Kelvin Probe Kuvvet Mikroskobu kullanılarak Bakterilerin Yüzey Potansiyel Ölçümü

Aşağıdaki deneyin genel amacı, farklı malzeme substratlarına yapıştıktan sonra hücre zarı yükündeki değişiklikleri gözlemlemektir. Bu, mikroorganizmaların sayılarını artırmak için besin açısından zengin ortamlarda kültürlenmesiyle elde edilir. Daha sonra mikroorganizmaların yapışacağı malzeme yüzeyleri temizlenir ve optimum mikrobiyal bağlanma oranları için işlevsel hale getirilir.

Daha sonra mikroorganizmalar, Kelvin prob kuvveti mikroskobu veya KPFM görüntülemesine izin vermek için çeşitli malzeme substratları üzerine kaplanır. Sonuçlar, malzeme substrat tipinin ve onun doğal yükünün, hücre zarı yükündeki ve hücre yapışmasındaki değişikliklerle görüldüğü gibi hücre aktivitesi üzerinde bir etkiye sahip olduğunu göstermektedir. Bu tekniğin elektroforetik, ışık saçılımı ve izoelektrik nokta belirleme gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, KPFM'nin tüm kültürler veya koloniler yerine tek tek hücrelerin ve biyofilmlerin yükünün incelenmesine izin vermesidir.

Bu, hücreden hücreye ve biyofilm elektriksel özelliklerini yüksek doğruluk ve hassasiyetle karşılaştırmak istediğinizde faydalıdır. Başlamak için, %5'lik koyun kanlı agar plakalarını hazırlayın, MRSA bakterilerini hazırlanan plakalara çizin ve tek, iyi izole edilmiş koloniler oluşturmak için 37 santigrat derecede 24 saat kuluçkaya yatırın. %1 glikoz ve %0.1 sodyum klorür otoklav ile desteklenmiş 500 mililitre triptik soya suyu, iki temiz cam test tüpü ve bir kutu bir mililitre pipet yudumu yapın.

Ortam ve test tüplerinin bir biyogüvenlik kabini altında veya bir çörek ve brülör yakınında soğumasına izin verdikten sonra, her bir test tüpüne altı mililitre TSB pipetleyin. Önceden hazırlanmış koyun kanlı agar plakalarından birini kullanarak, tek bir MRSA kolonisini tüplerden birine aşılayın. Steriliteyi sağlamak için ikinci tüpü negatif kontrol olarak kullanın, tüpleri karşılıklı bir inkübatörde 37 santigrat derece ve 200 RPM'de 24 saat inkübe edin.

MRSA tüpü büyüme göstermeli veya kontrol test tüpünde hiçbir şey büyümemiş olmalıdır. Daha sonra, altı mililitre taze triptik soya suyunu aşılamak için 24 saatlik kültürden bir mililitre kullanarak bir alt kültür oluşturun ve altı saat daha 37 santigrat derece ve 200 RPM'de inkübe edin. Daha sonra kültürün bir mililitresini afus tüpüne pipetleyin ve üç dakika boyunca 850 kez G'de santrifüjleyin.

Supinatı çıkarın ve peleti baskın eldeki forseps ile iki kez yıkamak için deiyonize su kullanın. 20 milimetre paslanmaz çelik bir FM numune diski tutun ve her iki tarafı temizlemek için beş mililitre deiyonize su kullanın. Temiz diskleri deiyonize su kabına yerleştirin ve sonikasyonu takiben bir dakika boyunca sonikasyon yapın.

Numune disklerini beherden çıkarmak için forsepsleri kullanın ve bunları bir kağıt havlu üzerinde açık bir Petri kabının kenarına yaklaşık 60 derecelik bir açıyla yaslayın Tamamen kurutmak için, kurutma disklerini örtmek için tabağın kapağını kullanın. Kuruduktan sonra, diskin yüzeyini işlevsel hale getirmek için diski bir Petri kabına aktarın. 200 ila 400 mikrolitre% 0.1 poliol lizini bir biyogüvenlik kabinindeki disklere pipetleyin ve diskleri tutmak için forseps kullanarak bir saat boyunca inkübe edilmiş oda sıcaklığında pipetleyin.

Bu videoda daha önce gösterildiği gibi yıkamak için deiyonize su kullanın. Sonraki plaka, kaplanmış numune diskleri üzerine iki kez yıkanmış 200 ila 400 mikrolitre yeniden süspanse hücre. Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe ettikten sonra, diskleri yıkamak için nazikçe bir mililitre deiyonize su kullanın.

Kelvin Probe Force mikroskopi görüntülemesini gerçekleştirmek için görüntülemeden önce disklerin gece boyunca kurumasını bekleyin. Bilgisayarı atomik kuvvet mikroskobu veya AFM'ler, HEB ve MAC üç denetleyici ile birlikte açın. Ulence P ovu genel bakış gibi bir A FM görüntüleme yazılımını açın.

Aralıklı temas modunda görüntüleme için A-C-A-F-M veya doğru atamayı seçin. Baskın elinizde bir FM forseps kullanarak ve diğer elinizde yaylı klips tutucuyu açık tutarak, A-K-P-F-M konsolunu dikkatlice başlığa yerleştirin. Başlığı dikkatli bir şekilde A FM'ye yerleştirin ve lazer ışığı ve sahne kaldırma motoru kablolarını bağlayın.

Ardından lazeri konsolun ucuna hizalayın. Lazeri konsolun ucuna hizalamak için. Lazeri konsol çipinin üzerinde hareket ettirmek için önden arkaya düğmeyi birkaç kez saat yönünde çevirin.

Lazer çipe ulaştığında bloke olacak ve artık görünmeyecektir. Ardından, lazer noktası yeniden görünene kadar önden arkaya düğmeyi saat yönünün tersine çevirin. Lazer artık çipin kenarında.

Lazeri konsol üzerine yerleştirmek için soldan sağa düğmeyi çevirin. Lazer konsolun üzerinden geçerken, hızlı bir şekilde art arda kaybolacak ve yeniden ortaya çıkacaktır. Lazer noktası, foto diyot ünitesinin daha sonra oturacağı buzlu cam kapakta görünür olmalıdır.

Buzlu cam üzerindeki nokta kaybolana kadar noktayı konsoldan aşağıya uca doğru hareket ettirmek için önden arkaya düğmeyi saat yönünün tersine çevirin. Şimdi lazeri sadece konsol ucuna oturacak şekilde konumlandırmak için önden arkaya düğmeyi saat yönünde hafifçe çevirin, lazer noktası buzlu cam üzerinde yeniden görünecektir. Lazer hizalandıktan sonra, konsol ile numune arasında yeterli boşluk olmasını sağlamak için sahne kaldırma motorunu 10 saniye açık konumda tutun.

Numuneyi A FM'ye takarken, şimdi numuneyi KPFM aşamasına yerleştirin. Numuneyi topraklamak için bakır tel kullanın ve A FM'den gelen uygun kabloları s'ye bağlayın.ample. Ardından s'yi bağlayıntage A FM yazılımındaki A FM'ye.

Ayar süresinin 10 milisaniyeden fazla olmadığından ve yaklaşma hızlarının saniyede iki mikronu geçmediğinden emin olun. Uç hasarını önlemek için konsolu ayarlayın ve konsol ucunu numuneye doğru hareket ettirmeye başlayın. Konsol ucu bir numune yüzeyine ulaştığında, bir görüntüleme penceresi boyutu ve ideal görüntüleme alanı seçin, topografik görüntülemenin optimize edilmesi için konsol ayar noktasıyla birlikte göz ve P kazançlarını optimize edin.

Topografik görüntüleme optimize edildiğinde, KPFM modülünü FM modunda açın. Görüntüleme penceresini beş 12'ye beş 12 çözünürlük veya yavaş tarama hızlarıyla beş mikron x beş mikron olarak ayarlayın. FM KPFM ayarları için, sürücüyü beş ile %10 arasında ayarlayınSürücü frekansını iki kilohertz bant genişliği ile bir ile beş kilohertz arasında ayarlayın.

F-M-K-P-F-M için demir NP kazançlarını %0,3 olarak ayarlayınKPFM görüntülerini aldıktan sonra, görüntüleri analiz etmek ve bu video Gösteriminde belirtilen ayarları kullanarak SP verilerini toplamak için görüntüleme sonrası işleme yazılımını kullanın. KPFM görüntüleri, hem paslanmaz çelik hem de altın yüzeylerde 15 MRSA hücresinde çekildi. Burada toplanan görüntü türleri gösterilmektedir.

KPFM çift frekans kullanarak çalıştığından, hücre yüzeyinin topografik görüntüleri ve elektriksel verileri aynı anda toplandı. Yüzey potansiyelindeki küçük değişiklikleri daha kolay ayırt etmek için yüzey potansiyeli haritalarına termal filtreler uygulandı. Bu grafikte, mikrobiyal membran yüzey potansiyelini belirlemek için görüntüler analiz edildi ve daha sonra farklı substratlar üzerindeki büyümeyi karşılaştırmak için kullanıldı.

Çıplak paslanmaz çelik ve çıplak altın alt tabakaların yüzey potansiyeli taramaları, genel negatif yüzey potansiyellerini gösterdi. Poliol lizin kaplı paslanmaz çelik ve altın disklerin her ikisi de pozitif yüzey potansiyellerine kayma sergiledi. MRSA hücre zarı potansiyelleri paslanmaz çelik ve altın yüzeyler arasında değişmiştir.

Paslanmaz çelik, negatif yüzey potansiyelleri gösteren altın substrat üzerindeki MRSA hücrelerine kıyasla hücreler için önemli ölçüde daha büyük bir pozitif membran yüzey potansiyeli sergilemektedir. KPFM'nin tüm yeteneklerini göstermek için, burada paslanmaz çelik üzerinde MRSA'nın bir adım yüksekliği grafiği örneği görülmektedir. Bu, substrat yüzeyi ile mikrobiyal membran arasındaki yüzey potansiyeli farkını gösterir.

Bu videoyu izledikten sonra, elektrik yükünün mikrobiyal hücre bağlanması ve farklı malzeme substrat yüzeyleri üzerindeki aktivitesi üzerindeki etkilerini incelemek için Kelvin prob kuvveti mikroskobunun nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.