Metazoan Model Organizma kullanma Serim ve toksisitesi prion-benzeri Proteinler incelenmesi

Aşağıdaki deneylerin genel amacı, Metazoan model organizma C zarafetini kullanarak PreOn benzeri proteinlerin yayılmasını ve karmaşık toksisitesini incelemektir. Bu, PreOn benzeri protein içeren veziküllerin hücre içi ve hücre içi taşınmasının, hızlandırılmış floresan mikroskobu kullanılarak izlenmesiyle elde edilir. Sonraki dokuya özgü katlama sensörleri ve her yerde ifade edilen stres.

Raportörler, hücresel uygunluk üzerindeki hücre özerk ve hücre dışı özerk etkileri değerlendirmek için kullanılır. Daha sonra, PreOn ile indüklenen toksisitenin yeni değiştiricilerini tanımlamak için genom çapında bir RNAi taraması gerçekleştirilir. Ekran, toksisite için bir okuma olarak harmanlama kullanılarak sıvı kültürde gerçekleştirilir.

Son olarak, solucan izleyici, C zarafetinin kombinasyon halindeki hareketini ölçmek için J görüntüsü için bir eklenti kullanılır. Bu yöntemler, PreOn benzeri proteinlerin hücreler arası hareketinde yer alan genetik yolların ve bunların hücre dışı otonom toksisitelerinin ayrılmasına izin verir. Senkronize deniz zarafeti kontrolü ve PreOn alan transgenik hatları ve% 10 agros pedlerini hazırladıktan sonra, ekteki metin protokolüne göre, üç mikrolitre 100 nanogram polistiren boncuk ve üç mikrolitre dört milimolar limasol pipetleyin.

Bir platin tel çekme kullanarak, istenen yaşta solucanları bir plakadan çözeltiye aktarın ve solucanları hücre altı düzeyde görüntülemek için örtmek için bir örtü fişi kullanın. Konfokal mikroskobun mikroskop slayt tutucusuna bir slayt yerleştirin ve 63 x veya 100 x 1.4 NA yağ objektifi kullanın. Ardından, METAMORPH'u açın ve çok boyutlu edinimi seçin.

Ve ana sekmenin altında, hızlandırılmış çekim ve çalıştırma günlükleri için kutuları işaretleyin. Kaydetme sekmesi altında, dosyaları kaydetmek için dizin klasörünü seçin veya oluşturun ve dosyaya bir ad atayın Dalga boyu sekmesi altında, Yoko dörtlü kırmızı veya MRFP görüntülemenin eşdeğer bir aydınlatmasını kullanın ve pozlamayı 100 ila 300 milisaniye arasında ve kamera kazancını 100 ila 300 arasında ayarlayın. Ardından, hızlandırılmış sekme sekmesi altında, zaman aralığını bir saniyeye, süreyi beş dakikaya ve zaman noktası sayısını 301'e ayarlayın.

Dergiler sekmesi altında. Günlük seçimi için A FC seti, Z tutma ve A FC'ye dönüş Z tutma türü için özel seçimi iki kez seçin ve başlangıç noktası için zaman noktasının başlangıcını ve zaman noktasının sonunu seçin. Kurulum tamamlandığında, edin'e basın Bu prosedürü takiben, diskin dinamik özelliklerini ölçmek için partikül izleme uygulamaları gibi diğer yöntemler kullanılabilir.

Prion alanı transgenik ve tip nematodlarını senkronize ettikten ve inger RNAI kütüphane plakalarını metin protokolüne göre kopyaladıktan sonra, boş vektör L 4 4 4 0'ı kontrol olarak barındıran HT bir 15 E coli bakterisini kullanmak için çoğaltılmış RNAi plakalarını 37 santigrat derece ve 300 RPM'de inkübe edin. Bir kültür tüpünde ayrı ayrı büyütün ve daha sonra 65 mikrolitre kültürü 2 96 oyuklarının dörtte birine aktarmak için çok kanallı bir pipet kullanın. Çok kanallı bir kafa içeren otomatik bir iş istasyonuna sahip kuyu plakaları dağıtılır.

RNAi bakterilerinin ve kontrol plakalarının her bir oyuğuna 10 mikrolitre beş, milimolar seyreltilmiş IPTG. Bakteriler kuluçkaya yatarken üç saat kuluçkaya yatırmadan önce tekrar kapatın. Senkronize vahşi tip kontrol ve transgenik L bir larva ve M dokuz tampon kuyusunu karıştırın ve beş ila 10 mikrolitreyi bir cam mikroskoba pipetleyin.

Solucanları kaydırın ve mikrolitre başına solucan sayısını hesaplayın. Üç saatlik bakteri inkübasyonundan sonra, plakaları inkübatörden çıkarın ve solucanları strese sokan ısıyı önlemek için oda sıcaklığına gelmelerine izin verin. Daha sonra, M dokuz tamponunu metin protokolüne göre IPTG kolesterol ve antibiyotiklerle destekleyin.

Ve eşit olarak dağıtmak için mikrolitre karışımı başına 15 solucanlık bir nihai konsantrasyona uygun hacimde PreOn etki alanı transgenik solucan çözeltisi ekleyin. Daha sonra RNAi plakalarının her bir kuyucuğuna ve boş vektör kontrol plakalarından birinin kuyularına 50 mikrolitre dağıtın. Yabani tip solucan çözeltisini ikinci kontrol plakasına dağıtın.

Daha sonra, havalandırmaya izin vermek için tüm plakaları açık bırakın ve dört ila beş plakayı bir araya getirerek, nemli bir kağıt havlu ve ardından alüminyum folyo ile sararak sıvı kültürün buharlaşmasını önleyin. Plakaları dört gün boyunca 20 santigrat derece ve 200 RPM'de inkübe edin. Plakalara göre, bir Falcon dört M 60 kamera ile monitörlü bir bilgisayara, kontrol ile tedavi edilen PreOn alan transgenik hayvanlara kıyasla daha fazla dövülmeyi görsel olarak taramak için.

Solucanları R RNAi plakalarına dağıtmak için otomatik bir sıvı işleme iş istasyonu kullanmanın ana avantajı, oyuk başına değişkenliği ve solucan sayısını büyük ölçüde azaltmasıdır. Katı plakalar üzerinde bir motilite testi yapmak ve aday RNAi klonlarını doğrulamak için, metin protokolüne göre gece boyunca RNAi bakterileri büyür. Ardından, üç saat boyunca DS RNA'nın ekspresyonunu indüklemek için bir milimolar IPTG kullanın.

İnce bir tabaka halinde yayılan önceden hazırlanmış NGM plakalarını tohumlamak için her RNAi bakteri klonundan 150 mikrolitre kullanın. Bakterilerin oda sıcaklığında karanlıkta stereo mikroskop altında iki gün kurumasına izin verin. Daha önce tarif edildiği gibi senkronize solucanların ve süspansiyonun miktarını belirleyin ve her deney plakasına 25 ila 30 L bir larva ekleyin.

Nematodları solucanlar ulaşana kadar dört gün boyunca 20 santigrat derecede inkübe edin. Solucan motilitesini ölçmek için yetişkinliğin ikinci günü, kamerayı ve basit PCI görüntüleme yazılımını açın. Görüntüleme koşullarının ayarlanmasını etkinleştirmek için kamera simgesine tıklayın.

Ardından, görüntüleme koşulunu aşağıdaki gibi ayarlayın. Kazancı sıfıra, ışık moduna, yüksek hız endeksini bire ve gruplamayı ikiye ayarlayın. Ardından canlı ve otomatik pozlama'ya tıklayın ve mikroskop aynalarını ve parlaklık ve kontrast kadranlarını hareket ettirerek aydınlatma koşullarını ayarlayın.

Zamana tıklayın, tarayın ve bir klasör ve bir dosya adı yazın, alan gecikmesini 20 milisaniye olarak ayarlayın ve zaman içinde 30 saniye olarak durun. Plakanın kaydedilecek alanını seçmek için canlı incelemeye basın. Ardından sahneye üç veya dört kez plakaya dokunun.

Görüş alanındaki konumunu hızlı bir şekilde onaylayın ve film kaydı bittikten sonra başlat'a basın, görüntüye sağ tıklayın ve filmi CXD formatından A VI dosyasına aktarmak için montaj sırasını dışa aktar'ı seçin. Hareket videolarını analiz etmek için, J görüntüsünü açın, eklentiler sekmesini seçin, ardından solucan izleyiciyi seçin ve Solucan İzleyici grubunu seçin ve Solucan İzleyici toplu işleminin ana giriş penceresinde analiz edilecek tüm dosyaları içeren dizini seçin, giriş değerlerini burada ayrıntılı olarak açıklandığı gibi yükleyin. Parametrelerin her biri için bir açıklama, eklentiye eşlik eden talimatlarda bulunabilir.

Tamam'a tıklayın ve hareket analizinin çalışmasına izin verin. Son olarak, sonuçları düzenlemek için, tespit edilen tüm izlerin gerçek deniz zarafetinden olduğunu onaylayın ve eserleri ortadan kaldırın. Her film için oluşturulan TXT dosyalarını açın ve bilgileri bir veri analizi yazılım dosyasına kopyalayın.

Oluşturulan etiket zip dosyalarını açın ve yanlış solucan izlerini manuel olarak kontrol etmek ve ortadan kaldırmak için elde edilen etiketleri TIFF çalıştırın. Laboratuvarda eski bir doktora sonrası araştırmacı olan Yesper Peterson, ilk olarak, toksisite için bir okuma olan CL Elegance motilinin manuel değerlendirmesinin yerine geçecek şekilde solucan izleyici fikrine sahipti. Solucan izleyici, hızlandırılmış görüntülemeyi kullanarak daha kısa sürede daha fazla koşulu değerlendirirken bu deneyleri kullanıcı önyargısı olmadan otomatik bir şekilde yapmamıza olanak tanır.

Boru şeklindeki veziküllerde biriken RFP etiketli R, iki, E, iki, bir katlama sensörü veya stres raportörünü ifade eden coex tarafından hücreler içinde ve arasında taşındığı görüldü. PreOn benzeri protein hücresi ile birlikte, otonom ve hücre dışı otonom etkiler değerlendirilebilir. Kas hücrelerinde R iki E iki ekspresyonu, bağırsakta daha erken bir Q 44 agregasyonunun başlamasına yol açar, bu da R iki E iki'nin proteostaz üzerinde hücre dışı otonom etkilere sahip olduğunu ortaya çıkarır, R iki E iki'nin birlikte ekspresyonu SOD üç PGFP ile Transkripsiyonel oksidatif stres raporlayıcı, raportörün farklı dokularda yukarı regülasyonuna yol açar, PreOn alanının, tüm genom ekranını otonom olarak takip eden hücre dışı bir oksidatif stres tepkisini indüklediğini göstermektedir.

Bu film, bilgisayar ekranında yüksek çözünürlüklü görüntüleme ve görselleştirmenin, bir plakanın dörtte birinin aynı anda taranmasını sağladığını göstermektedir Bir kez ustalaştıktan sonra, bu tarama protokolü seans başına 25 plakalık 12 turda yapılabilir. Haftada iki seans yapılırsa, tüm RNAi kütüphanesi altı hafta içinde taranabilir. Solucan izleyici, burada görüldüğü gibi C zarafet motilitesini ölçmek için kullanıldı.

Worm Tracker, orijinal bir videoyu ikili bir formata dönüştürür ve her solucana bir parça atanır. İşlenmiş videolar, herhangi bir yapaylığı manuel olarak ortadan kaldırmak için üst üste bindirilmiş parçalarla görüntülenebilir. Saniyedeki vücut uzunlukları parametresi, potansiyel boyut farklılıkları için normalleşir. Nematod.

Bu yöntem, kontrol ile tedavi edilen solucanlara kıyasla motilite fenotipini en az% 133 ve% 256'ya kadar artıran PreOn kaynaklı toksisitenin 35 baskılayıcısını tanımladı. Solucan izleyiciyi kiralarken, elde edilen solucan izlerini manuel olarak doğrulamayı unutmamak önemlidir. Yazılım, solucanları tanımlamada harika bir iş çıkarır, ancak bazen arka plan yine de yanlışlıkla bir hayvan olarak tanımlanabilir.

Bu nedenle, üzerlerinde solucan izleyici çalıştırdıktan sonra videolarınızı kontrol etmeyi unutmayın. Bu yöntemler, nörodejeneratif hastalıklar alanında, belirli bir hastalık bağlantı proteininin hücreden hücreye yayılıp yayılamayacağı, benzer şekilde uygulanıp yayılamayacağı veya hücreler arası iletim ile bu proteinlerin karmaşık toksisitesi arasında bir bağlantı olup olmadığı gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Çocuklar.