Kimyasal Genetik Etkileşimleri Hızlı Kimlik

Bu prosedürün genel amacı, ilgilenilen bir kimyasalın hedeflediği biyolojik süreçleri bulmak için maya hücrelerini kullanmaktır. Bu, önce maya için bir kimyasalın doz yanıt profilinin belirlenmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, öldürücü olmayan bir kimyasal doz ve bir kontrol plakası üzerinde maya geni nakavt suşlarının tam bir koleksiyonunu büyütmektir.

Daha sonra, kimyasala aşırı duyarlı olan maya mutantları tanımlanır. Bu liste, kimyasalı tolere etmek için gereken tüm genleri ortaya çıkarmak için biyoinformatik olarak analiz edilir. Son adım, deneyin biyolojik bir kopyasını düşük verimde gerçekleştirmektir.

Bu, bulunan herhangi bir kimyasal gen etkileşimini doğrular. Sonuç olarak, bu yüksek verimli kimyasal genetik tarama yöntemi, ilgilenilen kimyasalı tolere etmek için hangi gen ürünlerinin ve biyolojik yolların kullanıldığını göstermek için kullanılır. Bu tekniğin, sıvı kültürde barkodlu mutantların rekabetçi büyümesi gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, moleküler biyoloji tekniklerine gerek olmamasıdır.

Bu yöntem, yeni bir küçük molekülün ökaryotik hücrelerin büyümesini nasıl engelleyebileceği gibi kimyasal biyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Başlamak için, A-Y-E-P-D plakası üzerinde BY 4 7 4 1 hücreyi çizerek bir gece maya kültürü hazırlayın ve 30 santigrat derecede veya görünür koloniler oluşana kadar 48 saat inkübe edin. Koloniler hazır olduğunda.

Tek bir koloni seçerek ve steril bir kapta beş mililitre YEPD sıvı ortamını aşılayarak gece boyunca sıvı kültürler hazırlayın. Daha sonra sürekli döndürme veya çalkalama ile gece boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, test edilecek kimyasalın çeşitli dozlarını içeren katı agar ortamı hazırlayın.

Bunu yapmak için. İlk olarak, uygun bir çözücü içinde nihai konsantrasyonun 100 katı oranında ilgilenilen kimyasalın birkaç stok çözeltisini hazırlayın. Daha sonra test edilecek her konsantrasyon için üç mililitre erimiş YEPD agar'ı birkaç steril kültür tüpüne alikot edin.

Agarın katılaşmasını önlemek için agar içeren tüpleri 55 santigrat derecelik bir su banyosuna yerleştirin. Şimdi, 13'te test edilecek her bir kimyasal konsantrasyonu için, 100 x bileşiğin bir erimiş agar tex alikotuna beyaz salınımı, tüpü karıştırmak için iki ila üç saniye boyunca karıştırın ve daha sonra her tüpten bir mililitreyi 12 dünya plakasındaki çift kuyucuklara pipetleyin, plakanın gece boyunca oda sıcaklığında sertleşmesine izin verin. Ertesi gün, 10 mililitre YEPD sıvı ortamını iki mikrolitre doymuş gece maya kültürü ile aşılayın.

Daha sonra bu kültürün 25 mikrolitresini 12 balina plakasının kuyucuklarındaki kimyasal içeren agar üzerine pipetleyin ve steril cam boncuklar veya steril bir çubuk kullanarak eşit şekilde yayın. Plakanın alev altında kurumasını bekleyin ve ardından plakayı 48 saat boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin. Kuluçka süresi geçtikten sonra, kuyucuklardaki toplam koloni sayısını ve boyutunu değerlendirin.

Ekranda kullanmak için büyümeyi %10 ila 15'ten daha fazla engellemeyen öldürücü bir alt bileşik konsantrasyonu belirleyin. Delesyon mutant oranını, mililitre G dört 18'in mililitresi başına 200 mikrolitre içeren 16 YEPD agar plakası üzerinde çoğaltarak plaka başına 384 koloni yoğunluğunda tutun. Her üç ayda bir mikrobiyal dizileme robotik sistemi veya manuel sabitleme araçları kullanarak.

Plakaları gerekene kadar dört santigrat derecede saklayın. Daha sonra 250 mililitre YEPD agar ortamını aynı konsantrasyonda G dört, 18 veya beş agar plakası ile hazırlayın ve düz bir yüzeyde oda sıcaklığında gece boyunca soğumaya bırakın. Delesyon mutant koleksiyonunu içeren plakaları dört santigrat derecede depodan çıkarın ve plakaların oda sıcaklığına gelmesine izin verin.

Su damlacıklarının dizi üzerinde birikmesini ve dizi mutantlarının çapraz kontaminasyonunu önlemek için her plakanın kapağında oluşan yoğuşmayı gidermek için hassas bir görev mendili kullanın. Mikrobiyal dizi sabitleme robotunun, delesyon mutant dizisini 16 Petri kabında plaka başına 384 koloni yoğunluğundan dört Petri kabında plaka başına 1.536 koloniye yoğunlaştırmasını sağlayın. Diziyi gece boyunca 30 santigrat derecede inkübe ettikten sonra, kolonilerin kaynak plakalarından düzgün bir şekilde aktarılmasını sağlamak için diziyi inceleyin.

Diziye dahil edilmiş, silme mutant dizisinin doğru bir şekilde yoğunlaştırıldığına dair bir kılavuz görevi gören birkaç boş konum olacaktır. Bunlar, ilgilendiğiniz bileşimi içeren ortama çoğaltmak için kullanılan kaynak plakaları olacaktır. Birden fazla sabitleme için tek bir kaynak plakası kullanılabilir.

Ayrıca, birçok robot, her seferinde benzer sayıda mayanın aktarılmasını sağlayacak ofset özelliklerine sahiptir. Replika plaka silme mutant dizi onarımını kurmak için, sadece 700 mililitre kontrol aracı ve ilgilenilen kimyasalı içeren deneysel YEPD agar. Bu, testi üç nüsha halinde gerçekleştirmek için yeterlidir.

Kontrol ve deneysel agar kullanarak plakaları dökün. Her plakaya 50 mililitre ekleyerek. Bir plakayı tekrarlamak için robotu kullanarak plakaların düz, düz bir yüzeyde gece boyunca oda sıcaklığında soğumasına izin verin.

Çift mutant diziyi, deneysel olarak belirlenen konsantrasyonda kimyasallar içeren üç set plakaya ve ayrıca araç kontrolünü içeren plakaların sıfırlanmasına aşılayın. Tezgah üstündeki plakaları oda sıcaklığında toplam 24 ila 48 saat inkübe edin. Plakalar, kapağın çıkarılması ve yüzü aşağı bakacak şekilde düz yataklı bir tarayıcıya yerleştirilmesiyle 24 ve 48 saatlik inkübasyondur.

Görüntüleri en az 300 DPI çözünürlükte yakalayın. Alternatif olarak, görüntü yakalamak için bir dijital kamera kullanın. Bunu yapıyorsanız, plakaları koyu bir arka plan üzerine yüzü yukarı bakacak şekilde yerleştirin ve görüntü almak için kapakları çıkarın.

Ardından, bilyalı SGA araçları ve elek değirmeni dahil olmak üzere çeşitli açık kaynaklı programlardan birini kullanarak dizi koloni boyutlarının nicelleştirilmesini ve karşılaştırılmasını gerçekleştirin. Bu aşamada, birkaç maya delesyon mutantı, maya delesyon koleksiyonundan YEPD'ye istenen aşırı duyarlı mutantları çıkaran ilgilenilen kimyasala aşırı duyarlı olarak puan alacaktır. Mikrolitre başına 200 mikrogram G içeren Ager dört 18, koloniler oluşana kadar 30 santigrat derecede inkübe edilir.

Tanısal PCR ve Agel elektroforezi ile suşun genotipini doğruladıktan sonra, her suşla beş mililitre YPD sıvısını aşılayın ve gece boyunca 30 santigrat derecede döndürme veya çalkalama ile inkübe edin. Her kültürün OD 600'ünü ölçün ve her bir suşu steril damıtılmış suda bir OD 600'e seyreltin. Bunlar artık normalleştirilmiş maya kültürleridir.

Daha sonra, 100 mikrolitre normalleştirilmiş yabani tip 4 7 4 1 maya kültürü ile 96 oyuklu bir plakadan A kuyusuna dağıtın, kuyulara 100 mikrolitreye kadar yedi ek suş dağıtın, B bir ila H bir. Daha sonra, kuyulara 90 mikrolitre steril su dağıtın, A iki ila H iki ila altı ila H altı. Son olarak, normalleştirilmiş G heykellerinin bir ila 10 seyreltilmesinden oluşan bir dizi hazırlayın.

Çok kanallı bir pipet ile 10 mikrolitre birinci sütundan ikinci sütuna seri olarak pipetleyerek başlayın ve altı seyreltme yapılana kadar 96 oyuklu plaka boyunca devam edin. Daha sonra çok kanallı pipeti, YEP D'ler, kimyasal ve araç kontrolü içeren katı ortamlar üzerindeki bir ızgarada seyreltilmiş maya kültürlerinden iki ila beş mikrolitreye kadar kullanın. Plakaları inkübasyonu takiben 24 ila 48 saat boyunca uygun sıcaklıkta inkübe edin.

Plakaları inceleyin ve 24 ve 48 saatlerde BY 47 41 kontrol görüntü plakalarına göre seçilen mutantların kimyasala duyarlılığını karşılaştırın. Daha önce olduğu gibi, aşağıdaki resimler, kimyasalın subin inhibitör konsantrasyonunu belirlemek için prosedürden elde edilen sonuçları göstermektedir. İlk görüntü, bir ila 5.000 oranında seyreltilmiş ve artan beş floro urasil konsantrasyonlarında kaplanmış doymuş bir BY 4 7 4 1 kültürünün büyümesini göstermektedir.

10 mikromolar konsantrasyon, sub-in inhibitör doz olarak seçilir. Bu görüntü, beş fluro urasil içeren sıvı ortamdaki BY 4 7 41 hücrelerinin büyüme eğrisini göstermektedir. Dört hücrenin yaklaşık dört katı 10 ila dört hücre üç kopya halinde biriktirildi ve 22 saat boyunca her 10 dakikada bir beş florourasil ve optik yoğunlukların artan konsantrasyonları ölçüldü.

Yine 10 mikromolar dozun subin inhibitör doz olduğu görülebilir. Bu sonraki görüntüler, beş floro urasilin yeşil bir kimyasal genetiğinden elde edilen sonuçları göstermektedir. Burada, sağda 10 mikromolar beş Fluor urasil ve solda DMSO kontrolü içeren YPD agar üzerinde çoğaltılmış bir S sachar visier delesyon mutant dizisi gösterilmektedir.

Bu grafik, 10 mikromolar üzerindeki mutantların nispi büyümesi olan yeşil kimyasal genetiğin sonuçlarını göstermektedir. DMSO kontrolüne kıyasla beş Fluor urasil burada bir ışın konumuna göre sıralanır. Mutantların DMSO kontrolüne kıyasla 10 mikromolar, beş flora urasil üzerindeki nispi büyümesi, koloni büyüklüğü oranına göre sıralanır.

Her iki grafikte de 0,8'den küçük bir oran eşiği belirtilmiştir. Bu son görüntü, üç doğrulama testinin sonuçlarını göstermektedir. Solda DMSO kontrolünde, merkezde 10 mikromolar, beş floro UIL ve sağda %0.015 metil metan sülfonat üzerinde birkaç izole mutant suşun seri dilüsyonları büyütüldü.

Bu prosedürü denerken, maya lekelenme tahlilleri veya maya tetrad diseksiyonu gibi bağımsız bir metodoloji kullanarak herhangi bir sonucu doğrulamak için delesyon mutant dizisinin güvenilir bir kopyasıyla çalıştığınızdan emin olmanız önemlidir. Bu teknik, küçük molekül araştırmaları alanındaki bilim adamlarının, tomurcuklanan mayada sistem düzeyinde yaklaşımları kullanarak bir bileşiğin etki şeklini keşfetmeleri için etkili bir araç sağlar.