Gerçek zamanlı Elektrofizyoloji: Probe Nöronal Dynamics ve Ötesi Kapalı çevrim Protokolleri Kullanma

Aşağıdaki deneyin genel amacı, ücretsiz olarak kullanılabilen yazılım araç kutusu LCG'yi kullanarak kortikal nöronlarda in vitro dinamik klemp gerçekleştirmektir. Bu, parametal hücrelerden yama kelepçesi kayıtları için sıçan somatosensoriyel korteksi dilimleri hazırlanarak elde edilir. İkinci adım olarak, kaydedilen hücreye bir dizi otomatik elektrofizyolojik protokol uygulanır ve bu, hücre tipleri arasında sonraki analizler ve karşılaştırmalar için yararlı olacak hücrenin standart bir karakterizasyonunu sağlar.

Daha sonra, uyarıcı ve inhibitör sinaptik olayların enjeksiyonu simüle edilir. Neokortikal nöronların in vivo olarak deneyimlediği yüksek iletken durumu yeniden oluşturmak için sonuçlar, arka plan sinaptik enjeksiyonunun kortikal hücrelerin kazanımını nasıl modüle ettiğini göstermektedir. Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, örneğin bir deneysel protokolün sonucunu başka bir protokole girdi olarak kullanarak deneysel kayıtları daha karmaşık iş akışlarına yerleştirme olasılığıdır.

Bu yöntem, elektrofizyolojik protokollerin standartlaştırılmasına, veri analizinin hızlandırılmasına ve laboratuvarlar arasında veri paylaşımının önünün açılmasına yardımcı olabilir. Bu yöntem başlangıçta in vitro olarak toptan yama CLA kayıtları için geliştirilmiş olsa da, in vivo yama, CLA kayıtları veya yarışı dizmek için mikro ile hızlandırıcı kayıtlar gibi diğer deneysel hazırlık ve protokoller için de rahatlıkla kullanılabilir. Sıçan beynini çıkardıktan sonra, beyinciği atın ve bir neşter kullanarak orta hat boyunca iki yarım küreyi ayırın, yarım kürelerden birinden fazla sıvıyı çıkarın ve bir damla süper yapıştırıcı ile eğimli bir platforma yapıştırın.

Daha sonra beynin üzerine hızlı bir şekilde birkaç damla BOS ekleyin ve Vibram odasına aktarın. Beyin dokusunun ilk 2,5 ila üç milimetresini bir bıçakla çıkarın. Daha sonra, dilim yüzeyindeki hasarı sınırlamak için dilimleme hızını ve sıklığını ayarlayın.

Ardından, kalınlığı 300 mikrometreye ayarlayın ve dilimlemeye başlayın. Bıçak korteksi geçtikten sonra, hipokampusun üzerinde ve kortikal ilgi alanının kenarlarında bir kesim yapmak için bir tıraş bıçağı veya bükülmüş bir iğne kullanın. Bundan sonra, dilimleri 36 santigrat derecede çok kuyulu bir inkübasyon odasına aktarın.

Bu prosedürde, 40 x büyütme lensi ile kayıt odasına bir dilim yerleştirin. Beşinci katmanda ve 600 ila 1000 mikrometrede sağlıklı hücreleri arayın. Beyin yüzeyinin altında, bu hücreler genellikle daha düşük kontrasta, pürüzsüz bir görünüme sahiptir ve şişmezler.

Sağlıklı bir hücre bulunduğunda, mikro pipetin üçte birini hücre içi çözelti ile yükleyin. Ardından, önceden yapılandırılmış Linux işletim sisteminde baş aşamaya yerleştirin. Bir komut başlatın.

Kabuk istemini ekleyin. Veri toplama kartının amplifikatörü sürmediğinden emin olmak için bu komutu yazın. Ardından, pipet tutucusuna bağlı olan şırınganın pistonuna bastırarak 30 ila 50 milibar pozitif basınç uygulayın.

Ardından, pipeti dilimin yaklaşık 100 mikrometre yukarısına yerleştirin ve mikrom manipülatörünün yaklaşma modunu kullanarak pipeti hedef hücreye doğru hareket ettirin. Bundan sonra, elektrofizyoloji amplifikatöründeki pipet ofsetini ayarlayın ve voltaj kelepçesi modunda 10 milivoltluk bir Test darbesi verin. Pipet direncini izlemek için LCG SEAL testi komutunu kullanın, ardından şırınganın pistonunu çekerek basıncı 10 ila 30 milibara düşürün.

Hücreye yavaşça yaklaşın ve video kamera monitöründeki görüntüyü gözlemleyerek çukur oluşumunu kontrol edin. Aynı zamanda, monitörde görüntülenen akım dalga biçimini izleyerek test darbesi tarafından uyandırılan direnç artışını izleyin. Pipet direncinde bir artış olduğunda ve hücre üzerinde bir çukur oluştuğunda, basıncı hemen serbest bırakın ve sızdırmazlık oluşumuna yardımcı olmak için pipete hafif bir negatif basınç uygulayın.

Bu arada, tutma potansiyelini kademeli olarak eksi 70 milivolta düşürün. Hücre zarını yırtmak ve tüm hücre konfigürasyonunu oluşturmak için hafif emme uygulayın. Daha sonra hücreyi elektriksel özellikleri açısından karakterize edin.

LCGE kodu komutunu kullanarak. İşte negatif 50.5 milivolt eşiği olan yamalı bir katman beş parametal nöronun ortalama aksiyon potansiyeli. Bu şekil, hiperpolarize akımlara verilen pasif tepkilerin ölçümünü göstermektedir.

Hücrenin temel aktif özelliklerinin tanımlanması, hücrenin düzenli bir sivri uçlu nöron olduğunu ve simüle edilmiş uyarıcı, post-sinaptik potansiyelleri bir sonraki deneyin kaydedileceği dizine enjekte etmek için minimal adaptasyon olduğunu ortaya koymaktadır. Amplifikatörün geleneksel donanım kontrollerine göre hareket etmek yerine. Köprü dengeleme ve kapasitans kompanzasyonunu uygulamak için, bu komutu vererek aktif elektrot kompanzasyonunu gerçekleştirmek için gereken elektrot çekirdeğini tahmin edin.

Tam çekirdek, hızlı bir elektrot çekirdeği ve tam çekirdekte gözlemlenen üstel kuyruğa yol açan daha yavaş bir zar çekirdeği olmak üzere iki bileşenin toplamıdır. İlki, pipetin parametrik olmayan bir modelini oluşturur Membran ve elektrot çekirdeklerini ayırmak için akım enjeksiyonu üzerine, LCG çekirdek komutu kullanıcıdan hızlı elektrot çekirdeğini oluşturan noktaların sayısını isteyecektir. Ardından, elektrot çekirdeği üstel bozunma kuyruğunun sonunu kaplayacak şekilde bir sayı seçin.

Ardından bu komutu kullanarak dinamik kelepçe deneyini gerçekleştirin. Son olarak, sonuçları görselleştirin. İşte dinamik kelepçe kullanarak in vivo benzeri aktivitenin yeniden yaratılması.

Kırmızı ve mavi izler, sırasıyla uyarıcı ve inhibitör sinapsların simülasyonunu temsil eder. Ve burada, uyarıcı veya inhibe edici post-sinaptik akımların bombardımanına maruz kalan bir L beş parametal nörondan kaydedilen voltaj izleri. Hücreye enjekte edilen karşılık gelen uyarıcı, inhibitör ve toplam akım grafikte gösterilmiştir.

20 denemede üretilen sivri uçların raster grafiği, nöronun aynı girdiye yanıt olarak son derece güvenilir ve kesin olabileceğini gösteriyor. Bu videoyu izledikten sonra, ücretsiz olarak sunulan yazılım araç kutusunu kullanarak dinamik lamba deneylerinin nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız. LCG'yi seçin. Bu prosedür, nöral uyarılabilirlikten karmaşık ağ etkileşimlerine kadar çok çeşitli konuları araştırmak için diğer kapalı döngü protokollerine genişletilebilir.