Name: SDF-1α-Kitosan-Dekstran Sülfat nano partiküllerin hazırlanması ve Karakterizasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: Keşfedin SDF-1α-kitosan-dekstran sülfat nanopartiküllerinin hazırlanması ve karakterizasyonu yöntemini. Nanopartikül boyutu, zeta potansiyeli ve SDF-1α aktivitesi ölçülerek kök hücre tedavileri için etkili bir taşıyıcı sistem geliştirilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma NIH hibeleri tarafından desteklenmiştir: HL671795, HL048743 ve HL108630.

1. SDF-1α Glikan Nanopartiküllerinin Hazırlanması
 In vivo uygulama amacı nedeniyle, hazırlıkta kullanılan tüm kapları, pipetleri ve uçları sterilize edin.
<ol>
	<li>UltraPure Water'da aşağıdaki stok çözeltilerini hazırlayın:% 1 dekstran sülfat; 1 M NaOH (PES membranı ile steril filtrelenmiş); % 0.2 buzlu asetik asit içinde% 0.1 kitosan (art arda 0.8 ve 0.22 μm filtrelerden süzün ve daha sonra NaOH ile pH'ı 5.5'e ayarlayın); 0.1 M ZnS04;% 15 mannitol; ve 0.92 mg / ml SDF-1α (80 ° C'de alikotlarda saklanır, ve çözüldükten sonra 4 ° C'de tutulur).</li>
	<li>Stok çözeltilerini 0,22 μm filtre membranları ile sterilize edin. Hazırlanan çözeltideki endotoksin seviyelerini limulus amebosit lizat (LAL) jel pıhtı testi ile değerlendirin. Seviyelerin <0.06 EU/ml olduğundan emin olun.</li>
	<li>Manyetik karıştırma çubuğu içeren 1,5 ml'lik bir cam şişeye 0,18 ml UltraPure su ekleyin. Karıştırma hızını 800 rpm'ye ayarlayın. 0.1 ml% 1 dekstran sülfat ekleyin ve 2 dakika karıştırın. 0.08 mg SDF-1α (0.087 ml 0.92 mg / ml SDF-1α çözeltisi) ekleyin ve 20 dakika karıştırın.</li>
	<li>Damla damla 0.33 ml% 0.1 kitosan ekleyin ve 5 dakika karıştırın. Karıştırma hızını maksimuma ayarlayın ve 0.1 ml şırınga ile (1 dakikadan fazla) yavaşça 0.1 ml 0.1 M ZnS4 ekleyin.</li>
	<li>Karıştırma hızını 800 rpm'ye getirin ve 30 dakika karıştırın. 0.4 ml% 15 mannitol ekleyin ve 5 dakika karıştırın. Reaksiyon karışımını 1.5 ml'lik bir mikrofüj tüpüne aktarın. 10 dk. boyunca 4 ° C'de 16.000 x g'da santrifüjleyin
	Not: Mannitolün varlığı, santrifüjlemeden sonra partiküllerin yeniden süspansiyonunu kolaylaştırır. Peletin kompaktlığına bağlı olarak, mannitol konsantrasyonu %0 ila %5 arasında değişebilir. Her santrifüjlemeden sonra partiküllerin tamamen yeniden süspansiyonu, son süspansiyondaki agregaları önlemek için kritik öneme sahiptir.</li>
	<li>Süpernatanı aspire edin ve sıvının son damlasını yavaşça çıkarmak için bir pipet kullanın. 0.2 ml% 5 mannitol ekleyin. Peletleri 0.5 ml, 29 G iğneli şırınga ile askıya alın. 1 ml% 5 mannitol ekleyin. 15 dakika boyunca 16.000 x g'da santrifüjleyin.</li>
	<li>Adım 1.6'yı tekrarlayın.</li>
	<li>Süpernatanı aspire edin. Peleti 0.2 ml% 5 mannitol içinde yeniden süspanse edin. Partikül süspansiyonunu 4 °C. 'de saklayın
	Not: Partikül süspansiyonu ayrıca -80 °C'de donmuş olarak saklanabilir veya liyofilize edilebilir. Süspansiyona %5 mannitol dahil edilmesi, donma ve çözülme işleminden sonra veya liyofilizasyon ve rehidrasyondan sonra partiküllerin toplanmasını önlemek için gereklidir. Mannitol, depolamadan sonra süspansiyonun santrifüjlenmesiyle çıkarılabilir.</li>
</ol>
2. Partikül Boyutu ve Zeta Potansiyelinin Ölçümü
Partikül boyutu ve zeta potansiyeli, Malzeme Listesinde belirtilen bir partikül analizörü ile sırasıyla dinamik ışık saçılımı ve elektroforetik ışık saçılımı ile analiz edilir.
<ol>
	<li>Partikül boyutu ölçümü için aşağıdaki parametreleri ayarlayın: Biriktirme süreleri: 70; Tekrarlama süreleri: 4; Sıcaklık: 25 °C; Seyreltici: su; Yoğunluk ayarı: otomatik.</li>
	<li>SDF-1α-DS-CS numunesini suyla seyreltin (10 kat seyreltme). 100 μl numuneyi Eppendorf küveti gibi tek kullanımlık bir UV küvetine yükleyin. Küveti hücre tutucusuna yerleştirin. Yoğunluk ayarının "Optimum"a (~10.000 cps) ulaşmasını bekleyin. Veri toplamayı başlatın.</li>
	<li>Ölçüm tamamlandıktan sonra, çap (nm) ve polidispersite indeksinin kümülant sonuçlarını kaydedin. Tekrarlanan 4 okumanın her birinden elde edilen sonuçların ortalamasını alın ve standart sapmayı hesaplayın.</li>
	<li>Zeta potansiyeli ölçümü için 10 kat seyreltilmiş partikül numunesinin 500 μl'sini bir akış hücresine yükleyin. Ölçüm için aşağıdaki parametreleri ayarlayın: Biriktirme süreleri: 10; Tekrarlama süreleri: 5; Sıcaklık: 25 °C; Seyreltici: su; Yoğunluk ayarı: otomatik. Zeta potansiyelinin (mV) sonuçlarını kaydedin. Tekrarlanan 5 okumanın her birinden elde edilen sonucun ortalamasını alın ve standart sapmayı hesaplayın.</li>
</ol>
3. Parçacıklarda SDF-1α'nın Miktar Tayini
<ol>
	<li>Serbest formdaki SDF-1α'yı 1.3x Laemmli numune tamponunda 0.01, 0.02, 0.03, 0.04 ve 0.05 mg / ml konsantrasyonlarına seyreltin. 6 μl SDF-1α-DS-CS numunelerini 40 μl 1.3x Laemmli numune tamponu ile seyreltin. (0.25 M Tris-HCl, pH 7.5, %8 SDS, %40 gliserol, 0.05 mg / ml bromofenol mavisi ve %8 2-merkaptoetanol içeren 4x Laemmli stok tamponu hazırlayın. Stok çözeltisini küçük parçalara bölün ve tek kullanımlık olarak -20 °C'de tutun.)</li>
	<li>Numuneleri 100 °C'de 10 dakika ısıtın. Partikülleri tamamen ayırmak için numuneleri 10 dakikalık ısıtma süresi boyunca iki kez (her biri maksimum hızda 10 saniye boyunca) vorteksleyin. Numuneleri 2 dakika RT'ye soğutun. Su yoğuşmasını azaltmak için 10.000 x g'da 0,5-1 dakika santrifüjleyin. İyice karıştırmak için tekrar girdap yapın. 
	Not: Bu noktada, numune çözeltisi görünür bir çökelti olmadan berrak olmalıdır.</li>
	<li>%4-20'lik bir SDS jeline 10 μl numune / kuyucuk yükleyin. Elektroforezi 20 dakika boyunca 200 V'ta çalıştırın. Jeli Coomassie mavi protein boyası ile boyayın.</li>
	<li>Bir moleküler görüntüleyici ve dansitometri analiz yazılımı kullanarak SDF-1α'nın protein bant yoğunluğunu inceleyin. Serbest SDF-1α standartlarıyla oluşturulmuş standart bir eğriye karşı parçacıklardaki SDF-1α miktarını hesaplayın.</li>
</ol>
4. İn Vitro Serbest Bırakma Testi
<ol>
	<li>SDF-1α glikan parçacıklarını Dulbecco'nun kalsiyum ve magnezyum (D-PBS) içermeyen fosfat tamponlu salini ile 1: 1 oranında (h / v) karıştırın.</li>
	<li>Partikül süspansiyonunu 1,5 ml'lik tüplerde 0,05 ml'lik alikotlara bölün. Numuneleri tüplerin dibine yükleyin. Hava kabarcıkları sokmaktan veya sıvının yüzeyini rahatsız etmekten kaçının. Tüplerin üstünü Parafilm. ile kapatın
	NOT: Bunu yaparken, tüp karıştırıcı üzerinde müteakip yukarıdan aşağıya dönüş sırasında sıvı altta kalacaktır.</li>
	<li>Tüpleri dönen bir mikro tüp karıştırıcı üzerinde 37 °C'de döndürün. Belirlenen zamanlarda tüplerden alikotları çıkarın ve numuneleri hemen 16.000 x g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>Süpernatanları ve peletleri ayırın ve peleti 0.05 ml D-PBS ile sulandırın. Numuneleri -20 °C'de saklayın. Tüm numuneler toplandıktan sonra, yukarıda açıklandığı gibi bir SDS jeli üzerindeki süpernatanları ve peletleri inceleyin.</li>
</ol>
5. Migrasyon Testi
Bu test, SDF-1α'nın kemotaktik aktivitesini ölçer. SDF-1α'nın hücre yüzeyindeki reseptörü (CXCR4) ile etkileşimi, hücrenin SDF-1α gradyanına doğru göçüne neden olur. Bu tahlilde, hücreler bir üst kuyucuğa (bir alt kuyudan yarı geçirgen bir zarla ayrılmış) ve SDF-1α çözeltisi bir alt oyuğa yüklenir.
<ol>
	<li>SDF-1α'yı (serbest veya partiküle bağlı form) migrasyon tamponu (% 0.5 sığır serum albümini içeren RPMI-1640 ortamı) ile 100, 33, 11, 3.7, 1.2, 0.41, 0.14 ve 0.05 ng / ml'lik nihai konsantrasyonlara 3 kat seri seyreltmede seyreltin.</li>
	<li>24 oyuklu plakadaki bir kuyucuğa 0.6 ml seyreltilmiş SDF-1α çözeltisi veya sadece migrasyon tamponu (negatif kontrol) ekleyin. Bir kuyucuğa 0.57 ml migrasyon tamponu ekleyin (giriş hücresi kontrolü). 37 °C'de 30 dakika inkübe edin. Alt kuyucuğun üzerine Transwell (gözenek boyutu 5 μm, çap 6,5 mm) gibi geçirgen bir hücre kültürü eki yerleştirin. Transwell ekine 0.1 ml Jurkat hücreleri (5 × 105) yükleyin. 0,03 ml'lik hücreleri doğrudan giriş hücresi kontrol kuyusuna yükleyin. Plakayı 37 ° C'de% 5 CO2 inkübatörde 2 saat inkübe edin.</li>
	<li>Transwell eklerini çıkarın. Alt kuyucuklara göç eden hücreleri 4 ml'lik bir polistiren tüpe aktarın. Taşınan hücreleri bir akış sitometresi ile sayın.</li>
	<li>Negatif kontrollerdeki sayıların çıkarılmasından sonra (yalnızca migrasyon arabelleği içeren kuyucuklara geçirilen hücreler) giriş hücresi sayısının (giriş hücresi kontrol kuyucuğundaki hücre sayısı x 100/30) migrasyonu yüzde olarak hesaplayın.</li>
</ol>

<ol><li>Delair, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colloidal+polyelectrolyte+complexes+of+chitosan+and+dextran+sulfate+towards+versatile+nanocarriers+of+bioactive+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharm+Biopharm%22%5BJournal%5D)">Colloidal polyelectrolyte complexes of chitosan and dextran sulfate towards versatile nanocarriers of bioactive molecules.</a> Eur J Pharm Biopharm. 78 (1), 10-18 (2011).</li>
<li>Morachis, J. M., Mahmoud, E. A., Almutairi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+and+chemical+strategies+for+therapeutic+delivery+by+using+polymeric+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">Physical and chemical strategies for therapeutic delivery by using polymeric nanoparticles.</a> Pharmacol Rev. 64 (3), 505-519 (2012).</li>
<li>Yue, Z. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+charge+affects+cellular+uptake+and+intracellular+trafficking+of+chitosan-based+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Surface charge affects cellular uptake and intracellular trafficking of chitosan-based nanoparticles.</a> Biomacromolecules. 12 (7), 2440-2446 (2011).</li>
<li>Ghadge, S. K., Muhlstedt, S., Ozcelik, C., Bader, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SDF-1alpha+as+a+therapeutic+stem+cell+homing+factor+in+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">SDF-1alpha as a therapeutic stem cell homing factor in myocardial infarction.</a> Pharmacol Ther. 129 (1), 97-108 (2011).</li>
<li>Sharma, M., Afrin, F., Satija, N., Tripathi, R. P., Gangenahalli, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal-derived+factor-1%2FCXCR4+signaling%3A+indispensable+role+in+homing+and+engraftment+of+hematopoietic+stem+cells+in+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Stromal-derived factor-1/CXCR4 signaling: indispensable role in homing and engraftment of hematopoietic stem cells in bone marrow.</a> Stem Cells Dev. 20 (6), 933-946 (2011).</li>
<li>Sadir, R., Baleux, F., Grosdidier, A., Imberty, A., Lortat-Jacob, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+stromal+cell-derived+factor-1alpha-heparin+complex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of the stromal cell-derived factor-1alpha-heparin complex.</a> J Biol Chem. 276 (11), 8288-8296 (2001).</li>
<li>Amara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+cell-derived+factor-1alpha+associates+with+heparan+sulfates+through+the+first+beta-strand+of+the+chemokine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Stromal cell-derived factor-1alpha associates with heparan sulfates through the first beta-strand of the chemokine.</a> J Biol Chem. 274 (34), 23916-23925 (1999).</li>
<li>Sadir, R., Imberty, A., Baleux, F., Lortat-Jacob, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparan+sulfate%2Fheparin+oligosaccharides+protect+stromal+cell-derived+factor-1+%28SDF-1%29%2FCXCL12+against+proteolysis+induced+by+CD26%2Fdipeptidyl+peptidase+IV%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Heparan sulfate/heparin oligosaccharides protect stromal cell-derived factor-1 (SDF-1)/CXCL12 against proteolysis induced by CD26/dipeptidyl peptidase IV.</a> J Biol Chem. 279 (42), 43854-43860 (1074).</li>
<li>Yin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SDF-1alpha+in+glycan+nanoparticles+exhibits+full+activity+and+reduces+pulmonary+hypertension+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">SDF-1alpha in glycan nanoparticles exhibits full activity and reduces pulmonary hypertension in rats.</a> Biomacromolecules. 14 (11), 4009-4020 (2013).</li>
<li>Huang, M., Vitharana, S. N., Peek, L. J., Coop, T., Berkland, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyelectrolyte+complexes+stabilize+and+controllably+release+vascular+endothelial+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Polyelectrolyte complexes stabilize and controllably release vascular endothelial growth factor.</a> Biomacromolecules. 8 (5), 1607-1614 (2007).</li>
<li>McCall, R. L., Sirianni, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PLGA+nanoparticles+formed+by+single-+or+double-emulsion+with+vitamin+E-TPGS%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">PLGA nanoparticles formed by single- or double-emulsion with vitamin E-TPGS.</a> J Vis Exp. (82), 51015(2013).</li>
<li>Carrillo-Conde, B. R., Roychoudhury, R., Chavez-Santoscoy, A. V., Narasimhan, B., Pohl, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+synthesis+of+carbohydrates+and+functionalization+of+polyanhydride+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">High-throughput synthesis of carbohydrates and functionalization of polyanhydride nanoparticles.</a> J Vis Exp. (65), 3967(2012).</li>
<li>Xu, J., Amiji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+gene+delivery+and+transfection+in+human+pancreatic+cancer+cells+using+epidermal+growth+factor+receptor-targeted+gelatin+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Therapeutic gene delivery and transfection in human pancreatic cancer cells using epidermal growth factor receptor-targeted gelatin nanoparticles.</a> J Vis Exp. (59), e3612(2012).</li>
<li>Lauten, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoglycan+complex+formulation+extends+VEGF+retention+time+in+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Nanoglycan complex formulation extends VEGF retention time in the lung.</a> Biomacromolecules. 11 (7), 1863-1872 (2010).</li>
<li>Schatz, C., Domard, A., Viton, C., Pichot, C., Delair, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+and+efficient+formation+of+colloids+of+biopolymer-based+polyelectrolyte+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Versatile and efficient formation of colloids of biopolymer-based polyelectrolyte complexes.</a> Biomacromolecules. 5 (5), 1882-1892 (2004).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Yukarıda bahsedildiği gibi, DS-CS nanopartikülleri, polianyon (DS) ve polikasyon (CS) molekülleri arasındaki yük nötralizasyonu yoluyla oluşturulur. Yük etkileşimi moleküler çarpışma sırasında kolayca gerçekleştiğinden, polimer çözeltilerinin konsantrasyonu ve karıştırma sırasındaki karıştırma hızı, elde edilen parçacıkların boyutu için kritik öneme sahiptir. Genel bir eğilim, daha seyreltilmiş DS ve CS çözeltilerinin 15 ve daha yüksek karıştırma hızının daha küçük parçacıklarla sonuçlanmasıdır.
<p class="...

Dekstran sülfat (DS) ve kitosan (CS), çoklu ikame edilmiş negatif yüklü sülfat gruplarına (DS'de) veya pozitif yüklü amin gruplarına (deasetillenmiş CS) sahip polisakkaritlerdir. Sulu bir çözelti içinde karıştırıldığında, iki polisakkarit, elektrostatik etkileşimler yoluyla polielektrolit kompleksleri oluşturur. Elde edilen kompleksler, sulu çözeltiden (çökeltiler) faz ile ayrılacak büyük agregalar veya suda dağılabilen küçük parçacıklar (kolloidler) oluşturabilir. Bu sonuçlara katkıda bulunan özel koşullar kapsamlı bir şekilde incelenmiş ve yakın tarihli bir gözden geçirmede ayrıntılı olarak özetlenmiştir 1. Bu koşullar arasında, suda dağılabilir parçacıklar üretmek için iki temel gereksinim şunlardır: zıt yüklü polimerler 1) önemli ölçüde farklı molar kütleye sahip olmalıdır; ve 2) stokiyometrik olmayan bir oranda karıştırılmalıdır. Bu koşullar, yük nötralizasyonu ile üretilen yük-nötr kompleksli polimerik segmentlerin parçacığın çekirdeğini ayırmasına ve oluşturmasına ve fazla polimerin dış kabuğu 1 oluşturmasına izin verecektir. Bu protokolde tarif edilen glikan partikülleri, pulmoner doğum için tasarlanmıştır ve net negatif yüklü ve nanometre boyutlarında olacak şekilde tasarlanmıştır. Negatif yüzey yükü, parçacıkların 2,3 hücresel alım olasılığını azaltır. Nanometre boyutundaki partiküller distal hava yollarından geçişi kolaylaştırır. Bu amaca ulaşmak için, bu preparatta kullanılan DS miktarı CS'den fazladır (ağırlık oranı 3:1); ve yüksek moleküler ağırlıklı DS (ağırlık ortalaması MW 500.000) ve düşük moleküler ağırlıklı CS (MW aralığı 50-190 kDa, %75-85 deasetillenmiş) kullanılır.
SDF-1α, kemotaktik aktivitesi aracılığıyla hedef arama işlevini uygulayan bir kök hücre hedef arama faktörüdür. SDF-1α, kemik iliğinde hematopoietik kök hücrelerin yerleştirilmesinde ve sürdürülmesinde ve yaralanma onarımı için periferik dokuya progenitör hücrelerin alınmasında önemli bir rol oynar 4,5. SDF-1α, protein dizisinde, proteinin heparin/heparan sülfata bağlanmasına, dimerler oluşturmasına, proteaz (CD26/DPPIV) inaktivasyonundan korunmasına ve hücre yüzeyi reseptörleri 6-8 aracılığıyla hedef hücrelerle etkileşime girmesine izin veren bir heparin bağlama bölgesine sahiptir. DS, heparin/heparan sülfat ile benzer yapısal özelliklere sahiptir; bu nedenle, SDF-1α'nın DS'ye bağlanması, doğal polimerik ligandlarınınkine benzer olacaktır.
Aşağıdaki protokolde, SDF-1α-DS-CS nanopartiküllerinin hazırlanmasını açıklıyoruz. Prosedürler, daha önce incelenmiş olan formülasyonlardan birini temsil eder 9. Protokol başlangıçta VEGF-DS-CS nanopartikülleri 10'un araştırılmasından uyarlanmıştır. Aynı stok çözeltileri ve hazırlama koşulları ile kolayca ölçeklendirilebilen küçük ölçekli bir hazırlık tanımlanmıştır. Hazırlandıktan sonra, partiküller boyutları, zeta potansiyelleri, SDF-1α dahil edilme kapsamı, in vitro salım süresi ve dahil edilen SDF-1α'nın aktivitesi incelenerek karakterize edilir.

<table><tbody><tr><td>Dekstran sülfat</td><td>Fisher</td><td>BP1585-100</td><td></td></tr><tr><td>Chitosan, düşük moleküler ağırlıklı&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>448869</td><td></td></tr><tr><td>Çinko sülfat heptahidrat</td><td>Sigma</td><td>204986</td><td></td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>Sigma</td><td>M9546</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure su&nbsp;</td><td>Canlandırıcı&nbsp;</td><td>10977-023</td><td></td></tr><tr><td>SDF-1 ve alfa;</td><td>Referans 8'e göre hazırlanmıştır.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Şırınga filtresi, PES membran 0.22 & &#956; m</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Manyetik Mikro Karıştırma Çubukları (2&nbsp; x&nbsp; 7&nbsp; mm)</td> <td>Balıkçı&nbsp;</td><td>14-513-63</td><td></td></tr><tr><td>Cam flakon Kiti; SUN-SRi</td><td>Balıkçı&nbsp;</td><td>14-823-182</td><td></td></tr><tr><td>Delsa Nano C Partikül Analiz Cihazı&nbsp;</td><td>Backman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf UVette Küvet</td><td>Eppendorf</td><td>952010069</td><td></td></tr><tr><td>4&ndash; %20 Mini-PROTEAN TGX Jel</td><td>Bio-Rad</td><td>456-1096</td><td></td></tr><tr><td>GelCode Mavi Güvenli Protein Lekesi</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>PI-24592</td><td></td></tr><tr><td>Moleküler Görüntüleyici VersaDoc MP 4000 Sistemi</td><td>BioRad</td><td>170-8640</td><td></td></tr><tr><td>Corning Transwell Geçirgen Destekler</td><td>Corning</td><td>3421</td><td></td></tr><tr><td>Accuri C6 Akış Sitometresi</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' S Fosfat Tamponlu Salin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Pyrogent plus kiti</td><td>Fisher</td><td>NC9753738</td><td></td></tr></tbody></table>

sdf-1α-kitosan-dekstran sülfat nano partiküllerin hazırlanması ve karakterizasyonu

Preparation and Characterization of SDF-1&#945;-Chitosan-Dextran Sulfate Nanoparticles

Kitosan (CS) ve dekstran sülfat (DS), uygun koşullar altında karıştırıldığında polielektrolit kompleks bazlı nanopartiküller oluşturan yüklü polisakkaritlerdir (glikanlar). Glikan nanopartikülleri, proteinlerin in vivo olarak verilmesini kolaylaştıran ve hedeflenen dokuda tutulmalarını sürdüren protein faktörleri için yararlı taşıyıcılardır. Glikan polielektrolit kompleksleri, protein dağıtımı için de idealdir, çünkü birleştirme, proteinlerin inaktivasyon olasılığını azaltan sulu çözelti içinde gerçekleştirilir. Heparin bağlanma bölgesine sahip proteinler, dekstran sülfata kolayca yapışır ve sırayla bağlanma ile stabilize edilir. Bu parçacıklar ayrıca in vivo olarak verildiğinde daha az inflamatuar ve toksiktir. Aşağıda tarif edilen protokolde, bir kök hücre hedef arama faktörü olan SDF-1α (Stromal hücre kaynaklı faktör-1α) önce karıştırılır ve dekstran sülfat ile inkübe edilir. Polielektrolit kompleksleri oluşturmak için karışıma kitosan eklenir, ardından kompleksleri çinko köprülerle stabilize etmek için çinko sülfat eklenir. Elde edilen SDF-1α-DS-CS parçacıkları, boyut (çap) ve yüzey yükü (zeta potansiyeli) için ölçülür. Dahil edilen SDF-1α'nın miktarı belirlenir, ardından in vitro salım hızı ve kemotaktik aktivitesi partiküle bağlı bir formda ölçülür.

Hazırlanan SDF-1α-DS-CS partiküllerinin boyutu ve zeta potansiyeli bir partikül analizörü ile belirlenir. Şekil 1, boyut ölçümünün analizini göstermektedir. Dört tekrarlı ölçümden elde edilen kumulant sonuçlarına göre, SDF-1α-DS-CS partiküllerinin ortalama hidrodinamik çapı 661 ± 8.2 (nm) ve polidispersite değeri 0.23 ± 0.02'dir. Zeta potansiyeli ölçümünün sonucu Şekil 2'de gösterilmiştir. Beş tekrarlı ölçüm sonucunda, SDF-1α-DS-CS partiküllerinin zeta potansiyeli -24.8 ± 0.5 mV olarak b...

Bu protokolün amacı, bir kök hücre hedef arama faktörü olan SDF-1α'yı dekstran sülfat-kitosan nanopartiküllerine dahil etmektir. Elde edilen parçacıklar, boyutları ve zeta potansiyellerinin yanı sıra nanoparçacıklardan SDF-1α'nın içeriği, aktivitesi ve in vitro salım hızı için ölçülür.

SDF-1α-Kitosan-Dekstran Sülfat nano partiküllerin hazırlanması ve Karakterizasyonu

Chitosan (CS) and dextran sulfate (DS) are charged polysaccharides (glycans), which form polyelectrolyte complex-based nanoparticles when mixed under ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, SDF-1$\alpha$ kiazları ve dekstran sülfat nanopartiküllerini hazırlamak ve karakterize etmektir. Nanopartiküllerin hazırlığı, öncelikle kök hücre yönlendirici faktör olan stromal hücre türevli faktör bir alfa veya SDF-1$\alpha$'nın, negatif yüklü glikana bağlanmasını sağlamak amacıyla dekstran sülfat ile karıştırılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci bir adım olarak, karışıma pozitif yüklü bir glikan eklenerek dekstran sülfat ile bir polielektrolit kompleksi oluşturulur.Ardından, çinko köprüleri ile kompleksleri stabilize etmek amacıyla çinko sülfat eklenir. Elde edilen partikül, negatif yüklü bir kabukla çevrelenmiş yoğun bir çekirdeğe sahiptir. Daha sonra partiküllerin boyutları ve zeta potansiyellerinin yanı sıra nanopartiküllerdeki SDF-1α içeriği ve aktivitesi ölçülür. SDF-1α glikan nanopartiküllerinin temel avantajı, yapıya dahil edilen SDF-1α'nın partiküllerden salınmadan tam aktif kalmasıdır.Bu nedenle, partiküller kök hücre terapisinde sabit bir hermine sinyali olarak hizmet etmek için yararlı olabilir. Başlamak için, metin protokolünde açıklandığı gibi stok çözeltileri hazırlayın ve bunları 0,22 mikronluk filtre membranlarından geçirerek sterilize edin. Hazırlanan çözeltideki endotoksin seviyelerini ulu amoeba cyte lysate jel pıhtılaşma testi ile değerlendirin.Seviyelerin mililitre başına 0,06 endotoksin ünitesinden düşük olduğundan emin olun. Ardından, manyetik karıştırma çubuğu içeren 1,5 mililitrelik cam bir şişeye 0,18 mililitre ultrapure su ekleyin. Karıştırma hızını 800 RPM olarak ayarlayın, ardından 0,1 mililitre %1 dekstran sülfat ekleyin ve iki dakika boyunca karıştırın.0,08 mg SD F1 alpha ekleyin ve 20 dakika boyunca karıştırın. 0,33 mL %0,1 tizen'i damla damla ekleyin ve beş dakika boyunca karıştırın. Karıştırma hızını maksimuma getirin ve gaz sızdırmaz bir şırınga ile 0,1 mL çinko sülfatı yavaşça ekleyin.Karıştırma hızını 800 RPM'ye geri getirin ve 30 dakika boyunca karıştırın. Ardından 0,4 mL %15 mannitol ekleyin ve beş dakika sonra karıştırın. Reaksiyon karışımını 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve 16.000 Gs hızında, 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin.Santrifüj işleminin ardından, süpernatantı aspire edin ve son sıvı damlasını uzaklaştırmak için bir pipet kullanın. Yavaşça 0,2 mililitre %5 mannitol ekleyin ve pellet'i 0,5 mililitrelik 29 gauge iğneli bir şırınga ile süspanse edin. Ardından, santrifüjden önce bir mililitre daha %5 mannitol ekleyin.İkinci kez 16,000 GS'de 15 dakika boyunca santrifüjleyin. Resus süspansiyon santrifüjleme işlemi tekrarlandıktan sonra süpernatanı aspire edin ve peleti 0.2 mililitre %5 mannitol içinde yeniden süspande edin. Parçacık boyutu ve zeta potansiyeli sırasıyla dinamik ışık saçılması ve elektroforetik ışık saçılması ile analiz edilir.Başlamak için, dinamik ışık saçılması yoluyla parçacık boyutu ölçümü parametrelerini içeren SOP listesinden bir işlem prosedürü seçin. Metin protokolünde belirtildiği gibi, SD F1 alpha parçacık örneğini su ile seyreltin. Ardından, örneğin 100 µL'sini Einor Q Vet gibi tek kullanımlık bir UV Q Vet'e yükleyin.Q vet'i hücre tutucuya yerleştirin ve veri toplama işlemine başlamadan önce yoğunluk ayarının optimum seviyeye ulaşmasını bekleyin. Ölçüm tamamlandıktan sonra, çap ve polidispersite indeksinin toplam sonuçlarını kaydedin. Dört tekrarlı okumanın her birinden elde edilen sonuçların ortalamasını alın ve elektroforetik ışık saçılımı yoluyla zeta potansiyeli ölçümü için standart sapmayı hesaplayın.Akış hücresine on kat seyreltilmiş partikül örneğinden 500 µL yükleyin. Zeta potansiyeli SOP listesinden, metin protokolünde belirtilen ölçüm parametrelerini içeren bir işlem prosedürü seçin. Zeta potansiyeli sonuçlarını kaydedin.Ardından, beş tekrarlı okumanın her birinden elde edilen sonuçların ortalamasını alın ve standart sapmayı hesaplayın. Serbest ve partiküle bağlı SD F1 alpha'nın seyreltilmiş örneklerini, 1x örnek tamponunda 100 °C'de 10 dakika boyunca ısıtın. Partiküllerin tamamen ayrışmasını sağlamak için 10 dakikalık ısıtma sırasında örnekleri iki kez vorteksleyin. Örnekleri iki dakika boyunca oda sıcaklığında soğuttuktan sonra, su kondensasyonunu çöktürmek için 10.000 G'de 0,5 ila 1 dakika boyunca santrifüjleyin ve iyice karıştırmak için tekrar vorteksleyin.Bu noktada, örnek çözelti görünür bir çökelek olmadan berrak olmalıdır. Ardından, %4-20 sodyum ESAL sülfat veya SDS jeline kuyu başına 10 µL örnek yükleyin. Jeli Coomassie blue protein boyası ile boyamadan önce, elektroforezi 200 V'da 20 dakika boyunca gerçekleştirin.Bir moleküler görüntüleyici ve densitometrik analiz yazılımı kullanarak SDF-1$\alpha$ protein band yoğunluğunu inceleyin. İn vitro salım analizini gerçekleştirmek için, serbest SDF-1$\alpha$ standartları ile oluşturulmuş bir standart eğriye karşı partiküllerdeki SDF-1$\alpha$ miktarını hesaplayın. SDF-1$\alpha$ glikan partikülleri ile kalsiyum ve magnezyum içermeyen dokoz fosfat tamponlu salini (DPBS) bir bire oranında karıştırın. Partikül süspansiyonunu 1,5 mililitrelik tüplerde 0,05 mililitrelik alikotlara bölün.Numuneleri tüplerin dibine yükleyin. Hava kabarcığı oluşmasını veya sıvı yüzeyinin bozulmasını önleyin. Tüplerin üst kısmını parafilm ile mühürleyin.Ardından tüpleri döner bir mikro tüp karıştırıcıda 37 °C'de döndürün. Belirlenen zamanlarda tüplerden alikotlar alın ve santrifüjleme işleminin ardından örnekleri hemen 4 °C'de 10 dakika boyunca 16.000 G'de santrifüjleyin. Süpernatantları ve peletleri ayırın.Ardından pellet'i 0,05 milliliters DPBS ile yeniden süspande edin. Tüm örnekler toplandıktan sonra, süpernatantları ve pelletleri bir SDS jelinde inceleyin. Daha önce olduğu gibi, bu analiz S df'nin kemotaktik aktivitesini ölçer.S df one alpha'nın reseptörü ile olan bir alfa etkileşimi, hücrenin SD F1 alpha gradyanına doğru göç etmesine neden olur. Başlamak için, serbest veya partiküle bağlı formdaki SD F1 alpha'yı, metin protokolünde listelenen nihai konsantrasyonlara ulaşana kadar migrasyon tamponu ile üç katlı seri dilüsyonla seyreltin. Negatif kontrol için 24 kuyucuklu plakanın bir kuyucuğuna 0.6 milliliters seyreltilmiş SD F1 alpha çözeltisi ekleyin.Aynısını sadece migrasyon tamponu için yapın, ardından girdi hücre kontrolü için bir kuyucuğa 0,57 milliliters migrasyon tamponu ekleyin. Plakayı 37 degrees Celsius'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra, alt kuyucuğun üzerine Transwell gibi geçirgen bir hücre kültürü inserti yerleştirin ve Transwell insertine 0,1 milliliters jerk hat hücresi yükleyin.Ardından, 0,03 ml hücreyi doğrudan girdi hücre kontrol kuyucuğuna yükleyin. Plakayı, %5 karbon dioksit inkübatöründe 37 °C'de iki saat boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, hücre kültürü insertlerini çıkarın.Alt kuyucuklara göç eden hücreleri dört mililitrelik polistiren tüpe aktarın. Göç eden hücreleri bir akış sitometresi ile sayın. Son olarak, negatif kontrollerdeki sayıların çıkarılmasının ardından göçü, başlangıç hücre sayısının bir yüzdesi olarak hesaplayın.Burada, SD F1 alfa dekstran sülfat ozan partikül boyutu ölçümünün analizi gösterilmektedir. CUMUL sonucu, partikülün hidrodinamik çapının 671 nanometre ve polidispersite indeksinin 0,24 olduğunu göstermektedir. Bu ekran görüntüsü, SD F1 alfa DExT strand sülfat ozan partiküllerinin zeta potansiyelinin beş kez tekrarlanan ölçümünden birini göstermektedir.Zeta potansiyeli -24,7 millivolts'tur. S df one alpha dextran sulfate ozan partiküllerindeki S df one alpha miktarı SDS jel elektroforezi ile tahmin edilmiştir. Burada, SD F1 alpha standartları, dextran sulfate kaizan kontrol nanopartikülleri ve SD F1 alpha dextran sulfate kaizan nanopartikül örneklerinin yüklendiği, kumasi ile boyanmış bir SDS jeli gösterilmektedir.SD F1 Alpha Standart bantlarının yoğunluk analizinden standart bir eğri oluşturulmuştur; standart eğriden yapılan hesaplama, SDF bir alfa nanoparçacık örneğindeki S DF bir alfa konsantrasyonunun 0.03 mg/mL olduğunu göstermektedir. Nanoparçacıklardan S DF bir alfa'nın in vitro salınım hızını belirlemek için, süpernatanttaki salınmış S DF bir alfa miktarı ve peletlerdeki parçacığa bağlı sdf bir alfa miktarı, bir SDS jelinin Coomassie boyaması ve ardından sitometri analizi ile belirlenmiştir. Parçacığa bağlı S DF bir alfa'nın aktivitesi, bir migrasyon deneyi ile ölçülmüş ve burada gösterildiği gibi serbest SDF bir alfa ile karşılaştırılmıştır.Partiküle bağlanmış SDF one alpha, ölçülen tüm konsantrasyonlarda serbest s DF one alpha ile aynı düzeyde migrasyonu indüklemiştir. Bu prosedür uygulanırken, glikan protein partiküllerinin formülasyonunun değiştirilebileceğinin unutulmaması önemlidir. Spesifik uygulamaya bağlı olarak, diğer proteinler dahil edilebilir ve partikül boyutunu değiştirmek için farklı formülasyonlar kullanılabilir.Bu videonun, nanoparçacıkların toplanmasının hazırlanmasındaki temel teknikleri ve ardından bünyeye katılan SDF one alpha'nın fonksiyonel analizini gösterdiğini umuyoruz.

preparation-characterization-sdf-1-chitosan-dextran-sulfate

Research

JoVE Journal

Chemistry

Kimya

Mevcut kök hücre tedavilerinde büyük bir engel konak dokularına bu hücrelerin sunmak için en etkili yöntem belirlemektir. Adipoz kaynaklı kök hücreler kendi multipotency korumasını sağlarken Burada, verimli ve yaklaşım, basit bir kitosan tabanlı dağıtım yöntemi açıklar.

Kök Hücre yüklü Chitosan Mikrokürelerin teslimi için bir Kollajen Hidrojel oluşturma

Bu protokol çevreleyen hücre dışı matriks gelen ipucu almak ve birden fenotipleri farklılaşması için indüklenebilir kök hücrelerin doğal yeteneği kullanılmasına odaklanmıştır. Bu yöntemler yazının aynı anda yağ kaynaklı kök hücreleri birlikte ayırt etmek için, PEG-fibrin ve kollajen oluşan iki katmanlı hidrojel kullanan bir model, bizim ve nitelendirilmesi...

ASC farklılaşma kontrol için bir iki tabakalı Hidrojel mühendislik

Ücretsiz çözelti kapiler elektroforezi, kimyasal reaksiyonların gerçek zamanlı olarak kantitatif olarak izlenmesini sağlayan hızlı, ucuz ve sağlam bir analitik yöntemdir. Hızlı, kullanışlı ve hassas analiz için faydası, burada gelişmiş hücre yapışması için kitosan filmler üzerine kovalent peptit aşılamasının analizi yoluyla gösterilmiştir.

Kapiler Elektroforez Real Time Kitosan Films üzerine Peptit Aşılama Monitör

Basit homojenizasyon, sinir büyüme faktörünü kapsüllemek için yeni, yüksek yoğunluklu, lipoprotein-taklit nanoparçacıklar hazırlamak için kullanıldı. Bu makalede, nanoparçacık hazırlığı, in vitro karakterizasyon ve in vivo çalışmalar için zorluklar, ayrıntılı protokoller anlatılmıştır.

Sinir Büyümesi Faktörü Kapsüllemesi için Yeni HDL&#39;yi taklit eden Nanopartiküllerin Hazırlanması ve Karakterizasyonu

Burada facile hazırlanması enjekte edilebilir hydrogels kitosan tabanlı dinamik imin kimya kullanarak açıklar. Hidrojel'ın mekanik mukavemeti ve 3D hücre kültürü kendi uygulamasında ayarlamak için yöntemleri sunulmaktadır.

Kitosan-esaslı enjekte edilebilir Hydrogels ve kendi uygulamasında 3D hücre kültürü hazırlanması

Burada, plasental kondroitin sülfat A bağlama peptid (plCSA-BP) sentezi için bir iletişim kuralı mevcut-Birleşik lipid-polimer nano tanecikleri ile tek adım sonication ve bioconjugate teknikleri. Bu parçacıklar tedavi hedeflenen teslimat en insan tümörleri ve kanserleri ve plasental bozuklukları tedavisinde plasental trophoblasts için bir roman araç oluşturmaktadır.

Sentez ve karakterizasyonu plasental kondroitin sülfat (plCSA) - Lipid hedefleme - polimer nano tanecikleri

Bu makalede falcarindiol lipid kaplı 74 nm nano tanecikleri encapsulation. Nano tanecikleri lipid damlacıkları içine insan kök hücreleri tarafından hücresel alımını floresan ve confocal görüntüleme tarafından izlenir. Nano tanecikleri değişen solvent hızlı enjeksiyon yöntemiyle cihazlarında ve büyüklükleri dinamik ışık saçılma tekniği ile ölçülür.

Falcarindiol tarafından insan mezenkimal kök hücre içeren yeni Lipid kaplı nano tanecikleri alımını

Donma-eritme yöntemi çapraz ajanlar olmadan chitosan-poly (vinil alkol) hidrojeller üretmek için kullanılır. Bu yöntem için, elde edilen hidrojellerin özelliklerini ve uygulamalarını etkileyebilecek donma koşulları (sıcaklık, çevrim sayısı) ve polimer oranı göz önünde bulundurulması önemlidir.

Crosslinking Ajanlar ve Diflunisal Salınım Çalışmaları olmadan Chitosan-Poly(vinil alkol) Hydrogels hazırlamak için Bir Freeze-Eritme Yöntemi

Bu çalışma, özel ekipman gerektirmeyen kimyasal tekniklerle kitini bir köpüğün içine genişletme yöntemini açıklar.

Genişletilmiş Kitin Köpüklerinin Hazırlanması ve Sulu Bakırın Çıkarılmasında Kullanımı

Mevcut protokol, kitosan-genipin mikrojellerinin üretimi için emülsiyon bazlı olmayan bir yöntemi tanımlamaktadır. Bu mikrojellerin boyutu hassas bir şekilde kontrol edilebilir ve pH'a bağlı şişlik gösterebilir, in vivo olarak bozulabilir ve zamanla sürekli bir şekilde salınan terapötik moleküllerle yüklenebilir, bu da onları doku mühendisliği uygulamaları için oldukça alakalı hale getirir.

Doku Mühendisliği Uygulamaları için Boyut Kontrollü ve Emülsiyonsuz Kitosan-Genipin Mikrojellerinin İmalatı

Keşfedin SDF-1α-kitosan-dekstran sülfat nanopartiküllerinin hazırlanması ve karakterizasyonu yöntemini. Nanopartikül boyutu, zeta potansiyeli ve SDF-1α aktivitesi ölçülerek kök hücre tedavileri için etkili bir taşıyıcı sistem geliştirilir.

SDF-1α-Kitosan-Dekstran Sülfat nano partiküllerin hazırlanması ve Karakterizasyonu

Daha fazla video keşfet