksiyonları için üç günlük erkek puy toplayın. Üç günlük puy'un sarı bedenleri ve kırmızı gözleri var.

Kanat yastıkları daha küçük olanlar erkektir. Pupa'yı bir cımbızla ve ikinci bir cımbızla torasik bölgeye yakın karnın üst kısmından kavrayın. Karnın en distal ucunu tutun, ardından gözyaşı damlası şeklindeki testisleri çıkarın.

Nazikçe çalkalanabilen, herhangi bir dış vücut parçasını testislerden ayırabilen, uygun şekilde ezilmeyi önleyecek ve testisleri temiz bir plaka üzerinde bir XPBT damlasına aktarabilecek yağ gövdeleri ile çevrilidirler. Tüm dokular toplandıktan sonra, kardeş kromatitlerin ayrılmasını iyileştirmek için bunlara hipotonik bir çözelti uygulayın. E kromatik bölgelerde, dokuları 10 dakika boyunca% 0.5 sodyum sitrat damlasına aktarın.

Bu etkiyi elde etmek için kolşisin önerilmez çünkü kromozom morfolojisinde artefaktlara neden olabilir. Şimdi, dokuları ultra ince cımbız kullanarak düzeltin. Bunları, temiz sigma kaplama ile muamele edilmiş bir örtü üzerinde %45 asetik asit içinde 20 mikrolitrelik taze yapılmış %2,5'lik bir PFA damlasına aktarın, dokuları fiksatifte eşit şekilde yerleştirin ve oda sıcaklığında dört dakika inkübe edin ve ardından ezme işlemine devam edin, kapak fişleri, polilisin kaplı bir slaytı dokuya yüzü aşağı bakacak şekilde hafifçe yerleştirerek başlayın ve astarı örtün.

Kapak sürgüsünün bastırmadan sürgünün alt tarafına yapışmasına izin verin. Tedavi. Sigma kaplamalı lameller, lamel çıkarıldıktan sonra kabak dokusunun lam üzerinde kalmasını sağlamaya yardımcı olur. Bununla birlikte, nadiren doku kapak kızağına bağlı kalabilir.

Bu adım sırasında, replikasyon doku kabakları yapmanızı öneririz. Şimdi slaydı ters çevirin ve katlanmış kalın bir kağıda yerleştirin. Daha sonra sabit bir yüzeyde, başparmağınızı kullanarak kapak kaymasının üzerine çok sıkı bir şekilde bastırın.

Kapağı kaydıracak şekilde bastırmayın, aksi takdirde dokuyu bulaştırır. Çok sıkı presleme normalde kabak dokusu içinde güzel bir şekilde çözülmüş kromozomlarla sonuçlanır. Bununla birlikte, zaman zaman, eksik, ezilmiş veya parçalanmış kromozomlar gibi kromozom kalitesinde değişkenliklerle karşılaşabilirsiniz.

Bu yüzden yine, iki veya üç replike doku kabağı yapmanızı öneririz. Düzeneği birkaç dakika boyunca bir buz bloğuna aktarın, ardından nitrojen kaynamayı durdurana veya daha uzun süre sıvı nitrojene batırın Doku çözülmeden hemen önce slaytı çıkardıktan sonra, kapak contasının bir köşesini yukarı itmek için yeni bir tıraş bıçağı kullanın. Böylece onu kaldırmak.

Dokuyu çizmemek için dikkatli olun. Ardından slaytı hızlı bir şekilde %100 etanol ile doldurulmuş bir coplin kavanozuna yerleştirin ve en az beş dakika bekletelim. Slaytı çıkarın, dokuya dokunmadan fazla etanolü alın ve slaytın bir saat kurumasını bekleyin.

Slaytlar daha sonra bir kurutma odasında haftalarca veya aylarca saklanabilir. 22 mikrolitrelik bir x hibridizasyon tamponu çözeltisi için 20 mikrolitre 1.1 x hibridizasyon tamponuna her probdan 100 nanogram ekleyerek başlayın. Daha sonra karışımı sabit dokuya pipetleyin, dokuya dokunmadan bırakın ve nazikçe bir örtü fişi uygulayın.

Dokuya temas etmeyen küçük bir hava kabarcığı sorun yaratmaz, ancak daha fazla kabarcık, kapak fişinin yeniden uygulanmasını garanti eder. Sürgüyü 95 santigrat derecelik bir ısı bloğunun düz tarafına yerleştirin ve folyo ile kaplayın. Beş dakika bekleyin, bu süre zarfında bir uç kutusuna ıslak kağıt havlu ekleyerek nem odasını hazırlayabilirsiniz.

Ardından slaydı çıkarın. Slaytı dikkatlice gerilmiş paraforma sarın ve nemli bir havludan oluşan nemlendirilmiş bir odaya aktarın Bir uç kutusunda, slaytı haznede dört saat ila gece boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin. Bu sıcaklık, düşük GC içerikli problar için iyi çalışır, ancak daha yüksek GC içerikli problar için, hibridizasyon sıcaklıklarıyla ilgili bazı sorun giderme işlemleri gerekebilir.

İnkübasyondan sonra, para filmi dikkatlice çıkarın ve kapak kızağını bir köşeden yavaşça kaldırın. Ardından slaytı yıkama başına 15 dakika boyunca 0.1 XSSC tamponunda üç kez yıkayın. Işığa maruz kalmayı en aza indirmek için yıkama sırasında kavanozu folyo ile örtün.

Uzun biyotinile problar için, rod domine avadon ekleyin ve devam etmeden önce yıkayın. İlk olarak, dokunun etrafındaki alanı kurutun ve dokuyu 100 mikrolitre bloke edici solüsyonla kaplayın. Ardından, kabarcıkları sıkıştırmadan nazikçe yeni bir kapak fişi uygulayın.

Yine, slaydı param ile sarın. Daha sonra slaydı 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. İkinci olarak, inkübasyondan sonra, kapak kaymasını çıkarın ve dokunun etrafına bir mendil ile kurulayın.

Daha sonra dokuya, SBT ile seyreltilmiş 1000 mikrolitre bir ila 1000 rumin avadon uygulayın. Slaytı blokta olduğu gibi kaplayarak, sararak ve kuluçkaya yatırarak takip edin. Son olarak, kapak fişini dikkatlice çıkarın ve sürgüyü yıkayın.

Dört x SSC T'de üç yıkama, ardından 0,1 XSSC'de üç yıkama kullanın. Her yıkama adımı en az beş dakika uzunluğunda olmalıdır. Protokole devam ederek, dokuya dokunmadan fazla tamponu lekeleyerek slaytları kurulayın.

Daha sonra kayar dokuyu yukarı bakacak şekilde 10 ila 15 dakika veya nem tamamen dağılana kadar karanlık bir yere yerleştirin. Şimdi, slaytı DPI'lı 11 mikrolitre vektör kalkanı kullanarak monte edin ve sigma olmayan bir kaplama kaplama fişine dikkatlice indirin. Ortam tüm kenarlara ulaşmazsa, kenardan birkaç mikrolitre daha ortam uygulayın ve fazlalıkları silin.

Daha sonra kapak fişini oje ile kapatın ve oje kururken slaytı karanlık bir yerde dik olarak saklayın, bu genellikle en az yarım saat sürer. Ardından slaytı eksi 20 santigrat derecede bir haftaya kadar saklayın ve dokuyu mümkün olan en kısa sürede görüntüleyin. Floresan konjugatlar ve Nick Translation tarafından yapılan daha uzun bir biyotinile prob ile ticari olarak sentezlenmiş bir dizi küçük oligo, birkaç farklı doku tipinden kromozomlara hibritlendi.

Açıklanan metodolojiyi kullanarak, Drosophila Melanogaster 359 baz çifti uydu tekrarına yapılan sonda, x üzerinde büyük bir çoklu megabaz çifti bloğu ve kromozom üç üzerinde çok daha küçük bir bölge tanıdı. Yanıtlayıcı uyduya karşı daha uzun bir araştırma, yaklaşık 700 gibi nispeten düşük tekrar kopya sayılarından oluşan tekrar blokları tespit etti. Böylece, bu yöntem çok küçük uydu bloklarının görselleştirilmesine izin verir.

Hipotonik çözelti tedavi adımının süresi iki katına çıkarılarak 10 dakikaya çıkarıldığında, kardeş kromatitlerin ayrılması doğuya doğru artmıştır. Bu prosedür, belirli dizilere lokalize edilmiş belirli kromatin proteinleri gibi soruları yanıtlamak için antikor boyama gibi diğer yöntemlerle birleştirilebilir.