Floresan DNA için Basit Bir Yöntem

Bu prosedürün genel amacı, heterokromatik dizileri mitotik kromozomlar üzerinde haritalamak için DNA in situ hibridizasyonunu kullanmaktır. Bu işlem, öncelikle üçüncü instarla drosophila larvalarının beyinlerinin veya ilgilenilen başka bir dokunun diseke edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, dokunun bir lamel üzerine fikse edilmesidir.

Ardından, doku lam ve lamel arasında ezilir. Kromozomları hibridizasyona hazırlamak için son adım, sentezlenmiş kısa oligo probların ezilmiş dokuya hibridize edilmesidir. Son olarak, kromozomlar üzerindeki oligo problara komplementer dizilerin lokalizasyonunu göstermek için floresan mikroskobu kullanılır.

Bu yöntemin mevcut yöntemlere göre temel avantajı basitliğidir. Diğer kromozom ve C2 hibridizasyon yöntemlerinin çoğu, maliyetli ve zahmetli olabilen büyük miktarlarda formamid ile yıkama işlemlerini içerir. Bizim yöntemimiz formamid yıkamaları gerektirmediği için daha ucuz, daha temiz ve daha hızlı bir tekniktir.

Bu yöntem, drosophila beyinlerinin somatik kromozomlarındaki sekansların görünür şekilde haritalanması için basit bir yol sunsa da, farklı organizmaların farklı dokularından elde edilen diğer kromozom türleri üzerindeki sekansların haritalanması için de kullanılabilir. Hazırlanacak her lam için dört veya beş doku hazırlayın; ancak beyin diseksiyonları için bu sayıyı aşmayın. Gezgin üçüncü instar larvaların seçilmesi ve bir damla 1X PBS içerisinde toplanmasıyla işleme başlayın.

Aşırı kalabalık olmayan toplama flakonlarını seçin. Diseksiyon mikroskobu altında, ağız kancalarını tutmak için ultra ince pensler, vücut uzunluğunun üçte iki alt kısmından tutmak için ise başka bir pens çifti kullanın. Ardından beyni, ventral gangliyonları, tükürük bezlerini ve sindirim sisteminin bölümlerini açığa çıkarmak için ağız kancalarını nazikçe çekin.

Ardından, beyni ve ventral ganglionları diğer dokulardan cımbızla ayırın ve plastik bir plaka üzerindeki bir damla XPBT içine aktarın. Nasia testis diseksiyonları için üç günlük erkek puy toplayın. Üç günlük puy'lar sarı gövdelere ve kırmızı gözlere sahiptir.

Daha küçük kanat pedlerine sahip olanlar erkektir. Pupayı, toraks bölgesinin yakınındaki abdomenin üst kısmından bir cımbızla, abdomenin en distal ucundan ise ikinci bir cımbızla kavrayın. Ardından, damla şeklindeki testisleri dışarı çekin.

Bunlar, hafifçe sallayarak uzaklaştırılabilecek yağ cisimcikleri ile çevrilidir; uygun ezme işlemini engelleyecek olan tüm dış vücut parçalarını testislerden ayırın ve testisleri temiz bir plaka üzerindeki bir damla XPBT'ye aktarın. Tüm dokular toplandıktan sonra, kardeş kromatidlerin ayrılmasını iyileştirmek için onları hipotonik bir solüsyonla işleme tabi tutun. Kromatik bölgelerde, dokuları 10 dakika boyunca %0.5 sodyum sitrat damlasına aktarın.

Bu etkiyi elde etmek için, kromozom morfolojisinde artefaktlara neden olabileceği için kolşisin önerilmez. Şimdi, dokuları ultra ince pensler kullanarak sabitleyin. Dokuları, temiz bir sigma kaplama işleminden geçmiş lamelle kapatıcıya, %45 asetik asit içeren taze hazırlanmış %2,5 PFA'dan oluşan 20 microliter'lik bir damla içine aktarın; dokuları tespit sıvısı içinde eşit şekilde aralıklı olarak yerleştirin ve oda sıcaklığında dört dakika inkübe edin, ardından lamelleri ezme işlemine geçin; polilizin kaplı bir lamı, doku ve lamelle kapatıcının üzerine yüzü aşağı bakacak şekilde hafifçe yerleştirerek başlayın.

Lamelin, üzerine bastırmadan slayt camının altına yapışmasını sağlayın. Lamellerin sigma coat ile işlenmesi, lamel kaldırıldıktan sonra ezme yöntemine tabi tutulmuş dokunun slayt üzerinde kalmasını sağlamaya yardımcı olur. Ancak, doku nadiren de olsa lamele yapışık kalabilir.

Bu adım sırasında, tekrarlayan doku ezme işlemleri gerçekleştirmenizi öneririz. Şimdi lamı ters çevirin ve katlanmış kalın bir kağıt parçasının içine yerleştirin. Ardından, sabit bir yüzey üzerinde, başparmağınızla lamelin üzerinden doğrudan ve çok sıkı bir şekilde bastırın.

Kapağı kaydıracak şekilde bastırmayın, aksi takdirde doku yayılır. Normalde çok sıkı bastırmak, ezme işlemi görmüş doku içinde güzelce çözünmüş kromozomlar ile sonuçlanır. Ancak, zaman zaman eksik, ezilmiş veya parçalanmış kromozomlar gibi kromozom kalitesinde değişkenliklerle karşılaşabilirsiniz.

Bu nedenle, iki veya üç tekrarlı doku ezme işlemi gerçekleştirmenizi öneririz. Düzenekleri birkaç dakika boyunca bir buz kalıbı üzerinde bekletin, ardından azot kaynaması durana kadar veya daha uzun süre sıvı azota daldırın. Lamı, doku çözülmeden hemen önce çıkardıktan sonra, lamelin bir köşesini hafifçe kaldırmak için yeni bir jilet kullanın. Böylece lameli çıkarın.

Dokuyu çizmemeye dikkat edin. Ardından lamı hızla %100 etanol ile doldurulmuş bir coplin kavanozuna yerleştirin ve en az beş dakika boyunca bekletin. Lamı çıkarın, dokuya dokunmadan fazla etanolü emdirin ve lamın bir saat boyunca havada kurumasını sağlayın.

Slaytlar daha sonra bir kurutma odasında haftalarca veya aylarca saklanabilir. 1x hibridizasyon tamponu içeren 22 mikrolitrelik bir çözelti elde etmek için, her bir probdan 100 nanogramı 20 mikrolitre 1.1x hibridizasyon tamponuna ekleyerek başlayın. Ardından, karışımı fikse edilmiş dokunun üzerine pipetleyin, dokuya dokunmadan üzerine nazikçe bir lamell kapatın.

Dokuyla temas etmeyen küçük bir hava kabarcığı sorun teşkil etmeyecektir, ancak daha fazla kabarcık görülmesi durumunda lamelin yeniden uygulanması gerekir. Lamı, 95 °C'ye ayarlanmış bir ısıtma bloğunun düz tarafına yerleştirin ve üzerini folyo ile kapatın. Pipet ucu kutusuna ıslak kağıt havlular ekleyerek nem odasını hazırlayabileceğiniz beş dakika bekleyin.

Ardından lamı çıkarın. Lamı dikkatlice gerilmiş paraform ile sarın ve nemli bir havludan oluşan, bir uç kutusu içindeki nemlendirilmiş hazneye aktarın; lamı bu hazne içerisinde 30 °C'de dört saat ile bir gece boyunca inkübe edin. Bu sıcaklık düşük GC içeriğine sahip problar için iyi sonuç verir, ancak daha yüksek GC içeriğine sahip problar için hibridizasyon sıcaklıklarıyla ilgili bazı sorun giderme işlemleri gerekebilir.

İnkübasyonun ardından parafilmi dikkatlice çıkarın ve lamelin bir köşesinden yavaşça kaldırın. Ardından lamı, her bir yıkama 15 dakika sürecek şekilde üç kez 0.1 XSSC tamponu ile yıkayın. Işığa maruziyeti en aza indirmek için yıkama işlemleri sırasında kavanozu folyo ile kapatın.

Uzun biotinillenmiş problar için, devam etmeden önce rod domine avadon ekleyin ve yıkayın. Öncelikle, doku çevresindeki alanı kurulayın ve dokuyu 100 µL bloklama çözeltisi ile kaplayın. Ardından, hava kabarcığı kalmadığından emin olarak yeni bir lameli nazikçe yerleştirin.

Slaytı tekrar parafilm ile sarın. Ardından slaytı 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. İkinci olarak, inkübasyonun ardından lamelini kaldırın ve doku çevresini bir mendil ile kurulayın.

Ardından doku üzerine, SBT ile seyreltilmiş 1:1000 oranında rumine avadon'dan 100 µL uygulayın. Devamında, lamı blokta olduğu gibi kapatın, sarın ve inkübe edin. Son olarak, lamı dikkatlice kapatma camını kaldırarak yıkayın.

Önce 4x SSC'de üç kez, ardından 0.1 XSSC'de üç kez yıkama yapın. Her yıkama adımı en az beş dakika sürmelidir. Protokole devam ederek, dokuya temas etmeden fazla tamponu emdirerek lamları kurulayın.

Ardından, lamı doku tarafı yukarı gelecek şekilde karanlık bir yere 10 ila 15 dakika veya nem tamamen dağılana kadar yerleştirin. Şimdi, DPI içeren 11 µL vector shield kullanarak lamı monte edin ve sigma kaplamasız bir lamel üzerine dikkatlice indirin. Eğer ortam tüm kenarlara ulaşmazsa, kenardan birkaç µL daha ortam uygulayın ve fazlalıkları silin.

Ardından lamelin kenarlarını oje ile mühürleyin ve oje kuruyana kadar (bu işlem genellikle en az yarım saat sürer) lamı karanlık bir yerde dik konumda saklayın. Daha sonra lamı -20 °C'de bir haftaya kadar saklayın ve doku görüntülemesini mümkün olan en kısa sürede gerçekleştirin. Floresan konjugatlı ticari olarak sentezlenmiş küçük oligo setleri ve Nick Translation ile üretilmiş daha uzun biotinillenmiş bir prob, birkaç farklı doku tipinden alınan kromozomlarla hibridize edilmiştir.

Tanımlanan metodoloji kullanılarak, Drosophila Melanogaster 359 baz çifti uydu tekrarına yönelik prob, X kromozomunda büyük bir multi megabaz çifti bloğunu ve üçüncü kromozomda çok daha küçük bir bölgeyi tanımlamıştır. Responder uyduya karşı kullanılan daha uzun bir prob, yaklaşık 700 gibi nispeten düşük tekrar kopya sayılarından oluşan tekrar bloklarını tespit etmiştir. Bu nedenle, bu yöntem çok küçük uydu bloklarının görüntülenmesine olanak tanır.

Hipotonik çözelti uygulaması adımı 10 dakikaya çıkarılarak süresi iki katına çıkarıldığında, kardeş kromatitlerin ayrılması daha da artmıştır. Bu prosedür, belirli kromatin proteinlerinin spesifik dizilere yerleşip yerleşmediği gibi soruları yanıtlamak amacıyla antikor boyama gibi diğer yöntemlerle birleştirilebilir.