Name: Hastalık Modelleme için kas biyopsisi Hasta türetilmiş Hücre Hatları İzolasyonu ve Ölümsüzleştirme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Öğrenin kas hastalıkları araştırmaları için hasta biyopsisinden miyojenik hücre izolasyonu ve ölümsüzleştirme yöntemini. Bu teknik sınırsız hücre kaynağı sağlayarak ilaç tarama çalışmalarına olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu yayın, bir Association Contre Les Myopathies (AFM) hibesi olan Cure CMD (proje 16297) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (hibe numaraları K08 AR059750, L40 AR057721 ve 2R01NS047727) tarafından finanse edilmektedir.

NOT: insan dokusunun toplanması için protokoller gözden ve Kurumsal IRB komitesi tarafından onaylanmış olmalıdır. Atılan, de tanımlanan insan dokusunun Koleksiyon Boston Çocuk Hastanesi ve Brigham ve Kadın Hastanesi IRB Komiteleri tarafından onaylandı. Aşağıda tarif edilen yöntemler de tanımlanan gelen miyojenik hücre izolasyonu için uygulanmış olan, doku atılır. Tarif edilen yöntemler, razı hasta materyalinin toplanan dokuya uygulanabilir. 1. Hücre İzolasyonu <ol><li> Kas biyopsisi ve kas hücrelerinin saflaştırılması Ayrılma <ol><li> Doku miktarını hesaplamak için kas biyopsisi içeren plaka tartılır ve sonra tekrar ayrıldığı için, bir doku kültürü biyo-güvenlik başlığı içinde bir 10 cm doku kültürü plakası önceden ağırlık, vb. </li><li> Ince steril neşter, kıyma kas dokusu kullanılarak ve kurumasını önlemek için doku steril 1x HBSS birkaç damla ekleyin. </li><li> 3.5 ml di her ekleSpase II ve kas dokusu gramı başına kolajenaz D ile sindirilmiş olan. Bir steril 25 ml pipet ile birkaç kez kıyılmış doku ve enzim çözeltisinin Pipet. 15 dakika boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C &#39;de, bir doku kültürü inkübatörü içinde, plaka inkübe ve bulamaç kolayca steril 5 ml pipet da geçene kadar doku sindiremez. Not: Doku ayrılma, genellikle 45-90 dakika içinde enzimatik sindirimi ile elde edilir. Ek ayrıntılar için &#39;Temsili Sonuçlar&#39; bölümüne bakınız. </li><li> 329 xg (~ 1,100 rpm) oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 50 ml&#39;lik bir konik tüp ve topak hücreler üzerinde 100 um hücre süzgecinden ayrışmış dokunun, filtre edin steril büyüme ortamı 2 hacim ekleyin. Medya kompozisyon malzemeler Tablo bakınız. </li><li> Steril büyüme ortamı içinde 1 hacim pelet yeniden süspanse edin ve 7 hacim alyuvar lisiz çözeltisini ekleyin. 40 mikron hücre süzgecinden çözüm Filtre, ardından t pelet329 x g hızında 10 dakika, oda sıcaklığı için de hücreler. </li><li> Bir hemositometrede hücre sayımı, 1 x 10 6 hücre / 100 ul bir konsantrasyonda 1x HBSS,% 0.5 BSA içinde tekrar süspansiyon hücreleri. Bir kenara koyunuz ~ negatif (lekesiz) kontrol olarak kullanılacak bir tek tüp içinde 250,000 hücre. FACS sıralama tarafından CD56 pozitif hücrelerin düzgün yolluk için gerekli propidium iyodür ve CD56 için kenara ek tek renkli lekeli kontrol tüpleri, ayarlayın. Sıralama kılavuzları hücre veya uygun kontrolleri sağlamak için çekirdek tesis uzmanları sıralama FACS dahil danışmak bakınız. </li><li> Leke hücreleri, anti CD56 antikoru 5ul / 10 6 hücreleri ile sıralanacak. 30 dakika boyunca buz üzerinde (kontroller dahil) örnekleri inkübe edin. </li><li> 10 mi 1 x HBSS içinde yıkayın örnekler ve pelet hücreleri soğutmalı santrifüj 329 xg (~ 1,100 rpm) 4 ° C sıcaklıkta 10 dakika karıştırıldı. </li><li> Sor için örnek 1 ug / ml&#39;lik bir nihai konsantrasyonda propidyum iyodür eklemeÖlü hücrelerin dışlanması için ted. Floresan aktif hücre sıralayıcı kullanılarak olmayan Miyojenik hücrelerden myojenik CD56 pozitif hücreler arındırın. </li></ol></li><li> Cilt biyopsisi ayrışma Not: kas biyopsilerinde, mevcut olmadığında, dermal fibroblastlar hastadan bir deri zımba izole edilebilir. Dermal fibroblastlar miyojenik hücre elde etmek amacıyla MyoD transdüksiyon dahil olmak üzere birçok çalışmaları için malzeme olarak kullanılabilir. Buna ek olarak, dermal fibroblastlar, ileri çalışmalar için çeşitli hücre tiplerine ayırt edilebilir iPS hücrelerini üretmek için kullanılabilir. <ol><li> Ulaşım ortamında laboratuvara deri biyopsisi taşıyın. Numune alındıktan sonra, en kısa sürede temel kültürünü gerçekleştirmek. Birincil kültür aynı gün tesis edilemez ise, oda sıcaklığında gece boyunca örnek saklayın. </li><li> Laminer akış başlığı içinde steril bir 35 mm&#39;lik petri deri biyopsisi aktarın. </li><li> Steril 1 ile bir petri çanağı içinde deri biyopsisi durulayınx PBS kan ve enkaz kaldırmak için. Steril bir bisturi ile yağ dokusu çıkarın. </li><li> 2 ml kollajenaz solüsyonu eklenir ve neşter ile dokusunu inceltmek, doku boyutuna bağlı olarak 1 saat ile 45 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> , 15 ml konik tüp ile sindirilmiş doku transferi iki fibroblast kültür ortamına 2 ml petri durulama ve aynı tüp içerisinde ortam toplanır. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika süreyle 200 x g&#39;de topak hücrelere. </li><li> Süpernatantı atın ve sonra tekrar, pelet hücreleri kollajenaz çıkarmak için fibroblast orta 3 ml pelet yıkayın. Medya kompozisyon malzemeler Tablo bakınız. </li><li> Adım 1.2.7 kez daha tekrarlayın. </li><li> Bir T25 steril doku kültürü şişesi üzerine 5 ml fibroblast orta ve plaka hücrelerinde pelet yeniden askıya. % 5 CO2 ile 37 ° C &#39;de bir balon içinde inkübe edin. </li><li> Önümüzdeki 1-3 gün içinde fibroblast eki ve büyüme için kültür değerlendirin. &lt;br /&gt; Not: Bazı küçük doku parçaları da plaka takmak olabilir ve fibroblastların bu doku parçaları dışarı göç. </li><li> Fibroblastlar, yaklaşık% 80 konflüense kadar büyütülür kadar aynı koşullar altında kültür muhafaza edin. </li><li> Tripsinizasyon ile fibroblastlar toplayın ve ek genişleme için taze kültür şişeler üzerine aktarın. Ca ++ ve Mg ++ serbest Kültürlerin 1x PBS içinde 3 kez yıkanarak trypsinization gerçekleştirin. 37 ° C&#39;de 2 dakika için bir hücre (2 ml / T25 şişesi) ile Tripsin-EDTA (bakınız Materyaller Tablosu) ekleyin. </li><li> Ek şişeler içine müstakil hücreleri bölün. Bazı doku parçaları orijinal T25 şişeler bağlı kalırsa, bu şişeye 5 ml taze kültür ortamı ekleyin ve daha fibroblastlar sürekli dışarı göç edecek. NOT: Genişletilmiş fibroblast kültürü P1 dondurulur ve gelecekteki deneyler için sıvı azot içinde saklanır. </li></ol></li></ol> AndMyogenic Hücreler 2. Ölümsüzleştirme <ol><li&gt;, gece boyunca 4 oranında DMEM ve Medium 199 içinde 10 cm uzunluğunda bir steril doku kültür plakasında Levha 5000000 Phoenix ekotropik paketleme hücreleri (PE):% 10 dana serumu ile takviye edilmiş 1. </li><li> 10 mM kafein ile desteklenmiş taze ortam 5 ml transfeksiyondan 30 dakika önce besleme hücreleri. </li><li> Midi hazırlık (CDK4 veya hTERT plazmid) ve PolyJet plazmid DNA 2 ug homojen bir karışım ve üretici tarafından tavsiye edildiği gibi, 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Gecede PE hücrelere plazmid / polyjet karışımı ekleyin. </li><li> Taze ortam ile besleme hücreleri (DMEM ve 4 arasında bir oranda orta 199:% 10 dana serumu ile takviye edilmiş 1). Oniki saat sonra, virüs içeren süpernatan toplamak ve 0.45 um gözenek boyutlu filtre içinden filtre ediniz. </li><li> (G41 gece boyunca amfotropık paketleme hücre hattı PA317 5 enfekte süpernatan 1 ml kullanın ve ya 0.5 mg / ml neomisin ile seçildikten sonra stabil bir virüs üreten hücre hattı elde edilir8) CDK4 veya 0.5 mg / hTERT için higromisin ml. </li><li> Sonra üç hasat için süpernatant her sabah, akşam ve sabah hasat, yakın konfluansa stabil ambalaj hücreleri büyüyerek viral üst fazlar çalışma hazırlayın. </li><li> Viral süpernatanların, filtre edin ve doğrudan daha sonra kullanılmak üzere -80 ° C&#39;de 1 ml&#39;lik numuneler ve deposuna kullanan ya da bölün. Viral süspansiyon her dondurulup çözülerek% 50 enfeksiyonu verimlilik kaybeder unutmayın. Ağartıcı yıkama viral parçacıkların dokundu her şeyi atmadan önce unutmayın. Not: kararlı PA317 virüs üreten hücre çizgisi dondurulmuş ve kalıcı depolama için -150 ° C &#39;de muhafaza edilebilir (orta dondurma,% 10 DMSO,% 90 serum). </li><li> Plaka, FACS ile saflaştırılmış miyojenik hücre / göz% 0.1 jelatin ile kaplanmış 6-çukurlu levhalarda 5 x 10 4 hücre yoğunluğunda (1.1-1.9 adımlarda tarif edilmiştir). Hücreler viral enfeksiyon geçmeden önce plaka takılı olduğundan emin olun. </li><li> F, süzülmüş 400 ul eklereshly gece boyunca (kontrol olarak 2 kuyu tutun) her biri altı plaka viral süpernatan ya da dondurulmuş alikotları üretti. </li><li> 2.5 ml / oyuk taze kas madde (4 hücrelerin beslenmesi ile orta değiştirin: 0.02 M HEPES tamponu, 1.4 mg / L Vitamin B12,% 15 cenin sığır serumu ile takviye edilmiş 1 Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı (DMEM) ve Medium 199 0.03 mg / L ZnSO4, 0.055 mg / L, deksametason, 2.5 ug / L hepatosit büyüme faktörü ve 10 ug / L, temel fibroblast büyüme faktörü). Bir ağartıcı kap içinde viral partikülleri ihtiva eden ortam ve pipet atın. 3 gün sonra enfeksiyon kurtarmak 400 ug / ml neomisin (CDK4&#39;ün enfeksiyonu) veya 300 ug / ml higromisin (hTERT enfeksiyonu) kullanarak seçimi için tedavi için aynı ortamda hücreleri bırakın. </li><li> Kontrol çanak kalıp hücrelerin (1-2 hafta) kadar ilaç seçimi altında hücreleri koruyun. </li><li> Hatta selecti sırasında; (EDTA tripsin% 0.05 ile% 60-80 confluency) Geçiş hücreleri birleşik haline gelmeden öncedönemi. Seçim ilaç ile desteklenmiş taze miyoblast ortamı ile birden çok 10 cm tabaklarda Replate hücreleri (2.11 tarif edildiği gibi). Heterojen bir nüfus olarak ölümsüzleştirdi seçilen hücreleri korumak veya tamamen homojen genetik geçmişini (her hücrede transgenin aynı ekleme) elde etmek klon. </li><li> Aşağıdaki adımları kullanarak klonal seçim yapın: <ol><li> Küçük koloniler (10-20 hücreleri) oluşana kadar, düşük yoğunluklu (örneğin 10 cm yemekleri 300 ile 500 hücreler) hücreleri Tohum ve yaklaşık iki hafta boyunca onları korumak. </li><li> Kurumasını hücreleri önlemek için sadece ince bir film bırakarak, bu noktada sıvı ortamı en iyi çıkarın. </li><li> (Bir ucu silikon vakum yağ batırılmış) ile istenen her klon üzerinde klonlama halka yerleştirin ve tripsin / EDTA birkaç damla ekleyin. </li><li> Hasat hücreleri dikkatli bir 1 ml ucu veya Pasteur pipeti kullanarak hücrelerin aspire ve en küçük multiwell pla aktararak yuvarlak hale kezte (96 ya da 48, 24 ya da 12 havuzlu plakalar). </li><li> Yerel confluency önlemek için gerektiği gibi klonlar genişletin. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Flanigan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+muscular+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Neurol%22%5BJournal%5D)">The muscular dystrophies.</a> Semin Neurol. 32, 255-263 (2012).</li>
<li>Mercuri, E., Muntoni, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscular+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Muscular dystrophies.</a> Lancet. 381, 845-860 (2013).</li>
<li>Sharples, A. P., Stewart, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myoblast+models+of+skeletal+muscle+hypertrophy+and+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Clin+Nutr+Metab+Care%22%5BJournal%5D)">Myoblast models of skeletal muscle hypertrophy and atrophy.</a> Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 14, 230-236 (2011).</li>
<li>Tran, T., Andersen, R., Sherman, S. P., Pyle, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+skeletal+muscle+development+and+applications+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Insights into skeletal muscle development and applications in regenerative medicine.</a> Int Rev Cell Mol Biol. 300, 51-83 (2013).</li>
<li>Miller, A. D., Buttimore, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redesign+of+retrovirus+packaging+cell+lines+to+avoid+recombination+leading+to+helper+virus+production%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Redesign of retrovirus packaging cell lines to avoid recombination leading to helper virus production.</a> Mol Cell Biol. 6, 2895-2902 (1986).</li>
<li>Schubert, W., Zimmermann, K., Cramer, M., Starzinski-Powitz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+antigen+Leu-19+as+a+molecular+marker+of+regeneration+in+human+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte antigen Leu-19 as a molecular marker of regeneration in human skeletal muscle.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 307-311 (1989).</li>
<li>Mechtersheimer, G., Staudter, M., Moller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+natural+killer+%28NK%29+cell-associated+antigen+CD56%28Leu-19%29%2C+which+is+identical+to+the+140-kDa+isoform+of+N-CAM%2C+in+neural+and+skeletal+muscle+cells+and+tumors+derived+therefrom%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Expression of the natural killer (NK) cell-associated antigen CD56(Leu-19), which is identical to the 140-kDa isoform of N-CAM, in neural and skeletal muscle cells and tumors derived therefrom.</a> Ann N Y Acad Sci. 650, 311-316 (1992).</li>
<li>Pavlath, G. K., Gussoni, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+myoblasts+and+muscle-derived+SP+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Human myoblasts and muscle-derived SP cells.</a> Methods Mol Med. 107, 97-110 (2005).</li>
<li>Boldrin, L., Muntoni, F., Morgan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+human+and+mouse+satellite+cells+really+the+same%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Are human and mouse satellite cells really the same.</a> J Histochem Cytochem. 58, 941-955 (2010).</li>
<li>Belles-Isles, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+selection+of+donor+myoblast+clones+for+muscular+dystrophy+therapy+using+cell+surface+expression+of+NCAM%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Histochem%22%5BJournal%5D)">Rapid selection of donor myoblast clones for muscular dystrophy therapy using cell surface expression of NCAM.</a> Eur J Histochem. 37, 375-380 (1993).</li>
<li>Meng, J., Adkin, C. F., Xu, S. W., Muntoni, F., Morgan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+human+muscle-derived+cells+to+skeletal+muscle+regeneration+in+dystrophic+host+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Contribution of human muscle-derived cells to skeletal muscle regeneration in dystrophic host mice.</a> PLoS One. 6, e17454(2011).</li>
<li>Zhu, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+senescence+in+human+myoblasts+is+overcome+by+human+telomerase+reverse+transcriptase+and+cyclin-dependent+kinase+4%3A+consequences+in+aging+muscle+and+therapeutic+strategies+for+muscular+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular senescence in human myoblasts is overcome by human telomerase reverse transcriptase and cyclin-dependent kinase 4: consequences in aging muscle and therapeutic strategies for muscular dystrophies.</a> Aging Cell. 6, 515-523 (2007).</li>
<li>Mamchaoui, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+pathological+human+myoblasts%3A+towards+a+universal+tool+for+the+study+of+neuromuscular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Skelet+Muscle%22%5BJournal%5D)">Immortalized pathological human myoblasts: towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders.</a> Skelet Muscle. 1, 34(2011).</li>
<li>Sigmund, C. D., Stec, D. E. Genetic Manipulation of the Renin-Angiotensin System Using Cre-loxP-Recombinase. Methods Mol Med. 51, 53-65 (2001).</li>
<li>Ludlow, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+telomerase+enzyme+activity+determination+using+droplet+digital+PCR+with+single+cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative telomerase enzyme activity determination using droplet digital PCR with single cell resolution.</a> Nucleic Acids Res. 42, e104(2014).</li>
<li>Jankowski, R. J., Haluszczak, C., Trucco, M., Huard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+characterization+of+myogenic+cell+populations+obtained+via+the+preplate+technique%3A+potential+for+rapid+isolation+of+muscle-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric characterization of myogenic cell populations obtained via the preplate technique: potential for rapid isolation of muscle-derived stem cells.</a> Hum Gene Ther. 12, 619-628 (2001).</li>
<li>Gharaibeh, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+slowly+adhering+cell+fraction+containing+stem+cells+from+murine+skeletal+muscle+by+the+preplate+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of a slowly adhering cell fraction containing stem cells from murine skeletal muscle by the preplate technique.</a> Nat Protoc. 3, 1501-1509 (2008).</li>
<li>Qu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+approaches+to+improve+cell+survival+in+myoblast+transfer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of approaches to improve cell survival in myoblast transfer therapy.</a> J Cell Biol. 142, 1257-1267 (1998).</li>
<li>Choi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MyoD+converts+primary+dermal+fibroblasts%2C+chondroblasts%2C+smooth+muscle%2C+and+retinal+pigmented+epithelial+cells+into+striated+mononucleated+myoblasts+and+multinucleated+myotubes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">MyoD converts primary dermal fibroblasts, chondroblasts, smooth muscle, and retinal pigmented epithelial cells into striated mononucleated myoblasts and multinucleated myotubes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 7988-7992 (1990).</li>
<li>Huard, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+dermal+fibroblasts+expressing+MyoD1+in+mouse+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Transplantation of dermal fibroblasts expressing MyoD1 in mouse muscles.</a> Biochem Biophys Res Commun. 248, 648-654 (1998).</li>
<li>Lattanzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency+myogenic+conversion+of+human+fibroblasts+by+adenoviral+vector-mediated+MyoD+gene+transfer.+An+alternative+strategy+for+ex+vivo+gene+therapy+of+primary+myopathies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">High efficiency myogenic conversion of human fibroblasts by adenoviral vector-mediated MyoD gene transfer. An alternative strategy for ex vivo gene therapy of primary myopathies.</a> J Clin Invest. 101, 2119-2128 (1998).</li>
<li>Park, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase+modulates+Wnt+signalling+by+association+with+target+gene+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Telomerase modulates Wnt signalling by association with target gene chromatin.</a> Nature. 460, 66-72 (2009).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Faydalı Kaynak olarak Hücreler Hastalığın in vitro modellerde veya hastalık fenotipleri kurulurken miyojenik hücre popülasyonlarının izolasyonu ve kültürü son derece yararlıdır. Burada anlatılan Miyojenik hücre izolasyon prosedürü sonra, yayılır farklılaştırılmış, ya da hemen analiz edilebilir iskelet kas örneklerinde, gelen miyoblastların ve fibroblastların izolasyonu sağlar. Miyoblast yapısı ve fonksiyonu, hücre yaşamda kalması, hücre füzyonunun değerlendirilmesi değerlendirilmesi...

A correction was made to the authors section in: Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling
One of the authors names was corrected from:
Stacy C. Cossette
to:
Stacy A. Cossette

A correction was made to the authors section in: Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

Erratum: Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

Moleküler tanı son 20 yılda önemli ölçüde gelişti. Genomik DNA artık rutin olarak balgam veya yanak sürüntüsünden izole edilirken, geçmişte kan alımı gerektiriyordu. Mevcut hızlı geri dönüş süresi ve gen diziliminin kolaylığı sayesinde, birçok hastalık mutasyonu ek testlere gerek kalmadan rutin olarak tanımlanmaktadır. Kas hastalığı teşhisi söz konusu olduğunda, son on yılda kas distrofisi veya miyopatiden sorumlu düzinelerce yeni genin tanımlanması, bu hastalıkların teşhis edilme şeklini önemli ölçüde değiştirmiştir 1,2. Şu anda, kas distrofisi ve konjenital miyopatinin nedenleri olarak tanımlanan düzinelerce gen vardır, ancak bu genlerin çoğunun hastalık ürettiği mekanizmalar belirsizliğini korumaktadır. Özellikle, nadir hastalıklar hasta popülasyonlarının küçüklüğü nedeniyle bir zorluk teşkil etmektedir. Bu vakalar için olduğu kadar, daha yaygın hastalıklar için de, terapötik ilaçların patogenez mekanizması ve taranması ile ilgili çalışmaları kolaylaştıran stabil araçların üretilmesi oldukça arzu edilir. 
DNA teşhisindeki dramatik ilerlemeye rağmen, primer metabolik veya kas hastalığından şüphelenilen birçok hastada primer tanıyı koymak için kas biyopsileri hala yapılmaktadır. Kas biyopsisi gerektiğinde, hasta için minimum ek morbidite riski ile ek tanı ve araştırma dokusu toplanması için fırsat sunar. Her doku örneği için bir dizi kullanım olduğundan, basit, verimli ve minimum miktarda doku gerektiren cerrahi doku kullanılarak birincil hücre kültürü için tekniklerin oluşturulması oldukça arzu edilir. Primer hücrelerin dokudan izolasyonunu ve canlı materyalin uzun süreli depolanmasını en üst düzeye çıkarmak için kas veya deri biyopsilerinin uygun triyajı gereklidir. Ek olarak, kök hücre araştırmaları ve ilaç taraması, hücre bazlı tahliller kullanarak birçok hastalık için tedavi geliştirmek için büyük umut vaat etmektedir 3,4.
Burada, insan kası veya deri biyopsilerinden birincil hücre izolasyonu için yöntemleri açıklıyoruz. Ek olarak, bir bireyden çok sayıda hücre üretmek için yararlı olan miyojenik hücrelerin ölümsüzleştirilmesi için bir protokol ekliyoruz. Bu hücreler, birincil dokudan elde edilen genel düşük hücre sayısı ile elde edilemeyen özel ilaç taramaları gibi aşağı akış uygulamaları için kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>Ekipman</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dokusu&nbsp; kültür biyogüvenlik davlumbazı</td><td>Baker Company, Inc.</td><td>Model SterilGuard Hood</td><td></td></tr><tr><td>Tezgah üstü santrifüj, örneğin Beckman Modeli&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>Model Allegra 6R</td><td>Hücre ayıklaması yapılacaksa, soğutmalı bir santrifüj tercih edilir</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>Model Eclipse TS100</td><td></td></tr><tr><td>Doku kültürü inkübatörü, bir CO2 kaynağına bağlı</td><td>kaynak Forma Scientific&nbsp;</td><td>Seri II</td><td></td></tr><tr><td>Floresanla aktive edilen hücre sıralayıcı (FACS)</td><td>Becton Dickinson</td><td>Model Aria</td><td></td></tr><tr><td>Primer miyoblastların dokudan</td><td></td><td></td><td></td>izolasyonu için reaktifler</tr><tr><td>Dispas II</td><td>Roche Uygulamalı Bilim</td><td>#04942078001</td> DMEM Kollajenaz <td>D&nbsp'de 2.4U/ml'lik bir çorap çözeltisi hazırlayın</td></tr><tr><td>;</td><td>Roche Uygulamalı Bilimler</td><td>#088882001</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>1x Steril Hank'lik bir stok çözeltisi hazırlayın s Dengeli Tuzlu Çözelti (HBSS), kalsiyum ve magnezyum içermez</td><td>GIBCO Life Technologies</td> <td># 14185-052</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini, fraksiyon V</td><td>Sigma</td> <td># 05470</td><td>FACS sıralaması için 1X HBSS% 0.5 BSA'lık steril ve nbsp; bir çözelti hazırlayın</td></tr><tr><td>Miyoblastlar için steril büyüme ortamı: Dulbecco' s Modifiye Kartal' % 30 fetal sığır serumu ile desteklenmiş yüksek glikozlu (4.5 g) s Orta (DMEM)</td><td>GIBCO Life Technologies</td><td>11965-092</td><td>L-glutamin</td></tr><tr><td>RBC lizis çözeltisi</td> içerir <td>Qiagen</td><td>158904</td><td></td></tr><tr><td>Propidium İyodür stoğu 10mg / ml</td><td>Sigma</td><td>P4170</td><td>Tozu steril damıtılmış suda seyrelterek stok çözeltisini hazırlayın</td></tr><tr><td>Akış sitometrisi için anti-insan CD56</td><td>antikoru Biolegend</td><td>318310</td><td>APC konjuge antikor, diğer etiketler mevcuttur</td></tr><tr><td>Primer miyoblastların</td><td></td><td></td><td></td>ölümsüzleştirilmesi için reaktifler</tr><tr><td>Ekotropik paketleme hücre hattı PE</td><td>Cell Biolabs</td><td>RV-101</td><td></td></tr><tr><td>Amfotropik paketleme hücre hattı PA3174</td><td>Cell Biolabs</td><td>RV-102</td><td></td></tr><tr><td>Domuz derisi jelatin</td><td>Sigma</td><td>G1890-500g</td><td>Suda% 0.1 jelatin içeren bir stok çözeltisi hazırlayın. Çanağı 37 ° C'deki çözelti ile kaplayın; Bir saat boyunca C. Çözeltiyi çıkarın ve orta ekleyin.</td></tr><tr><td>PolyJet&nbsp;</td><td>Signagen</td><td>SL100688</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Fisher</td><td>345812</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin</td><td>EMD Biosciences</td><td>400051</td><td></td></tr><tr><td>mCDK4 ve hTERT içeren pBabe plazmitleri</td><td>ticari olarak mevcut</td><td></td> değildir <td>Stadler ve diğerleri, 2013</td></tr><tr><td>Qiagen plazmid midiprep kiti</td><td>Qiagen</td><td>12143</td><td></td></tr><tr><td>Orta 199</td><td>Yaşam Teknolojileri&nbsp;</td><td>Orta 199 (31150022)</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s modifiye Eagle medium (DMEM)</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>DMEM (11965-092)</td><td>Karışım 4:1 DMEM:199</td></tr><tr><td>Miyoblast büyüme ortamı: 4:1 Dulbecco' % 15 fetal sığır serumu ile desteklenmiş modifiye edilmiş Eagle medium (DMEM) ve Medium 199; 0,02 M HEPES tamponu; 1.4 mg/L B12 vitamini; 0.03 mg / L ZnSO4, 0.055 mg / L deksametazon, 2.5 & mu; g / L hepatosit büyüme faktörü ve 10 &mu; g/L beta fibroblast büyüme faktörü.</td><td>Yaşam teknolojisi (DMEM, F199); Atlanta Biyolojik (FBS); İnvitrojen (Hepes); Fisher (Çinkosülfat); Sigma (Vit.B12, deksametazon); Chemicon uluslararası (HGF); Biyoöncü (betaFGF)&nbsp;</td><td>#15630-080 (Hepes); #Z68-500 (ZnSO); #V2876.#D4902 (Vit.B12, Dex); GF116 (HGF); HRP-0011 (bFGF).&nbsp;</td><td>Ortam ve stok çözeltisi hazırlayın Vit. B12 (20mg / ml); Çinko Sülfat (60 & mikro; g/ml); Dex (55&mikro; g/&mikro; l) daha kolay kullanım için ayrı ayrı. HGF stok çözeltisi (5 & mikro; g / ml) ve FGF (20 & mikro; g / ml) son çalışma konsantrasyonunda her hafta taze olarak eklenmelidir.</td></tr><tr><td>TrypLE express</td><td>GIBCO Life Technologies</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>İmmün boyama için miyozin ağır zincir antikoru</td><td>Gelişimsel Hibridoma Bankası</td><td>MF20</td><td>Klonu MF20</td></tr><tr><td>Desmin İmmün boyama için Antikor</td><td>Thermo Scientific</td><td>MS-376-S0</td><td>Klon D33</td></tr><tr><td>At serumu</td><td>Invitrogen</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>Primer cilt fibroblast izolasyonu için reaktifler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Taşıma ortamı: %10 fetal sığır serumu ve %0.2 penisilin/streptomisin ile desteklenmiş RPMI 1640</td><td>RPMI ortamı 1640: GIBCO Yaşam Teknolojileri</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>İnsan primer fibroblast kültür ortamı: %10 fetal sığır serumu ve %1 penisilin/streptomisin ile desteklenmiş RPMI 1640</td><td>Fetal sığır serumu: Thermo Scientific</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz çözeltisi: 12.5 ml fibroblast kültür ortamında yeniden süspanse edilmiş ve filtre ile sterilize edilmiş kollajenaz tip 2 (100 mg)</td><td>Worthington</td><td>4176</td><td></td></tr><tr><td>Steril 1X Fosfat Tampon Salin (PBS) kalsiyum ve magnezyum içermez</td><td>Lonza</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>Primer miyoblastların</td><td></td><td></td><td></td>izolasyonu için malzemeler</tr><tr><td>50 ml ve 15 ml steril konik tüpler</td><td>GeneMate/Bioexpress</td><td>C-3394-4 (50 mi); C3394-1 (15 ml))</td><td></td></tr><tr><td>Steril neşterler</td><td>Aspen Surgical</td><td>372610</td><td></td></tr><tr><td>Hemositometre</td><td>Hausser Scientific</td><td>1492</td><td></td></tr><tr><td>Steril 5, 10 ve 25 ml pipetler</td><td>Bellco cam</td><td>1226-05010 (5 ml); 1200-10010 (10 ml) ; 1228-25050 (25 ml)</td><td>Tekrar kullanılabilir pipetler kullanımdan önce yıkanır, pamuk tıkanır ve otoklavlanır</td></tr><tr><td>Steril doku kültürü uygulanmış plastik tabaklar (10 cm</td>)<td>BD Falcon</td><td>353003</td> Steril naylon hücreli süzgeçler (100 & <td></td></tr> mikro<tr><td>; m ve 40 &mikro; m boyutu)</td> <td>BD Falcon</td><td>352340 (40 ve mikro; m); 352360 (100&mikro; m)</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Myoblast ölümsüzleştirme</td><td></td><td></td><td></td>malzemeleri</tr><tr><td>Steril 0.45 ve mikro; m filtreler</td><td>Kırlangıç</td><td>SLHV013SL</td><td></td></tr><tr><td>Klonlama halkaları</td><td>Corning</td><td>#3166-8</td><td>Kullanım öncesi ve sonrası temizlenecek ve otoklavlanacak</td></tr><tr><td>Fibroblast hücre hatları için malzemeler&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steril 35 mm doku kültürü uygulanmış plastik tabaklar</td><td>Greiner bio-one</td><td>628160</td><td></td></tr><tr><td>Steril neşterler</td><td>DeRoyal</td><td>D4510A</td><td></td></tr><tr><td>Steril T25 doku kültürü şişeleri</td><td>Tekno Plastik Ürün, TPP</td><td>90026</td><td>ABD'de MIDSCI</td></tr><tr><td>TrypLE express</td> tarafından satılmaktadır <td>GIBCO Life Technologies</td><td>12605-010</td><td></td></tr></tbody></table>

hastalık modelleme için kas biyopsisi hasta türetilmiş hücre hatları İzolasyonu ve Ölümsüzleştirme

Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

Hastaya özgü hücre dizilerinin oluşturulması, tanısal veya translasyonel araştırmalar için paha biçilmez bir araçtır ve bu hücreler, hastanın tanısal incelemesi sırasında mevcut olan deri veya kas biyopsi dokusundan toplanabilir. Bu protokolde, primer hücre kültürü için küçük miktarlarda kas veya cilt dokusundan canlı hücre izolasyonu için bir teknik tarif ediyoruz. Ek olarak, birincil hücrelerden miyojenik hücre hatlarının ve fibroblast hücre hatlarının ölümsüzleştirilmesi için bir teknik sunuyoruz. Hücre hatları ölümsüzleştirildikten sonra, hastadan türetilen hücrelerin önemli ölçüde genişlemesi sağlanabilir. Ölümsüzleştirilmiş hücreler, ilaç taraması ve genetik mutasyonun in vitro düzeltmesi dahil olmak üzere birçok alt uygulamaya uygundur. Toplamda, bu protokoller, aşağı akış uygulamaları için hastadan türetilen hücreleri oluşturmak ve korumak için güvenilir bir araç sağlar.

Şekil 1 birincil doku ayrışma yer alan önemli bazı adımlar göstermektedir: dokusunun tam miktarı (Şekil 1A, B) steril doku kültürü petri tartılır. Doku bulamaç (Şekil 1C, D) elde edilinceye kadar Doku daha sonra ince steril neşter kullanılarak çekilir. Sindirim enzim ilavesinden sonra, primer kas dokusu ayrılma, genellikle 45-90 dakika içinde enzimatik sindirimi ile elde edilir. Doku sindirimi ilerlemesi tipik Overdigestion ve hücre ölümünü önlemek için her 15-20 dakika...

Bu protokol, kas veya cilt dokusundan miyojenik ve fibroblast hücre hatlarının canlı hücre izolasyonu ve birincil kültürü için teknikleri açıklar. Bu hücre dizilerinin ölümsüzleştirilmesi için bir teknik de tarif edilmiştir. Toplamda, bu protokoller, aşağı akış uygulamaları için hastadan türetilen hücreleri oluşturmak ve korumak için güvenilir bir araç sağlar.

Hastalık Modelleme için kas biyopsisi Hasta türetilmiş Hücre Hatları İzolasyonu ve Ölümsüzleştirme

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, insan hasta kas biyopsilerinden saflaştırılmış kas hücrelerini izole etmek ve bunları sonraki çalışmalar için ölümsüzleştirmektir. Bu işlem, öncelikle toplanan dokunun tartılması, kıyılması ve mononükleer hücreleri ayrıştırmak için sindirilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda, miyojenik hücreler, FACS ile miyojenik olmayan hücrelerden saflaştırılır.Ardından, ölümsüzleştirilmiş hücreler oluşturmak için miyojenik hücreler hem CDK4 hem de hTERT ile enfekte edilir. Sonuçlar, hastadan türetilen canlı kas hücrelerinin birkaç pasaj boyunca çoğaltılabildiğini ve hücre füzyon analizleri, seğiren miyotüplerin varlığı ve miyojenik belirteçlerin ekspresyonuna dayanarak farklılaştırılabildiğini göstermektedir. Bu tekniğin etkileri, kas hastalığı teşhisinin ötesine geçmektedir; çünkü ilaç taramaları veya yüksek sayıda hücreye ihtiyaç duyulan diğer ileri uygulamalar için potansiyel olarak sınırsız sayıda miyojenik hücre sağlayabilir.Prosedürü, Dallas'taki Dr. Woody Wright laboratuvarından doktora sonrası araştırmacı Jerome Robbin ile birlikte uygulamalı olarak göstereceğim. Miyojenik hücreleri saflaştırmak için kas biyopsisinin disosyasyonu ile başlayın. İlk olarak, bir doku kültürü biyogüvenlik kabininde kas biyopsisinin kütlesini kaydedin.Ardından 10 santimetrelik bir kapta, steril bistüriler kullanarak dokuyu ince parçalar halinde kıyın. Dokunun kurumaması için gram başına birkaç damla 1X HBSS ekleyin. 3,5 mililitre disk pastası 2 ve 3,5 mililitre kollagenaz D çözeltileri ekleyin.Ardından hücreleri 25 milliliter pipetle karıştırın ve plakayı her 15 dakikada bir inkübatöre aktarın. Hücreleri 90 dakika içinde beş milliliter pipetle karıştırın. Tam bir doku disosiasyonu gerçekleşmiş olmalıdır.Doku disosiye edildikten sonra, iki hacim büyüme medyumu ekleyin ve bir 100 mikronluk süzgeçten süzün. Filtratı 50 mililitrelik bir tüpe toplayın. Filtrattaki hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 329 G'de pelletleyin.Ardından hücreleri %0,5 BS içeren HBSS içerisinde tekrar süspande edin ve sayılarını belirleyin. Hacmi, 100 mikrolitre başına 1 milyon hücre olacak şekilde ayarlayın. Boyanmamış kontrol olarak 250.000 hücreden oluşan bir alikot ve tekli boyama kontrolleri için benzer iki alikot ayırın.Bunların tamamı faks analizi için gereklidir. Şimdi, hücreleri milyon hücre başına beş µL anti CD 56 antikoru ile boyayın ve tüm örnekleri yarım saat boyunca buz üzerinde inkübe edin. Ardından, örnekleri 10 mL HBSS ile hızlıca yıkayın.Ardından hücreleri daha önce olduğu gibi, ancak 4 °C'de pelletleyin; hücreler pelletlendikten sonra süpernatanı uzaklaştırın ve hücre pelletini 1X HBSS içinde ml başına 5 milyon hücre olacak şekilde yeniden süspanse edin. Daha sonra, final konsantrasyonu 1 µg/mL olacak şekilde propidyum iyodür ekleyin. Şimdi, saflaştırma plakasına uygun olarak FACS kullanarak miyojenik CD56 pozitif hücreleri miyojenik olmayan hücrelerden saflaştırın.Miyojenik hücreleri, %0,1 jelatin ile kaplanmış altı kuyucuklu plaklarda kuyucuk başına 50.000 adet olacak şekilde kültüre edin; hücreler yapışana kadar bekleyin, ardından hücre hattını ölümsüzleştirmek için onları virüsle enfekte edin. Metin protokolünde, dermal fibroblastların nasıl saflaştırılacağı ve kültüre edileceğine dair metin protokolünde açıklandığı üzere ek bir inceleme yer almaktadır. Phoenix tropic hücrelerini, plazmit PolyJet karışımı ile gece boyunca inkübe ettikten sonra hazırlayın.Hücreleri; dört birim DME M1, bir birim medium 199 ve %10 dana serumundan oluşan taze besiyeri ile besleyin. Ayrıca izotropik paketleme hazırlayın. Altı kuyucuklu bir plakaya, kuyucuk başına yaklaşık 400.000 PA 3-17 hücresi olacak şekilde PA 3-17 hücrelerini ekleyin.12 saat sonra, Phoenix tropic hücrelerin üzerindeki virüs içeren süpernatantı toplayın ve 0.45 mikronluk bir filtreden geçirin. Ardından, PA three 17 hücrelerini enfekte etmek için süpernatantın bir mililitresini kullanın ve bunları gece boyunca kültüre edin. Ertesi gün, hücreler konfluens seviyesine yaklaştığında ortama 0.5 miligram/mL konsantrasyonunda antibiyotikler uygulayarak PA three 17 hücreleri arasından virüs üreten bir hücre hattı seçin; hücrelerin üzerindeki süpernatantı 12 saatlik aralıklarla üç kez hasat edin.Her hasat sonrası koleksiyonları filtreleyin. Filtrat, çalışma viral süpernatantıdır. Bunu bir mililitrelik alikotlara ayırın.Hemen kullanmak üzere birkaç alikotu ayırın. Fazla alikotlar -80 °C'de saklanabilir, ancak her dondurma-çözme döngüsünde verimlilikleri %50 azalacaktır. Tüm süreç boyunca, viral partiküllerle temas eden ekipmanların atık kutusuna atılmadan önce çamaşır suyu ile yıkanması gerektiğini unutmayın.Stabil PA three 17 virüs üreten hücre hattını kalıcı olarak saklamak için, hücreleri %10 DMSO %90 serum içinde dondurun ve saflaştırılmış hücrelerin her bir kuyucuğuna -150 °C'de saklayın. Altı kuyucuklu bir plakaya, 400 µL taze üretilmiş viral süpernatan ekleyin. Kontrol grubu olarak iki kuyucuğu virüssüz bırakın.Plakayı gece boyunca inkübe edin ve ertesi gün her kuyucuktaki besiyerini 2,5 milliliters taze kas besiyeri ile değiştirin. Viral partiküller içeren besiyerini ve pipetleri çamaşır suyu kabına attığınızdan emin olun. Hücreleri taze kas besiyerinde üç gün boyunca inkübe edin.Ardından, CDK 4 enfeksiyonu için mililitre başına 400 µg neomisin veya insan telomeraz ters transkriptaz enfeksiyonu için mililitre başına 300 µg higromisin kullanarak antibiyotik direnci için hücreleri seçin. Bu işlemi bir veya iki hafta boyunca sürdürün. Kontrol kuyucuklerindeki tüm hücreler ölene kadar hücreleri seçici koşullar altında tutun.Hücreleri, seçilim sürecinde bile, konfllü hale gelmeden önce, %60 ila %80 konfluens düzeyine ulaştıklarında pasajlayın; hücreleri toplamak ve pasajlamak için %0,05 tripsin EDTA çözeltisi kullanın. Hücreleri, antibiyotikli taze miyoblast ortamı içeren 10 santimetrelik kaplara pasajlayın. Başlangıçta hücreleri, 10 santimetrelik kap başına 3 ila 500 gibi çok düşük bir yoğunlukta ekimleyin.Hücreleri, 10 ila 20 hücreden oluşan küçük koloniler belirginleşene kadar yaklaşık iki hafta boyunca bu kaplarda tutun. Hücrelerin kurumasını önlemek için sadece ince bir medya tabakası bırakarak medyanın çoğunu uzaklaştırın. Şimdi, bir klonlama halkasının bir tarafını silikon vakum gresine batırın ve halkayı istenen klonun üzerine yerleştirin.Her halkadaki istenen her bir klonun etrafına farklı bir halka çizin. Birkaç damla tripsin EDTA çözeltisi ekleyin. Hücreler yuvarlaklaştığında, her bir hücre kümesini bir mikroskop altında 200 µL'lik bir pipet ucuyla dikkatlice aspire edin.Hücre toplarını mevcut olan en küçük çok kuyucuklu plakadaki kuyucuklara aktarın. Ardından, konfüensin önlenmesi için her bir klonu gerektiği şekilde genişletin. Tanımlanan protokol kullanılarak miyojenik hücreler; fibroblastlar, adipojenik hücreler ve muhtemelen bağışıklık hücreleri ile birlikte izole edilmiş ve ardından FACS ile saflaştırılmıştır.Hücreler daha sonra, siklin bağımlı kinaz dört (CDK4) ve insan telomeraz ters transkriptaz (hTERT) eksprese eden virüsler kullanılarak tanımlandığı şekilde ölümsüzleştirilmiştir. Hücrelerin farklılaşma programına girip miyotüpler oluşturabilme olasılığı nedeniyle, her adımda kapların konfluens seviyesini düşük tutmak kritik öneme sahipti. Ölümsüzleştirilmemiş kontrol hücreleri ile ölümsüzleştirilmiş hücrelerde miyotüp oluşumu ve kontraksiyon karşılaştırıldığında herhangi bir fark görülmemiştir.Hücre hattının ölümsüzlüğü, telomer uzunluğu ve telomer aktivitesi ölçülerek doğrulanmıştır. Ölümsüzlük, hücre büyüme eğrilerinden de belirgin şekilde görülmüştür. Bu videoyu izledikten sonra, primer kas hücrelerinin hasta biyopsisinden nasıl ayrıştırılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.Primer miyoblastları ölümsüzleştirin, ardından ölümsüzleştirilmiş miyojenik klonları izole edip seçin. Virüslerle çalışmanın özel bir doku kültürü kabini ve güvenli bir havalandırma sistemi kullanımını gerektirdiğini unutmayın. Ek olarak, istenmeyen kontaminasyonları önlemek için pipetler, uçlar, kaplar, şırıngalar ve filtreler gibi virüs manipülasyonunda kullanılan her şey çamaşır suyu ile sterilize edilmelidir.Viral partiküller tehlikeli olabilir ve bu prosedür gerçekleştirilirken her zaman gerekli önlemler alınmalıdır.

isolation-immortalization-patient-derived-cell-lines-from-muscle

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Mikro-disseke eksplantlar tekniği, iskelet kas kök hücre kaynağı olarak çocuk, yetişkin ya da embriyonik kasları proliferatif iskelet kas hücreleri izole için sağlam ve güvenilir bir yöntemdir. Benzersiz, bu hücrelerin klonal in vivo nakli için kullanılan iskelet kas kök hücre hatları üretmek için türetilmiştir.

Yetişkin ve Embriyonik İskelet, Kas Microexplant Kültür ve İskelet Kası Kök Hücre İzolasyonu

Myofibers izolasyonu ve kültürü altın...

Yetişkin İskelet Kası gelen bireysel Myofibers ve Uydu Hücre İzolasyonu ve Kültür

İnsan kasından türetilen ana yapışık hücre tipleri miyojenik hücreler ve fibroblastlardır. Burada, hücre popülasyonları, CD56 antijenine dayalı olarak manyetik olarak aktive edilen hücre sıralaması kullanılarak zenginleştirilir. Spesifik antikorlarla müteakip immüno-etiketleme ve görüntü analiz tekniklerinin kullanılması, tek tek hücrelerde sitoplazmik ve nükleer özelliklerin miktar tayinine izin verir.

İnsan İskelet Kası İlköğretim andMyogenic Hücreleri ve Fibroblast İzolasyon ve Kantitatif İmmünositokimyasal Karakterizasyonu

Bu protokol, fare kas liflerinde floresan olarak işaretlenmiş proteinleri tanıtmak ve eksprese etmek için elektroporasyonu kullanır. Elektroporasyondan sonra geri kazanımın ardından lifler izole edilir. Tek tek lifler daha sonra kas yapısını görselleştirmek için yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskopi kullanılarak görüntülenir.

DNA Elektroporasyon, Myofibers İzolasyon ve Görüntüleme

Burada, insan miyoblastlarının saf bir popülasyonunu yetişkin kas dokusundan elde etmek için bir metodoloji tarif ederiz. Bu hücreler, in vitro iskelet kası diferansiasyonunu incelemek ve özellikle Ca 2+ sinyallemeyle ilgili proteinleri incelemek için kullanılırlar.

İnsan Myoblastlarının İzolasyonu, Miyojenik Farklılaşmanın Değerlendirilmesi ve Mağazada Kullanılan Kalsiyum Giriş Ölçümü

İskelet kas biyopsi sözünde nizolating, culturing, karakterizasyonu ve insan primer kas atası hücreleri (hMPCs) ayırt etme teknikleri salıyoruz.  bu yöntemlerle elde edilen ve karakterize edilen hMPC'ler daha sonra insan miyogenezi ve iskelet kası rejenerasyonu ile ilgili araştırma sorularını ele almak için kullanılabilir.

İskelet Kas Biyopsisi Prosedüründen İnsan Kas Atası Hücrelerinin İzolasyon, Kültür, Karakterizasyonu ve Farklılaşması

Miyoblastlar polinükleatlı miyotüpler ve sonunda iskelet kası miyofiberleri oluşturmak için farklılaşan öncül hücrelerdir. Burada, genç yetişkin fare iskelet kaslarından etkili izolasyon ve birincil miyoblast kültürü için bir protokol salıyoruz. Bu yöntem, kültürdeki kas hücrelerinin moleküler, genetik ve metabolik çalışmalarını mümkün kılar.

Fare İskelet Kas Ekstranında Primer Miyoblastların İzolasyon ve Farklılaşması

Burada, homozigot mutant Lamin Δ8-11 fare modeli, Emery-Dreifuss kas distrofisi (EDMD) için çok ciddi bir model erken doğum sonrası gelişim aşamalarında verimli bir şekilde tek kas lifleri elde etmek için bir yöntem öneriyoruz.

Erken Doğum Sonrası Gelişimde Emery-Dreifuss Musküler Distrofi'nin Murine Modelinden Tek Miyofiber İzolasyon ve Kültür

Bu protokol, cilt fibroblastlarının miyoblastlara dönüşümünü ve farklılaşmalarını miyotüplere açıklar. Hücre hatları nöromüsküler bozukluğu olan hastalardan türetilmiştir ve patolojik mekanizmaları araştırmak ve terapötik stratejileri test etmek için kullanılabilir.

Nöromüsküler Bozukluklar için Tedavileri Araştırmak için İnsan Fibroblastlarının Myoblastlara Doğrudan Yeniden Programlanması

Bu protokol, kas kök hücrelerinin ve fibro-adipojenik progenitörlerin farelerde bireysel iskelet kaslarından izolasyonunu tanımlar. Protokol, tek kas diseksiyonu, floresan aktive hücre sıralama ile kök hücre izolasyonu, immünofloresan boyama ile saflık değerlendirmesi ve 5-etinil-2'-deoksiüridin dahil etme testi ile S-faz girişinin kantitatif ölçümünü içerir.

Sessiz Kök Hücre Popülasyonlarının Bireysel İskelet Kaslarından İzolasyonu

Bu protokol, yetişkin ve yenidoğan fare iskelet kaslarından birincil miyoblastların doku ayrışması, ardışık filtrasyon, ön kaplama ve tanımlanmış kültür koşulları yoluyla izole edilmesi ve zenginleştirilmesi için standartlaştırılmış bir yöntem sunar; böylece uydu hücresinden türetilen miyoblast kültürlerinin sonraki deneysel uygulamalar için oluşturulması ve bakımı mümkün olur.

In vitro miyogenez çalışmaları için iskelet kası uydu hücrelerinin izolasyonu

Öğrenin kas hastalıkları araştırmaları için hasta biyopsisinden miyojenik hücre izolasyonu ve ölümsüzleştirme yöntemini. Bu teknik sınırsız hücre kaynağı sağlayarak ilaç tarama çalışmalarına olanak tanır.

Hastalık Modelleme için kas biyopsisi Hasta türetilmiş Hücre Hatları İzolasyonu ve Ölümsüzleştirme

Daha fazla video keşfet