Name: Polizom Profil Yöntemi ile memeli hücrelerine selektif mRNA dönüşümüyle Değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Öğrenin, polizom profil yöntemiyle memeli hücrelerinde stres koşullarında seçici olarak çevrilen mRNA'ları nasıl belirleyeceğinizi. Bu teknik, translasyon düzenlemesini ve hücresel adaptasyon mekanizmalarını incelemek için değerlidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Laboratuvarın geçmiş ve şimdiki üyelerine, özellikle de Urszula Liwak'a, polizom profil oluşturma protokolleri ve veri paylaşımı ile ilgili kritik tartışmalar için minnettarız. Bu çalışma, Kanada Sağlık Araştırmaları enstitüleri, Kanser Araştırma Derneği ve Kanada Ulusal Bilim ve Mühendislik Araştırma Konseyi'nden MH'ye verilen işletme hibeleri ile desteklenmiştir. MDF, Vanier Kanada Yüksek Lisans Bursu Doktora Ödülü ve Ontario Yüksek Lisans Bursu tarafından desteklenmiştir ve bu çalışma doktora tezinin bir parçasını oluşturmaktadır.

<ol><li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+in+stress+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).</li>
<li>Obrig, T. G., Culp, W. J., McKeehan, W. L., Hardesty, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+by+which+cycloheximide+and+related+glutarimide+antibiotics+inhibit+peptide+synthesis+on+reticulocyte+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The mechanism by which cycloheximide and related glutarimide antibiotics inhibit peptide synthesis on reticulocyte ribosomes.</a> J Biol Chem. 246 (1), 174-181 (1971).</li>
<li>Tscherne, J. S., Pestka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+protein+synthesis+in+intact+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Inhibition of protein synthesis in intact HeLa cells.</a> Antimicrob Agents Chemother. 8 (4), 479-487 (1975).</li>
<li>Damgaard, C. K., Lykke-Andersen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+coregulation+of+5%27TOP+mRNAs+by+TIA-1+and+TIAR%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Translational coregulation of 5'TOP mRNAs by TIA-1 and TIAR.</a> Genes Dev. 25 (19), 2057-2068 (2011).</li>
<li>Thakor, N., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRES-mediated+translation+of+cellular+messenger+RNA+operates+in+eIF2alpha-+independent+manner+during+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">IRES-mediated translation of cellular messenger RNA operates in eIF2alpha- independent manner during stress.</a> Nucleic Acids Res. 40 (2), 541-552 (2012).</li>
<li>McKinney, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+reprogramming+of+the+cellular+translational+landscape+facilitates+cytomegalovirus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Global reprogramming of the cellular translational landscape facilitates cytomegalovirus replication.</a> Cell Rep. 6 (1), 9-17 (2014).</li>
<li>Jivotovskaya, A. V., Valasek, L., Hinnebusch, A. G., Nielsen, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+translation+initiation+factor+3+%28eIF3%29+and+eIF2+can+promote+mRNA+binding+to+40S+subunits+independently+of+eIF4G+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic translation initiation factor 3 (eIF3) and eIF2 can promote mRNA binding to 40S subunits independently of eIF4G in yeast.</a> Mol Cell Biol. 26 (4), 1355-1372 (2006).</li>
<li>Gross, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+Loading+onto+the+mRNA+Cap+Is+Driven+by+Conformational+Coupling+between+eIF4G+and+eIF4E%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ribosome Loading onto the mRNA Cap Is Driven by Conformational Coupling between eIF4G and eIF4E.</a> Cell. 115 (6), 739-750 (2003).</li>
<li>Graber, T. E., Baird, S. D., Kao, P. N., Mathews, M. B., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF45+functions+as+an+IRES+trans-acting+factor+that+is+required+for+translation+of+cIAP1+during+the+unfolded+protein+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">NF45 functions as an IRES trans-acting factor that is required for translation of cIAP1 during the unfolded protein response.</a> Cell Death Differ. 17 (4), 719-729 (2010).</li>
<li>Spriggs, K. A., Stoneley, M., Bushell, M., Willis, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-programming+of+translation+following+cell+stress+allows+IRES-mediated+translation+to+predominate%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Re-programming of translation following cell stress allows IRES-mediated translation to predominate.</a> Biol Cell. 100 (1), 27-38 (2008).</li>
<li>Uniacke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+oxygen-regulated+switch+in+the+protein+synthesis+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An oxygen-regulated switch in the protein synthesis machinery.</a> Nature. 486 (7401), 126-129 (2012).</li>
<li>Liwak, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+suppressor+PDCD4+represses+internal+ribosome+entry+site-mediated+translation+of+antiapoptotic+proteins+and+is+regulated+by+S6+kinase+2%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tumor suppressor PDCD4 represses internal ribosome entry site-mediated translation of antiapoptotic proteins and is regulated by S6 kinase 2.</a> Mol Cell Biol. 32 (10), 1818-1829 (2012).</li>
<li>Occhi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+mutation+in+the+upstream+open+reading+frame+of+the+CDKN1B+gene+causes+a+MEN4+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">A novel mutation in the upstream open reading frame of the CDKN1B gene causes a MEN4 phenotype.</a> PLoS Genet. 9 (3), (2013).</li>
<li>Faye, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+composition+of+cellular+internal+ribosome+entry+sites+defines+dependence+on+NF45+and+predicts+a+posttranscriptional+mitotic+regulon%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nucleotide composition of cellular internal ribosome entry sites defines dependence on NF45 and predicts a posttranscriptional mitotic regulon.</a> Mol Cell Biol. 33 (2), 307-318 (2013).</li>
<li>Zong, Q., Schummer, M., Hood, L., Messenger Morris, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+translation+state%3A+the+second+dimension+of+high-throughput+expression+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">RNA translation state: the second dimension of high-throughput expression screening.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (19), 10632-10636 (1999).</li>
<li>Bunnik, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+profiling+reveals+translational+control+of+gene+expression+in+the+human+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Polysome profiling reveals translational control of gene expression in the human malaria parasite Plasmodium falciparum.</a> Genome Biol. 14 (11), (2013).</li>
<li>Choudhuri, A., Maitra, U., Evans, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+initiation+factor+eIF3h+targets+specific+transcripts+to+polysomes+during+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Translation initiation factor eIF3h targets specific transcripts to polysomes during embryogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (24), 9818-9823 (2013).</li>
<li>Corbin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fragile+X+mental+retardation+protein+is+associated+with+poly%28A%29%2B+mRNA+in+actively+translating+polyribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">The fragile X mental retardation protein is associated with poly(A)+ mRNA in actively translating polyribosomes.</a> Hum Mol Genet. 6 (9), 1465-1472 (1997).</li>
<li>Riley, A., Jordan, L. E., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+5%27+UTRs+regulate+XIAP+expression+under+normal+growth+conditions+and+during+cellular+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Distinct 5' UTRs regulate XIAP expression under normal growth conditions and during cellular stress.</a> Nucleic Acids Res. 38 (14), 4665-4674 (2010).</li>
<li>Thermann, R., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+miR2+induces+pseudo-polysomes+and+inhibits+translation+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Drosophila miR2 induces pseudo-polysomes and inhibits translation initiation.</a> Nature. 447 (7146), 875-878 (2007).</li>
<li>Darnell, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FMRP+stalls+ribosomal+translocation+on+mRNAs+linked+to+synaptic+function+and+autism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism.</a> Cell. 146 (2), 247-261 (2011).</li>
<li>Graber, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactivation+of+stalled+polyribosomes+in+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Reactivation of stalled polyribosomes in synaptic plasticity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (40), 16205-16210 (2013).</li>
<li>Wang, Y., Ringquist, S., Cho, A. H., Rondeau, G., Welsh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+polyribosome+fractionation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">High-throughput polyribosome fractionation.</a> Nucleic Acids Res. 32 (10), (2004).</li>
<li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li>
<li>Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+profiling%3A+new+views+of+translation%2C+from+single+codons+to+genome+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale.</a> Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).</li>
<li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nat Protoc. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Polysomal profil farklı tedavi koşulları altında belirli transkript çeviri devletin ölçümü için olanak sağlayan güçlü bir tekniktir. Prensip çok basit bir tekniktir ama iyi Polizom profilleri üretmek için kritik bazıları yürütme birkaç adımları gerektirir. 1) RNazsız kimyasallar ve plastik malzeme kullanılarak, 2) (iyi sakaroz geçişlerini hazırlamak bizim deneyim% 10-50 sakaroz geçişlerini verimli bağlı ribozomlarla 40 / 60S alt birimleri ve mRNA&#39;lan) çözümlemek için en iyi iş, ve 3: Bu tuş adımlar ) en yüksek çeviri oranlarını yakalamak için katlanarak büyüyen hücreleri ve fazla% 80 konfluent kullanarak. Bu tür gen demonte veya aşırı ekspresyonuna sürece hücre tedavileri, yaparken plaka hücre miktarı hücreler son ucunda birleştirilebilmeli ne kadar bir fonksiyonu olacaktır, böylece bu ikinci aşaması dikkate alınmalıdır. Sonuçlarda Konusuted burada, Polizom profili analizi IRES&#39;e-barındıran mRNAlar XIAP ve Bcl-xL 12 çeviri düzenlenmesinde PDCD4 rol değerlendirmek için önemli bir araç oldu. Biz PDCD4 knock-down (Şekil 1B) üzerine genel Polizom profillerinde herhangi bir değişiklik dikkat etmedi aslında bize PDCD4 deney koşullarında küresel hücresel çeviri zarar vermedi sonucuna izin verdi. Önümüzdeki PDCD4 veya kontrol siRNA&#39;lara ile tedavi hücrelerde XIAP ve Bcl-xL mRNA&#39;ların dağılımını belirlemek için RT-qPCR analizi kullanılmıştır. Bu mRNA&#39;nın dağılımının niceliksel yerine Yarı-nicel analiz için ve tedaviler arasında çeviri verimliliği ince değişimlerin saptanması için sağlar, çünkü QPCR, standart RT-PCR veya Northern Blot karşıt olarak, polisom profilleri analiz için tercih edilen bir yöntemdir. Bu tekniği kullanarak, XIAP ve Bcl-xL mRNA&#39;ların dağılımı (gr edilen toplam hedef mRNA&#39;nın bir yüzdesi olarak ifade edilen bu gösterebilmişlerdiradient) belirgin ve böylece, bu mRNA çevirisinde bir artışla, PDCD4 knock-down (Şekil 1D, e) bunlarla ilişkili ribozom çok sayıda) ağır poliribozomların (mRNA içine kaydırılmıştır. Bu da XIAP ve Bcl-xL protein düzeyinde değil, bunların kararlı durum RNA düzeyi (Şekil 1F, G), bir artış ile teyit edilmiştir. Önemli bir şekilde, XIAP olmayan IRES varyantının polisom dağılımı tedavi edilen ve edilmeyen hücreleri (Şekil 1C) arasında aynı idi. Seçenek olarak ise, dönüşüm etkinliğini 14 (genellikle 2-4 fraksiyonlar) monosomes karşı polizom mRNA içeriği olan bir oranda (genellikle 5-10 fraksiyon) olarak sunulabilir. 254 nm absorbans okuma gözlenen zirveleri kendi ribozomal RNA (deterjan isnat edilemez olarak protokol boyunca kontrolleri kullanımı sonucu profilleme herhangi Polizom doğrulayarak önemlidirörneğin Triton X-100 gibi ler, kuvvetli) spektrumun bu bölgede absorbe ve gradyan üstündeki 40 / 60S tepe gizleyebilir. Lisatı olmayan ve / veya lisat tamponu ile Boş gradyanı, 254 nm&#39;de abzorbans, tamponlar nispi katkısının belirlenmesi için çalıştırılması gerekir. Artefactual yüksek mertebeden yapılar da aslında hiçbiri (örneğin &quot;sözde Polisomlar&quot; 20) vardır polizom hatalı yorumlara yol açabilir. Magnezyum Ayrılan iki değerlikli katyon kenetleme maddesi EDTA (80S ribozomlar stabilize etmek için işlem boyunca kullanılan) büyük (60S bileşen küçük (40S) içine ribozom ayrılmasına neden olacaktır lizatlarına ve gradyan tamponu (15 dakika için 20 mM) eklendi ) alt birimi. 260 nm&#39;de kaydedilen absorbans pikleri polisomlann gerçekten de Dolayısıyla, eğer EDTA muamelesiyle tek bir maksimum mRNA ve ribozomal birimleri serbest tekabül gradyanının üst kısmında görülen edilecek şekilde profili çökecek (veriler gösterilmemiştir). RastlayanProfilin EDTA kaynaklı çökmesiyle birlikte, qPCR analiz belirli hedeflerin hepsi şimdi degrade üstünde bulunmalıdır. Bir mRNA ile ilişkili ribozomların sayısı her zaman belirli bir mRNA tercüme ediliyor nasıl verimli bir göstergesi değildir. Nitekim, polisomlar aktif çeviri okuyucu farkında olmalıdır 21,22 durdu hale geldiği özel bağlamları vardır. Transkript aktif EDTA aksine, &#39;run-off&#39; aktif bir mRNA boyunca translocating olan ribozomların neden Puromycin ile örnek, tedavi) bir tarafından yapılabilir çeviri makine ile meşgul, veya b) örnek tedavisi olsun ya da olmasın belirlenmesi Yine herhangi bir aşağı translokasyon Ribozomların &#39;run-off&#39; neden başlangıç ​​kodonu sadece ilk ribozomun translokasyonu inhibe homoharringtonin&#39;le. QPCR analizi için kontrol transkriptleri kullanılması da önemlidir. SelecBu tür XIAP IRES olmayan IRES varyant bazı temizlik genin (GAPDH, aktin, tubulin, Nucleolin), ribozomal mRNA (18S, RPL13A) halinde ya da bu durumda, farklı tedavi koşullarında etkilenmez transkript tion, önemlidir doğrulama çeviri üzerinde tedavinin etkisinin spesifik ya da genel olup olmadığını. Bu kontrol transkriptleri burada yapılan gibi analiz mRNA&#39;ların dağılımını normalize etmek için kullanılabilir (XIAP ve Bcl-xL mRNA&#39;lar, GAPDH mRNA için normalize edildi ve her fraksiyon mRNA içeriğinin toplamı ile temsil edilen toplam mRNA&#39;nın içeriğinin yüzdesi olarak ifade edildi ) ya da seçenek olarak, hedef ve kontrol mRNA&#39;lar, mutlak değerler olarak ifade edilen ve ayrı olarak gösterilebilir. giriş lizatlan (toplam hacmi genellikle,% 10) olarak QPCR analizi belirli mRNA&#39;ların dağıtımı için kontrol edecek bir adımdır. İdeal olarak, giriş lizat belirli transkriptin mRNA içeriği analiz 10 fraksiyonları mRNA muhtevası toplamının ile karşılaştırılabilir nitelikte olmalıdır. NihayetBir isteğe bağlı aşama fenol kontrol etmek için: kloroform ile ekstre etme aşaması (kedi, kloramfenikol asetil transferaz gibi) ardından qPCR sayısal olarak ve hatta kullanılabilir normalleştirmek için bir in vitro transkribe raportör mRNA ile her polisom fraksiyonu başak etmektir Veriler 14. Herhangi bir teknik olduğu gibi, polisom profil bazı sınırlamalar sunulur. Genellikle 10 kesirler bir asgari güzel Polizom dağılımları olması için toplanması gerekmektedir (çeviri verimliliğinde daha ince kaymalar 20 veya daha fazla gerekebilir) olması bu adımı 4 örneklerinin sadece maksimum olabilir anlamda, sınırlayıcı yapar Bir anda analiz rahat bir kerede RNA ekstraksiyon ve 40 örnekleri ve 4 giriş kontrolleri QPCR analizini idare edebilmek için. Örneklem büyüklüğü kolayca QPCR yapmak çoğaltır kaç transkript analiz edilecek ve kaç ile ekleyebilirsiniz, ve bu pahalıya mal olabilir. QPCR tabanlı polysomal profil a diğer kısıtlılığınalysis sadece (transkript önceden bilinen analiz edilmesi) ve çeviri genom analizi için tatbik edilemez bir aday temelli yaklaşım yapılabilir olmasıdır. Ancak, 21. yüzyılın başında, araştırmacılar DNA kullanılarak bir genomik düzeyde polysomal RNA sorguya başladı nesil dizileme 16,17 ile daha yakın zamanda 15 ve mikroarray&#39;ler. Daha çok ayrı ayrı fraksiyonların QPCR analizi yapan daha haricinde bu protokolde tarif edildiği gibi, bu güçlü bir yaklaşım olarak, polysomal profil gerçekleştirilir, genel çeviri kısımlar (genellikle fraksiyon 2-4) ve polizom parçacıklar (genellikle kısımlar) toplanır ve varyasyonları analiz monosomes DNA mikro-dizisi ya da tüm genom RNA sekansları vasıtası ile. Dolayısıyla bu yaklaşım ile, bu değerlendirmek mümkündür tüm olan dağıtım kaymalar polisomlar dan monosomes için (çeviri azalma) ya da tam tersi (çeviri artış) belirli bir tedavi üzerine mRNAlarment. Belirli mRNA Polisomlar dağıtım Doğrulama ve miktar sonra qPCR yapılabilir. Polysomal profil ilkesinin daha da güçlü kullanım ribozom profillemesidir. Bu tekniğin daha yüksek verimlilik uzatma Polizom fraksiyonların 23 yüzlerce eşzamanlı izleme sağlayan son zamanlarda bildirildi. Mutant koleksiyonları veya büyük ölçekli RNAi ekranlarında öteleme verimliliği sondalama Bu açık bir avantaj sağlamaktadır. Ribozom profil protein sentezinde 24,25 yapan ribozomlar (ribozom ayak) tarafından korunan RNA parçaları eşleştirmek için yeni nesil dizileme yararlanır bir tekniktir. Bu teknikte, ribozom translokasyon sikloheksimid (geçici) ya da emetin (geri dönüşümsüz) bir ribozom ayak izi bir popülasyonunu üretmek üzere hücre lizizi ve RNaz sindirimi ile başlık ile inhibe edilebilir. Ribozomlar, zenginleştirilmiş total RNA izole edilir ve kirletici ribozomal ve mitokondriyal ribozomal RNA çıkarılır.Yaklaşık 26-28 nükleotid RNA ayak izi izole bir cDNA kütüphanesine dönüştürülmüştür, transkripsiyonu ve 26 dizilenmiştir ters. Standart Polizom profilleme aksine, bu yaklaşım sadece translationally düzenlenir belirli mRNA&#39;lan tanımlayan değil aynı zamanda belirli bir transkript boyunca tam işgal ve ribozomların yoğunluğu gibi kodon çözünürlükte mRNA özgü bilgileri verir. O nerede oluştuğunu transkript ribozom-istihdamına hakkında daha fazla bilgi verebilir Bu, özellikle, bu tür IRES-yataklık mRNA&#39;lanmn gibi çeviri özel modları ile mRNA&#39;larL için ilginçtir.

Protein sentezi (translasyon) düzenlenmesi, iyice hücre hayatta kalma ile bağlantılı önemli bir hücresel süreçtir. Çeviri hücrenin enerji% 50&#39;sinden fazlasını tüketir göz önüne alındığında, bu çeviri sıkı bir şekilde düzenlenmiştir ki ve çeviri tedirginlikler iyi tolere edilmez olması şaşırtıcı değildir. Tersine, bir çok sapkın hücresel süreçlerle nakil mekanizması ve çeviri çıkış (yani proteom) değiştirilmek üzere olmasını gerektirir. Bu genellikle, çeşitli stres cevabı ve hastalık durumlarında da olduğu, ve muhtemelen en iyi kanser örneklenmiştir. Translasyon kontrolünde önemli bir avantajı, hızlıca, çeşitli iç ve dış tetikleyicilere karşılık olarak protein çıkışı yeniden programlamak hücrelerin yeteneği, ve böylece ince ayar mekanizması olduğunu şunun hücre yaşamı ve ölümüyle 1 arasındaki denge. Öteleme kontrolü iki yönü özellikle ilginçtir; düzenleyici mec doğa anlayışıilk yerde seçici çeviri ortaya, özel tetikle idare hücresel yanıt olarak katılmak hanism (ler) ve kontrol belli bir çeviri izin elemanları, ve spesifik mRNA tespiti ve bunların protein ürünleri. Polizom profil Her iki yöntemin etkin çalışma sağlayan bir tekniktir. Polizom profil tekniğinin genel amacı eğitim ve farklı hücresel şartlar altında belirli mRNA&#39;lann çeviri durumunu ölçmek için. Tekniğin temel ilkesi, böylece, bir sükroz gradyanı üzerinde ultra-santrifüj ile elde edilen poliribozomların &#39;dondurulması farklı kopyalar üzerinde aktif çeviri ribozomlar ve ayrı&#39; (birkaç ribozom bağlayıcı) son derece çevrilmiş transkriptler arasında bir ayrım için izin vererek mRNA dönüşümüyle yakalamak için kötü (bir veya iki ribozomlar bağlı) olanlar çevrilmiştir. Bu özel protokol, antibiyotik sikloheksimidin bağlandığım60S ribozomal alt birim ve bloklar ribozom E sitesinden 2 deasetillenmiş tRNA serbest, ribozom translokasyon inhibe ve çeviri mRNA üzerinde ribozomlar durak için kullanılır. Ancak, aynı zamanda blok yapıldı uzama 3, kullanılabilirler, örneğin, emetin gibi bloke edici maddeler. Western blotting ve çeviri işleminin son çıkış ölçmek 35S-metionin etiketleme teknikleri farklı olarak, bu nedenle, farklı koşullar altında mekanizmalarından ilişkin daha ayrıntılı bir çalışma için izin veren, profil aktif çevrilmemiş mRNA ile ribozom ilişki ölçüm avantajına sahiptir polisom. Bu yüzden, tekniği kolayca özel çeviri 4-6 farklı modlar incelemek için adapte edilebilir, protein faktörleri çeviri düzenleme, 7-9, protein sentezini 1,10,11 ya da üst baş yangınlar ya da mRNA yapıları etkilerini etkileyen, gerilimli şartlar yer Protein synth açık okuma çerçeveleriagenezis 12-14. Günümüzde, polisom profil uygulama daha geniş polisomlann ilişkili mRNA&#39;ları analiz etmek için, DNA mikrodizilerinin 15 ya da yeni nesil dizileme 16,17 kullanımı ile bulunmaktadır.

<table><tbody><tr><td>Gradient Master 108 otomatik gradyan yapıcı</td><td>BIOCOMP</td><td>107-201M</td><td></td></tr><tr><td>Otomatik Densi-Flow iki odacıklı gradyan yapıcı</td><td>LABCONCO</td><td>4517000</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Ultrasantrifüj ve nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>Model # L-100-XP</td><td></td></tr><tr><td>Yoğunluk gradyan fraksiyonlayıcı</td><td>TELEDYNE ISCO</td><td>69-3873-246</td><td>Şunlardan oluşur: tüp delme sistemi, &nbsp; peristaltik pompa, 254 ve 280 nm filtreli UA-6 Dedektörü ve Foxy R1 Fraksiyon Toplayıcı</td></tr><tr><td>WinDaq veri toplama yazılımı</td><td>DATAQ INSTRUMENTS</td><td>WINDAQ / LITE</td><td></td></tr> <tr><td>http://www.dataq.com/products/software/acquisition.htmPollyallomer ultrasantrifüj tüpleri (SW41 için, 14 x 89 mm)</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease içermeyen 2 ml'lik santrifüj tüpleri (yunus burnu)</td><td>DiaMed</td><td>PRE1900-N</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease içermeyen 2 ml santrifüj tüpleri (düz tabanlı)</td><td>SafeSeal</td><td>12000</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz (nükleaz içermez)</td><td>Calbiochem</td><td>573113</td><td>MW = 342,3 g/mol</td></tr><tr><td>Sikloheksimid</td><td>SIGMA</td><td>C7698</td><td>MW = 281.4 g/mol. DMSO'da tekrar süspanse edin ve uzun süreli sotraj için -80C'de tutun. Dikkat: ZEHİRLİ! Solunum yollarına ve cilt tahrişine neden olabilir. Tartı yaparken maske takın.</td></tr><tr><td>Sodyum klorür (nükleaz içermez)</td><td>OmniPur</td><td>7710</td><td>MW = 58.44 g/mol</td></tr><tr><td>MgCl2.6H2O (nükleaz içermez)</td><td>OmniPur</td><td>5980</td><td>MW = 203.3 g/mol</td></tr><tr><td>Tris Baz (nükleaz içermez)</td><td>JT Baker</td><td>4109-01</td><td>MW = 121.14 g/mol</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>OmniPur</td><td>9400</td><td>Dikkat: ZEHİRLİ! Solunum yollarına ve cilt tahrişine neden olabilir</td></tr><tr><td>Rekombinant RNasin Ribonükleaz İnhibitörü</td><td>Promega</td><td>N2515</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap Rnaze inaktivasyon solüsyonu</td><td>Ambion, Yaşam Teknolojileri</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>GlycoBlue Kopreçökeltican (15 mg/ml)</td><td>İnvitrojen, Yaşam Teknolojileri</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>Asit-Fenol:Kloroform, pH 4.5 (IAA ile, 125:24:1)</td><td>Ambion, Yaşam Teknolojileri</td><td>AM9722</td><td>Dikkat: ZEHİRLİ! Solunum yollarında tahrişe ve ayrıca cilt tahrişine ve korozyona neden olabilir</td></tr></tbody></table>

polizom profil yöntemi ile memeli hücrelerine selektif mrna dönüşümüyle değerlendirilmesi

Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

Protein sentezi Düzenleme strese hücre yanıt olarak önemli bir kontrol noktasını temsil eder. Özellikle, gizli RNA, düzenleyici elemanlar tipik olarak belirli bir stres tepkisi için gerekli olan proteinler için kodlayan spesifik mRNA, seçici çeviri izin vermek için gösterilmiştir. Bu mRNA&#39;lardan yanı sıra seçici çeviri sorumlu düzenleyici mekanizmaların karakterizasyonu Kimlik süredir moleküler biyoloji ön planda olmuştur. Polizom profilleme bu çalışmalarda bir dönüm yöntemdir. Polizom profil amacı, farklı kopyalar üzerinde aktif çeviri ribozomlar immobilize edilmesi ile mRNA dönüşümüyle yakalamak ve bu yüzden de çok tercüme transkript ve kötü tercüme olanlar arasında bir ayrım sağlayan, bir sükroz gradyanı üzerinde ultra-santrifüj ile elde edilen poliribozomların ayırmaktır. Bu daha sonra, klasik biyokimyasal ve moleküler biyoloji yöntemleri ile ayırt edilebilir. Önemli bir şekilde, birleştirme syüksek kapasiteli genomik yaklaşımları ile olysome profil öteleme düzenlemenin bir büyük ölçekli analizi sağlar.

Biz son zamanlarda apoptotik inhibitörleri XIAP ve Bcl-xL 12 kodlayan mRNA&#39;lan IRES-barındıran bir seçici çeviri inhibitörü olarak tümör baskılayıcı PDCD4 için yeni bir rol tarif var. Polizom profil IRES-aracılı çeviri PDCD4 özel katılımını göstermek için önemli bir tekniktir. HEK293 hücreleri geçici PDCD4 (Şekil 1A) endojenik düzeylerini tüketmek için transfekte edilmiş ve daha sonra profil analizleri polisom tabi tutuldu. Biz siCTRL ve siPDCD4 ile işlenen hücrelerde (Şekil 1B) karşılaştıran polisom profilindeki değişikliklerle eksikliği ile karar PDCD4 azaltılması kat, küresel hücresel Çeviri zarar almadığı gözlemlenmiştir. Benzer şekilde, XIAP 19 olmayan IRES varyantının polisom dağılımı, işlenmiş ve işlenmemiş hücreleri (Şekil 1C) arasında aynı idi. Buna karşılık, iki IRES-barındıran mRNA&#39;ların polisom dağılımı, XIAP ve Bcl-xL, önemli ölçüde değişmiş edildi. P yokluğundaDCD4 Bu iki mRNA&#39;ların dağılımı ağır ribopolysomes (Şekil 1D, E) içine kaydırılır. Bu XIAP ve Bcl-xL, mRNA (Şekil 1F), bu sonuçlar kararlı durum seviyelerinde değişikliklere eşlik olmadığından daha ileri olarak Western lekeleme (Şekil ile teyit edilmiştir, indirgenmiş PDCD4 seviyeleri ile hücrelerde XIAP ve Bcl-xL translasyonunu daha zengin oldukları bilinir 1G). <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52295/52295fig1highres.jpg" /> Şekil 1:. Polisom profil XIAP ve Bcl-xL çeviri seçici önleyicisi olarak PDCD4 tanımlayan (A), HEK293 hücreleri PDCD4 siRNA veya kontrol (CTRL) ile muamele edildi, bir anti-PDCD4 lizlendi ve Western blot analizine tabi tutulmuştur siRNA olmayan hedefleme ve anti-Nucleolin antikorları. PDCD4 knock-down kapsamını doğrulamak (B) PDCD4 (A) gibi yıkıldığında veHücre lizatları, profil polisom tabi tutuldu. Temsilci Polizom profil üst panelde gösterilir; XIAP olmayan IRES (C) dağılımı, GAPDH edilene göre, Bcl-xL (D) ve XIAP IRES (E) mRNAlar, her bir parça halinde toplam mRNA yüzde (% mRNA) olarak gösterilmiştir. (F) Sabit -durum mRNA seviyeleri PDCD4, siRNA veya Kontrol (CTRL) siRNA ile muamele görmüş hücreler RT-qPCR ölçüldü. (G) &#39;den Lizatlar (A)&#39; da, anti-XIAP, anti-Bcl-xL, ve birlikte western blot analizine tabi tutulmuştur Anti-Nucleolin antikorlar. (NB. Veri başlangıçta 12 yayınlandı Şekil 1&#39;de sunulan) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52295/52295fig1large.jpg" target="_blank">bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Hücrelerin strese uyum sağlama yeteneği, hayatta kalmaları için çok önemlidir. mRNA translasyonunun düzenlenmesi, proteomun hızlı bir şekilde düzenlenmesini sağlayan böyle bir adaptasyon stratejisidir. Burada, stres koşulları altında seçici olarak çevrilen spesifik mRNA'ları tanımlamak için standartlaştırılmış bir polizom profilleme protokolü sunuyoruz.

Polizom Profil Yöntemi ile memeli hücrelerine selektif mRNA dönüşümüyle Değerlendirilmesi

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, poliribozomların immobilizasyonu ve ayrıştırılması yoluyla yüksek ve düşük düzeyde transle edilen mRNA'lar arasında ayrım yapmaktır. Bu işlem, öncelikle hücrelerin ribozom translokasyonunu ve RNA translasyonunu inhibe etmek için hücrelere sikloheksimid eklenerek gerçekleştirilir. İkinci adımda, işlem görmüş hücrelerden elde edilen lizatlar bir sükroz gradyanına yüklenir ve depolanan poliribozomları kütlelerine göre ayırmak için ultrasantrifüjle çevrilir.Ardından, son adımda yüksek ve düşük düzeyde çevrilmiş transkriptleri ayırmak için gradyan eşit fraksiyonlara bölünür. Her bir fraksiyonda ilgilenilen mRNA'ların varlığını tespit etmek için R-T-Q-P-C-R kullanılır. Nihayetinde, ribozom profilleme, farklı fizyolojik ve patofizyolojik streslere yanıt olarak mRNA'nın hem genel hem de spesifik çevirisindeki değişiklikleri tespit etmek için kullanılabilir.PolyOne profilleme, hangi mRNA'ların S stresine maruz kaldığında seçildiği ve transle edildiği ile bunun hücrelerin bu koşullara adapte olmasına nasıl olanak tanıdığı gibi moleküler ve hücre biyolojisi alanlarındaki temel soruları yanıtlayabilir. Bu prosedürün gösterimi, laboratuvardaki bir lisansüstü öğrencisinin sorumluluğundadır. Bir sükroz gradyanı hazırlamak için otomatik gradyan hazırlayıcıyı kullanmak üzere, önce gradyan hazırlayıcıyı açın ve gradyanları tutacak olan plakayı düzlemleyin; plaka düzlendiğinde "tamam" seçeneğine tıklayın.Ardından gradyan programını seçmek için grad menüsünü ve seçme listesini açın. SW 41'e tıklayın ve ardından listede %10'dan %50'ye 11 basamaklı gradyan programı görünene kadar kaydırıp Use'a basın. Sonrasında, bir SW 41 konik ultrasantrifüj tüpünü işaretleme bloğuna yerleştirin ve bloğun üst basamağı boyunca tüp üzerine bir çizgi çizmek için verilen ince tüp işaretleyiciyi kullanın.Tüpleri sabit bir yüzey üzerindeki uygun bir rafa yerleştirin ve ardından sağlanan iki kanülü iki adet 10 mililitrelik şırıngaya takın. Şırıngaları yıkamak için aktivasyon çözeltisindeki RNA'ları içeren ılık distile suyu birkaç kez pipetle çekip boşaltın. Ardından suyun tüm izlerini giderdikten sonra, şırıngalardan birini %10 sükroz ve sikloheksid ile doldurun ve kanülü ultrasantrifüj tüpünün tabanına yerleştirin.Hava kabarcığı oluşmamasına dikkat ederek, çözeltiyi tüp üzerine konulan işaretin hemen geçene kadar yavaşça dağıtın. Ardından, diğer şırıngayı %50 sükroz ve sikloheksamid karışımı ile doldurun ve tüp üzerindeki fazla sıvıyı bir mendille temizleyin.Kanülü kullanarak %50 sükroz çözeltisini tüpün içine yavaşça aktarın; çözelti işaretle aynı seviyeye geldiğinde işlemi durdurun ve ardından kanülü hızlı ve pürüzsüz bir hareketle çıkarın. %10 sükroz çözeltisi, tüpün üst kısmında bir menisküs oluşturacak şekilde yükselmelidir. Ardından, hava kabarcıklarını uzaklaştırmak için ultrasantrifüj tüpünü hafifçe eğin ve kapağı yerleştirin; kapağın rezervuarındaki fazla sıvıyı bir mikropipet yardımıyla alın.Tüpleri gradyan oluşturucuya yerleştirin ve ardından çalıştırma düğmesine basın. Plakanın belirtilen açıda eğileceğine dikkat edin. Beş saniye bekleyin, ardından gradyanı oluşturmak için rotasyonlar başlayacaktır.Yaklaşık iki dakika sonra, cihaz gradyan oluşumunun tamamlandığını belirten bir bip sesi çıkaracaktır. Gradyanı bozmamak için tüpleri nazikçe bir rafa aktarın ve kapakları tek bir yukarı yönlü hareketle hızlıca çıkarın. Ardından, önceden hazırlanmış hücre lizatından her bir sakroz gradyanına eşit miktarda 260 birim nazikçe yükleyin ve tüpleri bir ultrasentrifüjde bir buçuk saat boyunca 260.343 ×g ve 4 °C'de döndürün.Gradyan fraksiyonlama sistemi cihazını kurmak için öncelikle spektrofotometreyi açın. Ardından, ana ekrana dönmek için klasör simgesine iki kez ve ardından geri dönüş okuna iki kez tıklayın; fraksiyon toplayıcıyı PolyZone yöntemine ayarlayarak fraksiyon toplayıcıdaki valfin atık konumuna getirildiğinden emin olun. Çöp kutusu simgesine yönelen oka tıklayın ve ardından atık toplama tüpünün altına distile su içeren 250 mililitrelik bir MIA erlenmayer yerleştirin.Şimdi grafik kaydedici üzerinde şu ayarları seçin: lamba ve optik ayarları için hassasiyet kadranını, gürültü filtresini 1.5'e, pik ayırıcı kadranını "off" konumuna, grafik hız kadranını saatte 30 santimetreye getirin ve spektrofotometre ünitesinin üstündeki temel çizgi ayar kadranını maksimum açık konuma getirin. Ardından şırıngayı ve gövdeyi pompaya yerleştirin ve sağlanan vidalar ile Alan Anahtarını kullanarak yerlerine sıkıca sabitleyin.Şırıngayı kovalama çözeltisiyle doldurmak için rev komutunu yüksek hızda kullanın. Ardından pompayı dik konuma getirin ve havayı tüplerden dışarı itmek için forward komutunu kullanın. Sonra, tutucuya RNAs free water ile doldurulmuş bir ultrasentrifüj tüpü yerleştirin ve iki siyah işaret görünene kadar kanülü tübe batırın.Dağıtım deliği iki işaretin arasındadır. Şırınga pompasını ileri manuel modda 6,0 milliliters per minute hızda çalıştırın. Sürükleme çözeltisi tüpün üçte birini doldurduğunda, hızı 1,0 milliliters per minute akış hızına sahip değişken moda getirin.Şimdi, grafikteki voltaj sıfıra ulaşana kadar spektrofotometredeki taban çizgisi ayarlama (baseline adjust) düğmesini çevirin. Su, atık tüpünden el Mya balonuna akmaya başlayacaktır. Ardından istenen hassasiyeti 1.0 au olarak ayarlayın.Hassasiyet ayarlandığında, baseline düğmesine basın ve grafik kaydedicideki baseline ayarını %10 işaretine getirmek için kaydedici offset kadranını çevirin. Ardından, stabil bir baseline elde edildiğinde, pompa şalterini ve grafik hızı kadranını kapalı konuma getirin. Pompa kapandıktan sonra, chase solüsyonu delme kanülündeki ilk işarete ulaşana kadar geri toplamak için pompayı rev konumuna getirin.Ardından santrifüj tüpünü çıkarın, kanül içindeki hava kabarcıklarını az miktarda sürükleme çözeltisi (chase solution) ile dağıtın ve gradyanı fraksiyonlara ayırmak için akış hücresinden sızmış olabilecek kalıntı suları temizleyin. Daha sonra, sakkaroz gradyanı içeren santrifüj tüpünü tutucuya yerleştirin ve kanülü tüpe batırın. Sonra, kapakları yukarıya doğru çıkıntı yapmayacak şekilde, iki mililitrelik on adet mikro santrifüj tüpünü fraksiyon toplayıcı tepsisinin iki ile 11 arasındaki konumlarına ve bir atık tüpünü birinci konuma yerleştirin.Pompa kontrol kadranını manuel konuma ve şırınga pompasındaki akış hızını dakikada 6,0 mililitreye ayarlayın. Ardından, kol ilk tüpe ulaşır ulaşmaz fraksiyon toplayıcıdaki oynat düğmesine basın. Kolu konumlandırmak ve fraksiyon dağıtım valfini açmak için duraklatma düğmesine basın.Ardından, pompayı başlatmak için ileri komutunu kullanın ve grafik kaydedici kalemini izleyin. Kalem yukarı doğru sapmaya başladığında, bu numunenin akış hücresinden geçtiğini gösterir; bu aşamada atık tüpünü hızlıca bir numaralı tüple değiştirin. İlk damla toplandığında, komutları hızlıca uzaktan başlatma, durdurma ve dakikada 1,0 mililitre değişken hız seçeneklerine getirin ve fraksiyon toplayıcı arayüzünün her dakika bir mililitrelik fraksiyonlar toplamasını sağlamak için oynat düğmesine basın.Son olarak, mavi kovalama çözeltisi son tüpe girdiğinde durdurma düğmesine basın. PolyZone profilleme, IRAs aracılı translasyonda PD CD4'ün spesifik rolünü göstermek için temel bir tekniktir. Örneğin, bu deneyde, endojen PDC D dört seviyelerini azaltmak için HEC 2 93 hücreleri geçici olarak transfekte edilmiş ve ardından PolyZone profil analizine tabi tutulmuştur.PolyZone profilindeki değişikliklerin yokluğuna bakılarak değerlendirildiği üzere, PDC D four seviyelerinin düşürülmesi genin global translasyonunu bozmamıştır. SI kontrolü ve IPD CD four uygulanmış hücreler karşılaştırıldığında, XIAP'ın bir non IRAs varyantının polisom dağılımı, uygulanmış ve uygulanmamış hücreler arasında değişmemişti. Buna karşılık, iki IS içeren mRNA'lar olan XIAP ve BCL XL'in polisom dağılımı önemli ölçüde değişmiştir.PD CD4 yokluğunda, bu iki mRNA'nın dağılımı ağır ribozomlara kaymıştır. Bu durum XIAP ve BCL XL mRNA'larının kararlı durum seviyelerindeki değişimlerle birlikte gerçekleşmediğinden, bu sonuçlar, Western blotting ile daha da doğrulandığı üzere, azalmış PDC D dört seviyelerine sahip hücrelerde XIAP ve BCL XL'in artan translasyonunu kanıtlamaktadır. Bu videoyu izledikten sonra, Sükroz gradyanı hazırlayarak ve polisomları ultrasentrifüj ile ayırarak mRNA translasyonunun nasıl ölçüleceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.

assessment-selective-mrna-translation-mammalian-cells-polysome

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu makale, ökaryotik hücrelerde ribozom tercüme çıkarılması için bir protokol tanımlamaktadır. Bir kez çıkarılan, ribozom, farklı ribozomal popülasyonlar analiz izin vermek için sukroz gradient fraksiyonlandırmasıyla monosomes ve polyribosomes içine ayrılır. Gibi, bu yöntem çeviri düzenleme incelenmesi için altın standarttır.

Ökaryotik Polyribosome Profil Analizi

Burada, stres koşullarında tepki olarak ökaryotik hücrelerin mRNA çevirisi başlatılmasında değişiklikleri analiz etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem olmayan çeviri ribozom ribozomlan çeviri sakaroz Yokuşta hız ayrılık dayanmaktadır.

Polizom profilleme Stres Durumlardaki Çeviri başlatılması Analizi

Ribozomlar protein sentezinde önemli bir rol oynamaktadır. Sükroz yoğunluk gradyanlı santrifugasyon sureti ile Polyribosome (Polizom) fraksiyonlara ayırma, bir genom geniş bir ölçekte tek mRNA translasyon etkinliklerine doğrudan belirlenmesini sağlar. Buna ek olarak, bu yöntem, şaperonlar ve sinyal molekülleri gibi ribozom-ve Polizomdan ilişkili faktörleri biyokimyasal analizi için kullanılabilir.

Bir genom Ölçeği Polizom Fraksiyonu ve Memeli Translatomes Analizi

Ribozom Afinite Saflaştırması (TRAP) çevirisi, mRNA'nın hücre tipine özgü translasyonunu yakalayabilir. Burada, Drosophila embriyolarının nadir hücre popülasyonlarında mRNA'nın izolasyonuna adanmış ilk TRAP protokolünü rapor ediyoruz.

Nadir hücre popülasyonlarının gelen TUZAK-rc, Tercüme Ribozom Affinity Arıtma<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar

Bu protokol, bağlı ribozom sayısına dayanarak bitki dokularından transkriptleri çıkarmak ve fraksiyonlamak için kolay bir yöntemi açıklar. Translasyon aktivitesinin küresel bir tahminine ve belirli mRNA'ların translasyon durumunun belirlenmesine izin verir.

Bitki Polizom Profiling için bir Kolay Yöntem

Bu el yazması görselleştirmek ve hücre altı bölmeleri olaylarda yerelleştirilmiş çeviri ölçmek için bir yöntem açıklanır. Bu el yazması önerilen yaklaşım temel confocal görüntüleme sistemi ve Kimyasalları gerektirir ve hızlı ve düşük maliyetlidir.

Nicel ayirt ölçmek küresel çeviri lokalize

Polysome profil çıkarma tekniği genel amacı, protein sentezi sırasında translasyonel etkinlik bireysel mRNA'ların veya transcriptome mRNA'ların analizidir. Protein sentezi yönetmelik, çeviri harekete geçirmek ve baskı sağlık ve birden çok insan hastalıkları için önemli bir yöntemdir.

Polysome LEISHMANIA, insan hücreleri ve fare Testis profil oluşturma

Burada izole periosteum fare kalp üzerinde profil oluşturma polysome gerçekleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut. Biz kalp perfüzyon, profil oluşturma polysome ve polysome kesirler ile ilgili mRNA'ların, miRNAs ve polysome Proteom analizi için yöntemler açıklanmaktadır.

Dinamik proteomik ve miRNA analiz polizomlar izole fare kalp sonra Langendorff perfüzyon üzerinden

Burada RiboTag sistemini kullanarak erişkin erkek fare mikrop hücrelerinin belirli popülasyonlarından ribozomların ve ilişkili RNA'nın immünopresipitesini tanımladık. Stratejik üreme ve dikkatli immünopresipitasyon, germ hücre translatomu hakkında bilgi veren ve mutant fenotiplerin mekanizmaları hakkında bilgi veren temiz, tekrarlanabilir sonuçlar la sonuçlanır.

Erkek Farenin Germ Hücrelerinde RiboTag İmmünanyağış

Memeli beyninin gelişimi, gen ekspresyonunun çeviri düzeyinde uygun şekilde kontrolini gerektirir. Burada, gelişmekte olan beyindeki mRNA'ların çevirisel durumunu değerlendirmek için montajı kolay bir sakkaroz gradyan ve fraksiyonasyon platformuna sahip bir polisome profilleme sistemini tarif ediyoruz.

Polisome Profilleme Kullanarak Gelişen Fare Beyninde Çeviri Analizi

Bu protokol, otomatik gradyan üreticileri veya gradyan fraksiyonasyon sistemleri kullanmadan bir çoklu profilin nasıl oluşturulacağını açıklar.

Degrade Yapıcılar veya Fraksiyonasyon Sistemleri Olmadan Polizom Profilleme

Öğrenin, polizom profil yöntemiyle memeli hücrelerinde stres koşullarında seçici olarak çevrilen mRNA'ları nasıl belirleyeceğinizi. Bu teknik, translasyon düzenlemesini ve hücresel adaptasyon mekanizmalarını incelemek için değerlidir.

Polizom Profil Yöntemi ile memeli hücrelerine selektif mRNA dönüşümüyle Değerlendirilmesi

Daha fazla video keşfet