SDF-1α-Kitosan-Dekstran Sülfat nano partiküllerin hazırlanması ve Karakterizasyonu

Aşağıdaki deneyin genel amacı, SD F1, Alpha Chias ve dekstran sülfat nanopartiküllerini hazırlamak ve karakterize etmektir. Nanopartiküllerin hazırlanması, önce kök hücre hedef arama faktörü stromal hücre türetilmiş faktör bir alfa veya S df bir alfa'nın negatif yüklü glikana bağlanmaya izin vermek için dekstran sülfat ile karıştırılmasıyla elde edilir. İkinci adım olarak, karışıma pozitif yüklü bir glikan eklenir ve dekstran sülfat ile bir poli elektrolit kompleksi oluşturulur.

Daha sonra, kompleksleri çinko köprüleri ile stabilize etmek için çinko sülfat eklenir. Ortaya çıkan parçacık, negatif yüklü bir kabuk ile çevrili yoğun bir çekirdeğe sahiptir. Parçacıklar daha sonra boyutları ve zeta potansiyellerinin yanı sıra nanopartiküllerdeki S df bir alfa içeriği ve aktivitesi için ölçülür SDF bir alfa glikan nanopartiküllerinin ana avantajı, dahil edilen SDF bir alfanın partiküllerden salınmadan tamamen aktif olmasıdır.

Bu nedenle, parçacıklar kök hücre tedavisinde sabit bir hermin sinyali olarak hizmet etmek için yararlı olabilir. Başlamak için, metin protokolünde açıklandığı gibi stok çözeltileri hazırlayın ve bunları 0,22 mikron filtre membranları ile sterilize edin. Hazırlanan solüsyondaki endotoksin seviyelerini ulu amip site lizat jel pıhtı testi ile değerlendirin.

Seviyelerin mililitre başına 0.06 endotoksin biriminden az olduğundan emin olun. Daha sonra 0.18 mililitre ultra saf suya, manyetik bir karıştırma çubuğu içeren 1.5 mililitrelik bir cam şişeye. Karıştırma hızını 800 RPM'ye ayarlayın, ardından 0.1 mililitre %1 dekstran sülfat ekleyin ve iki dakika sonra karıştırın.

0.08 miligram SD F1 alfa ekleyin ve 20 dakika karıştırın. Damla damla 0.33 mililitre %0.1 tizen ekleyin ve beş dakika karıştırın. Karıştırma hızını maksimuma getirin ve gaz geçirmez bir şırınga ile yavaşça 0,1 mililitre çinko sülfat ekleyin.

Karıştırma hızını 800 RPM'ye getirin ve 30 dakika karıştırın. Sonra 0.4 mililitre% 15 mannitol ekleyin ve beş dakika sonra karıştırın. Reaksiyon karışımını 1.5 mililitrelik bir füge tüpüne aktarın ve 16.000 Gs ve dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin.

Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı aspire edin ve sıvının son damlasını çıkarmak için bir pipet kullanın. Yavaşça 0,2 mililitre% 5 mannitol ekleyin ve peleti 0,5 mililitre 29 gauge iğne şırıngası ile askıya alın. Ardından santrifüjlemeden önce bir mililitre daha %5 manitol ekleyin.

15 dakika boyunca 16.000 GS'de ikinci kez. Resus süspansiyon santrifüjleme işlemini tekrarladıktan sonra, süpernatanı aspire edin ve peleti 0.2 mililitre% 5 mannitol içinde yeniden süspanse edin. Parçacık boyutu ve zeta potansiyeli, sırasıyla dinamik ışık saçılımı ve elektroforetik ışık saçılımı ile analiz edilir.

Başlamak için, dinamik ışık saçılımı yoluyla partikül boyutu ölçümüne yönelik parametreleri içeren SOP listesinden bir işlem prosedürü seçin. Metin protokolünde listelendiği gibi, SD F1 alfa parçacık örneğini suyla seyreltin. Daha sonra 100 mikrolitre numuneyi Einor Q Vet gibi tek kullanımlık bir UV Q Vet'e yükleyin.

Q vet'i hücre tutucusuna yerleştirin ve veri toplamaya başlamadan önce yoğunluk ayarının optimuma ulaşmasını bekleyin. Ölçüm tamamlandıktan sonra, çap ve poli dağılım indeksinin kümül sonuçlarını kaydedin. Tekrarlanan dört okumanın her birinden elde edilen sonuçların ortalamasını alın ve elektroforetik ışık saçılımı yoluyla zeta potansiyelinin ölçümü için standart sapmayı hesaplayın.

On kat seyreltilmiş partikül numunesinden 500 mikrolitre akış hücresine yükleyin. Metin protokolünde listelendiği gibi ölçüm parametrelerini içeren Zeta potansiyel SOP listesinden bir işlem prosedürü seçin. Zeta potansiyelinin sonuçlarını kaydedin.

Ardından, tekrarlanan beş okumanın her birinden elde edilen sonuçların ortalamasını alın ve standart sapmayı hesaplayın. Seyreltilmiş serbest ve parçacıklı SD F1 alfa örneklerini laly örnek tamponunda 100 santigrat derecede 10 dakika ısıtın. Numuneleri iki dakika oda sıcaklığına soğuttuktan sonra partikülleri tamamen ayırmak için 10 dakikalık ısıtma sırasında numuneleri iki kez vorteksleyin, santrifüj, su yoğuşma girdabını tekrar iyice karıştırmak için 0.5 ila bir dakika boyunca 10.000 G'ye sahipti.

Bu noktada, numune çözeltisi görünür bir çökelti olmadan berrak olmalıdır. Ardından, oyuk başına 10 mikrolitre numuneyi %dört ila 20 sodyum ESAL sülfat veya SDS jeline yükleyin. Jeli kumasi mavisi protein boyası ile boyamadan önce 20 dakika boyunca 200 voltta elektroforez çalıştırın.

Bir moleküler görüntüleyici ve dansitometri analiz yazılımı kullanarak SD F1 alfa'nın protein bandı yoğunluğunu inceleyin. İn vitro salım tahlilini gerçekleştirmek için serbest SDF bir alfa standartlarıyla oluşturulmuş standart bir eğriye karşı parçacıklardaki S, DF, bir alfa alfa miktarını hesaplayın, SD F1 alfa glikan parçacıklarını dokos, fosfat, tampon, serum fizyolojik ile kalsiyum ve magnezyum içermeyen tuzlu su ile karıştırın veya bire bir oranda. Parçacık süspansiyonunu 1,5 mililitrelik tüplerde 0,05 mililitrelik alikotlara bölün.

Numuneleri tüplerin dibine yükleyin. Hava kabarcıkları sokmaktan veya sıvının yüzeyini rahatsız etmekten kaçının. Tüplerin üstünü paraform ile kapatın.

Daha sonra tüpleri dönen bir mikro tüp karıştırıcı üzerinde 37 santigrat derecede döndürün. Belirlenen zamanlarda tüplerden alikotları çıkarın ve santrifüjlemeyi takiben numuneleri hemen 16.000 G'de 10 dakika boyunca dört santigrat derecede santrifüjleyin. Süpernatanları ve peletleri ayırın.

Daha sonra peleti 0,05 mililitre DPBS ile sulandırın. Tüm numuneler toplandıktan sonra, bir SDS jeli üzerindeki süpernatanları ve peletleri inceleyin. Daha önce olduğu gibi, bu test S df'nin kemotaktik aktivitesini ölçer.

S df bir alfa'nın reseptörü ile bir alfa etkileşimi, hücrenin SD F1 alfa gradyanına doğru göçüne neden olur. Seyreltik serbest veya parçacığa bağlı form SD F1 alfa'yı, metin protokolünde listelenen nihai konsantrasyonlara üç katlı bir seri seyreltmede migrasyon tamponu ile başlatmak için. Negatif kontrol için 24 oyuklu plakadaki bir kuyuya 0.6 mililitre seyreltilmiş SD F1 alfa çözeltisi ekleyin.

Aynısını migrasyon tamponu için de yapın, ancak daha sonra giriş hücresi kontrolü için bir kuyuya 0,57 mililitre migrasyon tamponu ekleyin. Plakayı 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Daha sonra, transwell gibi geçirgen bir hücre kültürü ekini alt kuyu yükünün üzerine, 0.1 mililitre şapka hücresinin transwell ekine yerleştirin.

Ardından 0,03 mililitre hücreyi doğrudan giriş hücresi kontrolüne yükleyin. Plakayı% 5'lik bir karbondioksit inkübatöründe iki saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyonun ardından, hücre kültürü eklerini çıkarın.

Alt kuyucuklara göç eden hücreleri dört mililitrelik bir polistiren tüpe aktarın. Taşınan hücreleri bir akış sitometresi ile sayın. Son olarak, negatif kontrollerdeki sayıların çıkarılmasından sonra göçü giriş hücresi sayısının yüzdesi olarak hesaplayın.

Burada SD F1 alfa dekstran sülfat ozan partikül boyutu ölçümünün analizi gösterilmektedir. CUMUL sonucu, parçacığın hidrodinamik çapının 671 nanometre ve poli dağılımının 0.24 olduğunu gösterir. Bu ekran görüntüsü, SD F1 alfa DExT iplikçik sülfat ozan parçacıklarının zeta potansiyelinin tekrarlanan beş ölçümünden birini göstermektedir.

Zeta potansiyeli eksi 24.7 milivolttur. S df bir alfa dekstran sülfat ozan partiküllerindeki S df bir alfa miktarı SDS jel Elektroforezi ile tahmin edilmiştir. Burada, SD F1 alfa standartları dekstran sülfat kaizan kontrol nanopartikülü ve SD F1 alfa dekstran sülfat kaizan nanopartikül numuneleri yüklenmiş kumasi lekeli bir SDS jeli gösterilmektedir.

SD F1 Alfa Standart bantlarının yoğunluk analizinden standart bir eğri oluşturulur, standart eğriden yapılan hesaplama, SDF bir alfa nanopartikül numunesindeki S DF bir alfa konsantrasyonunun mililitre başına 0.03 miligram olduğunu gösterir. Nanopartiküllerden S DF bir alfa'nın in vitro salınım oranını belirlemek için, süpernatta salınan S DF bir alfa miktarı ve peletlerdeki partikül bağlı sdf bir alfa miktarı, bir SDS jelinin kumasi boyaması ve ardından sitometri analizi ile belirlendi. Parçacığa bağlı S DF bir alfanın aktivitesi, bir migrasyon tahlili ile ölçülür ve bununla karşılaştırıldığında, burada gösterildiği gibi serbest bir SDF bir alfa yapılır.

Parçacığa bağlı SDF bir alfa, ölçülen tüm konsantrasyonlarda serbest bir s DF bir alfa ile aynı derecede göçü indükledi. Bu prosedürü denerken, glikan proteini parçacıklarının formülasyonunun değiştirilebileceğini hatırlamak önemlidir. Spesifik uygulamaya bağlı olarak, diğer proteinler dahil edilebilir ve partikül boyutunu değiştirmek için farklı formülasyonlar kullanılabilir.

Bu videonun, nanopartiküllerin toplanmasının hazırlanmasındaki temel teknikleri ve ardından dahil edilen SDF bir alfa'nın fonksiyonel analizini göstermesini umuyoruz.