Kelvin Probe Kuvvet Mikroskobu kullanılarak Bakterilerin Yüzey Potansiyel Ölçümü

Aşağıdaki deneyin genel amacı, farklı materyal substratlara tutunma sonrası hücre zarı yükündeki değişimleri gözlemlemektir. Bu, mikroorganizma sayılarını artırmak için besin açısından zengin bir ortamda kültürleme yapılarak gerçekleştirilir. Ardından, mikroorganizmaların tutunacağı materyal yüzeyleri temizlenir ve optimal mikrobiyal tutunma oranları için fonksiyonelleştirilir.

Ardından, Kelvin prob kuvvet mikroskobisi veya KPFM görüntülemesine olanak sağlamak amacıyla mikroorganizmalar çeşitli malzeme altlıklarına ekilir. Sonuçlar, malzeme altlığı tipinin ve onun doğal yükünün, hücre membran yükündeki ve hücre tutunmasındaki değişimlerle görüldüğü üzere hücre aktivitesi üzerinde etkili olduğunu göstermektedir. Bu tekniğin elektroforetik, ışık saçılımı ve izoelektrik nokta belirleme gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, KPFM'nin tüm kültürler veya koloniler yerine tekil hücrelerin ve biyofilmlerin yükünün incelenmesine olanak tanımasıdır.

Bu yöntem, hücreden hücreye ve biyofilm elektriksel özelliklerini yüksek doğruluk ve hassasiyetle karşılaştırmak istendiğinde faydalıdır. Başlamak için, %5 koyun kanlı agar plakları hazırlayın, MRSA bakterilerini hazırlanan plakalara ekin ve tekil, iyi izole edilmiş koloniler elde etmek için 37 derece Celsius'da 24 saat inkübe edin. %1 glukoz ve %0,1 sodyum klorür ile takviye edilmiş 500 mililitre triptik soy bulyonu hazırlayıp otoklavlayın; beraberinde iki temiz cam test tüpü ve bir kutu bir mililitrelik pipet ucu bulundurun.

Besiyerinin ve deney tüplerinin bir biyogüvenlik kabininde veya bek alevi yanında soğumasına izin verdikten sonra, her bir deney tüpüne altı mililitre TSB pipetleyin. Daha önce hazırlanmış koyun kanlı agar plaklarından birini kullanarak, tüplerden birine tek bir MRSA kolonisi inoküle edin. Sterilliği sağlamak için ikinci tüpü negatif kontrol olarak kullanın; tüpleri bir orbital çalkalayıcı inkübatörde 24 saat boyunca 37 °C'de ve 200 RPM'de inkübe edin.

MRSA tüpünde üreme görülmeli veya kontrol test tüpünde hiçbir üreme olmamalıdır. Ardından, 24 saatlik kültürden bir mililitre kullanarak altı mililitre taze triptik soya broyunu inoküle ederek bir alt kültür oluşturun ve 37 °C'de, 200 RPM'de altı saat daha inkübe edin. Daha sonra kültürden bir mililitreyi bir santrifüj tüpüne pipetleyin ve 850 ×g'de üç dakika boyunca santrifüjleyin.

Süpinatörle çıkarın ve baskın eldeki pensle peleti iki kez deiyonize su ile yıkayın. 20 milimetrelik paslanmaz çelik bir FM örnek diskini tutun ve her iki tarafını temizlemek için beş mililitre deiyonize su kullanın. Temizlenen diskleri deiyonize su dolu bir behere yerleştirin ve sonikasyon işleminden sonra bir dakika boyunca sonike edin.

Örnek diskleri penset yardımıyla beherden çıkarın ve açık bir Petri kutusunun kenarına, kağıt havlu üzerine yaklaşık 60 derecelik bir açıyla yaslayın. Tamamen kurumaları için kutunun kapağını kullanarak kuruyan disklerin üzerini kapatın. Kuruma işlemi tamamlandığında, disk yüzeyini fonksiyonelleştirmek için diski bir Petri kutusuna aktarın. Biyogüvenlik kabini içerisinde, diskleri tutmak için penset kullanarak, disklerin üzerine 200 ila 400 µL %0,1 polyol lysine pipetleyin ve oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin.

Bu videonun önceki bölümlerinde gösterildiği gibi, bunları yıkamak için deiyonize su kullanın. Ardından, iki kez yıkanmış olan resüspande hücrelerden 200 ila 400 µL'yi kaplanmış örnek disklerinin üzerine ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe ettikten sonra, diskleri yıkamak için nazikçe 1 mL deiyonize su kullanın.

Kelvin Prob Kuvvet mikroskopisi görüntülemesi yapmadan önce disklerin gece boyunca kurumasına izin verin. Bilgisayarı, atom kuvvet mikroskobu veya AFM'ler, HEB ve MAC üç kontrolörü ile birlikte açın. Ulence P ovu overview gibi bir AFM görüntüleme yazılımı açın.

Aralıklı temas modunda görüntüleme için A-C-A-F-M veya doğru tanımı seçin. Baskın elinizde bir FM penseti kullanarak ve diğer elinizle yaylı klips tutucuyu açık tutarak, A-K-P-F-M konsolunu dikkatlice başlığa yerleştirin. Başlığı dikkatlice A FM'ye yükleyin; lazer ışığı ve sahne kaldırma motoru kablolarını bağlayın.

Ardından lazeri konsolun ucuna hizalayın. Lazeri konsolun ucuna hizalamak için, lazeri konsol çipinin üzerine getirmek amacıyla ön-arka düğmesini birkaç kez saat yönünde çevirin.

Lazer çipe ulaştığında, engellenecek ve artık görünmeyecektir. Ardından, lazer noktası tekrar görünene kadar ön-arka ayar düğmesini saat yönünün tersine döndürün. Lazer şu anda çipin kenarındadır.

Lazeri konsol üzerine konumlandırmak için sağa sola döndürme düğmesini çevirin. Lazer konsolun üzerinden geçerken, hızlı bir şekilde kaybolup yeniden belirecektir. Lazer noktası, fotodiyot ünitesinin daha sonra yerleşeceği buzlu cam kapakta görünür olmalıdır.

Buzlu cam üzerindeki nokta kaybolana kadar, ön-arka ayar düğmesini saat yönünün tersine çevirerek noktayı konsol boyunca uca doğru aşağı hareket ettirin. Şimdi, lazeri tam konsol ucuna yerleştirmek için ön-arka ayar düğmesini saat yönünde çok hafifçe çevirin; lazer noktası buzlu cam üzerinde yeniden belirecektir. Lazer hizalandıktan sonra, konsol ile numune arasında yeterli alan olduğundan emin olmak için sahne kaldırma motorunu 10 saniye boyunca açık konumda tutun.

Numuneyi AFM'ye yerleştirirken, numuneyi KPFM tablasının üzerine koyun. Numuneyi topraklamak için bakır tel kullanın ve AFM'den numune tablasına uygun kabloları bağlayın. Ardından, AFM yazılımı üzerinden tablayı AFM'ye bağlayın.

Yerleşme süresinin 10 milisaniyenin altında olduğundan ve yaklaşma hızlarının saniyede iki mikronu aşmadığından emin olun. Uç hasarını önlemek için ardından konsolu ayarlayın ve konsol ucunu numuneye doğru hareket ettirmeye başlayın. Konsol ucu numune yüzeyine ulaştığında, bir görüntüleme penceresi boyutu ve ideal görüntüleme alanı seçin; topografik görüntülemenin optimize edilmesi için integral ve proporsiyonel kazançları konsol set noktasıyla birlikte optimize edin.

Topografik görüntüleme optimize edildiğinde, KPFM modülünü FM modunda açın. Görüntüleme penceresini beş mikron çarpı beş mikron olarak, çözünürlüğü 512 x 512 olacak şekilde veya yavaş tarama hızlarında ayarlayın. FM KPFM ayarları için drive değerini %5 ile %10 arasına ayarlayın. Drive frekansını, 2 kHz bant genişliğinde, 1 ile 5 kHz arasına ayarlayın.

F-M-K-P-F-M için demir NP kazançlarını %0,3 olarak ayarlayın. KPFM görüntülerini elde ettikten sonra, görüntüleri analiz etmek ve bu video gösteriminde belirtilen ayarları kullanarak SP verilerini toplamak için görüntüleme sonrası işlem yazılımını kullanın. KPFM görüntüleri, hem paslanmaz çelik hem de altın yüzeyler üzerindeki 15 MRSA hücresinden alınmıştır. Burada toplanan görüntü türleri gösterilmektedir.

KPFM çift frekans kullanarak çalıştığı için, hücre yüzeyinin topografik görüntüleri ve elektriksel verileri eş zamanlı olarak toplanmıştır. Yüzey potansiyelindeki küçük değişimleri daha kolay ayırt edebilmek için yüzey potansiyeli haritalarına termal filtreler uygulanmıştır. Bu grafikte, mikrobiyal membran yüzey potansiyelini belirlemek için görüntüler analiz edilmiş ve ardından farklı substratlardaki büyümeleri karşılaştırmak için kullanılmıştır.

Çıplak paslanmaz çelik ve çıplak altın alt tabakaların yüzey potansiyeli taramaları, genel olarak negatif yüzey potansiyelleri göstermiştir. Polyol lizin kaplı paslanmaz çelik ve altın disklerin her ikisi de pozitif yüzey potansiyellerine doğru bir kayma sergilemiştir. MRSA hücre membran potansiyelleri, paslanmaz çelik ve altın yüzeyler arasında farklılık göstermiştir.

Paslanmaz çeliğin, negatif yüzey potansiyelleri gösteren altın alt katmandaki MRSA hücrelerine kıyasla, hücreler için önemli ölçüde daha büyük pozitif bir membran yüzey potansiyeli sergilediği görülmüştür. KPFM'nin tüm yeteneklerini göstermek amacıyla, paslanmaz çelik üzerindeki MRSA'nın basamak yüksekliği grafiğine bir örnek burada sunulmuştur. Bu grafik, alt katman yüzeyi ile mikrobiyal membran arasındaki yüzey potansiyeli farkını göstermektedir.

Bu videoyu izledikten sonra, farklı malzeme substrat yüzeylerinde elektrik yükünün mikrobiyal hücre tutunması ve aktivitesi üzerindeki etkilerini incelemek için Kelvin prob kuvvet mikroskopisinin nasıl kullanılacağına dair iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.