Name: Memeli Hücreleri içinde fonksiyonel Bakteriyel Efektör elektroporasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Öğrenin, memeli hücrelerine bakteriyel efektör proteinlerini elektroporasyon ile nasıl aktaracağınızı. Konfokal immünofloresan mikroskopi ile lokalizasyon ve fonksiyon analizi yapın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma NIGMS, Ulusal Sağlık Enstitüleri (GM094623) tarafından desteklenmiştir. Bu çalışmanın önemli bölümleri, Pasifik Kuzeybatı Ulusal Laboratuvarı'nda (PNNL) bulunan bir DOE/BER ulusal bilimsel kullanıcı tesisi olan Çevresel Moleküler Bilimler Laboratuvarı'nda gerçekleştirildi. PNNL, DOE için DE-AC05-76RLO1830 Sözleşmesi kapsamında Battelle tarafından işletilmektedir.

1. Advance hazırlayın <ol><li> 37 ° C sıcak bir steril fosfat tamponlu tuz (PBS). </li><li> % 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş Eagle Medium (DMEM) ve Minimal Essential Medium (MEM) Sıcak Dulbecco modifikasyonu, 100 lU / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin, 37 ° C arasındadır. Not: Bunlar sırasıyla RAW ve HeLa hücreleri için normal Büyüme Medya (NGM) temsil eder. </li></ol> Hücreler 2. Hazırlık <ol><li> NGM içinde% 70-90 confluency RAW 264.7 hücreleri büyümek. <ol><li> Nemlendirilmiş% 95 hava /% 5 CO2 atmosferinde, 37 ° C&#39;de hücreler muhafaza edin. </li></ol></li><li> NGM içinde% 70-90 confluency HeLa hücreleri büyür. <ol><li> Nemlendirilmiş% 95 hava /% 5 CO2 atmosferinde, 37 ° C&#39;de hücreler muhafaza edin. </li></ol></li><li> Toplanmadan önce steril PBS ile bir kez, hücre tekli tabakası yıkayın. </li><li> Steril konik bir tüp içinde önceden konfluent hücreler toplanır. <ol><li> Yavaşça RAW hücreleri kazıyınPBS içinde, bir lastik policeman ile tekrar pipetleme hücre toplamalardan dağıtmak için. </li><li> Görsel muayene kültür yüzeyinden ayrışma gösterene kadar% 0.25 tripsin solüsyonu ile HeLa hücreleri ayırmak. Örneğin, T-75 balonuna için 2-3 ml kullanılır. Tripsin çözüm tüm büyüme yüzeyini kaplayan sağlamak için buna göre ses seviyesini ayarlayın. <ol><li> NGM,% 10 FBS içeren ayrılma reaksiyonu söndürün. </li><li> Hücre toplamalardan dağıtmak için tekrar pipetleme ile, tripsin için NGM en az iki hacim kullanın. </li></ol></li></ol></li><li> Hafif 4 dakika boyunca 900 x g&#39;de santrifüj ile pelet hücreleri. </li><li> Steril PBS kullanarak tripsin / söndürme çözüm olarak aynı hacimde süspanse. </li><li> Hemasitometre veya parçacık sayacı kullanarak hücreleri saymak. </li><li> Hafif 4 dakika boyunca 900 x g&#39;de santrifüj ile pelet hücreleri. </li><li> 5,5 x 10 6 6 10 x 6.0 hücre / ml PBS yeterli hacimde süspanse. Not: Örneğin, bir T-75 şişe approxim verecektirulaştırılması 7.5 x 10 6 hücre 29. </li><li> Elektroporasyon kadar buz üzerinde hücre süspansiyonu tutun. </li></ol> Elektroporasyon 3. Hazırlık <ol><li> Buz Öncesi soğuk elektroporasyon küvetler (0.4 cm boşluk). </li><li> Elektroporasyon aparatı açın ve 0,3 kV gerilim ayarlayın. NOT: Kapasite ve direnç (üretici tarafından 10 iF ve 600 Ω ayarlı) bizim elektroporatörü ayarlanabilir ayarları değildi. </li><li> NGM ile geri kazanım plakaları, doldurun ve 37 ° C de, nemlendirilmiş bir% 95 hava /% 5 CO2 atmosferinde dengeye </li></ol> 4. Elektroporasyon <ol><li> Önceden soğutulmuş küvet içinde hücre süspansiyonu 400 ul koyun ve küvetin (ug / ml 50 ug) seçilen proteinin 20 ug ekleyin. </li><li> Flick küvet hafifçe ~ 10 kez hücrelere zarar vermeden karıştırın. Not: küvet de iyice karıştırın birkaç kez ters olabilir, ancak yukarı pipetlemeyin yok ve aşağı ya da vorteks hücreleri zarar vermemek için. </li><li&gt; Kağıt havlu veya diğer silecek ile küvetin kuru dış Elektroporatör elektrik arkı önlemek için. </li><li> 1.5-1.7 msn 0.3 kV electroporate örnek. Not: Bu, bu çalışma için tipik oldu. </li><li> Hemen elektroporasyon fiske küveti sonra yavaşça ~ 10 kat iyice karıştırın. </li></ol> Hücreler 5. Kaplama <ol><li> Hazır olana kadar buz üzerinde Electroporated hücreleri ile mağaza küvet kurtarma plakalarda yer. </li><li> En mansap analizler için, yabancı efektör protein kaldırmak için önceden ısıtılmış NGM ile hücreler 1x yıkayın. <ol><li> Analiz için hücreleri kaldırmak ve NGM 3-5 ml askıya. </li><li> 4 dakika boyunca 900 x g&#39;de santrifüj ile pelet hücreleri. </li><li> Istenen plaka boyutuna (örneğin 35 mm tabak için 2 mi) için NGM yeterli hacmi içinde süspanse. </li></ol></li><li> Mansap analizi için hücrelerin uygun miktarda çıkarın. <ol><li> Örnek 1: mikroskopi analizi için cam alt yemekleri içine plaka. </li><li> Örnek 2: levha intBöyle afinite saflaştırma gibi protein analizi için o hücre kültürü plastik. </li></ol></li><li> Hücrelerin en az 4 saat 37 ° C&#39;de nemlendirilmiş% 95 hava /% 5 CO2 atmosferde dengelenmiş plakalarda kurtarmak için izin verin. </li></ol> 6. Mikroskopi Analizi 6.1) Sabitleme / İmmünofloresan Boyama <ol><li> Yıkama hücreleri 4 saat iyileşme döneminden sonra steril PBS ile 1x. </li><li> Oda sıcaklığında 2 dakika boyunca% 100 metanol hücreleri saptamak. Tamamen hücreleri (örneğin 2 ml 35 mm çanak için) karşılamak için yeterli metanol kullanın. </li><li> Steril PBS ile yıkayın 3x. </li><li> 15 dakika boyunca PBS içinde% 0.4 Triton X-100 ile hücrelerin geçirgenliği. Örneğin, bir 35 mm çaplı levha 1 ml kullanılır. <ol><li> Epitop ile hedef proteinin konumuna göre, Triton X-100 geçirgenliği ve gücü uzunluğunu ayarlayın. Not: En iyi sonuçları ancak yukarıdaki koşullar çoğu c yeterli olmalıdır, ampirik her hedef için belirlenen gerekecektirytosolic hedefler. </li></ol></li><li> Oda sıcaklığında 1 saat için PBS içinde% 5 sığır serum Albumin (BSA) ile bloke edin. Örneğin, bir 35 mm çaplı levha 1 ml kullanılır. </li><li> PBS ile yıkayın 3x. </li><li> 4 ° C&#39;de bir gece boyunca antikor bağlayıcı çözelti içinde birincil antikor (PBS içinde% 0.1 Triton X-100 ve% 1 BSA) inkübe &#160; Hafifçe çalkalanarak ° C. Örneğin, bir 35 mm çaplı levha için 0,5 ml kullanılır. <ol><li> Antikor seyreltme için üreticinin tavsiyelerini uygulayın. Not: 200 seyreltme: PKN1 antikoru 1 kullanıldı olurken, 1000 seyreltme Örneğin, streptavidin bağlayıcı peptit etiketi (SBP-etiket) antikoru 1 kullanılmıştır. </li></ol></li><li> PBS ile yıkayın 4x. </li><li> Işıksız bir ortamda oda sıcaklığında 1 saat süre ile antikor bağlama çözeltisi içinde uygun floresan konjuge sekonder antikor ile inkübe edin. <ol><li> Örneğin, oda sıcaklığında 1 saat süre ile Alexa 488 veya Alexa 647 kullanır. <ol><li> Karıncanın üreticinin önerilerini izleyinibody seyreltme. (Örneğin, yaklaşık 1: 1000, bu çalışma için). </li></ol></li><li> Örneğin, gerekli olan diğer lekeler ekleme, 5 uM Buğday agglutinnin (WGA) ile oda sıcaklığında 1 saat süre ile, üreticinin tavsiyesine göre Alexa 647 veya DAPI birleştirilir. </li></ol></li><li> Görüntü hazır olana kadar ışıktan korundu PBS ile 4 ° C &#39;de deposu ile yıkayın 5x. </li></ol> 6.2) Konfokal Mikroskopi ve Görüntü Analizi <ol><li> 63x immersiyon yağı hedefi kullanarak bir ters konfokal mikroskop görüntü örnekleri. <ol><li> 492-542 nm arasındaki bant genişliği emisyonu ile argon lazer 488nm hattını kullanarak görüntü yeşil kanal. </li><li> 640-718 nm arasındaki bant genişliği emisyonu ile 633 nm diyot lazer kullanarak görüntü kırmızı kanalı. </li><li> 407-453 nm arasındaki bant genişliği emisyonu ile 405 nm diyot lazer kullanarak görüntü mavi kanal. </li><li> Z-yığınları hücresel hacmi bütününü kapsayan çoklu kanal emin olun. </li></ol></li><li> Uygun görüntü işleme yazılımı ile Süreç görüntüleri. </li></ol> 7. Affinity Arıtma <ol><li> 4 saat iyileşme süresinden sonra 4 ° C&#39;de iki kez PBS ile elektroporasyona hücreleri yıkayın. </li><li> Ile lizleyin ~ liziz tamponu buz üzerinde (PBS içinde proteaz inhibitör kokteyli ve fosfataz inhibitörü ile% 1 Triton X-100) ve 1.0 mi. Üretici talimatlarına göre inhibitörleri kullanın. Not: Örneğin, her ikisi de bu çalışmada kullanılan fosfataz ve proteaz inhibitörleri 100x de temin edilmiştir, ancak diğer formülasyonlar eşit derecede iyi çalışmasıdır. </li><li> Derhal lastik polis hücreleri kazıyın ve konik tüpler içine toplamak. </li><li> Güçlü döndürülerek ve sonikasyon ile lizleyin. Not: Diğer lizis yöntemleri eşit olarak iyi çalışabilir, ancak verimlilik ampirik tahlil gereksinimleri uygunluğu tespit edilecek gerekecektir. <ol><li> Aralıklı vorteks 3 x 30 sn sonikasyon. </li></ol></li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 10,000 x g&#39;de santrifüjleyin toplamakHücresel enkaz ve çözünmeyen agrega; süpernatant kaydedin. </li><li> Sonu aşırı uç rotasyon ile bir gece boyunca 4 ° C &#39;de Streptavidin agaroz reçinesi süspansiyonuna 50 ul ile elektropore edildi hücre lizatının eşit hacimleri (~ 1.0 mi) birleştirin. Not: Bu reçine olan streptavidin bağlama peptidi afinite etiketi ile elektropore protein (ve ilişkili kompleksler) yakalar. </li><li> 2 dakika için 2.500 xg&#39;de Santrifüj ve süpernatant atın. </li><li> 40 yatak hacmi (~ 1 mi) iki kez PBS ile yıkayın. </li><li> 30 ul 4x LDS yükleme tamponu (141 mM Tris baz,% 2 LDS,% 10 gliserol, 0.51 mM EDTA, 0.22 mM SERVA Mavi G kırmızı 0.175 mM fenol, pH 8.5), 20 ul diH 2 O ve 1 ul ekle bir hacim sağlayan, 0.5 M tris (2-karboksietil) fosfin (TCEP); boncuk içinde kalması beklenir. </li><li> 10 dakika boyunca 95 ° C de ısı ve buz üzerinde soğutulur. </li><li> Sıkma 5 dakika boyunca 4 ° C &#39;de&gt; 10,000 xg. </li><li> Süpernatant toplayın. </li><li> Uygun antikorlar Not kullanarak batı leke gerçekleştirin: OYeniden anti-PKN1 birincil antikor kullanılır. </li></ol>

<ol><li>Mota, L. J., Cornelis, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bacterial+injection+kit%3A+type+III+secretion+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">The bacterial injection kit: type III secretion systems.</a> Annals of Medicine. 37, 234-249 (2005).</li>
<li>Galan, J. E., Collmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+III+secretion+machines%3A+bacterial+devices+for+protein+delivery+into+host+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Type III secretion machines: bacterial devices for protein delivery into host cells.</a> Science. 284, 1322-1328 (1999).</li>
<li>Hueck, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+III+protein+secretion+systems+in+bacterial+pathogens+of+animals+and+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+molecular+biology+reviews+%3A+MMBR%22%5BJournal%5D)">Type III protein secretion systems in bacterial pathogens of animals and plants.</a> Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 62, 379-433 (1998).</li>
<li>Cornelis, G. R., Van Gijsegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+function+of+type+III+secretory+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Assembly and function of type III secretory systems.</a> Annual Review of Microbiology. 54, 735-774 (2000).</li>
<li>He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+III+protein+secretion+systems+in+plant+and+animal+pathogenic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Type III protein secretion systems in plant and animal pathogenic bacteria.</a> Annual Review of Phytopathology. 36, 363-392 (1998).</li>
<li>Dean, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+domains+and+motifs+of+bacterial+type+III+effector+proteins+and+their+roles+in+infection%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Functional domains and motifs of bacterial type III effector proteins and their roles in infection.</a> FEMS Microbiology Reviews. 35, 1100-1125 (2011).</li>
<li>Espinosa, A., Alfano, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disabling+surveillance%3A+bacterial+type+III+secretion+system+effectors+that+suppress+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Disabling surveillance: bacterial type III secretion system effectors that suppress innate immunity.</a> Cellular Microbiology. 6, 1027-1040 (2004).</li>
<li>Orchard, R. C., Alto, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mimicking+GEFs%3A+a+common+theme+for+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Mimicking GEFs: a common theme for bacterial pathogens.</a> Cellular Microbiology. 14, 10-18 (2012).</li>
<li>Galan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+themes+in+the+design+and+function+of+bacterial+effectors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Common themes in the design and function of bacterial effectors.</a> Cell Host Microbe. 5, 571-579 (2009).</li>
<li>Ellis, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+ex+vivo%2Fin+vitro+transduction+efficiency+of+mammalian+primary+cells+and+cell+lines+with+Nine+natural+adeno-associated+virus+%28AAV1-9%29+and+one+engineered+adeno-associated+virus+serotype%5BTitle%5D)+AND+%22Virology+Journal%22%5BJournal%5D)">A survey of ex vivo/in vitro transduction efficiency of mammalian primary cells and cell lines with Nine natural adeno-associated virus (AAV1-9) and one engineered adeno-associated virus serotype.</a> Virology Journal. 10, 74(2013).</li>
<li>Sreelatha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrio+effector+protein%2C+VopQ%2C+forms+a+lysosomal+gated+channel+that+disrupts+host+ion+homeostasis+and+autophagic+flux%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Vibrio effector protein, VopQ, forms a lysosomal gated channel that disrupts host ion homeostasis and autophagic flux.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 11559-11564 (2013).</li>
<li>McNeil, P. L., Murphy, R. F., Lanni, F., Taylor, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+incorporating+macromolecules+into+adherent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A method for incorporating macromolecules into adherent cells.</a> The Journal of Cell Biology. 98, 1556-1564 (1984).</li>
<li>Lafon, M., Lafage, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiviral+activity+of+monoclonal+antibodies+specific+for+the+internal+proteins+N+and+NS+of+rabies+virus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Antiviral activity of monoclonal antibodies specific for the internal proteins N and NS of rabies virus.</a> The Journal of General Virology. 68 (Pt. 12), 3113-3123 (1987).</li>
<li>Kriegler, M. P., Livingston, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+facilitated+microinjection+of+proteins+into+intact+monolayers+of+tissue+culture+cells%29%5BTitle%5D)+AND+%22Somatic+Cell+Genetics%22%5BJournal%5D)">Chemically facilitated microinjection of proteins into intact monolayers of tissue culture cells).</a> Somatic Cell Genetics. 3, 603-610 (1977).</li>
<li>Nossa, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+abundant+nuclear+factor+poly%28ADP-ribose%29+polymerase-1+by+Helicobacter+pylori%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Activation of the abundant nuclear factor poly(ADP-ribose) polymerase-1 by Helicobacter pylori.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 19998-20003 (2009).</li>
<li>Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfecting+mammalian+cells%3A+Optimization+of+critical+parameters+affecting+calcium-phosphate+precipitate+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Transfecting mammalian cells: Optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation.</a> Nucleic Acids Research. 24, 596-601 (1996).</li>
<li>Winegar, R. A., Phillips, J. W., Youngblom, J. H., Morgan, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Electroporation+Is+a+Highly+Efficient+Method+for+Introducing+Restriction+Endonucleases+into+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">Cell Electroporation Is a Highly Efficient Method for Introducing Restriction Endonucleases into Cells.</a> Mutation Research. 225, 49-53 (1989).</li>
<li>Cortes, F., Ortiz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+damage+induced+by+restriction+endonucleases+recognizing+thymine-rich+DNA+sequences+in+electroporated+CHO+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Biology%22%5BJournal%5D)">Chromosome damage induced by restriction endonucleases recognizing thymine-rich DNA sequences in electroporated CHO cells.</a> International Journal of Radiation Biology. 61, 323-328 (1992).</li>
<li>Cortes, F., Ortiz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+chromosomal+aberrations+in+the+CHO+mutant+EM9+and+its+parental+line+AA8+by+EcoRI+restriction+endonuclease%3A+electroporation+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">Induction of chromosomal aberrations in the CHO mutant EM9 and its parental line AA8 by EcoRI restriction endonuclease: electroporation experiments.</a> Mutation Research. 246, 221-226 (1991).</li>
<li>Baron, S., Poast, J., Rizzo, D., McFarland, E., Kieff, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+antibodies%2C+DNA%2C+and+other+macromolecules+into+cells%3A+a+highly+efficient+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Electroporation of antibodies, DNA, and other macromolecules into cells: a highly efficient method.</a> Journal of Immunological Methods. 242, 115-126 (2000).</li>
<li>Lewis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+edges+toward+clinic+for+both+gene+therapy+and+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Genetic+Engineering+and+Biotechnology+News%22%5BJournal%5D)">Electroporation edges toward clinic for both gene therapy and drug delivery.</a> Genetic Engineering and Biotechnology News. 17, (1997).</li>
<li>Kotzamanis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CFTR+expression+from+a+BAC+carrying+the+complete+human+gene+and+associated+regulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">CFTR expression from a BAC carrying the complete human gene and associated regulatory elements.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13, 2938-2948 (2009).</li>
<li>Chakrabarti, R., Wylie, D. E., Schuster, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+monoclonal+antibodies+into+mammalian+cells+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Transfer of monoclonal antibodies into mammalian cells by electroporation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 264, 15494-15500 (1989).</li>
<li>Graziadei, L., Burfeind, P., Bar-Sagi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+unlabeled+proteins+into+living+cells+by+electroporation+and+isolation+of+viable+protein-loaded+cells+using+dextran-fluorescein+isothiocyanate+as+a+marker+for+protein+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Introduction of unlabeled proteins into living cells by electroporation and isolation of viable protein-loaded cells using dextran-fluorescein isothiocyanate as a marker for protein uptake.</a> Analytical Biochemistry. 194, 198-203 (1991).</li>
<li>Wilson, A. K., Horwitz, J., De Lanerolle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+electroinjection+method+for+introducing+proteins+into+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the electroinjection method for introducing proteins into living cells.</a> The American Journal of Physiology. 260, C355-C363 (1991).</li>
<li>Prasanna, G. L., Panda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation%3A+Basic+principles%2C+practical+considerations+and+applications+in+molecular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Bioprocess+Engineering%22%5BJournal%5D)">Electroporation: Basic principles, practical considerations and applications in molecular biology.</a> Bioprocess Engineering. 16, 261-264 (1997).</li>
<li>Weaver, J. C., Chizmadzhev, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theory+of+electroporation%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectrochemistry+and+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">Theory of electroporation: A review.</a> Bioelectrochemistry and Bioenergetics. 41, 135-160 (1996).</li>
<li>Weaver, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+theory.+Concepts+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Electroporation theory. Concepts and mechanisms.</a> Methods in Molecular Biology. 55, 3-28 (1995).</li>
<li>McAteer, J. A., Douglas, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolayer+culture+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Monolayer culture techniques.</a> Methods in Enzymology. 58, 132-140 (1979).</li>
<li>Ho, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+GtgE%2C+a+novel+virulence+factor+encoded+on+the+Gifsy-2+bacteriophage+of+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Identification of GtgE, a novel virulence factor encoded on the Gifsy-2 bacteriophage of Salmonella enterica serovar Typhimurium.</a> Journal of Bacteriology. 184, 5234-5239 (2002).</li>
<li>Niemann, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+novel+secreted+virulence+factors+from+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+by+proteomic+analysis+of+culture+supernatants%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Discovery of novel secreted virulence factors from Salmonella enterica serovar Typhimurium by proteomic analysis of culture supernatants.</a> Infection and Immunity. 79, 33-43 (2011).</li>
<li>Spano, S., Liu, X., Galan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolytic+targeting+of+Rab29+by+an+effector+protein+distinguishes+the+intracellular+compartments+of+human-adapted+and+broad-host+Salmonella%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Proteolytic targeting of Rab29 by an effector protein distinguishes the intracellular compartments of human-adapted and broad-host Salmonella.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 18418-18423 (2011).</li>
<li>Haraga, A., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Salmonella+type+III+secretion+effector+interacts+with+the+mammalian+serine%2Fthreonine+protein+kinase+PKN1%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A Salmonella type III secretion effector interacts with the mammalian serine/threonine protein kinase PKN1.</a> Cellular Microbiology. 8, 837-846 (2006).</li>
<li>Zinchuk, V., Grossenbacher-Zinchuk, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+colocalization+analysis+of+confocal+fluorescence+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology+%2F+Editorial+Board%2C+Juan+S.+Bonifacino+...+%5Bet+al%5D%22%5BJournal%5D)">Quantitative colocalization analysis of confocal fluorescence microscopy images.</a> Current Protocols in Cell Biology / Editorial Board, Juan S. Bonifacino ... [et al]. 4 (Unit 4.19), (2011).</li>
<li>Kimple, M. E., Sondek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+affinity+tags+for+protein+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science+%2F+Editorial+Board%2C+John+E.+Coligan+...+%5Bet+al%5D%22%5BJournal%5D)">Overview of affinity tags for protein purification.</a> Current Protocols in Protein Science / Editorial Board, John E. Coligan ... [et al]. 9 (Unit 9.9), (2004).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Patojen bakterilerin salgılanan efektörleri konak hücre ortamında çalışabilmesi için geliştiğini ve böylece konak içinde in situ bunları incelemek yararlı olacaktır. Konakçı hücrelere özel ilgi efektörlerinin giriş ilgili patojen-konakçı etkileşimleri bakteriyel proteinlerden müdahalesi olmaksızın tek başına ele sağlar. amaç, böylece transfeksiyon ya da transdüksiyon ile bağlantılı bazı zorluklar kaçınarak ökaryotik konakçı hücrelere bakteriyel efektör proteinler katılması için bir araç olarak elektroporasyon i...

Bir çok Gram-negatif bakteriler, doğrudan konakçı hücreler 1-5 içerisine (efektör olarak anılacaktır) hastalık oluşturma ilişkili proteinler enjekte özel salgılama sistemleri kullanılmaktadır. Ev sahibi dokunulmazlık baskılanması, hücre iskeleti değişiklikler, hücre içi ticareti ve sinyalizasyon, transkripsiyon değişikliklerin modifikasyonu ve ev sahibi proteasome değişiklikler 6-9: Bu efektörleri dahil olmak üzere biyolojik fonksiyonları geniş bir yelpazesi var. Bazı efektörlerinin işlevleri ancak ev sahibi hedefleri ve diğerleri biyokimyasal eylem (ler) belirlenecek kalır bilinmektedir. Vahşi tip ve yeniden birleştirici bakteriyel enfeksiyonların karşılaştırılması hücre içi efektör hastalık oluşturma mekanizmaları incelemek için geçerli bir yaklaşım olsa da, konakçı hücre içerisine bağımsız bir efektör tanıtmak için sıklıkla yararlıdır. Böylece, konakçı hücreler bağlamında bakteriyel efektör proteinler katma ve karakterize edilmesi için basit bir yöntem arzu edilmektedir. Deneysel analiz wi BasitleştirmeTek bir efektör kritik inci diğer efektörler karşı ya da gereksiz işlevlere sahip olabilir. Bu basitleştirme gerçekleştirmek için, araştırmacılar, daha önce kazıma 12,13 yükleme viral transdüksiyon 10, mikroenjeksiyon 11 de dahil olmak üzere birçok farklı yöntemler ile hücrelere makromolekülleri getirmiştir, kimyasal olarak teşvik mikroenjeksiyon 14, özel bir protein &quot;transfeksiyon&quot;, reaktif 15, kalsiyum fosfat çöktürme ile hücre füzyonu 16 ve elektroporasyon 17-20. kişiye moleküller, hücre içi hedefleri 21,22 protein, hücre-geçirgen olmayan boyalar ve antikorlar, DNA, RNA ve RNAi türler dahil olmak üzere nükleik asitler arasında değişir. Bazı yöntemler dahil edilebilir makromolekül Çeşidi dahil kısıtlamaları vardır ve özellikle alt-analizler, yüksek hücresel toksisite, etki zarar mekanizmaları, düşük etkililik ve giriş verimliliği ile sınırlı olabilir. Transfeksiyon, bir ofteaynı zamanda makrofajlar ve birincil hücre gibi uygun bir ev sahibi hücre tipi, transfeksiyon karşı özellikle dirençlidir sınırlama uğrar, memeli hücrelerinde bakteri genleri ifade etmek için bir yöntem, n-kullanılmıştır. Bunun ötesinde, yabancı DNA&#39;nın sokulması üzerine üretilen bakteriyel protein seviyelerini kontrol etmek zordur. Çok iş bilinen bir laboratuvar tekniği olarak bakteriyel ve memeli yaratıkların hücrelerine nükleik asit elektroporasyon kurdu; Bununla birlikte, fizyolojik koşullar altında, hücre içine proteinlerin verilmesi için en iyi yöntem devam etmekte olan bir araştırma vardır. Protein transfeksiyon üzerindeki raporlar umut vericidir, ama pahalı reaktifler ve optimizasyon gerektirir. minimum maliyet ile hücre hedefleri çeşitli içine potansiyel toksik bakteri efektörler tanıtmak arzusu in vivo bu proteinleri eğitim için bir yöntem olarak elektroporasyon dikkate götürdü. Protein elektroporasyon 23-25 ​​bir araya geldi iseAyrıca elektro-transfeksiyon veya elektro-enjeksiyon 26 olarak bilinen electropermeabilization üzerinden canlı hücreler içine proteinleri tanıtmak hod. Bu teknik, hücre zarlarında gözenekleri oluşturmak için yüksek yoğunluklu elektrik darbeleri kullanır. Bu geri dönüşümlü gözenekler normal hücre içi alandan dışlanan makromoleküllerin hücreye girmesine izin. Dış elektrik alanının çıkarılması üzerine, zar, hücre gözenekler 27,28 geçirilir molekülleri korumak için izin kapatın olabilir. Standart bir Electroporator sürekli fare makrofaj-benzeri hücreleri ve insan epitel hücreleri hem de içine bakteri efektör tanıtmak için bu çalışmada kullanılmıştır. yöntem hücresel canlılığı hiçbir kayda değer azalma ile, hızlı, verimli ve ucuz. kişiye proteinler immünofloresan mikroskopi ile görüntülenmiştir veya fonksiyonel deneyleri için de kullanılabilir. Bu aynı zamanda, bir toksik-olmayan, standart olarak yeşil floresan proteini (GFP) ile gösterilmiştirİki Salmonella efektör proteinler, SspH1 ve GtgE. Bu ökaryotik konakçı hücrelerde bu bakteriyel hastalık oluşturma proteinleri ve işlevlerin çalışması için repertuarında ek bir araç olarak, protein elektroporasyon önerilmektedir.

<table><tbody><tr><td>% 0.25 Tripsin-EDTA Çözeltisi</td><td>Cellgro</td><td>25-050-Cl</td><td></td></tr><tr><td>0.4 cm Boşluklu tek kullanımlık elektroporasyon küvetleri</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2088</td><td></td></tr><tr><td>%100 Metanol</td><td>Herhangi Bir</td><td>N / A</td><td>Yanıcı, Toksik Sığır</td></tr><tr><td>Serumu Albümini (BSA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A4919</td><td></td></tr><tr><td>Hücre Sayma Cihazı - Hemositometre veya Coulter Sayacı</td><td>Beckman Coulter</td><td>Model Z1</td><td></td></tr><tr><td>Hücre Kültürü İnkübatörü</td><td>Herhangi Bir</td><td>N/A</td><td>Nemlendirilmiş %95 hava/%5 CO2 </alt>atmosfer 37 ° C; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Hücre Kültürü Plastik</td><td>Herhangi bir</td><td>N/A</td><td>Hücre kültürü şişeleri/plakaları, pipetler, tüpler, kauçuk polis memuru</td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Eagle Modifikasyonu s Orta (DMEM)</td> <td>Cellgro</td><td>10-013</td><td>37 ° C'ye kadar sıcak; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Elektroporatör</td><td>Bio-Rad</td><td>E. coli Pulser</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td> <td>Cellgro</td><td>35-016-CV</td><td></td></tr><tr><td>Floresan konfokal mikroskop ve nbsp;</td><td>Ziess</td><td>Modeli&nbsp; LSM 710&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopi için Cam Alt</td><td>Tabaklar Wilco Wells</td><td>HBSt-3522</td><td></td></tr><tr><td>HALT Proteaz İnhibitörü Kokteyl</td><td>Pierce</td><td>78430</td><td>Aşındırıcı, Toksik</td></tr><tr><td>HeLa Hücre Hattı</td><td>ATCC</td><td>ATCC CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>LDS 4X Yükleme Tamponu</td><td>Invitrogen</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>Minimal Esansiyel Orta (MEM)&nbsp;</td><td>Cellgro</td><td>10-010</td><td>37 °C'ye kadar sıcak; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Solma önleyici reaktif ile birlikte diğer floresan lekeler (WGA, DAPI)</td><td>Herhangi bir</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin/Streptomisin</td><td>Cellgro</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>RAW 264.7 Hücre hattı</td><td>ATCC</td><td>TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>İlgilenilen Hedefe Karşı Birincil Antikor</td><td></td> Florofora Konjuge Herhangi Bir <td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>İkincil Antikor</td> Herhangi <td>bir</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Tuzlu Salin</td><td>Herhangi Bir</td><td>N / A</td><td>4 °C'ye Kadar Chill; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Steril Fosfat Tamponlu Tuzlu</td><td>Salaman Herhangi Bir</td><td>N / A</td><td>37 °C'ye Kadar Sıcak; C&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Streptavidin Agaroz Reçine Süspansiyonu&nbsp;</td><td>Pierce</td><td>20353</td><td></td></tr><tr><td>Konik Tüpleri Kabul Edebilen Masa Üstü Santrifüj (sallanan kova tercih edilir)</td><td>Herhangi bir</td><td>N/</td><td></td></tr><tr><td>A TCEP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>646547</td><td>Aşındırıcı, Toksik</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8585</td><td>Tahriş Edici, Toksik</td></tr></tbody></table>

memeli hücreleri içinde fonksiyonel bakteriyel efektör elektroporasyonu

Electroporation of Functional Bacterial Effectors into Mammalian Cells

canlı hücrelerin bağlamında protein etkileşimleri çalışma lokalizasyonu, dinamikleri ve etkileşim ortakları hakkında kritik bilgiler üretebilir. Bu bilgiler, evsahibi-patojen etkileşimlerinin bağlamında özellikle değerlidir. Birçok patojen proteinleri, hücre içi bir ortam içinde konak bağışıklık sistemi ve hayatta kalma kaçırma sağlayan, bu gibi bir şekilde çeşitli konak hücreleri içinde çalışır. Bu patojenin protein konukçu hücre etkileşimini incelemek için çeşitli yaklaşımlar sık dahil olmak üzere kullanılır: in vivo enfeksiyon transfeksiyon ya da transdüksiyon ile etiketli veya mutant protein ya da patojen genlerin katılması eksprese eden bir suşu ile. Bu yaklaşımların her biri avantajları ve dezavantajları vardır. Bu direkt olarak hücrelere ekzojen proteinleri katılması için bir araç çalıştı. Elektroporasyon yaygın hücrelere nükleik asitlerin dahil edilmesi için kullanılabilir, ancak biyo-fiziksel temeli tam olarak aynı olmasına rağmen daha nadir proteinlere uygulanmıştır.Standart bir Electroporator memeli hücrelerine afinite etiketli bakteriyel efektör tatbik etmek için kullanılmıştır. İnsan epiteliyal ve fare makrofaj hücreleri, geleneksel metodlarla kültürlenmek sureti ile ayrılır ve ilgi dahilindeki bir eksojen bakteriyel patojenin proteini (örneğin, Salmonella Typhimurium GtgE) ile 0.4 cm boşluk elektroporasyon küvetler içine yerleştirilmiştir. Elektroporasyon (0.3 kV) ve kısa (4 saat) geri kazanım süresinden sonra, hücre içi protein, flüoresan olarak afinite etiketi ile protein etiketleme ve konfokal mikroskopi ile mekansal ve zamansal dağılımının incelenmesi ile doğrulanmıştır. Elektroporasyona protein aynı zamanda hücre içinde işlevsel ve doğru hücre içi ticareti ve protein-protein etkileşimi yeteneğine sahip olduğu gösterilmiştir. Ekzojen proteinler hücrelerin yüzeyi üzerinde birikme eğiliminde iken, elektroporasyona örnekler sadece kuluçkalama için hücre içi efektör konsantrasyonda büyük artışlar vardı. protokol ap yapılacak basit ve yeterince hızlıhücre içi hedefleme ve hastalık oluşturma proteinlerin işlevine de dahil olmak üzere, konakçı hücrelerde patojen proteinlerinin yüksek verimli bir karakterizasyon için izin arallel moda.

Kavramının bir ilk kanıtı olarak, saflaştırılmış yeşil flüoresan proteini başarıyla elektroporasyon ile memeli hücrelerine dahil edilmiştir. GFP, yaklaşık 27 kD molekül ağırlığına sahip protein özel genellikle önemli hücresel toksisite olmaksızın moleküler biyoloji aracı olarak (normal olarak plasmid DNA ifade edilen), memeli hücreleri içine dahil edilir. HeLa hücreleri (Şekil 1A) kuluçkalanmıştır veya floresan GFP sinyali kontrol etmek için imüno-konfokal mikroskopi ile, ardından 25 ug / ml GFP ile <st...

Elektroporasyon, saflaştırılmış bakteriyel virülans efektör proteinlerini doğrudan canlı ökaryotik hücrelere yerleştirmek için kullanıldı. Protein lokalizasyonu konfokal immünofloresan mikroskopi ile izlendi. Bu yöntem, ökaryotik hücrelerde heterolog ekspresyon ihtiyacını ortadan kaldırarak, aktif eksojen proteinleri kullanarak kaçakçılık, fonksiyon ve protein-protein etkileşimleri üzerine çalışmalara izin verir.

Memeli Hücreleri içinde fonksiyonel Bakteriyel Efektör elektroporasyonu

The study of protein interactions in the context of living cells can generate critical information about localization, dynamics, and interacting partners. ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, etkilerini ve işlevlerini incelemek amacıyla bakteriyel efektörler gibi ekzojen, potansiyel olarak sitotoksik proteinleri memeli hücrelere tanıtmaktır. Bu işlem, öncelikle ilgili saflaştırılmış proteinin aktarılacağı uygun konak benzeri hücreler elde etmek için memeli hücrelerin standart kültür koşullarında büyütülmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım olarak, saflaştırılmış bir bakteriyel efektör varlığında kültürlenmiş konak hücrelerin elektroporasyonu gerçekleştirilir; bu sayede proteinin konak hücrelere girmesi ve onlarla etkileşime girmesi sağlanır.Ardından, efektör proteinin hücre altı lokalizasyonunu ve işlevselliğini değerlendirmek amacıyla görselleştirme veya başka bir fonksiyonel analiz gerçekleştirilir. Konfokal mikroskopi, immünokimyasal yöntemler veya diğer analiz tekniklerine dayanan sonuçlar, fonksiyonel bakteriyel efektörlerin beklenen hücre altı bölgelere lokalizasyonunu ve bilinen etkileşim ortaklarına bağlanmasını gösterir. Bu tekniğin transfeksiyon veya transduksiyon gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, bu protokolün potansiyel sitotoksisiteyi aşmak için hızlı, basit ve düşük maliyetli bir yaklaşım olmasıdır.Bu yöntem, bakteriyel efektör proteinlerin fonksiyonlarının keşfi veya doğrulanması gibi patojen biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntem bakteriyel efektör proteinler hakkında bilgi sağlamak için kullanılmış olsa da, diğer proteinlere veya küçük moleküllere de uygulanabilir. Sonucun görselleştirilmesi kritik öneme sahiptir.Bilinen hücresel özelliklerle kolokalizasyon sağlayarak, elektropore edilmiş proteinin beklenen hücre altı ilişkisini doğrulayın. Bu prosedüre başlamak için, 400 µL hücre süspansiyonunu önceden soğutulmuş bir tüpe aktarın. Ardından, nihai konsantrasyon 50 µg/mL olacak şekilde seçilen proteinden 20 µg ekleyin.Karıştırmak ve hücrelere zarar vermemek için vete'yi nazikçe yaklaşık 10 kez sallayın. Ardından, elektrotla elektrik arkı oluşmasını önlemek için Q Vet'in dışını kağıt havluyla kurulayın. Numuneyi elektrota yerleştirin ve elektroporasyondan hemen sonra 0,3 kilovolt değerini 1,5 ila 1,7 milisaniye için ayarlayın.Fiksasyona ve immünofloresan boyamaya veya afinite saflaştırmaya geçmeden önce, örneği iyice karıştırmak için qve'yi yaklaşık 10 kez hafifçe altüst edin. Elektroporasyondan sonra dört saatlik toparlanma süresinin ardından hücreleri steril PBS ile yıkayın. Ardından hücreleri oda sıcaklığında iki dakika boyunca %100 metanol ile fikse edin.Ardından, hücreleri steril PBS ile 3 kez daha yıkayın. Hücreleri PBS içerisinde %0,4 Triton X 100 ile 15 dakika boyunca permeabilize edin. Permeabilizasyon süresini ve Triton X 100 konsantrasyonunu, hedef proteinin epitopuna ve konumuna göre ayarlayın.Ardından, hücreleri oda sıcaklığında bir saat boyunca PBS içinde %5 BSA ile bloke edin. Sonrasında, hücreleri üç kez PBS ile yıkayın. Daha sonra, hücreleri antikor bağlama çözeltisi içindeki primer antikor ile dört derece santigrat sıcaklıkta, nazikçe sallayarak gece boyunca inkübe edin.Hücreleri PBS ile dört kez daha yıkayın. Ardından, hücreleri antikor bağlama çözeltisi içinde uygun floresan konjuge ikincil antikor ile inkübe edin. Gerektiğinde; beş µM buğday germ aglutinin veya Alexa 647'ye konjuge WGA ya da DPI gibi diğer boyaları ekleyerek oda sıcaklığında, ışıktan koruyarak bir saat boyunca bekletin.Ardından hücreleri beş kez PBS ile yıkayın ve bu adımdaki görüntüleme işlemine hazır olana kadar ışıktan korunmuş şekilde dört derece Celsius'ta saklayın. Elektropore edilmiş hücreleri dört derece Celsius'taki PBS ile iki kez yıkayın. Dört saatlik toparlanma süresinin ardından, hücreleri buz üzerinde bir mililitre lizis tamponu ile lize edin.Hücreleri bir kauçuk polisçik (rubber policeman) ile hızla sıyırın ve konik tüplere toplayın. Ardından, hücreleri sonikasyon ve güçlü vorteksleme ile parçalayın. Son olarak, örneği 10,000 ×g'de santrifüj edin.Hücre kalıntılarını ve çözünmeyen agregatları toplamak için 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüj edin ve süpernatantı saklayın. Berraklaştırılmış elektropore edilmiş hücre lizatının 1 mL'sini, 50 µL Strep-Tactin reçine süspansiyonu ile birleştirin. Elektropore edilmiş proteini ve ilişkili kompleksleri, Strep-Tactin bağlayıcı peptit afinite etiketi aracılığıyla yakalamak için karışımı 4 °C'de, gece boyunca uçtan uca rotasyonla inkübe edin.Ardından, örneği 2.500 ×g kuvvetinde iki dakika boyunca santrifüjleyin ve süpernatantı atın. Daha sonra örneği bir mililitre PBS ile iki kez yıkayın. Sonra, örneğe 30 µL 4X LDS yükleme tamponu, 20 µL distile H₂O ve 1 µL 0,5 M TCEP ekleyin ve bir miktar süpernatant bırakın.Numuneyi 95 °C'de 10 dakika boyunca ısıtın. Ardından, yaklaşık bir dakika boyunca buz üzerinde soğutun. Sonrasında, numuneyi 4 °C'de 10.000 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin.Sonda, uygun antikorlarla western blot analizi yapmak için süpernatantı toplayın. HeLa hücreleri, mililitrede 50 mikrogram afinite etiketli salmonella efektörü GTGE ile inkübe edildi veya elektropore edildi; ardından bir efektör etiket karşıt antikoru, dpi, bir nükleer maske ve WGA ile boyandı. Sitozolik sınırı belirlemek için inkübe edilen HeLa hücreleri, GTGE'nin içselleştirilmediğini gösteren yeşil floresans yoksunluğu sergilemektedir. Bu, elektropore edilen hücre içi efektör proteini gösteren, elektropore edilmiş GTGE'ye ait temsilci bir fotomikrograftır.Ökaryotik etkileşim ortağı sine thine protein kinaz N1'i saptamak için yapılan western blot burada gösterilmiştir. En sağdaki şeridin iki havuzlanmış küveti içerdiğine dikkat edin. Bir qve'den gelen sinyal arka plana karışmış olsa da, 50 µg/mL ile elektroporasyondan sonra konfokal mikroskopi ile bakıldığında, pkn1 düzeyi hala yemin (bait) olmayan kontrolde görülen bağlanma eksikliğinin üzerinde zenginleşmişti.S sph one hela hücreleri, pkn one ve S SPH one arasındaki kolokalizasyonu göstermektedir. Bu optik örtüşme, efektörün ve konak proteinin fiziksel olarak etkileşime girecek kadar yakın olduğunu belirtir. Etkileşimin ilk kez çekirdekte gösterilmiş olması, proteinin konak tarafından doğru şekilde taşındığına dair ek destek sağlamaktadır.Bu teknik bir kez kavrandığında, yüksek verimli bir şekilde uygulanabilir. Birden fazla bireysel proteini incelemek için bu prosedürü uygularken, her hücre tipi ve protein hedefi için en iyi elektroporasyon koşullarının deneysel olarak belirlenmesi gerektiğini unutmamak önemlidir. Bu prosedür, çeşitli model sistemlerdeki hücresel süreçleri daha iyi anlamak için birkaç protein, küçük molekül veya her ikisinin bir kombinasyonu ile çoklama yapmanıza olanak tanıyabilir.Bu videoyu izledikten sonra, proteinler gibi makromoleküllerin memeli hücrelerine aktarılması için elektroporasyonun nasıl kullanılabileceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmanız gerekir.

electroporation-of-functional-bacterial-effectors-into-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Mikobakteriyel patojenik stratejileri tam olarak anlaşılamamıştır. Çoğu türlerin yavaş büyüme hızı, hücre duvar aşılmaz doğa ve patojenler ile çalışan tehlikeleri mikobakteriler zor çalışma yapmak ve bu organizmalar bizim kötü anlamak için büyük ölçüde sorumludur. Bu video, DNA girişi sağlamak için kısa bir yüksek elektrik uyarısı konusu hücreler içerir elektroporasyon tekniği, gösterecektir. Mikobakteriyel hücrelerin içine DNA tanıtmak için en yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir.

Mikobakteriler, Elektroporasyon

Kaynak: Stefan, A., ve diğerleri, Escherichia coli'de Protein Birlikte Ekspresyonunun Çok Yönlü Faydaları. J. Vis. Uzm. (2015)Bu video, hücre hazırlama, elektroporasyon, geri kazanım ve transformantların seçimi dahil olmak üzere Escherichia coli'yi antibiyotik direnç geni taşıyan bir plazmit ile dönüştürme prosedürünü göstermektedir.

Yüksek Voltajlı Elektroporasyon Kullanılarak Bakterilerin Hazırlanması ve Dönüşümü

Kaynak: Berens, C. ve diğerleri. Bakteriyel virülans faktörlerinin hücre içi sinyal ile girişimini incelemek için indüklenebilir bir ifade sistemi uygulamak. J. Vis. Exp. (2015)Bu video, bakteriyel efektör protein CaeB'nin konak apoptotik kaskadını nerede bozduğunu belirlemek için indüklenebilir bir ekspresyon sisteminin kullanımını göstermektedir. Tetrasiklin-tepkili bir sistemle CaeB-eksprese eden hücrelerin transfekte edilmesi, pro-apoptotik gen ekspresyonunu indüke etmek ve zincir içindeki...

İndüklenebilir bir gen ifade sisteminin bakteriyel efektör proteini ifade eden hücrelere aktarılması

Bu videoda, bakteriyel efektör proteinlerin elektroporasyon yoluyla memeli hücrelerine girişini gösteriyoruz. Bakteriyel efektör proteinlerin hücre içi lokalizasyonu, spesifik florofor konjuge antikorlarla boyamayı takiben konfokal mikroskopi ile tespit edilir.

Bakteriyel Efektör Proteinlerin Elektroporasyon ile Memeli Hücrelerine Sokulması

Elektroporasyon dönüşüm olarak bilinen bir süreç içinde bakteri DNA'nın verilmesi için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Elektro-hücrelerinin hazırlanması için geleneksel protokoller zaman alıcı ve emek yoğundur. Bu makalede, bir alternatif, hızlı ve şu anda bazı laboratuarlarda tarafından kullanılan elektro-hücrelerinin hazırlanması için etkili bir yöntem tarif eder.

Elektrokompetan Hazırlanması için hızlı Protokolü<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Ve<em&gt; Vibrio cholerae</em

Elektroporasyon genler çıkarlarının hücrelere teslim etmek için etkili bir yaklaşımdır. Bu yaklaşım içinde vivo yetişkin fare dorsal kök gangliyon (DRG) nöronlar üzerinde uygulayarak, biz axon yenilenme içinde vivoçalışmaya bir modeli açıklar.

Soruşturma memeli Axon rejenerasyon: Vivo Elektroporasyon yetişkin fare Dorsal kök gangliyon

Burada sunulan, çeşitli in vitro hipokampal dilim kültürü çağlarında hem uyarıcı hem de inhibitör nöronlarda genler sağlayabilen tek hücreli elektroporasyon için bir protokoldür. Yaklaşımımız, hücre-otonom ve hücreler arası fonksiyonları incelemek için kullanılabilecek tek tek hücrelerdeki genlerin kesin ve verimli bir şekilde ifade edilmesini sağlar.

Fare Hipokampal Uyarıcı ve Sınıfa Özgü inhibitör Nöronların Farklı Organotipik Dilim Kültürü boyunca Tek Hücreli Elektroporasyon

Uyuyan Güzel (SB) transpozon sistemini kullanarak pigment epitel türevi faktörü (PEDF) kodlayan gen ile elektroporasyon yoluyla primer insan pigment epitel hücrelerini transfekte etmek için bir protokol geliştirdik. Başarılı transfeksiyon, kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR), immünoblotlama ve enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) ile gösterilmiştir.

Uyuyan Güzel Transpozon Sistemi Kullanılarak Primer İnsan Pigment Epitel Hücrelerinin Elektroporasyon Tabanlı Genetik Modifikasyonu

Plazmid DNA'sının iskelet kasına elektroporasyonu, farelerde kas kontraktilitesinden ödün vermeden gen ekspresyonunu modüle etmek için uygun bir yöntemdir.

Plazmid DNA'sının Fare İskelet Kasına Elektroporasyonu

Genom editörlerinin RNA olarak sunulması, birincil memeli hücrelerinin ve hücre hatlarının genomlarını değiştirmek için özellikle güçlü bir yöntemdir. Bu protokolün amacı, genom düzenleyicilerini mRNA olarak birincil memeli hücrelerine ve hücre hatlarına göndermek, ardından düzenleme sonuçlarını nicelendirmek için hedefli Illumina dizileme ve analizi yapmaktır.

Birincil memeli hücrelerinde editör RNA'nın elektroporasyonu yoluyla genom düzenlemesi

Öğrenin, memeli hücrelerine bakteriyel efektör proteinlerini elektroporasyon ile nasıl aktaracağınızı. Konfokal immünofloresan mikroskopi ile lokalizasyon ve fonksiyon analizi yapın.

Memeli Hücreleri içinde fonksiyonel Bakteriyel Efektör elektroporasyonu

Daha fazla video keşfet