Polizom Profil Yöntemi ile memeli hücrelerine selektif mRNA dönüşümüyle Değerlendirilmesi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, poliribozomların immobilizasyonu ve ayrıştırılması yoluyla yüksek ve düşük düzeyde transle edilen mRNA'lar arasında ayrım yapmaktır. Bu işlem, öncelikle hücrelerin ribozom translokasyonunu ve RNA translasyonunu inhibe etmek için hücrelere sikloheksimid eklenerek gerçekleştirilir. İkinci adımda, işlem görmüş hücrelerden elde edilen lizatlar bir sükroz gradyanına yüklenir ve depolanan poliribozomları kütlelerine göre ayırmak için ultrasantrifüjle çevrilir.

Ardından, son adımda yüksek ve düşük düzeyde çevrilmiş transkriptleri ayırmak için gradyan eşit fraksiyonlara bölünür. Her bir fraksiyonda ilgilenilen mRNA'ların varlığını tespit etmek için R-T-Q-P-C-R kullanılır. Nihayetinde, ribozom profilleme, farklı fizyolojik ve patofizyolojik streslere yanıt olarak mRNA'nın hem genel hem de spesifik çevirisindeki değişiklikleri tespit etmek için kullanılabilir.

PolyOne profilleme, hangi mRNA'ların S stresine maruz kaldığında seçildiği ve transle edildiği ile bunun hücrelerin bu koşullara adapte olmasına nasıl olanak tanıdığı gibi moleküler ve hücre biyolojisi alanlarındaki temel soruları yanıtlayabilir. Bu prosedürün gösterimi, laboratuvardaki bir lisansüstü öğrencisinin sorumluluğundadır. Bir sükroz gradyanı hazırlamak için otomatik gradyan hazırlayıcıyı kullanmak üzere, önce gradyan hazırlayıcıyı açın ve gradyanları tutacak olan plakayı düzlemleyin; plaka düzlendiğinde "tamam" seçeneğine tıklayın.

Ardından gradyan programını seçmek için grad menüsünü ve seçme listesini açın. SW 41'e tıklayın ve ardından listede %10'dan %50'ye 11 basamaklı gradyan programı görünene kadar kaydırıp Use'a basın. Sonrasında, bir SW 41 konik ultrasantrifüj tüpünü işaretleme bloğuna yerleştirin ve bloğun üst basamağı boyunca tüp üzerine bir çizgi çizmek için verilen ince tüp işaretleyiciyi kullanın.

Tüpleri sabit bir yüzey üzerindeki uygun bir rafa yerleştirin ve ardından sağlanan iki kanülü iki adet 10 mililitrelik şırıngaya takın. Şırıngaları yıkamak için aktivasyon çözeltisindeki RNA'ları içeren ılık distile suyu birkaç kez pipetle çekip boşaltın. Ardından suyun tüm izlerini giderdikten sonra, şırıngalardan birini %10 sükroz ve sikloheksid ile doldurun ve kanülü ultrasantrifüj tüpünün tabanına yerleştirin.

Hava kabarcığı oluşmamasına dikkat ederek, çözeltiyi tüp üzerine konulan işaretin hemen geçene kadar yavaşça dağıtın. Ardından, diğer şırıngayı %50 sükroz ve sikloheksamid karışımı ile doldurun ve tüp üzerindeki fazla sıvıyı bir mendille temizleyin.

Kanülü kullanarak %50 sükroz çözeltisini tüpün içine yavaşça aktarın; çözelti işaretle aynı seviyeye geldiğinde işlemi durdurun ve ardından kanülü hızlı ve pürüzsüz bir hareketle çıkarın. %10 sükroz çözeltisi, tüpün üst kısmında bir menisküs oluşturacak şekilde yükselmelidir. Ardından, hava kabarcıklarını uzaklaştırmak için ultrasantrifüj tüpünü hafifçe eğin ve kapağı yerleştirin; kapağın rezervuarındaki fazla sıvıyı bir mikropipet yardımıyla alın.

Tüpleri gradyan oluşturucuya yerleştirin ve ardından çalıştırma düğmesine basın. Plakanın belirtilen açıda eğileceğine dikkat edin. Beş saniye bekleyin, ardından gradyanı oluşturmak için rotasyonlar başlayacaktır.

Yaklaşık iki dakika sonra, cihaz gradyan oluşumunun tamamlandığını belirten bir bip sesi çıkaracaktır. Gradyanı bozmamak için tüpleri nazikçe bir rafa aktarın ve kapakları tek bir yukarı yönlü hareketle hızlıca çıkarın. Ardından, önceden hazırlanmış hücre lizatından her bir sakroz gradyanına eşit miktarda 260 birim nazikçe yükleyin ve tüpleri bir ultrasentrifüjde bir buçuk saat boyunca 260.343 ×g ve 4 °C'de döndürün.

Gradyan fraksiyonlama sistemi cihazını kurmak için öncelikle spektrofotometreyi açın. Ardından, ana ekrana dönmek için klasör simgesine iki kez ve ardından geri dönüş okuna iki kez tıklayın; fraksiyon toplayıcıyı PolyZone yöntemine ayarlayarak fraksiyon toplayıcıdaki valfin atık konumuna getirildiğinden emin olun. Çöp kutusu simgesine yönelen oka tıklayın ve ardından atık toplama tüpünün altına distile su içeren 250 mililitrelik bir MIA erlenmayer yerleştirin.

Şimdi grafik kaydedici üzerinde şu ayarları seçin: lamba ve optik ayarları için hassasiyet kadranını, gürültü filtresini 1.5'e, pik ayırıcı kadranını "off" konumuna, grafik hız kadranını saatte 30 santimetreye getirin ve spektrofotometre ünitesinin üstündeki temel çizgi ayar kadranını maksimum açık konuma getirin. Ardından şırıngayı ve gövdeyi pompaya yerleştirin ve sağlanan vidalar ile Alan Anahtarını kullanarak yerlerine sıkıca sabitleyin.

Şırıngayı kovalama çözeltisiyle doldurmak için rev komutunu yüksek hızda kullanın. Ardından pompayı dik konuma getirin ve havayı tüplerden dışarı itmek için forward komutunu kullanın. Sonra, tutucuya RNAs free water ile doldurulmuş bir ultrasentrifüj tüpü yerleştirin ve iki siyah işaret görünene kadar kanülü tübe batırın.

Dağıtım deliği iki işaretin arasındadır. Şırınga pompasını ileri manuel modda 6,0 milliliters per minute hızda çalıştırın. Sürükleme çözeltisi tüpün üçte birini doldurduğunda, hızı 1,0 milliliters per minute akış hızına sahip değişken moda getirin.

Şimdi, grafikteki voltaj sıfıra ulaşana kadar spektrofotometredeki taban çizgisi ayarlama (baseline adjust) düğmesini çevirin. Su, atık tüpünden el Mya balonuna akmaya başlayacaktır. Ardından istenen hassasiyeti 1.0 au olarak ayarlayın.

Hassasiyet ayarlandığında, baseline düğmesine basın ve grafik kaydedicideki baseline ayarını %10 işaretine getirmek için kaydedici offset kadranını çevirin. Ardından, stabil bir baseline elde edildiğinde, pompa şalterini ve grafik hızı kadranını kapalı konuma getirin. Pompa kapandıktan sonra, chase solüsyonu delme kanülündeki ilk işarete ulaşana kadar geri toplamak için pompayı rev konumuna getirin.

Ardından santrifüj tüpünü çıkarın, kanül içindeki hava kabarcıklarını az miktarda sürükleme çözeltisi (chase solution) ile dağıtın ve gradyanı fraksiyonlara ayırmak için akış hücresinden sızmış olabilecek kalıntı suları temizleyin. Daha sonra, sakkaroz gradyanı içeren santrifüj tüpünü tutucuya yerleştirin ve kanülü tüpe batırın. Sonra, kapakları yukarıya doğru çıkıntı yapmayacak şekilde, iki mililitrelik on adet mikro santrifüj tüpünü fraksiyon toplayıcı tepsisinin iki ile 11 arasındaki konumlarına ve bir atık tüpünü birinci konuma yerleştirin.

Pompa kontrol kadranını manuel konuma ve şırınga pompasındaki akış hızını dakikada 6,0 mililitreye ayarlayın. Ardından, kol ilk tüpe ulaşır ulaşmaz fraksiyon toplayıcıdaki oynat düğmesine basın. Kolu konumlandırmak ve fraksiyon dağıtım valfini açmak için duraklatma düğmesine basın.

Ardından, pompayı başlatmak için ileri komutunu kullanın ve grafik kaydedici kalemini izleyin. Kalem yukarı doğru sapmaya başladığında, bu numunenin akış hücresinden geçtiğini gösterir; bu aşamada atık tüpünü hızlıca bir numaralı tüple değiştirin. İlk damla toplandığında, komutları hızlıca uzaktan başlatma, durdurma ve dakikada 1,0 mililitre değişken hız seçeneklerine getirin ve fraksiyon toplayıcı arayüzünün her dakika bir mililitrelik fraksiyonlar toplamasını sağlamak için oynat düğmesine basın.

Son olarak, mavi kovalama çözeltisi son tüpe girdiğinde durdurma düğmesine basın. PolyZone profilleme, IRAs aracılı translasyonda PD CD4'ün spesifik rolünü göstermek için temel bir tekniktir. Örneğin, bu deneyde, endojen PDC D dört seviyelerini azaltmak için HEC 2 93 hücreleri geçici olarak transfekte edilmiş ve ardından PolyZone profil analizine tabi tutulmuştur.

PolyZone profilindeki değişikliklerin yokluğuna bakılarak değerlendirildiği üzere, PDC D four seviyelerinin düşürülmesi genin global translasyonunu bozmamıştır. SI kontrolü ve IPD CD four uygulanmış hücreler karşılaştırıldığında, XIAP'ın bir non IRAs varyantının polisom dağılımı, uygulanmış ve uygulanmamış hücreler arasında değişmemişti. Buna karşılık, iki IS içeren mRNA'lar olan XIAP ve BCL XL'in polisom dağılımı önemli ölçüde değişmiştir.

PD CD4 yokluğunda, bu iki mRNA'nın dağılımı ağır ribozomlara kaymıştır. Bu durum XIAP ve BCL XL mRNA'larının kararlı durum seviyelerindeki değişimlerle birlikte gerçekleşmediğinden, bu sonuçlar, Western blotting ile daha da doğrulandığı üzere, azalmış PDC D dört seviyelerine sahip hücrelerde XIAP ve BCL XL'in artan translasyonunu kanıtlamaktadır. Bu videoyu izledikten sonra, Sükroz gradyanı hazırlayarak ve polisomları ultrasentrifüj ile ayırarak mRNA translasyonunun nasıl ölçüleceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.