İnsanlar ve Mouse Periventriküler Doku Yanal ventrikülleri ve histolojik Karakterizasyonu 3D Modelleme

Aşağıdaki prosedürlerin genel amacı, ventriküler magalinin neden ve etkisinin araştırılmasına izin vermek için bir araç sağlamak ve ventriküler sistem sağlığının ve beyindeki önemli bariyer ve filtrasyon işlevlerinin incelenmesine izin veren teknikleri vurgulamaktır. Bu, ventriküllerin 3D rekonstrüksiyonlarını oluşturmak ve ventriküllerin apikal yüzeyinin en foss preparatlarını içeren postmortem doku, ikinci adım olarak fare beyninin koronal bölümlerinin veya insan beyninin MRI taramalarının toplanmasıyla elde edilir. Daha sonra, tüm ventrikül yüzeyindeki hücresel organizasyonun bir montajı hazırlanır ve ventrikülün 3 boyutlu modeli üzerinde, sağlam ek hücrelere karşı gliozis bölgelerini göstermek için işlenir.

Sonuçlar, ventriküllerin uzunlamasına 3D modellemesine dayanan ventrikül genişleme bölgelerini ve ventrikül astarının ek tematik hücre tabakasının artık sağlam olmadığı, ancak glial yara izleri ile değiştirildiği alanları göstermektedir. 3D modelleme verilerini immünohistokimyasal verilerle birleştirerek, ventrikül astarının hücresel bileşiminin 3D bölgeye özgü bir haritası oluşturulabilir. Bu tekniğin etkileri, beyin hasarı, Alzheimer hastalığı gibi nörodejeneratif hastalıklar ve normal yaşlanma gibi tedavilere veya teşhise kadar uzanır ve bunların tümü tipik olarak bir miktar ventrikül genişlemesi ve dolayısıyla muhtemelen ventrikül yüzey skolyozu gösterir.

Laboratuvarımızdan Richard Wolffer ve lisans öğrencisi Richard Wolffer tarafından yapılacak işlemler ve postmortem insan dokusu kullanılarak gerçekleştirilen işlemler farede gösterilecektir. Şu anda bir tıp öğrencisi ve Rebecca Chu, laboratuvarda yüksek lisans öğrencisi. Protokolün yazılı kısmında belirtildiği gibi fare beynini sabitleyerek, kesit alarak, immün boyamayı ve monte ederek görüntülenecek slaytları hazırlayın Prosedüre başlamak için, fare lateral ventriküllerini izlemek, dik floresan mikroskobunu ve bilgisayarı açmak için, mikroskop otomatik bir aşama ve bir dijital CCD kamera ile donatılmalıdır.

Haritalama yazılımını floresan modunda başlatın, izleme için gereken araç çubuklarını ve yerleştirme havuzu panellerini yüklemek için ekran seçeneklerini açın. Ardından, seçenekler'e tıklayın, seçenekleri görüntüle donatıları'nı tıklayın ve aynı menüden ana ve işaretleyici araç çubuklarını seçin. Havuz panellerini yerleştirme altında, kamera histogramı, çok kanallı kontrol, kamera ayarları ve görüntü alımı'nı seçin.

Ek hücreleri etiketleyen güçlü S 100 beta floresansına dayalı olarak lateral ventrikülleri içeren ilk doku parçasını tanımlayın. Lateral ventrikülün astarlanması. Kesit alma sırasında yapılan küçük kesiyi tanımlayarak sol ve sağ hemisferleri yönlendirin.

Şimdi yeni bir veri dosyası oluşturun ve sol lateral ventrikülün üzerindeki görüntü penceresine tıklayarak sahne hareketi için bir referans noktası belirleyin. Bu referans noktasını, izleme dosyaları boyunca lateral ventriküllere göre tutarlı bir konumda tutun. Seri rekonstrüksiyon için konturları içe aktarırken yardımcı olması için, kontur açılır menüsünden uygun ön ayarlı kontur tipini seçin.

Sol ve sağ lateral ventrikül izlerinin her biri için benzersiz bir renk kullanın. Şimdi ventrikülün konturunu izlemek için ek astarın tüm apikal yüzeyi boyunca tıklayın. Ok tuşlarını kullanarak izleme penceresini hareket ettirin.

Konturu izledikten sonra sağ tıklayın ve konturu kapat'ı seçin. Farklı bir renk kullanarak sağ ventrikül için izlemeyi tekrarlayın. Ardından, soldaki işaretçiler araç çubuğundan uygun işaretçiyi seçin ve 3D rekonstrüksiyon için seri konturları hizalamaya yardımcı olmak üzere izleme ekranına orta çizgi boyunca bir işaretçi bırakmak için tıklayın.

İkinci bir işaret yapmak için bu prosedürü tekrarlayın. Dosya Veri dosyasını farklı kaydet'i seçerek doku izlerini kaydedin ve yeni bir klasör ve dosya adı oluşturun, seri bölümlerden izlerin kolay tanımlanması için izlemeleri konvansiyonel slayt numarasına, çizgi doku numarasına göre numaralandırın. Ardından, ventrikül içeren tüm bölümler için gösterilen prosedürü tekrarlayın.

Lateral ventrikül 3D rekonstrüksiyonunu gerçekleştirmek için. 3D rekonstrüksiyon programını açın. Ardından dosya Aç'a tıklayın ve ilk izleme seri bölümünün kontur dosyasını seçin.

Sol ve sağ ventrikülün tüm kontur izlerinin yanı sıra eklenen işaretçileri de içe aktarın. Konturları protokolün yazılı kısmındaki talimatlara göre hizalayın. Ardından sol paneldeki tüm konturları seçin ve ardından son 3D rekonstrüksiyonu görüntülemek için 3D görselleştirme düğmesine tıklayın.

Bu görüntü, S 100 beta immünoreaktif ek hücreler tarafından özetlenen lateral ventrikülleri içeren koronal fare beyin bölümünü göstermektedir. Yıldız işareti, lateral ventrikülleri gösterir. Parantezler yapışmayı tanımlar ve ölçek çubuğu 500 mikronu temsil eder.

Fare lateral ventrikülleri konturlar olarak izlenir ve alt segment bölümleri olarak düzenlenir. İntraventriküler bölgeler hacimsel analize müdahale etmekten elimine edilir. Bu görüntü, lateral ventrikül konturlarının son 3D rekonstrüksiyonunu göstermektedir.

Sarı renk, lateral ventrikülleri içeren ilgi bölgesini kapsayan tüm beyin hacimlerinin konturunu temsil eder. Corona dilimlenmiş beyin dokusunun 3D ventrikül rekonstrüksiyonlarının nasıl oluşturulacağını iyi anlamalısınız Protokoller, lateral ventriküllerin 3D görüntü rekonstrüksiyonu ve hacimsel kantifikasyonunu oluşturmak ve uzunlamasına kaplama analizi kullanarak zaman içindeki hacimsel değişiklikleri değerlendirmek için listelenmiştir, MR'de tutarlılığa dikkat etmek önemlidir. R veri toplama ve edinim sonrası işleme, veri kümelerinin dahil edilmesi için son derece önemli kriterlerdir Ventriküler segmentasyonu gerçekleştirmek için, yüksek çözünürlüklü T bir ağırlıklı MR görüntülerinden ventrikülleri segmentlere ayırmak için ITK SNAP kullanılır. Programı başlattıktan sonra gri tonlamalı görüntüyü açın, istediğiniz dosyayı seçin ve şık bir dosya olarak açın.

Daha sonra her anatomik düzlemde ilerleyin ve burun bölgeleri, büyük veya küçük temporal boynuzlar veya benzerleri gibi ventriküler anormallikleri not edin. Ana araç kutusunun ardından, yılan, ROI aracı'nı tıklayın. Ardından 3D'yi segmentlere ayırın ve yoğunluk bölgesi seçeneğini seçin.

Şimdi ön işlem görüntüsüne tıklayın ve yukarıdan seçin. Kaydırma çubuğunu kullanarak maksimum yoğunluğu kaydedin. Ardından eşiği maksimum yoğunluğun %15'ine ayarlayın ve bu değeri kaydedin.

Bu, yatırım getirisini beyaz olarak vurgulamalıdır. Düzgünlük parametresini 10 olarak ayarlayın. Tamam'a tıklayın.

Sonra sonraki. Daha sonra, her ventriküle 10 ila 12 küçük boyutlu iki baloncuk ekleyin. İkisi ön frontal boynuzda, yedisi lateral ventrikül gövdesinin üst yüzeyi boyunca eşit aralıklı, biri oksipital boynuzda ve biri lateral ventrikülün temporal boynuzunda.

Ardından, parametreleri seçin ve eğrilik kuvvetini 0,4 olarak ayarlayın. Ardından aktif kontur evrimine başlamak için oynat sembolüne tıklayın. Şimdi yüzeyi görselleştirmek için ağı güncelle'ye tıklayın.

Ardından otomatik güncellemeyi kontrol edin. Lateral ventrikülün tüm alanları ilgilenilen bölgeye dahil edildiğinde segmentasyon sürecini durdurun. Üçüncü ventrikülün dahil edilmesinden kaçının.

Son olarak, bitir'e tıklayın ve segmentasyon sonuçlarını şık bir dosya formatı olarak kaydedin. Toplam ventrikül hacmini elde etmek için, segmentasyonu, hacmi seçin ve istatistikler, ayarlanmış renk etiketini kullanarak ventrikülün toplam hacmini elde edin. Bu segmentte, denekler içinde zaman içinde ventrikül hacmindeki değişiklikleri kalitatif ve kantitatif olarak göstermek için mango yazılımı kullanılarak uzunlamasına ROI'ler üst üste bindirilir.

Yazılımı açtıktan sonra, aç'a tıklayın, dosyayı açın, önceden kaydedilmiş şık dosyayı yükleyin. Görüntü dosyası yüklendikten sonra, dosya yükleme ROI'sine tıklayın ve temel ROI zaman noktasının ROI'sini yeşil olarak yükleyin. Dosya yükleme ROI'sine tıklayın ve ikinci ROI zaman noktasını kırmızı olarak yükleyin.

Dosya kaydetme ROI'yi seçerek uzunlamasına kaplamayı kaydedin, her görüntüye şu anda ekranda gösterilen kurala göre bir dosya adı atayın. Ardından, ITK snap'i açın. Ardından, boylamsal hacim verilerini elde etmek için görüntü birleştirilmiş ROI dosyasından segmentasyon yükünü seçerek birleştirilmiş ROI'yi gri tonlamalı bir görüntü yükü birleşik ROI olarak yeniden açın, aşağıdaki segmentasyon hacmini ve istatistiklerini çalıştırın.

Etiket bir kırmızı eşittir genişleme hacmi etiketi iki yeşil eşittir stenoz hacmi etiketi üç mavi eşittir baz hacmi, en fazla altı hafta boyunca% 10 Formin içinde sabitlenmiş ve 0.1 molar PBS dilimi ile iyice durulanmış sağlam bir yarım küre ile başlayarak, 1.5 santimetre kalınlığında koronal bölümler mikro cerrahi bir neşter kullanılarak büyük bir bıçak kullanılarak tüm yarım küre boyunca. Ventrikül duvarını bir santimetre derinliğinde inceleyin, tüm yan duvar için sürekli bir bölüm koruyun, boyama için uygun boyutta bölümler oluşturmak için duvarı gerektiği gibi alt bölümlere ayırın. Ventrikül duvarının karşı tarafındaki bölümü iyi bir şekilde çentikleyin.

Üst inferior oryantasyonu tanımlamak için immünohisto kimyası yapın ve bölümleri yazılı protokole göre monte edin. Bir diseksiyon dürbünü altında, mikrocerrahi bir bıçak bıçağıyla pimler kullanarak dokuyu sabitleyin, lateral ventrikül duvarının düzgün bir şekilde ince bir bölümünü oluşturun ve bir pemineti bir slayt üzerine bir kenara monte edin Slaytlar tamamen kuruduğunda, bölümleri immünofloresan konfokal mikroskopi ile inceleyin. Apikal yapışma için bir belirteç olan beta-katenin kullanımıyla belirlendiği gibi ventrikül yüzeyinde görüntüleme odak düzlemini ayarlayın.

Ek hücrelerin bağlantı proteinleri. Daha sonra, tüm ventrikül yüzeyini belgelemek ve monte etmek için ventrikül yüzeyindeki GFAP boyamaya göre hücre kapsamı ve yüzey astro gliozis bölgelerini tanımlayın. Seri görüntülerin bir montajını oluşturmak için tüm yüzeyin üst üste binen görüntülerini kullanın.

Adobe Photoshop'u açın ve üst üste bindirilecek görüntüleri seçmek için dosya otomatik olarak ortaya çıkan etkileşimli düzeni kullanın ve gerekirse manuel ayarlamalar yapın. Bozulmamış bir karikatür temsili oluşturmak için montajı izlemek için yeni bir katman oluşturun. Hücre kapsamına veya ventrikül yüzeyi G skolyozuna bağlı olarak, ventrikül duvarının haritasını yeniden oluşturmak için tüm bölümleri derleyin ve MRG rekonstrüksiyonunda ilgili bölgeye bağlanın.

Bu, insan MR görüntülerinin burada bir araya getirilmesidir. Lateral ventrikül kırmızı ile ilgilenilen bölge olarak tanımlanmıştır. Burada gösterildiği gibi 3D görüntü rekonstrüksiyonu, lateral ventrikülün hacimsel olarak ölçülmesine ve kalitatif olarak görselleştirilmesine izin verir.

Bu görüntü, yaşlı bir hastada longitudinal ventrikül genişlemesinin değerlendirmesini göstermektedir. Birden fazla noktadan alınan uzunlamasına MRG'ler, zaman içinde denekler içindeki ventrikül hacmi genişlemesini görselleştirmek ve ölçmek için hizalanabilir ve üst üste bindirilebilir. Bu son üç görüntü, insan lateral ventrikül yüzeyinin immünohistokimyasal değerlendirmesini ve bölgesel haritalamasını göstermektedir. Burada.

Beta katin ve boyama ile özetlenen sağlam ek hücrelerin alanları, yıldız işaretiyle gösterildiği gibi bir parke taşı görünümü gösterir ve GFAP boyama ile özetlenen ventrikül yüzeyindeki astro gliozis bölgelerinden noktalı bir çizgi ile ayrılır. Seri konfokal görüntüler, bölgesel bir montaj oluşturmak için üst üste bindirilir ve Adobe Photoshop veya ventrikül yüzeyindeki hücresel organizasyonun karikatür temsili kullanılarak izlenir. Montajın bu karikatür görüntüsü, ilgili MRI tabanlı 3D ventrikül rekonstrüksiyonunda ventrikül yüzeyine eşlenir.

Gösterildiği gibi, yeşil renk sağlam ataşmanı ve kırmızı gliozis alanlarını gösterir. Bu prosedürü gerçekleştirirken, hücresel bütünlüğün seri rekonstrüksiyonunu ve haritalamasını gerçekleştirmek için her doku örneğinin dikkatli bir şekilde belgelenmesi önemlidir. Bu prosedürü takiben, zaman içinde bölgeye özgü genişleme ile ilgili ek soruları yanıtlamak için lateral ventriküllerin alt segmentasyonu gibi diğer yöntemler uygulanabilir.