Fare Kolorektal Afferent Endings in vitro Fonksiyonel Karakterizasyonu içinde

Aşağıdaki deneyin genel amacı, fare co rektumundaki ekstrinsik afferent sinir uçlarını in vitro olarak fonksiyonel olarak karakterize etmektir. Bu, kolorektal ve bağlı pelvik veya lomber Splunk boyun sinirinin süreklilik içinde toplanması ve dokunun bir in vitro kayıt odasına yerleştirilmesiyle elde edilir İkinci adım olarak, pelvik veya lomber Splunk boyun sinir gövdesi ince filamentlere bölünür, böylece tek tek sinir aksonlarının tek lifli elektrofizyolojik kayıtları yapılabilir. Daha sonra, bireysel kolorektal sinir uçları, alıcı alanların tarafsız elektriksel stimülasyonu ile tanımlanır ve üç farklı mekanik uyarana yanıt profillerine göre fonksiyonel olarak sınıflandırılır.

Ek olarak, sinir uçlarına uygulanan kimyasallara verilen tepkiler, alıcı alanı bir parça pirinç boru ile izole ederek ve çözeltiyi kimyasal veya kimyasal karışımını içeren çözelti ile değiştirerek test edilebilir. Sonuçlar, fare kolorektalinin beş farklı mekanik duyarlı ens sınıfı tarafından innerve edildiğini göstermektedir. Ek olarak, kolorektal enslerin yaklaşık% 25'i mekanik olarak duyarsız veya sessiz nosiseptörlerdir.

Bu yöntem, kolorektalin duyusal innervasyonunu incelemek için biz ve diğerleri tarafından kullanılır. Bu araştırma yaklaşımını kullanmakla ilgileniyoruz çünkü birçok gastrointestinal bozukluk duyarlılık veya duyusal innervasyonun uyarılabilirliğinde bir değişiklik ile ilişkilidir. Duyarlılık mekanizmalarını anlamaya olan ilgimiz, daha sonra irritabl bağırsak sendromu gibi bu gastrointestinal bozukluklarla tipik olarak ilişkili ağrı ve rahatsızlığı modüle etmek için yararlı olabilecek terapötik stratejiler geliştirmeye yardımcı olma arzumuzla ilgilidir.

Doku diseksiyonu ve sinir bölme adımlarında ustalaşmak çok zor olduğu için bu yöntemin görsel gösterimi çok önemlidir. Sinirler yenilik yapıyor. Distal kolorektal diseksiyon sırasında kolayca hasar görebilir.

Bu nedenle, dikkatli bir diseksiyon ve bölme adımları, bu deneyi tekrarlamak isteyenler için gerçekten kritiktir. Bir fareyi ötenazi yaptıktan hemen sonra kan kaçırın, göğüs odasını kesin, sağ atriyumu delin ve fare karkasını ve yaklaşık yarım litre buz gibi soğuk Creb solüsyonunu daldırın. Ardından, kolon ve pelvik organlar dışındaki tüm iç organları dikkatlice çıkarın.

Daha sonra farenin gövdesini torasik diyaframın biraz üzerinde yaklaşık T 12'de geçirin ve vücudun yarısını buz gibi soğuk kabarcık crebs solüsyonu içeren bir diseksiyon odasına aktarın. Bir stereoskop altında, mesaneyi ve üreme organlarını, birleşim yerlerinden üretraya keserek çıkarın. Ayrıca, inen aortu ortak iliak arterlere çatallanana kadar çıkarın.

Şimdi, pelvik veya lomber splank boyun sinirlerini çevre dokulardan kurtarın. Sinirleri iliak krestin dışından vertebral kolona giriş noktalarına kadar takip edin. Pelvik sinirler L altı ve S bir vertebral kolona girer ve lomber splank sinirleri T 13 ve L bir'e girer.

İşte sol ve sağ pelvik sinirlerin diseksiyonu. Sonra, kasık sentezini kesin ve sağ ve sol asetabular eklemleri kesin. Ardından iliak kemiği çıkarın İlyakı çıkardıktan sonra, distal kolorektali bağlı sinir Serbest olacak şekilde diseksiyon yapın.

Çevredeki kas ve bağ dokusundan bağlanan sinir. Sinir, mekanik hasara karşı hassastır. Çevresindeki dokudan kurtuluruz, bu nedenle siniri çekmemek veya sıkıştırmamak için özel dikkat gösterilmelidir.

Daha sonra kolorektali bağlı sinir ile doku odasına aktarın. Kolorektali anti mezenterik sınır boyunca uzunlamasına açın ve kolorektal mukozal tarafı yukarı gelecek şekilde konumlandırın. Ardından siniri, banyo bölmesine bir fare deliği ve kapısı ile bağlanan kayıt bölmesine uzatın.

Sinir gövdesini küçük bir cam aynanın üzerine yerleştirin. Ayna hidrofiliktir ve sinir ona yapışacaktır. Şimdi kayıt bölmesinin yanında, kolorektalin mezenterik kenarını sabitleyin.

Şimdi bir banyo bölmesini ılık oksijenli Creb solüsyonuyla süper birleştirin ve kurulumu tamamlamak için kayıt bölmesini mineral yağ ile doldurun. Kolorektalin anti mezenterik uzunluğunu, yüksek büyütmede stereo mikroskop altında bir kuvvet aktüatörüne bağlı bir kanca tırmığına takın. İnce forseps kullanarak izole edilmiş pelvik veya lomber splank boyun sinirinden sinir kılıfını dikkatlice soyun.

Sinir gövdesini, her biri yaklaşık 100 mikron kalınlığında olan beş ila sekiz sinir demetine ayırın. Şimdi referans elektrodu doku odasındaki Krebs çözeltisi ile temas ettirin. Ardından, kolorektal enslerden aksiyon potansiyellerini uyandırmak için tek tek sinir demetlerini kayıt elektroduna sırayla yerleştirin.

Yumuşak bir boya fırçası kullanarak kolorektal yüzeye hafifçe vurun. Böylece, kolonu innerve eden sinir demetini veya demetlerini tanımlayın. Şimdi bir çift 30 gauge iğne ucu kullanarak, sinir demetini 10 mikron kalınlığında filamentlere bölün ve filamentlerden birini kayıt elektroduna yerleştirin.

Bu adım, yüksek düzeyde göz, el koordinasyonu ve el becerisi gerektirir. Daha sonra, afferent sinir uçlarını elektriksel olarak uyarmak için, yuvarlak uçlu konsantrik elektrotu mukozal yüzeye dik olarak konumlandırın ve bir üst eşik yoğunluğunda uyarın. Bu, iki milimetre yarıçapına yayılmış bir akım üretir.

Alıcı uçları bulmak için, elektrodu düzleştirilmiş korektumun uzunluğu ve genişliği boyunca 1,5 milimetrelik adımlarla sistematik olarak hareket ettirin. Afferent bir son uyarıldığında, yanıt vermek için en az uyaran yoğunluğuna ihtiyaç duyan alıcı alanı tam olarak belirlemek için elektrot konumunu ve uyaran yoğunluğunu ayarlayın. Uyaran eşiği üç miliamperden büyükse, o sinir ucunu atın ve başka bir sinir filamentini incelemeye devam edin.

Şimdi, alıcı alandaki uyarıcı elektrot ile kayıt bölgesi arasındaki mesafeden ve uyaran artefaktı ile aksiyon potansiyelinin başlangıcı arasındaki iletim gecikmesinden iletim hızını hesaplayın. Elektriksel uyaranla bir alıcı alan bulduktan sonra, üç mekanik uyaran uygulayın. İlk olarak, naylon monofilament gibi kalibre edilmiş bir von yıpranmasının ucunu, düzleştirilmiş kolorektal üzerindeki alıcı alana dik olarak bastırarak bir sondalama uyarısı uygulayın.

0.4 gram ve bir gram kuvvet üreten monofilamentler kullanın. İkinci olarak, alıcı alanda küçük bir yüzey kesme gerilimi oluşturmak için 10 miligramlık bir kuvvet üreten kolorektal mukozayı ince bir naylon filament ipliği ile nazikçe okşayarak bir okşama uyarısı üretin. Üçüncüsü, bilgisayar kontrollü bir kuvvet aktüatörü kullanarak çevresel esnemeyi gerçekleştirin.

Kolorektalin anti mezenterik kenarı boyunca çevresel yönde gerilmiş bir rampa kuvveti iletmesini sağlayın. Şimdi ENS'yi serozal mukozal kas mukozal veya MIAA mekanik olarak duyarsız afferent olarak sınıflandırın. Üç testin sonuçlarına dayanarak.

Kimyasal duyarlılığı test etmek için rampalı bir çevresel, germe veya dikey mekanik problama ile önceki bölümde olduğu gibi mekanik bir uyarana temel bir yanıt kaydederek başlayın. İlk olarak, bir pirinç veya paslanmaz çelik boru parçasının alt kenarını petrolle kaplayın ve kolorektal üzerindeki alıcı alanın üzerine yerleştirin. Şimdi Krebs çözeltisini borunun içinden aspire edin ve çözeltiyi 170 mikrolitre test çözeltisi ile değiştirin.

Afferentteki yanıtları izlerken boruyu üç ila beş dakika yerinde bırakın. Hortumu dört ila altı dakika içinde çıkardıktan hemen sonra, temel yanıtta olduğu gibi aynı mekanik uyarana karşı afferent yanıtı test edin. 15 veya daha fazla dakika sonra, reaktifler yıkanmış olarak kabul edilebilir.

Daha sonra mekanik uyaran tekrar uygulanır. Temel karıncalarla karşılaştırmak için, alıcı bir alan bulmak için disseke edilmiş bir sinir uyarıldı. Alıcı alan, aksiyon potansiyelinin iletim gecikmesi kullanılarak bir aksiyon potansiyeli yanıtı ile tanımlandı.

Hesaplanan iletim hızı saniyede 43 metre idi, bu da miyelinsiz bir C lifi aralığında. Alıcı alanı belirledikten sonra, monofilamentler gibi elde tutulan von fray ile dik olarak incelendi ve ayrıca elde tutulan ince bir naylon filament tarafından nazikçe okşandı. Sondalamaya verilen AFR tepkileri, kolorektal üzerinde aynı bölgeye, bir dizi hassas zamanlanmış ve tekrarlanabilir mekanik kuvvet ileten bilgisayar kontrollü bir kuvvet aktüatörü tarafından da değerlendirildi.

Benzer şekilde, kolorektalin çevresel gerilmesi aynı aktüatör çabası ile sağlandı. Yanıtlar, beş dakika ile ayrılmış üç ardışık çevresel gerilme ile uyandırılan gerilmeye duyarlı bir afferentten sondalama, okşama ve germe yanıtlarına verilen yanıtlara dayalı olarak ayırt edilebilir. Spike sayıları eşit olarak sabitlendi ve yüksek tekrarlanabilirlik ve hem tepki büyüklüğü hem de yanıt eşiğini ortaya çıkaran uyaran tepki fonksiyonları olarak görüntülendi.

Daha sonra kimyasallar uygulandı. Ens'in doğrudan aktivasyonu, mekanik olarak duyarsız bir afferent üzerine enflamatuar bir çorbanın uygulanmasından sonra bir asit hipertonik çözeltinin uygulanmasından sonra meydana geldi. Sonun aktivasyonu meydana gelmedi, ancak meno duyarlılığının kazanılması belirgindi.

Gerilmeye duyarlı, meno'ya duyarlı bir afferent ayrıca, enflamatuar bir çorbanın uygulanmasından sonra alıcı alanın mekanik gerilmesine karşı duyarlı hale getirildi. Bir kez ustalaştıktan sonra, doku diseksiyonunu tamamlamak ve tek lif kaydı elde etmek genellikle üç ila dört saat sürer. Tipik bir deney baştan sona bütün bir gün sürer. Bu videoyu izledikten sonra, kolorektalin sinirler bağlıyken cerrahi olarak nasıl çıkarılacağını ve hasat edileceğini anlamalısınız.

Daha sonra, pelvik sinirdeki veya lomber splank sinirindeki tek Ahern liflerinden kayıt yapabilir ve tarafsız bir elektriksel arama stratejisi kullanarak kolonu innerve edebilir. Daha sonra kok rektumdaki alıcı uçları tanımlayabilmeli ve bunları doğrudan alıcı uçlara kimyasallar uygulayarak mekanik duyarlılık ve kemoterapi duyarlılığı açısından test edebilmelisiniz. Bu hazırlık, kolorektaldeki temel fizyolojik soruların yanı sıra patofizyolojik mekanizmaları incelemenize izin veren güçlü bir hazırlıktır.