Name: Metazoan Model Organizma kullanma Serim ve toksisitesi prion-benzeri Proteinler incelenmesi ° C. elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 57 s
Description: Keşfedin prion-benzeri proteinlerin yayılmasını ve toksisitesini C. elegans model organizmasında. Zaman atlamalı floresan mikroskopi ve genom çaplı RNAi tarama ile hücre içi ve hücreler arası taşımayı izleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

El yazması hakkındaki yararlı tartışmaları ve eleştirel yorumları için Cindy Voisine ve Yoko Shibata'ya teşekkür ederiz. Northwestern Üniversitesi'ndeki Yüksek Verimli Analiz Laboratuvarı'na (HTAL) ve Biyolojik Görüntüleme Tesisi'ne (BIF) yardımları için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIGMS, NIA, NINDS), Ellison Tıp Vakfı ve Daniel F. ve Ada L. Rice Vakfı'ndan (RIM'e) alınan hibelerle finanse edildi. C.I.N.-K. Deutsche Forschungsgemeinschaft (KR 3726/1-1) tarafından desteklenmiştir.

1. İzleme transselüler İn Vivo Time-lapse Görüntüleme By prion-benzeri Proteinlerin Yayılma NOT: C büyütün standart yöntemlere ve dikkatli bir şekilde kültür sıcaklığı 47 kontrol göre elegans vahşi tip (WT) (N2) ve transgenik çizgiler. <ol><li> C transjenik çizgileri oluşturmak elegans monomerik kırmızı floresan proteini (MRFP) ile etiketlenmiş prion proteini gibi, ifade. Mikroenjeksiyon 48 nasıl kullanılacağını gösterir bu videoyu izleyin. Bu ekstrakromozomal satırları nasıl entegre açıklayan Daha detaylı bilgi ve yöntemleri için, 49 bkz. </li><li> Yumurta standart yöntemlere göre 50 döşeme veya ağartıcı senkronize popülasyonlar hazırlayın. <ol><li> Yumurtlayarak Senkronizasyon <ol><li> Transferi 10-20 gebe bir plaka üzerinde yetişkin ve onları 1 yumurtalarını izin - 2 saat. Plaka yetişkin çıkarın ve döl istenen yaşına kadar büyümesine izin. </li></ol></li> &lt;ağartma tarafından li&gt; Senkronizasyon <ol><li> Gebe yetişkin eşleşmemiş olan bir popülasyon toplamak ve alkalin hipoklorit çözeltisi (250 mM NaOH ve 1: 2 konumundaki H O ticari ağartıcı 4 (h / h) seyreltme) ile, peroksijen ağartıcıdır. 2 O 7H, 22 mMKH 2 PO 4, 86 mMNaCl, 1 mMMgSO 4 · 7H 2 O, 1 dH 2 O toplayın M9 tampon 47 (21 MMNA 2 HPO 4 · iki kez (218 xg az 1 için) yumurta yıkayın L) sokuldu. </li><li> Bunları 20 ° C / nazik ajitasyon O ile M9 tampon N yumurtadan izin verin. Solucan geliştirme senkronize nüfusu bırakarak, bir besin kaynağı yokluğunda L1 aşamasında tutuklama olacaktır. OP50 E. ile seribaşı taze Nematodu Büyüme Medya (NGM) plakalar üzerine L1S Transferi E. coli bakteri ve döl istenen yaş 47 kadar geliştirmek verelim. </li></ol></li></ol></li><li> 50 tarif edildiği gibi, bir mikroskop lamı üzerine (H2O)% 2 agaroz pedleri hazırlayın. <ol><li> İki mil hazırlayınbunların tüm uzunluğu boyunca yerleştirilmiş etiketleme bant ile mikroskop slayt ayırıcılar olarak kullanılır. Aralarında üçüncü bir mikroskop lamı yerleştirin. </li><li> Temiz slayt üzerine H 2 O 2% agaroz ve pipet bir damla eritin. </li><li> Agar damla üstüne diğer üç slaytlar dik dördüncü slayt yerleştirin. Yavaşça etiketleme bant aynı kalınlıkta pedi düzleştirmek için bastırın. </li><li> Aralayıcıları kaldırılması ve hafifçe birbirinden slaytlar çekerek önce 1 dakika kurumaya bırakın. Agar ped bunlardan birine sopa olacak. </li></ol></li><li> Pipet ~ 10 ul anestezik pedi ve transfer (2 mM levamizol M9 tampon) ~ bir platin tel çekme kullanarak 10 hayvan. Bir kapak kayma (~ 22 x 22 mm) ile kaplayın ve 1 saat içinde görüntüleri almak. </li><li> Seçenek olarak ise, daha uzun bir süre boyunca film elde etmek için ya da daha fazla, hayvanların herhangi bir hareket olasılığını azaltmak anestezi ve boncuk hareketsizleştirme 51 bir arada kullanımı. <ol><li> 10% aga hazırlayın(M9 tampon) 51 tarif ve 3 ul Nanokürecikli boyutu standartları çözüm solucanlar (polistiren boncuklar, 100 nm) artı 3 ul anestezik (M9 tampon 4mM Levamizol) ekleyin yastıkları yükseldi. Bir kapak kayma hafifçe örtün. Kuruma önlemek için, valap (vazelin, lanolin ve parafin mumu eşit miktarda karışımı) ile kapak kayma mühür. </li></ol></li><li> Görüntü konfokal mikroskop kullanılarak solucanlar hareketsiz. NOT: Sonuçlar bir EM-CCD kamera ve MetaMorph gibi bir Mikroskopi Otomasyon ve Görüntü Analiz Yazılımı ile donatılmış bir İplik Disk AF Konfokal Mikroskobu kullanılarak elde edilen ve aşağıda özelliklerini ana hatlarıyla, ancak diğer karşılaştırılabilir konfokal görüntüleme sistemleri de tercih edilebilir. <ol><li> 63X veya 100X / 1.4NA yağı hedefi kullanın ve mikroskop lamı tutucuya yerleştirin solucanları içeren mikroskop lamı yerleştirin. </li><li> Yazılımını açın. MRFP görüntüleme için lazer gücü ve filtreleri ayarlayın. % 10 güç ve emisyon filtresi&gt; 600 nm 561 nm lazer kullanın. </li><li&gt; Aç &quot;Çok Boyutlu Toplama&quot;. &quot;Ana&quot; sekmesinde, &quot;Timelapse&quot; ve &quot;Run Dergiler&quot; (: kapalı Donanım Otomatik Odaklama) için onay kutularını. </li><li> &quot;Tasarruf&quot; sekmesinde seçmek veya dosyaların kaydedilmesi gereken dizin klasör oluşturun. Dosyaya bir ad atayın. </li><li> &quot;Dalga Boyu&quot; sekmesi altında uygun aydınlatma seçmek ve pozlama ve kazancını ayarlayın. 100 ve 300 ms ve 100 ile 300 arasında bir kamera artışı arasında bir maruz kalma ile &quot;YokoQuad Kırmızı&quot; (ya da MRFP görüntüleme için eşdeğer aydınlatma ayarı) kullanarak, tek tek örnek olarak (canlı görüntü ile değerlendirildi). </li><li> &quot;Timelapse&quot; sekmesi altında &quot;zaman noktalarının sayısı&quot; = 301, &quot;Süre&quot; = 5 dk ve &quot;Zaman / Aralığı&quot; = 1 sn seçin. </li><li> &quot;AFC SET Z TUT&quot; ve &quot;Z TUT için AFC dön&quot;, Türü: &quot;Dergiler&quot; sekmesi seçin Journal altında &amp;# 8220; Özel &quot;(iki kez), Başlangıç ​​Noktası:&quot; Başlat zaman noktası &quot;ve&quot; zaman noktası Sonu &quot;. Bu otofokus seçenek görüntünün daha uzun bir süre boyunca aynı bölümü için önemlidir. </li><li> Kurulum tamamlandığında, basın &quot;Acquire&quot;. timelapse Video ayrı TIFF dosyaları olarak safed edilir. </li><li> ImageJ belirli bir zaman serisinin tüm .tiff dosyaları açın. &quot;Image&quot; → &quot;Yığınlar&quot; → &quot;Yığınlarına Görüntüler&quot; gidin. İsteğe bağlı olarak, → &quot;File&quot; altında film İhracat, vb boyut çubuğu eklemek, parlaklık ve kontrast ayarı → &quot;AVI ...&quot; &quot;olarak Kaydet&quot; (bir örnek için, Video 1 ve 2 Şekil 1&#39;e tekabül bakın). </li></ol></li></ol> 2. Özerk ve Non hücre Özerk Proteostasis ve Toksisite Etkileri Hücre Araştırma Katlanır Sensörleri ve Stres Gazeteciler kullanma <ol><li> Bir katlama sensörü veya stres önce bildirilmiştir birlikte açığa transgenik hatları oluşturunBirlikte prion-benzeri protein r. Çarpılar kurmak veya transgenik çizgiler oluşturmak için nasıl yöntemler için, 48,49,52 bkz. C listesi için bakınız Tablo 1 kullanılabilir elegans suşu. </li><li> Transgenik hayvanların senkronize popülasyonları hazırlayın ve (bölüm 1.2) 50 yukarıda anlatıldığı gibi istenilen yaşına kadar onları büyümek. </li><li> Bir Stereomikroskopta kullanarak, katlama sensörü veya stres muhabiri ilgili fenotip incelemek. <ol><li> Katlama sensörü için, senkronizasyon sonra her gün agrega barındıran hayvanların sayısını belirlemek (bir örnek için, Şekil 2E ve F). </li><li> Stres haberci için, deney habercisinin artmış floresan prion-benzeri protein sonuçları birlikte ekspresyonu (örnek için, bakınız Şekil 3) gösterir. </li></ol></li></ol> C. prion kaynaklı zehirlilik Önlenmesi 3. genom Ekran elegans<img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52321/52321fig4highres.jpg" /> RNAi tarama protokolü 4. şematik gösterimi Şekil. Bireysel adımların ayrıntılı bir açıklama için protokol bölümüne 3 Bkz. <ol><li> C. Senkronizasyon elegans solucanlar ve RNAi kütüphane çoğaltılması <ol><li> RNAi ekran için, Ahringer RNAi kütüphane (veya Vidal RNAi kütüphanesi) 53,54 kullanın. % 10 gliserol ile takviye edilmiş 100 ul LB-amp ortamı ile plakaları (LB içinde 50 ug / ml ampisilin) ​​doldurarak 96 gözlü levhalar içine, orijinal 384 gözlü formattan RNAi kütüphane Rearray ve 96 pimli çoğaltıcı kullanarak inoküle. -80 ° C&#39;de ajitasyon ve mağaza ile 37 ° CO / N büyür. </li><li> C koruyun elegans WT ve 20 ° C NGM üzerinde plakaları transgenik hatları OP50 E. ile seribaşı standart yöntemlere göre 47 E. coli bakterisi. </li><li>Ağartma tarafından prion etki transgenik ve WT (kontrol) nematod senkronize (bölüm 1.2). </li><li> Solucanlar ağartılmış aynı gün, 50 ug / ml ampisilin ile desteklenmiş LB ortam hazırlar. Dağıtmak için otomatik bir reaktif dağıtıcı kullanma (veya pipet el ile), 96 gözlü bir plakanın her oyuğuna LB-amp ortamının 65 ul. </li><li> -80 ° C den 96 de Ahringer RNAi kütüphane plakaları çıkarın ve kağıt havlu ile kaplı steril bir kaput getirmek. Hemen plakaları hala donmuş ise plakaların dış buz kirlenmesini önlemek için dikkatli olmak, baş aşağı plaka tutarak mühür-bandı çıkarın. Plakaları Reinvert ve bunları yaklaşık 30 dakika çözülme sağlar. </li><li> Bir taze LB-amp plaka içine sonra bir RNAi kütüphane plaka içine bir steril 96 pimli çoğaltıcı batırın ve. Her plaka için taze steril çoğaltıcısının kullanın. Yapışkanlı folyo bant ile tüm plakaları Seal ve -80 ° C kütüphane plakaları dönün. çoğaltıcılar, çamaşır suyu ile ıslatılmış çalkalanabilir,ve tekrar kullanılmak üzere otoklavlanmıştır. </li><li> Çoğaltılmış RNAi plakalar 37 ° C ve 300 rpm&#39;de ayarlanmış bir kuluçka makinesi içinde O / N büyümeye izin verin. HT115 E. kullanmak için E. coli, bir kontrol olarak boş bir vektör (L4440) barındıran bakteri, bir kültür tübü içinde ayrı olarak büyür ve daha sonra iki 96 gözlü levhalar dörtte biri bir çok kanallı pipet ile kültür 65 ul pipetle. </li></ol></li><li> Bakteriyel dsRNA&#39;nın üretim ve solucanların ilavesinden indüksiyonu <ol><li> Ile kombine edilmiştir 2 O içinde bir 5 mM konsantrasyona kadar izopropil-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) seyreltin Dağıtmak için çok kanallı bir kafa ile otomatik bir iş istasyonu kullanarak (veya pipeti el ile) RNAi bakteri ve kontrol plakalarının her bir oyuğuna seyreltildi IPTG 10 ul. Yeniden mühürlemek ve geri kuvöz içine plakaları yerleştirin. Bunların 37 ° C&#39;de 3 saat boyunca sallamak olsun. </li><li> Bakteriler sallayarak iken, solucanlar hazırlamak. Bir cam mikroskop lamı - (10 ul ~ 5) küçük bir örnek de M9 / solucan süspansiyon karıştırın ve pipetle. Saymaksteromikroskopla solucanlar sayısı ve ul başına solucanlar sayısını hesaplamak. </li><li> , 0.20 mg / ml IPTG, 8.0 ug / ml kolesterol 50 ug / ml ampisilin, 9.6 ug / ml tetrasiklin, 0,0835 ug / ml Fungizone, ve: Steril teknik kullanılarak, aşağıdaki nihai konsantrasyonları ile desteklenmiş M9 (M9 +) ihtiva eden bir çözelti hazırlamak 50 ul başına 15 solucanlar. <ol><li> Prion etki transgenik ve WT solucanlar için ayrı çözümler olun. Nihai (aşağıya bakınız), kopyalanan RNAi plakalarının sayısına bağlıdır gerekli M9 + solucan çözeltisinin hacmi artı ~ otomatik dağıtıcı kullanılırsa, rezervuar içinde kalır ölü hacim 30 mi. </li></ol></li><li> Bakteriyel dsRNA&#39;nın üretimi 3 saat indüksiyon sonrası, inkübatör dışına plakaları almak ve onları hayvanlar vurgulayarak ısı önlemek için RT (~ 30 dk) soğumasını bekleyin. </li><li> Her RNAi plakaları kuyu ve boş vektör kontrol plakaları birine 50 ul M9 + prion alanı transgenik solucan çözümü dağıtın. Yapmakhayvanlar rezervuar altına birikme eğiliminde her adımdan önce solucan çözüm karıştırmak için emin olun. </li><li> İkinci kontrol plakasına WT solucanlar dağıtın. Havalandırma sağlamak için mühürsüz plakaları bırakın. 5 tabak ve birlikte nemli bir kağıt havlu ve alüminyum folyo ile sarın - buharlaşan sıvı kültürü korumak için, 4 yığını. 4 gün boyunca 20 ° C&#39;de 200 rpm&#39;de inkübe edin. </li></ol></li><li> Puanlama NOT: inkübatör 4 gün sonra, solucanlar yetişkinliğe ikinci gününde olması ve ekran hazır olacaktır. Hayvanlar rahatsız dayak sağlamak için tarama önce 30 dakika süreyle olmayan sallayarak koşullarına uyum edelim. <ol><li> Kontrol tedavi prion alanı transgenik hayvanlara kıyasla artmış dayak için görsel bir monitör, ekran bir bilgisayara bağlı bir Falcon 4M60 kameranın kullanılması. </li><li> WrMTrck kullanarak onaylamak için ön hit bir listesini derlemek (bir sonraki bölüme bakınız). </li></ol></li></ol> Preliminary 4. OnayEkran Hits <ol><li> Katı plakalar üzerinde Motilite deneyi <ol><li> Standart yöntemlere 47 göre 100 ug / ml ampisilin, 12.5 ug / ml tetrasiklin ve 1 mM IPTG ile takviye NGM ile tabak hazırlayın. Mümkünse, tüm plakalar daha akıcı bir video toplama işlemi için izin verecektir medya aynı yüksekliğe sahip sağlamak için bir plaka dökme makinesi kullanın. </li><li> 37 ° C&#39;de ve 250 rpm&#39;de ~ 1 ml LB + 50 ug / ml ampisilin, O / N farklı RNAi klonlar büyütün. </li><li> Bir sonraki gün, 3 saat süre ile, 1 mM IPTG ile dsRNA&#39;nın ifadesini teşvik eder. Ince bir tabaka halinde yayılır, her RNAi bakteriyel klon 150 ul, plak Tohum. Karanlıkta ve oda sıcaklığında 2 gün boyunca kuru bakteri olsun. RNAi klon başına 3 tabak hazırlayın. </li><li> Standart yöntemler 50 (bölüm 1.2) göre ağartıcı solucan nüfus senkronize ve yumurta ambar O / N M9 medyayı izin. </li><li> Sonsuz bir süspansiyon örneği alın ve NEM miktarını belirlemekstereomikroskopta ul başına atodes. 30 L1 solucanlar - 25 içerecek şekilde Ardından, her deneysel plaka içine M9 artı solucanlar uygun hacmi pipetle. Solucanlar yetişkinliğe gün 2 ulaşana kadar 4 gün boyunca 20 ° C&#39;de nematod büyütün. </li></ol></li><li> ImageJ için wrMTrck eklentisi ile solucan hareketlilik kantitatif analizi NOT: Video Hamamatsu Orca-R2, dijital kamera C10600-10B ve Hamamatsu Basit PCI görüntüleme yazılımı ile 10X büyütmede bir skala kullanılarak kaydedildi. <ol><li> Kamera ve Basit PCI görüntüleme yazılımı açın. Görüntüleme koşulları ayarlanması için izin vermek için &quot;Canlı&quot; üzerine tıklayın. </li><li> Aşağıdaki gibi video koşullarını ayarlayın: Kazanç = 0; Işık Modu = Yüksek; Hız Endeksi = 1; Binning = 2. &quot;Otomatik Açığa&quot; ve ardından mikroskop aynalar ve parlaklık ve kontrast kadranları hareketli, aydınlatma koşulları ayarlayın. NOT: Video overexp olmadan yüksek kontrast olması gerekirhayvanlar parlak arka plan üzerine siyah şekiller görünür, böylece bırakılmıştı. </li><li> &quot;Zaman Scan&quot; seçeneğini tıklayın ve bir klasör ve dosya adını seçin. 20 msn &quot;Alan Gecikmesi&quot; Set ve 30 sn &quot;Zamanda Dur&quot;. (Çoğu solucanlar nerede) kaydetmek için plakanın alanı seçmek için basın &quot;Live İnceleme&quot;. Görünümü ve basın &quot;Başlat&quot; alanındaki konumunu teyit hızlı, sahnede plaka 3 veya 4 kez dokunun. </li><li> Film kayıt tamamlandıktan sonra, resmin üzerine sağ tıklayın ve bir avi bir .cxd formatta filmi ihracat &quot;İhracat Montaj Sırası&quot; seçin. </li></ol></li><li> Motilite videoları analiz <ol><li> , ImageJ yazılımı açın &quot;Eklentiler&quot; sekmesine gidin, ardından &quot;wrmtrck&quot; ve &quot;wrMTrck Toplu&quot; seçeneğini seçin. Tüm dosyaları içeren dizini seçin analiz edilecek. </li><li> Figür detaylı olarak wrMTrck_Batch ana giriş penceresinde, giriş değerleri yüklemekE 5C. Parametrelerin her biri için açıklama eklentisi eşlik kılavuzunda bulunabilir. &quot;Tamam&quot; ı tıklayın ve hareket analizi çalışmasına izin. </li><li> Sonuçları küratörlüğünü ve algılanan tüm parçaları gerçek C&#39;den onaylamak için elegans ve ortadan kaldırmak eserler, her film için oluşturulan .txt dosyaları her açmak ve bir veri analiz yazılımı dosya bilgileri kopyalayın. Oluşturulan &quot;* _labels.zip&quot; dosyaları açın ve elle kontrol etmek ve yanlış solucan parçaları ortadan kaldırmak için ortaya çıkan &quot;* _labels.tif&quot; çalıştırın. </li></ol></li></ol>

Yazarlar herhangi bir rakip mali çıkar beyan etmemektedir.

Burada tarif edilen yöntemler yayılan göstermek için yardımcı ve prion-benzeri proteinler kompleks hücre otonom olmayan hücre otonom toksisitesi. Son zamanlarda, bir agregasyon eğilimli sitosolik prion alan bir Otofaji ilgili süreç içinde membran-sınırlayıcı kabarcıklar içine alınmış olduğunu keşfettik. Bu vesikül spesifik bir alt kümesi içindeki hücre ve doku 40 ile prion etki taşır. canlı bir hayvanda hareketlerini izlemek için anahtar proteinin, sadece MRFP-etiketli proteinler, bu muhtemelen asidik vezikül...

Alzheimer hastalığı (AD), Parkinson hastalığı (PD), Amyotrofik lateral skleroz (ALS) ve bulaşıcı sünger tipi ansefalopatiler (TSEler) dahil olmak üzere birçok nörodejeneratif hastalıklar, agregasyon eğilimli proteinler ile ilişkili ve dolayısıyla birlikte, protein yanlış katlanması bozuklukları (pmds şekilde bilinmektedir ). Her ikisi de insanlarda ve hayvanlarda 1 enfeksiyona sebep olabilir ki TSEler veya prion hastalıkları pmds benzersiz bir sınıfını teşkil ederler. Moleküler düzeyde, prion alımı ve patolojik β-tabaka zengin PrPSc konformasyonunda 2,3 içine monomerik α-sarmal zengin konak-kodlanmış hücresel PRP (PrP C) dönüştürerek çoğaltmak. Kendi kendine ilerleyen Protein topakları ayrıca memeli prion 4,5 ile önemli özellikleri paylaşan mantarlar içinde tanımlanmıştır. Buna ek olarak, bir memeli, prionlar hücreden hücreye hareket edebilen ve naif hücreleri 6,7 enfekte etmektedir. Pmds OTH daer TSE&#39;ler bulaşıcı değildir, daha onlar prion hastalıkları 8,9 ile ortak bir patojenik ilke paylaşıyoruz. Pmds her birine bağlı proteinler yapı veya fonksiyonunda ilgili olmasa da, bir kristalleşme gibi süreci ile tüm form agrega çekirdekli denir ya polimerizasyonu numaralı seribaşı; üstelik proteinli tohumlar onların çözünür izoformlarını 2,10,11 işe alarak büyür. öz-yayılmasına verimliliği birlikte, moleküler chaperones gibi ek hücresel faktörlerle sonuçta toplam çekirdeklenme, tohumlama, parçalanma ve 12-15 yayılma oranlarını belirlemek protein içsel özelliklerine bağlı olarak, in vivo değişir. Bu nedenle, protein agregasyonu verimli yayılmasını izin veren bu faktörler arasında ince bir denge bulunmalıdır. Sadece bazı Amiloidojenik agrega bir prion özelliklerini barındıran ve böylece tüm pmds bulaşıcı Bu yüzden de açıklayabilir. Prionlar &#39;üst-sanatçıların o temsil görünüyorOnlara pmds 8,13 incelemek için güçlü bir araç yapar kendini kopyalayan proteinli agrega fa geniş spektrumlu,. Ilginç bir hastalıkla ilişkili agrega ile ilişkili toksisite genellikle olmayan bir hücre özerk bileşeni 16,17 sahiptir. Bu durum, sadece hücreler, gen sergilediğini belirli bir fenotip ifade ima katı bir hücre otonom etkisi, aksine, ilgili geni ifade etmeyen komşu hücreleri üzerinde etki anlamına gelir. Bu zorlayıcı dokuya özel ekspresyon gösterdiği veya nörodejeneratif hastalıklar 18-26 çok sayıda model ilgili proteinlerin yıkmak edildi. Çeşitli mekanizmalar azalmış besin kaynağı, nöronal sinyalleşme dengesizlik, glutamat eksitotoksisitesi ve nöro 16,27,28 içeren pmds bu sigara hücrenin otonom toksisite için bir temel olarak önerilmiştir. Buna ek olarak, hücreler arasında hastalığa bağlı agregalar prion-benzeri hareket might Bu açıdan 29,30 katkıda bulunur. Giderek artan kanıtlar, prionlar dışındaki protein inklüzyonlar özelliği de pmds 30-36 gözlenen patolojinin yayılma açıklayabilir, hücreden hücreye iletmek düşündürmektedir. Ancak, henüz hastalık proteinlerin hücreler arası hareket ve komşu hücreler üzerinde toksik etkisi arasında net bir nedensel bağlantı olup olmadığı belirlenecek olan. Bu nedenle, hücre-hücre iletim ve olmayan hücre özerk toksisite altında yatan hücresel yolların daha iyi anlaşılması yeni tedavilerin geliştirilmesi için gerekli ve önemlidir. Bununla birlikte, Metazoan&#39;da olarak yanlış katlanmış proteinler, hücre-hücre iletim etkileyen yayılması ve hücresel faktörlerin prion-benzeri birçok yönü de organizma seviyesinde, özellikle anlaşılamamıştır. Caenorhabditis elegans nematod potansiyeli sağlamak çeşitli avantajları vardır prion-benzeri SPREADI yeni yüzleri keşfedeceksinizMetazoan&#39;da 17 ng. Bu, in vivo canlı bir organizmada floresan etiketli proteinleri izleme sağlayan saydamdır. Ayrıca, hastalıktan etkilenen birçok hücresel ve fizyolojik süreçler insana solucanlar korunmuş, ve C edilir C. elegans, genetik manipülasyon ve moleküler ve biyokimyasal analizler 37-39 çeşitli elverişlidir. Tam 959 somatik hücreler hala kas, nöronlar ve bağırsak dahil olmak üzere birçok farklı doku tipleri vardır basit bir vücut planına sahip yetişkin hermafrodit makyaj. C. yeni bir prion modeli kurmak için elegans, biz solucanlar 4,40 bilinen hiçbir endojen prion proteinleri vardır çünkü dışsal olarak, iyi karakterize glutamin / asparagin (Q / N) sitozolik maya prion proteini Sup35 olan bakımından zengin prion alanı NM ifade seçti. Maya prionların prion çoğaltma 41-44 temel mekanizmaların tanıtılması çok değerli olmuştur. Ayrıca, NM FIRmemeli hücre kültüründe 45,46 bir prion tam yaşam döngüsü özetlemek gösterilmiştir st sitosolik prion-benzeri protein. Benzer şekilde, C olarak ifade edildiğinde elegans, mitokondriyal bütünlüğü ve görünüm bozulması dahil 40. NM toplama derin toksik fenotip ile ilişkili maya hücreleri ve prion biyoloji sergilenen temel özellikleri karşılaştırıldığında metazoan hücrelerde yayılması için farklı ihtiyaçlarına oldukça iyi kabul Sup35 prion alanı Hücresel düzeyde çeşitli otofaji ilgili kesecikler, yanı sıra embriyonik ve larva tutuklama, gelişimsel gecikme ve organizma düzeyinde protein katlanması ortamının yaygın bir rahatsızlık. Çarpıcı, prion etki transgen ifade değildi hangi komşu dokuları etkileyen, hücre özerk olmayan hücre özerk toksisite sergiler. Ayrıca, hücreler içinde ve arasında prion etki vesiküler taşıma gerçek zamanlı olarak izlenir &lt;em&gt; in vivo 40. Burada C prion-benzeri yayılmasını incelemek için nasıl açıklamak elegans. Biz time-lapse floresan mikroskobu kullanarak prion alanı içeren veziküllerin içi ve hücreler arası ulaşım izlemek için nasıl açıklayacağız. Biz doku-spesifik katlama sensörleri kullanımını vurgulamak ve her yerde bulunan hücresel fitness hücre özerk olmayan hücre özerk etkilerini değerlendirmek için stres gazetecilere dile olacaktır. Son olarak, biz prion kaynaklı toksisite yeni değiştiricileri belirlemek için bir süre önce gerçekleştirilen genom RNA enterferans (RNAi) Ekranın prosedürü anlatacağız. Kombinasyon halinde, bu yöntemler, protein arası hareketi ve olmayan hücre otonom toksisite yer genetik yolları ayrı takılmak için yardımcı olabilir.

<table><tbody><tr><td>Reaktif</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanosfer boyut standartları 100 nm</td><td>ThermoScientific</td><td>3100A</td><td></td></tr><tr><td>Levamisol</td><td>Sigma</td><td>L-9756</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma</td><td>15502-10G</td><td></td></tr><tr><td>Ahringer RNAi kitaplığı</td><td>Kaynak: BioScience LifeSciences&nbsp;</td><td></td><td>http://www.lifesciences.sourcebioscience .com/klon-ürünleri/memeli olmayan/c-elegans/c-elegans-rnai-library/</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend XTR Soğutmalı Santrifüj, 120VAC</td><td>ThermoScientific</td><td></td><td>75004521 http://www.coleparmer.com/Product/Thermo_Scientific_Sorvall_Legend_ XTR_Refrigerated_Centrifuge_120 VAC/EW-17707-60</td></tr><tr><td>96 pinli çoğaltıcı&nbsp;</td><td>Scionomix&nbsp; &nbsp;</td><td></td><td>http://www.scinomix.com/all-products/96-pin-replicator/</td></tr> <tr><td>HiGro yüksek kapasiteli, inkübe çalkalayıcı&nbsp;</td><td>Digilab</td><td></td><td>http://www.digilabglobal.com/higro</td></tr><tr><td>Multidrop Kombi Reaktif Dispenseri&nbsp;</td><td>Titertrek</td><td></td><td>http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/titertek.htm</td></tr><tr><td>Biomek FX AP96 Otomatik İş İstasyonu&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/biomek_multi.htm</td></tr><tr><td>Innova44 çalkalayıcı</td><td>New Brunswick</td><td></td><td>http://www.eppendorf.com/int///index.php?sitemap=2.3&pb=d78efbc05310ec 04& action=ürünler& contentid=1& catalognode=83389</td></tr><tr><td>M205 FA&nbsp;</td><td>Leica</td><td></td><td>http://www.leica-microsystems.com/de/produkte/stereomikroskope-makroskope/fluoreszenz/details/product/leica-m205-fa/</td></tr> <tr><td>ORCA-R2 C10600-10BDigital CCD kamera</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td>http://www.hamamatsu.com/jp/en/community/life_science_camera/product/search/C10600-10B/index.html</td></tr><tr><td>İplik Diski AF Konfokal Mikroskop&nbsp;</td><td>Leica</td><td></td><td>http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/life-science-research/fluorescence-microscopes/details/product/leica-sd-af/</td></tr> <tr><td>Falcon 4M60 fotoğraf makinesi&nbsp;</td><td>Teledyne Dalsa&nbsp;</td><td></td><td>http://www.teledynedalsa.com/imaging/products/cameras/area-scan/falcon/PT-41-04M60/</td></tr> <tr><td>Yazılım</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph Mikroskopi Otomasyonu & Görüntü Analiz</td><td>Yazılımı Moleküler Cihazlar</td><td></td><td>http://www.moleculardevices.com/products/software/meta-imaging-series/metamorph.html</td></tr><tr><td>Hamamatsu SimplePCI Görüntü Analiz Yazılımı</td><td>Meyer Instruments</td><td></td><td>http://meyerinst.com/imaging-software/hamamatsu/index.htm</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>ImageJ</td> <td>için wrMTrck eklentisi</td><td></td><td>http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html</td></tr><tr><td> C. elegans suşları</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N2 (WT)</td> <td>Caenorhabditis Genetik Merkezi (CGC)</td><td></td> <td>http://www.cgc.cbs.umn.edu/strain.php?id=10570</td></tr><tr><td>AM815 ve nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; rmIs323[myo-3p::sup35(r2e2)::rfp]</td><td>Morimoto laboratuvarı</td><td></td><td>laboratuvarımızdan temin edilebilir&nbsp;</td></tr><tr><td>Katlama sensörü ve stres raporlayıcı suşları</td><td></td><td></td><td></td> için bir kaynak için tablo 1'e bakın</tr></tbody></table>

metazoan model organizma kullanma serim ve toksisitesi prion-benzeri proteinler incelenmesi<em&gt; ° c. elegans</em

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prionlar, herhangi bir kodlama nükleik asidinden yoksun, geleneksel olmayan kendi kendine yayılan proteinli parçacıklardır. Bu proteinli tohumlar, iyi huylu hücresel izoformlarının dönüştürülmesi ve replikasyonu için şablon görevi görür. Biriken kanıtlar, birçok protein agregatının kendi kendine yayılan şablonlar olarak hareket edebileceğini ve aynı kökenli proteinlerin katlanmasını bozabileceğini göstermektedir. Agregalar belirli koşullar altında işlevsel olabilse de, bu süreç genellikle hücresel protein homeostazının (proteostaz) bozulmasına yol açar ve sonunda Alzheimer hastalığı (AD), Parkinson hastalığı (PD), Amyotrofik lateral skleroz (ALS) veya bulaşıcı süngerimsi ensefalopatiler (TSE'ler) gibi yıkıcı hastalıklara yol açar. Prion yayılımının ve protein agregatlarının hücreden hücreye yayılmasının kesin mekanizmaları hala yoğun araştırma konularıdır. Bu bilgiyi daha da ileri götürmek için, son zamanlarda Caenorhabditis elegans'ta sitozolik maya prion proteini Sup35'in prion alanının ekspresyonu için yeni bir metazoan modeli oluşturulmuştur. Bu prion modeli, canlı hayvanlarda floresan etiketli prion alanının doğrudan izlenmesine ve genetik yaklaşımların kolaylığına izin verdiği için çeşitli avantajlar sunar. Burada, protein agregatlarının prion benzeri davranışını incelemek ve C. elegans kullanarak prion kaynaklı toksisite değiştiricilerini tanımlamak için yöntemler açıklanmaktadır.

In vivo time-lapse görüntüleme ile prion-benzeri proteinler yayılması hücrelerarası İzleme Transgenik C. Prion domainini ifade eden C. elegans hatları prion-benzeri proteinler, örneğin, hücreden hücreye intikal olmayan hücre otonom toksisite bazı yönlerinin analizi için özel olarak uygundur. sağlayan floresan izleme hayvanların şeffaflık hayatın her aşamasında canlı organizma içinde proteinlerin etiketledi. Bu yararlanan, hücreler ve bir f...

Protein agregatlarının prion benzeri yayılımı, son zamanlarda birçok nörodejeneratif hastalıkta rol oynadığı ortaya çıkmıştır. Bu protokolün amacı, nematod C. elegans'ın protein yayılımını izlemek ve prion benzeri olayları araştırmak için bir model sistem olarak nasıl kullanılacağını açıklamaktır.

Metazoan Model Organizma kullanma Serim ve toksisitesi prion-benzeri Proteinler incelenmesi<em&gt; ° C. elegans</em

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for ...

Aşağıdaki deneylerin genel amacı, Metazoan model organizma C zarafetini kullanarak PreOn benzeri proteinlerin yayılmasını ve karmaşık toksisitesini incelemektir. Bu, PreOn benzeri protein içeren veziküllerin hücre içi ve hücre içi taşınmasının, hızlandırılmış floresan mikroskobu kullanılarak izlenmesiyle elde edilir. Sonraki dokuya özgü katlama sensörleri ve her yerde ifade edilen stres.Raportörler, hücresel uygunluk üzerindeki hücre özerk ve hücre dışı özerk etkileri değerlendirmek için kullanılır. Daha sonra, PreOn ile indüklenen toksisitenin yeni değiştiricilerini tanımlamak için genom çapında bir RNAi taraması gerçekleştirilir. Ekran, toksisite için bir okuma olarak harmanlama kullanılarak sıvı kültürde gerçekleştirilir.Son olarak, solucan izleyici, C zarafetinin kombinasyon halindeki hareketini ölçmek için J görüntüsü için bir eklenti kullanılır. Bu yöntemler, PreOn benzeri proteinlerin hücreler arası hareketinde yer alan genetik yolların ve bunların hücre dışı otonom toksisitelerinin ayrılmasına izin verir. Senkronize deniz zarafeti kontrolü ve PreOn alan transgenik hatları ve% 10 agros pedlerini hazırladıktan sonra, ekteki metin protokolüne göre, üç mikrolitre 100 nanogram polistiren boncuk ve üç mikrolitre dört milimolar limasol pipetleyin.Bir platin tel çekme kullanarak, istenen yaşta solucanları bir plakadan çözeltiye aktarın ve solucanları hücre altı düzeyde görüntülemek için örtmek için bir örtü fişi kullanın. Konfokal mikroskobun mikroskop slayt tutucusuna bir slayt yerleştirin ve 63 x veya 100 x 1.4 NA yağ objektifi kullanın. Ardından, METAMORPH'u açın ve çok boyutlu edinimi seçin.Ve ana sekmenin altında, hızlandırılmış çekim ve çalıştırma günlükleri için kutuları işaretleyin. Kaydetme sekmesi altında, dosyaları kaydetmek için dizin klasörünü seçin veya oluşturun ve dosyaya bir ad atayın Dalga boyu sekmesi altında, Yoko dörtlü kırmızı veya MRFP görüntülemenin eşdeğer bir aydınlatmasını kullanın ve pozlamayı 100 ila 300 milisaniye arasında ve kamera kazancını 100 ila 300 arasında ayarlayın. Ardından, hızlandırılmış sekme sekmesi altında, zaman aralığını bir saniyeye, süreyi beş dakikaya ve zaman noktası sayısını 301'e ayarlayın.Dergiler sekmesi altında. Günlük seçimi için A FC seti, Z tutma ve A FC'ye dönüş Z tutma türü için özel seçimi iki kez seçin ve başlangıç noktası için zaman noktasının başlangıcını ve zaman noktasının sonunu seçin. Kurulum tamamlandığında, edin'e basın Bu prosedürü takiben, diskin dinamik özelliklerini ölçmek için partikül izleme uygulamaları gibi diğer yöntemler kullanılabilir.Prion alanı transgenik ve tip nematodlarını senkronize ettikten ve inger RNAI kütüphane plakalarını metin protokolüne göre kopyaladıktan sonra, boş vektör L 4 4 4 0'ı kontrol olarak barındıran HT bir 15 E coli bakterisini kullanmak için çoğaltılmış RNAi plakalarını 37 santigrat derece ve 300 RPM'de inkübe edin. Bir kültür tüpünde ayrı ayrı büyütün ve daha sonra 65 mikrolitre kültürü 2 96 oyuklarının dörtte birine aktarmak için çok kanallı bir pipet kullanın. Çok kanallı bir kafa içeren otomatik bir iş istasyonuna sahip kuyu plakaları dağıtılır.RNAi bakterilerinin ve kontrol plakalarının her bir oyuğuna 10 mikrolitre beş, milimolar seyreltilmiş IPTG. Bakteriler kuluçkaya yatarken üç saat kuluçkaya yatırmadan önce tekrar kapatın. Senkronize vahşi tip kontrol ve transgenik L bir larva ve M dokuz tampon kuyusunu karıştırın ve beş ila 10 mikrolitreyi bir cam mikroskoba pipetleyin.Solucanları kaydırın ve mikrolitre başına solucan sayısını hesaplayın. Üç saatlik bakteri inkübasyonundan sonra, plakaları inkübatörden çıkarın ve solucanları strese sokan ısıyı önlemek için oda sıcaklığına gelmelerine izin verin. Daha sonra, M dokuz tamponunu metin protokolüne göre IPTG kolesterol ve antibiyotiklerle destekleyin.Ve eşit olarak dağıtmak için mikrolitre karışımı başına 15 solucanlık bir nihai konsantrasyona uygun hacimde PreOn etki alanı transgenik solucan çözeltisi ekleyin. Daha sonra RNAi plakalarının her bir kuyucuğuna ve boş vektör kontrol plakalarından birinin kuyularına 50 mikrolitre dağıtın. Yabani tip solucan çözeltisini ikinci kontrol plakasına dağıtın.Daha sonra, havalandırmaya izin vermek için tüm plakaları açık bırakın ve dört ila beş plakayı bir araya getirerek, nemli bir kağıt havlu ve ardından alüminyum folyo ile sararak sıvı kültürün buharlaşmasını önleyin. Plakaları dört gün boyunca 20 santigrat derece ve 200 RPM'de inkübe edin. Plakalara göre, bir Falcon dört M 60 kamera ile monitörlü bir bilgisayara, kontrol ile tedavi edilen PreOn alan transgenik hayvanlara kıyasla daha fazla dövülmeyi görsel olarak taramak için.Solucanları R RNAi plakalarına dağıtmak için otomatik bir sıvı işleme iş istasyonu kullanmanın ana avantajı, oyuk başına değişkenliği ve solucan sayısını büyük ölçüde azaltmasıdır. Katı plakalar üzerinde bir motilite testi yapmak ve aday RNAi klonlarını doğrulamak için, metin protokolüne göre gece boyunca RNAi bakterileri büyür. Ardından, üç saat boyunca DS RNA'nın ekspresyonunu indüklemek için bir milimolar IPTG kullanın.İnce bir tabaka halinde yayılan önceden hazırlanmış NGM plakalarını tohumlamak için her RNAi bakteri klonundan 150 mikrolitre kullanın. Bakterilerin oda sıcaklığında karanlıkta stereo mikroskop altında iki gün kurumasına izin verin. Daha önce tarif edildiği gibi senkronize solucanların ve süspansiyonun miktarını belirleyin ve her deney plakasına 25 ila 30 L bir larva ekleyin.Nematodları solucanlar ulaşana kadar dört gün boyunca 20 santigrat derecede inkübe edin. Solucan motilitesini ölçmek için yetişkinliğin ikinci günü, kamerayı ve basit PCI görüntüleme yazılımını açın. Görüntüleme koşullarının ayarlanmasını etkinleştirmek için kamera simgesine tıklayın.Ardından, görüntüleme koşulunu aşağıdaki gibi ayarlayın. Kazancı sıfıra, ışık moduna, yüksek hız endeksini bire ve gruplamayı ikiye ayarlayın. Ardından canlı ve otomatik pozlama'ya tıklayın ve mikroskop aynalarını ve parlaklık ve kontrast kadranlarını hareket ettirerek aydınlatma koşullarını ayarlayın.Zamana tıklayın, tarayın ve bir klasör ve bir dosya adı yazın, alan gecikmesini 20 milisaniye olarak ayarlayın ve zaman içinde 30 saniye olarak durun. Plakanın kaydedilecek alanını seçmek için canlı incelemeye basın. Ardından sahneye üç veya dört kez plakaya dokunun.Görüş alanındaki konumunu hızlı bir şekilde onaylayın ve film kaydı bittikten sonra başlat'a basın, görüntüye sağ tıklayın ve filmi CXD formatından A VI dosyasına aktarmak için montaj sırasını dışa aktar'ı seçin. Hareket videolarını analiz etmek için, J görüntüsünü açın, eklentiler sekmesini seçin, ardından solucan izleyiciyi seçin ve Solucan İzleyici grubunu seçin ve Solucan İzleyici toplu işleminin ana giriş penceresinde analiz edilecek tüm dosyaları içeren dizini seçin, giriş değerlerini burada ayrıntılı olarak açıklandığı gibi yükleyin. Parametrelerin her biri için bir açıklama, eklentiye eşlik eden talimatlarda bulunabilir.Tamam'a tıklayın ve hareket analizinin çalışmasına izin verin. Son olarak, sonuçları düzenlemek için, tespit edilen tüm izlerin gerçek deniz zarafetinden olduğunu onaylayın ve eserleri ortadan kaldırın. Her film için oluşturulan TXT dosyalarını açın ve bilgileri bir veri analizi yazılım dosyasına kopyalayın.Oluşturulan etiket zip dosyalarını açın ve yanlış solucan izlerini manuel olarak kontrol etmek ve ortadan kaldırmak için elde edilen etiketleri TIFF çalıştırın. Laboratuvarda eski bir doktora sonrası araştırmacı olan Yesper Peterson, ilk olarak, toksisite için bir okuma olan CL Elegance motilinin manuel değerlendirmesinin yerine geçecek şekilde solucan izleyici fikrine sahipti. Solucan izleyici, hızlandırılmış görüntülemeyi kullanarak daha kısa sürede daha fazla koşulu değerlendirirken bu deneyleri kullanıcı önyargısı olmadan otomatik bir şekilde yapmamıza olanak tanır.Boru şeklindeki veziküllerde biriken RFP etiketli R, iki, E, iki, bir katlama sensörü veya stres raportörünü ifade eden coex tarafından hücreler içinde ve arasında taşındığı görüldü. PreOn benzeri protein hücresi ile birlikte, otonom ve hücre dışı otonom etkiler değerlendirilebilir. Kas hücrelerinde R iki E iki ekspresyonu, bağırsakta daha erken bir Q 44 agregasyonunun başlamasına yol açar, bu da R iki E iki'nin proteostaz üzerinde hücre dışı otonom etkilere sahip olduğunu ortaya çıkarır, R iki E iki'nin birlikte ekspresyonu SOD üç PGFP ile Transkripsiyonel oksidatif stres raporlayıcı, raportörün farklı dokularda yukarı regülasyonuna yol açar, PreOn alanının, tüm genom ekranını otonom olarak takip eden hücre dışı bir oksidatif stres tepkisini indüklediğini göstermektedir.Bu film, bilgisayar ekranında yüksek çözünürlüklü görüntüleme ve görselleştirmenin, bir plakanın dörtte birinin aynı anda taranmasını sağladığını göstermektedir Bir kez ustalaştıktan sonra, bu tarama protokolü seans başına 25 plakalık 12 turda yapılabilir. Haftada iki seans yapılırsa, tüm RNAi kütüphanesi altı hafta içinde taranabilir. Solucan izleyici, burada görüldüğü gibi C zarafet motilitesini ölçmek için kullanıldı.Worm Tracker, orijinal bir videoyu ikili bir formata dönüştürür ve her solucana bir parça atanır. İşlenmiş videolar, herhangi bir yapaylığı manuel olarak ortadan kaldırmak için üst üste bindirilmiş parçalarla görüntülenebilir. Saniyedeki vücut uzunlukları parametresi, potansiyel boyut farklılıkları için normalleşir. Nematod.Bu yöntem, kontrol ile tedavi edilen solucanlara kıyasla motilite fenotipini en az% 133 ve% 256'ya kadar artıran PreOn kaynaklı toksisitenin 35 baskılayıcısını tanımladı. Solucan izleyiciyi kiralarken, elde edilen solucan izlerini manuel olarak doğrulamayı unutmamak önemlidir. Yazılım, solucanları tanımlamada harika bir iş çıkarır, ancak bazen arka plan yine de yanlışlıkla bir hayvan olarak tanımlanabilir.Bu nedenle, üzerlerinde solucan izleyici çalıştırdıktan sonra videolarınızı kontrol etmeyi unutmayın. Bu yöntemler, nörodejeneratif hastalıklar alanında, belirli bir hastalık bağlantı proteininin hücreden hücreye yayılıp yayılamayacağı, benzer şekilde uygulanıp yayılamayacağı veya hücreler arası iletim ile bu proteinlerin karmaşık toksisitesi arasında bir bağlantı olup olmadığı gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Çocuklar.

investigating-spreading-toxicity-prion-like-proteins-using-metazoan

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Transgenik kullanarak Assaying β-amiloid Toksisite C. elegans Model

Bu video, kırmızı floresan proteini ile etiketlenmiş prion benzeri proteinleri eksprese eden C. elegans'ın in vivo görüntüleme prosedürünü göstermektedir. Protokol, zaman atlamalı konfokal mikroskopi için bir agaroz ped üzerinde nematodların hareketsiz hale getirilmesini, protein agregasyonunu ve hücreler içinde ve arasında taşınmayı ortaya çıkarmayı içerir. Bu teknik, nörodejeneratif hastalıklarla ilgili protein agregasyonunu incelemek için çok önemlidir.

Transgenik Nematodlarda Prion Benzeri Proteinlerin Hücre Arası Yayılımını İzlemek için Hızlandırılmış Görüntüleme

Biz solucan amylopathies yönlerini incelemek için yöntemler...

Bir<em&gt; Caenorhabditis elegans</emAmylopathy Çalışmaları&gt; Model Sistemi

Burada, mikrobiyal etkileşim çalışmaya çok yönlü ana model olarak Caenorhabditis elegans Yuvarlak solucanlar mevcut.

Nematot Caenorhabditis Elegans - konak-mikrop etkileşimleri çalışmaya çok yönlü Vivo içinde manken

Burada, biz transgenik Caenorhabditis elegans hatları yeşil floresan protein ifade canlı nöronal hücrelerin belirli grupların basit yalıtım için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, belirli nöronlara odaklanan ex vivo çalışmaların çeşitli sağlar ve daha kısa vadeli kültür için hücreleri yalıtmak için kapasitesine sahiptir.

Roundworm Caenorhabditis elegans belirli neuron nüfus yalıtım

Burada, yaşla ilişkili nörodejeneratif hastalıkların hücresel ve moleküler temellerini izlemek ve incelemek için hiperaktive iyon kanal kaynaklı nekroz ve protein agrega kaynaklı nörotoksisite gibi çok yönlü nematod modellerini kullanan yaygın olarak erişilebilir metodolojileri tanıtıyor ve tanımlıyoruz.

Caenorhabditis elegans Yaş İlişkili Nörodejeneratif Hastalıkların Modellendirilmesi

Burada, Caenorhabditis elegans'taki test bileşiklerinin poliglutamin agregasyonu, nöronal ölüm ve kemoavoidans davranışı dahil olmak üzere nöroprotektif aktivitelerini ve çoklu fenotiplerin örnek bir entegrasyonunu değerlendirmek için bir protokol sunuyoruz.

Poliglutamin aracılı nörotoksisiteye karşı biyoaktif bileşiklerin keşfedilmesi için bir model sistem olarak Caenorhabditis elegans

Burada, nematod Caenorhabditis elegans'ta protein agregasyon kinetiğinin analizi için bir yöntem sunulmuştur. Yaş senkronize edilmiş bir popülasyondan gelen hayvanlar farklı zaman noktalarında görüntülenir, ardından CellProfiler'da yarı otomatik dahil etme sayımı ve AmyloFit'teki matematiksel bir modele uyar.

Caenorhabditis elegans'ta Otomatik Inklüzyon Sayımı Kullanarak Protein Agregasyon Kinetiğinin In Vivo'da İzlenmesi

Bu video transgenik hayvanlar oluşturmak için C. elegans gonad içine mikroenjeksiyon tekniği göstermektedir.

Mikroenjeksiyon Kararlı Transgenik C. elegans Üretimi

Erişilebilir sinaps elektrofizyoloji Uygulama sinaptik mutantlar analiz yararlı sinaptik aktivite ölçülebilir bir ölçü, sağlar. Bu makale, nöromüsküler kavşaklar (NMJ) ortaya çıkarmak için kullanılan bir diseksiyon yöntemi...

C. Elegans Nöromüsküler Kavşağı Diseksiyon ve kayıt

Keşfedin prion-benzeri proteinlerin yayılmasını ve toksisitesini C. elegans model organizmasında. Zaman atlamalı floresan mikroskopi ve genom çaplı RNAi tarama ile hücre içi ve hücreler arası taşımayı izleyin.

Metazoan Model Organizma kullanma Serim ve toksisitesi prion-benzeri Proteinler incelenmesi

Daha fazla video keşfet