Polizom Profil Yöntemi ile memeli hücrelerine selektif mRNA dönüşümüyle Değerlendirilmesi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, poliribozomların immobilizasyonu ve ayrılması ile yüksek ve zayıf translasyonlu mRNA'ları ayırt etmektir. Bu, önce ribozomlarını, translokasyonlarını ve RNA translasyonlarını inhibe etmek için hücrelere siklo heide eklenerek elde edilir. İkinci adım olarak, muamele edilen hücrelerden gelen lizatlar, depolanan poliribozomları kütlelerine göre ayırmak için bir sükroz gradyanı ve ultrasantrifüj üzerine yüklenir.

Daha sonra, son adımda yüksek ve kötü çevrilmiş transkriptleri ayırmak için gradyan eşit kesirlere bölünür. R-T-Q-P-C-R, her fraksiyondaki ilgilenilen mRNA'ların varlığını tespit etmek için kullanılır. Sonuç olarak, ribozom profillemesi, farklı fizyolojik ve patofizyolojik streslere yanıt olarak mRNA'nın spesifik translasyonunun yanı sıra küresel değişiklikleri tespit etmek için kullanılabilir.

PolyOne profilleme, moleküler ve hücre biyolojisi alanlarındaki hangi mRNA'ların seçildiği, S stresi sırasında çevrildiği ve bunun hücrelerin bu koşullara nasıl uyum sağlamasına izin verdiği gibi temel soruları yanıtlayabilir. Bu prosedürü göstermek, laboratuvardaki bir yüksek lisans öğrencisinin annesi Dar'dır: Bir sakaroz gradyanı hazırlamak için otomatik bir gradyan yapıcı kullanmak için, degrade yapıcıyı açarak başlayın ve plaka tesviye edildiğinde gradyanları tutacak plakayı düzleştirin. Bitti'yi tıklayın.

Ardından gradyan programını seçmek için grad menüsünü açın ve listeyi seçin. SW 41'e tıklayın ve ardından %10 ila %50 gradyan 11 adımlı program görüntülenene kadar listede ilerleyin ve düğmesine basın. Kullanmak. Daha sonra, işaretleyici bloğa bir SW 41 konik ultrasantrifüj tüpü yerleştirin ve bloğun üst basamağı boyunca tüp üzerinde bir çizgi izlemek için sağlanan ince tüp işaretleyicisini kullanın.

Tüpleri sabit bir yüzey üzerinde bir bağlantı rafına yerleştirin ve ardından verilen iki kanülü iki adet 10 mililitrelik şırıngaya takın. Şırıngaları yıkamak için aktivasyon solüsyonunda RNA'lar içeren ılık damıtılmış suyu birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Daha sonra suyun tüm izlerini çıkardıktan sonra, şırıngalardan birini% 10 sükroz artı siklo heide ile doldurun ve kanülü ultrasantrifüj tüpünün altına yerleştirin.

Solüsyonu, tüp üzerinde yapılan işareti geçene kadar nazikçe dağıtın. Kabarcıklardan kaçınmaya özen gösterin. Daha sonra diğer şırıngayı% 50 sükroz artı siklo heide ile doldurun ve tüpteki fazla sıvıyı bir mendille temizleyin.

% 50 sükroz solüsyonunu tüpe nazikçe yerleştirmek için kanülü kullanın, solüsyon işaretle aynı seviyeye geldiğinde durun ve ardından kanülü hızlı ve düzgün bir şekilde çıkarın. % 10'luk sükroz çözeltisi, tüpün tepesinde menisküs oluşturacak şekilde yükselmelidir. Ardından, hava kabarcıklarını çıkarmak için ultrasantrifüj tüpünü hafifçe eğin ve kapağın haznesindeki fazla sıvıyı çıkarmak için bir mikro pipet kullanarak kapağı yerleştirin.

Tüpleri degrade yapıcıya yerleştirin ve ardından çalıştır düğmesine basın. Plakanın belirtilen açıda eğileceğini unutmayın. Beş saniye duraklayın, ardından gradyanı oluşturmak için dönüşler başlayacaktır.

Yaklaşık iki dakika sonra, makine gradyan oluşumunun tamamlandığını belirten bir bip sesi çıkaracaktır. Tüpleri yavaşça bir rafa aktarın ve gradyanı bozmamak için yukarı doğru hareket ederken kapakları hızla çıkarın. Daha sonra, her bir sükroz gradyanına 260 birim önceden hazırlanmış hücre lizatını yavaşça yükleyin ve tüpleri bir ultrasantrifüjde 260, 343 kez G ve dört santigrat derecede bir buçuk saat döndürün.

Gradyan fraksiyonlama sistemi cihazını kurmak için spektrofotometreyi açarak başlayın. Ardından, ana ekrana dönmek ve fraksiyon toplayıcı üzerindeki valfin boşa ayarlandığından emin olmak için fraksiyon toplayıcıyı PolyZone yöntemine ayarlamak için klasör simgesini iki kez ve ardından dönüş okunu iki kez seçin. Çöp kutusu simgesini gösteren oka tıklayın ve ardından atık toplama tüpünün altına damıtılmış su içeren 250 mililitrelik bir MIA şişesi yerleştirin.

Şimdi grafik kaydedicide aşağıdaki ayarları seçin: ayarlamak için hassasiyet kadranıamp ve optik, gürültü filtresi. Grafik hızını kapatmak için tepe ayırıcı kadranı 1.5'e geçin, saatte 30 santimetreye ve taban çizgisine çevirin ve spektrofotometre ünitesinin üstündeki kadranı maksimum açık olacak şekilde ayarlayın. Ardından şırıngayı ve namluyu pompaya yerleştirin ve yerine sıkmak için verilen vidaları ve Alan Key'i kullanın.

Şırıngayı kovalama solüsyonu ile doldurmak için rev komutunu hızlı bir şekilde kullanın. Ardından pompayı dik konuma getirin ve havayı borudan kovalamak için ileri komutunu kullanın. Daha sonra, tutucuya RNA içermeyen su ile doldurulmuş bir ultrasantrifüj tüpü takın ve ardından iki siyah işaret görünene kadar tüpü kanül ile delin.

Dağıtım deliği iki işaret arasındadır. Şırınga pompasını ileri kılavuzda dakikada 6.0 mililitre ile başlatın. Takip çözeltisi tüpün üçte birini doldurduğunda, dakikada 1.0 mililitre akış hızıyla değişken hıza geçin.

Şimdi spektrofotometre üzerindeki taban çizgisi ayar kadranını grafikteki voltaj sıfıra gelene kadar çevirin. Su, atık borusundan el Mya şişesine çıkmaya başlayacaktır. Ardından istenen hassasiyeti 1.0 au'ya ayarlayın.

Hassasiyet ayarlandığında, taban çizgisi düğmesine de basın ve taban çizgisi ayarını grafik kaydedicideki %10 işaretine ayarlamak için kaydedici ofset kadranını çevirin. Ardından, kararlı taban çizgisine ulaşıldığında, pompa anahtarını ve grafik hız kadranını kapalı konuma getirin. Pompa kapandıktan sonra, delici kanül üzerindeki ilk işarete ulaşana kadar kovalama solüsyonunu kurtarmak için devir konumuna getirin.

Ardından santrifüj tüpünü çıkarın, kanüldeki kabarcıkları biraz kovalama solüsyonu ile dağıtın ve gradyanı parçalamak için akış hücresinden sızmış olabilecek artık suyu temizleyin. Ardından, sakaroz gradyanını içeren santrifüj tüpünü tutucuya takın ve tüpü kanül ile delin. Ardından, on adet iki mililitrelik mikro santrifüj tüpünü, iki ila 11 arasındaki fraksiyon toplayıcı tepsi konumlarına ve bir bel tüpünü, kapaklar yukarı doğru çıkıntı yapmayacak şekilde birinci konuma yerleştirin.

Pompa kontrol kadranını manuel konuma ve şırınga pompasındaki akış hızını dakikada 6.0 mililitreye ayarlayın. Ardından, kol ilk tüpe ulaşır ulaşmaz fraksiyon toplayıcıda oynat düğmesine basın. Kolu konumlandırmak ve fraksiyon dağıtım valfini açmak için duraklatma düğmesine basın.

Ardından, pompayı başlatmak ve grafik kaydedici kalemini izlemek için ileri komutunu kullanın. Kalem, numunenin akış hücresinden geçtiğini gösterecek şekilde yukarı doğru sapmaya başladığında, atık tüpünü hızlı bir şekilde bir numaralı tüple değiştirin. Ardından, ilk damla toplandığında, komutları hızlı bir şekilde uzaktan başlatma, durdurma ve dakikada 1.0 mililitre değişken olarak değiştirin ve kesir toplayıcı arayüzünün her dakika bir mililitre kesir toplamasına izin vermek için oynat düğmesine basın.

Son olarak, mavi kovalama çözeltisi son tüpe girdikten sonra durdur'a basın. PolyZone profilleme, IRA'ların aracılı çevirisinde PD CD4'ün spesifik katılımını göstermek için anahtar bir tekniktir. Örneğin, bu deneyde, HEC 2 93 hücreleri, PDC D four'un endojen seviyelerini tüketmek için geçici olarak transfekte edildi ve daha sonra PolyZone profil analizine tabi tutuldu.

PDC D dört seviyelerinin düşürülmesi, PolyZone profilindeki değişikliklerin eksikliği ile değerlendirildiği gibi genin global translasyonunu bozmadı. SI kontrolü ve IPD CD'si karşılaştırıldığında, benzer şekilde, XIAP'ın IRA olmayan bir varyantının polizom dağılımı, tedavi edilen ve tedavi edilmeyen hücreler arasında değişmedi. Buna karşılık, XIAP ve BCL XL mRNA'larını barındıran iki IS'nin polizom dağılımı önemli ölçüde değişmiştir.

PD CD4'ün yokluğunda, bu iki mRNA'nın dağılımı ağır ribozomlara kaydırıldı. Buna, XIAP ve BCL XL mRNA'nın kararlı durum seviyelerindeki değişiklikler eşlik etmediğinden, bu sonuçlar, Western çiçeklenmesi ile daha da onaylandığı gibi, PDC D dört seviyesi azaltılmış hücrelerde XIAP ve BCL XL'nin gelişmiş translasyonunu göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, Sükroz bölgesini hazırlayarak ve ultrasantrifüjleme ile polizomu ayırarak mRNA translasyonunun nasıl ölçüleceğini iyi anlamış olmalısınız.