Gerçek zamanlı Elektrofizyoloji: Probe Nöronal Dynamics ve Ötesi Kapalı çevrim Protokolleri Kullanma

Aşağıdaki deneyin genel amacı, ücretsiz olarak sunulan LCG yazılım araç kiti kullanılarak kortikal nöronlarda in vitro dinamik klempleme gerçekleştirmektir. Bu işlem, parametal hücrelerden patch clamp kayıtları almak üzere sıçan somatosensör korteks dilimleri hazırlanarak gerçekleştirilir. İkinci adım olarak, kaydedilen hücreye bir dizi otomatik elektrofizyolojik protokol uygulanır; bu protokoller, sonraki analizler ve hücre tipleri arasındaki karşılaştırmalar için faydalı olacak standart bir hücre karakterizasyonu sağlar.

Ardından, eksitatör ve inhibitör sinaptik olayların enjeksiyonu simüle edilir. Neokortikal nöronların in vivo ortamda deneyimlediği yüksek iletim durumunu yeniden oluşturmak amacıyla, sonuçlar arka plan sinaptik enjeksiyonunun kortikal hücrelerin kazancını nasıl modüle ettiğini göstermektedir. Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, örneğin bir deneysel protokolün sonucunu başka bir protokolün girdisi olarak kullanarak, deneysel kayıtları daha karmaşık iş akışlarına entegre edebilme imkanıdır.

Bu yöntem, elektrofizyolojik protokollerin standardize edilmesine yardımcı olabilir, veri analizini hızlandırabilir ve laboratuvarlar arası veri paylaşımının önünü açabilir. Bu yöntem başlangıçta in vitro toptan patch CLA kayıtları için geliştirilmiş olsa da, in vivo patch, CLA kayıtları veya mikro elektrot dizileri ile yapılan kayıtlar gibi diğer deneysel hazırlıklar ve protokoller için de kolaylıkla kullanılabilir. Sıçan beynini çıkardıktan sonra cerebellum'u atın ve iki hemisferi bir bistüri kullanarak orta hat boyunca ayırın, hemisferlerden birindeki fazla sıvıyı uzaklaştırın ve bir damla hızlı yapıştırıcı ile eğimli bir platforma yapıştırın.

Ardından, beynin üzerine hızlıca birkaç damla CSF ekleyin ve beyni Vibram haznesine aktarın. Beyin dokusunun ilk 2,5 ila 3 milimetresini bir bistüri ile çıkarın. Sonrasında, kesit yüzeyindeki hasarı sınırlamak için dilimleme hızını ve frekansını ayarlayın.

Ardından, kalınlığı 300 micrometers olarak ayarlayın ve dilimleme işlemine başlayın. Bıçak korteksin üzerinden geçtikten sonra, hipokampusun üzerinden ve ilgilenilen kortikal bölgenin kenarlarından kesikler atmak için bir ustura bıçağı veya eğik bir iğne kullanın. Bunun ardından, dilimleri 36 °C'deki çok kuyucuklu bir inkübasyon odasına aktarın.

Bu prosedürde, 40x büyütmeli lens ile bir kesiti kayıt odasına yerleştirin. Beşinci katmanda ve beyin yüzeyinin 600 ile 1000 mikrometre altında sağlıklı hücreler arayın. Bu hücreler genellikle daha düşük kontrasta ve pürüzsüz bir görünüme sahiptir ve şişmemişlerdir.

Sağlıklı bir hücre bulunduğunda, mikropipetin üçte birini hücre içi solüsyon ile doldurun. Ardından pipeti, önceden yapılandırılmış Linux işletim sistemindeki kafa aşamasına (head stage) yerleştirin. Bir komut başlatın.

Kabuk (shell) istemini ekleyin. Veri toplama kartının amplifikatörü sürmediğinden emin olmak için bu komutu yazın. Ardından, pipet tutucuya bağlı olan şırınganın pistonuna bastırarak 30 ila 50 milibar pozitif basınç uygulayın.

Ardından, pipeti kesitin yaklaşık 100 mikrometre üzerine yerleştirin ve mikro manipülatörün yaklaşma modunu kullanarak pipeti hedef hücreye doğru hareket ettirin. Bundan sonra, elektrofizyoloji amplifikatöründeki pipet ofsetini ayarlayın ve voltaj klempleme modunda 10 milivoltluk bir test darbesi uygulayın. Pipet direncini izlemek için LCG SEAL testi komutunu kullanın, ardından şırınga pistonunu geri çekerek basıncı 10 ila 30 milibara düşürün.

Hücreye nazikçe yaklaşın ve video kamera monitöründeki görüntüyü gözlemleyerek bir çukurluk (dimple) oluşup oluşmadığını kontrol edin. Aynı zamanda, monitörde görüntülenen akım dalga formunu izleyerek test darbesinin tetiklediği direnç artışını takip edin. Pipet direncinde bir artış ve hücre üzerinde bir çukurluk oluştuğunda, basıncı hemen serbest bırakın ve sızdırmazlık (seal) oluşumuna yardımcı olmak için pipete nazikçe negatif basınç uygulayın.

Bu sırada, tutma potansiyelini kademeli olarak negatif 70 milivolt değerine düşürün. Hücre membranını yırtmak ve bütün hücre konfigürasyonunu oluşturmak için hafif vakum uygulayın. Ardından hücreyi elektriksel özellikleri açısından karakterize edin.

LCGE kodu komutu kullanılmıştır. Burada, -50,5 mV eşiğe sahip, patch uygulanmış bir tabaka beş parametal nöronun ortalama aksiyon potansiyeli verilmiştir. Bu şekil, hiperpolarizan akımlara verilen pasif yanıtların ölçümünü göstermektedir.

Hücrenin temel aktif özelliklerinin tanımlanması, hücrenin düzenli spike atan bir nöron olduğunu ve simüle edilmiş eksitatör post-sinaptik potansiyellerin enjekte edilmesine karşı minimal adaptasyon gösterdiğini ortaya koymaktadır; bir sonraki deneyin kaydedileceği dizini değiştirmek için kabuk komut istemine bu komutu yazın. Amplifikatörün geleneksel donanım kontrollerini kullanmak yerine, köprü dengeleme ve kapasitans kompanzasyonu uygulamak için bu komutu yürüterek aktif elektrot kompanzasyonunu gerçekleştirmek için gereken elektrot çekirdeğini tahmin edin.

Tam çekirdek, hızlı bir elektrot çekirdeği ile tam çekirdekte gözlemlenen eksponansiyel kuyruğa neden olan daha yavaş bir membran çekirdeği olmak üzere iki bileşenin toplamıdır. İlki, pipetin parametrik olmayan bir modelini oluşturur. Membran ve elektrot çekirdeklerini ayırmak için akım enjeksiyonu yapıldığında, LCG çekirdek komutu kullanıcıdan hızlı elektrot çekirdeğini oluşturan nokta sayısını girmesini isteyecektir. Ardından, elektrot çekirdeğinin eksponansiyel sönümlenme kuyruğunun sonunu kapsayacağı bir sayı seçin.

Ardından, bu komutu kullanarak dinamik klempt deneyini gerçekleştirin. Son olarak, sonuçları görselleştirin. İşte dinamik klempt kullanılarak in vivo benzeri aktivitenin yeniden oluşturulması.

Kırmızı ve mavi izler sırasıyla eksitatör ve inhibitör sinapsların simülasyonunu temsil etmektedir. Burada, eksitatör veya inhibitör post-sinaptik akım bombardımanına maruz bırakılmış bir L5 parametal nöronundan kaydedilen voltaj izleri yer almaktadır. Hücreye enjekte edilen ilgili eksitatör, inhibitör ve toplam akımlar grafikte gösterilmiştir.

20 deneme boyunca üretilen spike'ların raster grafiği, nöronun aynı girdiye yanıt olarak son derece güvenilir ve hassas olabileceğini göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, ücretsiz olarak sunulan LCG yazılım araç seti kullanılarak dinamik lamba deneylerinin nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu prosedür, nöral eksitabiliteden karmaşık ağ etkileşimlerine kadar çok çeşitli konuları araştırmak için diğer kapalı döngü protokollerine genişletilebilir.