Hastalık Modelleme için kas biyopsisi Hasta türetilmiş Hücre Hatları İzolasyonu ve Ölümsüzleştirme

Aşağıdaki deneyin genel amacı, saflaştırılmış kas hücrelerini insan hasta kas biyopsilerinden izole etmek ve bunları sonraki çalışmalar için ölümsüzleştirmektir. Bu, mononükleer hücreleri ayırmak için önce toplanan dokunun tartılması, kıyılması ve sindirilmesiyle elde edilir. İkinci adım olarak, miyojenik hücreler gerçeklerle miyojenik olmayan hücrelerden saflaştırılır.

Daha sonra, miyojenik hücreler, ölümsüzleştirilmiş hücreler oluşturmak için hem CDK four hem de H turt ile enfekte edilir. Sonuçlar, hasta kaynaklı canlı kas hücrelerinin birkaç pasaj için genişletilebileceğini ve hücre füzyon deneylerine, seğiren miyo tüplerinin varlığına ve miyojenik belirteçlerin ekspresyonuna dayalı olarak farklılaştırılabileceğini göstermektedir. Bu tekniğin etkileri, kas hastalığının teşhisinin ötesine uzanır, çünkü ilaç taraması veya yüksek sayıda hücrenin gerekli olduğu diğer aşağı akış uygulamaları için potansiyel olarak sınırsız sayıda miyojenik hücre sağlayabilir.

Prosedürü, Dallas'taki Dr.Woody Wright'ın laboratuvarından doktora sonrası bir araştırmacı olan Jerome Robbin ile birlikte göstereceğim. Miyojenik hücreleri saflaştırmak için kas biyopsisini ayrıştırmakla başlayın. İlk olarak, bir doku kültürü biyogüvenlik başlığında, kas biyopsisinin kütlesini kaydedin.

Daha sonra 10 santimetrelik bir tabakta, dokuyu ince doğranmış parçalara ayırmak için steril neşterler kullanın. Bir gram doku başına dokunun kurumaması için birkaç damla X-H-B-S-S ekleyin. 3,5 mililitre disk macunu iki ve 3,5 mililitre kollajenaz D solüsyonu ekleyin.

Daha sonra hücreleri 25 mililitrelik bir pipetle karıştırın ve plakayı her 15 dakikada bir inkübatöre aktarın. Hücreleri 90 dakika içinde beş mililitrelik bir pipetle karıştırın. Tam bir doku ayrışması olmalıdır.

Doku ayrıştıktan sonra, iki hacim büyüme ortamı ekleyin ve 100 mikronluk bir süzgeçten süzün. Süzüntüyü 50 mililitrelik bir tüpte toplayın. Hücreleri süzüntüden oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 329 G'de peletleyin.

Daha sonra HBSS'deki hücreleri% 0.5 BS, A ile yeniden süspanse edin ve sayın. 100 mikrolitre başına 1 milyon hücre elde etmek için hacmi ayarlayın. Lekesiz kontrol olarak 250.000 hücreli bir alikot ayırın ve tek leke kontrolleri için iki benzer alikot ayırın.

Bunların hepsi faks analizi için gereklidir. Şimdi, hücreleri milyon hücre başına beş mikrolitre anti CD 56 antikoru ile boyayın ve tüm örnekleri yarım saat boyunca buz üzerinde inkübe edin. Daha sonra, numuneleri 10 mililitre HBSS ile hızlı bir şekilde yıkayın.

Daha sonra hücreleri daha önce olduğu gibi peletleyin, ancak hücreler peletlendikten sonra dört santigrat derecede, süpernatanı atın ve hücre peletini mililitre başına 5 milyon hücrede bir X-H-B-S-S'de yeniden süspanse edin. Daha sonra mililitre başına bir mikrogramlık bir nihai konsantrasyona propidyum iyodür ekleyin. Şimdi, saflaştırma plakasını takip eden gerçekleri kullanarak miyojenik CD 56 pozitif hücreleri miyojenik olmayan hücrelerden arındırın.

% 0.1 jelatin kültürü ile kaplanmış altı oyuklu plakalarda kuyu başına 50.000'deki miyojenik hücreler, hücreler bağlanana kadar, daha sonra hücre hattı ölümsüzlüğü için virüs ile enfekte eder. Metin protokolünde, metin protokolünde açıklandığı gibi dermal fibroblastların nasıl saflaştırılacağı ve kültürleneceği hakkında ek bir inceleme vardır. Anka tropik hücrelerini plazmid PolyJet karışımı ile gece boyunca inkübe ettikten sonra anka kuşu tropik hücrelerini hazırlayın.

Hücreleri taze, orta, dört kısım DME M1, bir kısım orta, 1 99 ve% 10 buzağı serumundan oluşur. Ayrıca inotropik ambalaj hazırlayın. PA üç 17 hücreli altı oyuklu bir plakada, yaklaşık 400.000 PA, kuyucuk başına üç 17 hücre.

12 saat sonra, süpernatan içeren virüsü Phoenix tropik hücreleri üzerinde toplayın ve 0.45 mikronluk bir filtreden geçirin. Daha sonra PA üç 17 hücresini enfekte etmek için bir mililitre süpernatan kullanın ve bunları gece boyunca kültürleyin. Ertesi gün, hücreler ko-akıcılığına yakın olduğunda ortama mililitre başına 0.5 miligramda antibiyotik uygulayarak PA üç 17 hücreden virüs üreten bir hücre hattı seçin, süpernatanı hücrelerden 12 saatlik aralıklarla üç kez toplayın.

Her hasattan sonra koleksiyonları filtreleyin. Süzüntü, çalışan viral süpernatandır. Bir mililitreye bölün. Öksürükler.

Hemen kullanım için birkaç alikot ayırın. Ekstra alikotlar eksi 80 santigrat derecede saklanabilir, ancak her donma çözülme döngüsünde %50 verim kaybeder. Proses boyunca viral partiküllere temas eden ekipmanın, atık kutusuna atılmadan önce ağartıcı ile yıkanması gerektiğini unutmayın.

Kararlı PA üç 17 virüsü üreten hücre hattını kalıcı olarak saklamak için, hücreleri %10 DMSO% 90 serumda dondurun ve eksi 150 santigrat derecede faksla saflaştırılmış hücrelerin her bir kuyusuna saklayın. Altı oyuklu bir plakaya, 400 mikrolitre taze üretilmiş viral süpernatan ekleyin. Kontrol olarak virüssüz iki kuyu bırakın.

Plakayı gece boyunca inkübe edin ve ertesi gün her bir oyuğun içindeki ortamı 2,5 mililitre taze kas ortamına değiştirin. Viral parçacıklar içeren ortamı ve pipetleri çamaşır suyu kabına attığınızdan emin olun. Hücrelerin taze kas ortamında üç gün boyunca kuluçkaya yatmasına izin verin.

Daha sonra, CDK dört enfeksiyonu için mililitrede 400 mikrogram neomisin veya insan telomerazı için mililitrede 300 mikrogram higromisin kullanarak antibiyotik direnci için hücreleri seçin. Bir veya iki hafta boyunca transkriptaz enfeksiyonunu tersine çevirin. Hücreler ve kontrol kuyuları ölene kadar hücreleri seçici koşullar altında tutun.

Hücreleri her zaman birleşim haline gelmeden önce geçirin, seçim sırasında bile% 60 ila% 80 Co akıcılığına ulaştıklarında bile, hücreleri toplamak ve geçirmek için% 0.05'lik bir tripsin EDTA çözeltisi kullanın. Hücreleri 10 santimetrelik yemeklere taze miyoblast, orta antibiyotiklerle geçirin. İlk olarak, hücreleri 10 santimetrelik bir tabak başına üç ila 500 arasında çok düşük bir yoğunlukta tohumlayın.

Küçük koloniler belirgin olduğunda 10 ila 20 hücreden oluşan küçük koloniler oluşana kadar bu kaplardaki hücreleri yaklaşık iki hafta koruyun. Hücrelerin kurumasını önlemek için yalnızca ince bir ortam filmi bırakarak ortamın çoğunu çıkarın. Şimdi, bir klonlama halkasının bir tarafını silikon vakum yağına batırın ve halkayı istediğiniz bir klonun üzerine batırın.

Her halkada istenen her klonun etrafına farklı bir halka koyun. Birkaç damla tripsin EDTA çözeltisi ekleyin. Hücreler yuvarlaklaştığında, her bir hücre topunu 200 mikrolitrelik bir pipet ucuna dikkatlice aspire etmek için bir mikroskop kullanın.

Hücre toplarını mevcut en küçük çok kuyulu plakanın kuyularına aktarın. Ardından, co akıcılığını önlemek için her klonu gerektiği gibi genişletin. Tarif edilen protokol kullanılarak, miyojenik hücreler fibroblastlar, adipojenik hücreler ve muhtemelen bağışıklık hücreleri ile birlikte izole edildi ve daha sonra gerçeklerle saflaştırıldı.

Hücreler daha sonra siklin bağımlı kinaz dört, CDK dört ve insan telomeraz ters transkriptaz h turt eksprese eden virüsler kullanılarak tarif edildiği gibi ölümsüzleştirildi. Ölümsüzleştirilmemiş kontrol hücreleri ile ölümsüzleştirilmiş hücrelerde mio tüp oluşumu ve kasılmasını karşılaştıran miyo tüpleri oluşturabilecekleri için bulaşıkların her adımda ortak akıcılığın altında tutulması çok önemliydi. Hiçbir fark görülmedi.

Hücre hattının ölümsüzlüğü, telomer uzunluğu ve telomer aktivitesi ölçülerek doğrulandı. Ölümsüz, hücre büyüme eğrilerinden de belirgindi. Bu videoyu izledikten sonra, birincil kas hücrelerini hasta biyopsisinden nasıl ayıracağınızı iyi anlamış olmalısınız.

Birincil miyoblastı ölümsüzleştirin ve miyojenik klonları izole edin ve ölümsüzleştirin. Virüsle çalışmanın özel doku kültürü ve güvenli ventilasyon sistemi gerektirdiğini unutmayın. Ek olarak, istenmeyen kontaminasyonu önlemek için pipetler, uçlar, bulaşıklar, şırıngalar ve filtreler gibi virüs manipülasyonuna dahil olan her şey ağartılmalıdır.

Viral partiküller tehlikeli olabilir ve bu prosedür uygulanırken her zaman önlem alınmalıdır.