Name: Kimyasal Genetik Etkileşimleri Hızlı Kimlik Saccharomyces cerevisiae (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 13 s
Description: Öğrenin, Saccharomyces cerevisiae kullanarak kimyasal-genetik etkileşimleri hızlıca belirleme yöntemini. Bu maliyet etkin yaklaşım, belirli kimyasallara karşı tolerans için gerekli genleri ve biyolojik süreçleri ortaya çıkarır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

CJN laboratuarında Araştırma NSERC, Kanada Kanser Derneği Araştırma Enstitüsü (CCSRI) ve Kanada Meme Kanseri Vakfı (BC-Yukon Şubesi) faaliyet hibe tarafından desteklenmektedir.

NOT: Bu prosedür genel iş akışı, Şekil 2&#39;de belirtilmiştir. Büyüme inhibe edici Doz 1. belirlenmesi <ol><li> Maya, gece boyunca kültürün hazırlanması NOT: Bu protokolde kullanılan maya-özü-pepton-dekstroz büyüme ortamı (YEPD) standart tarifi 13 olduğunu. <ol><li> BY4741 (mata his3 Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) bir YEPD agar plakası üzerine hücreler üzerinden çizik ve 30 ° C de ya da görünür koloniler oluşana kadar 48 saat boyunca inkübe edilir. </li><li> Tek bir koloni ile steril bir kültür kabı içinde YEPD sıvı ortam 5 ml aşılayarak bir gecelik kültürler olarak hazırlanır. Sürekli dönme veya çalkalama ile 30 ° C&#39;de gece boyunca inkübe edin. Kültür tipik sabah (~ 2 × 10 8 hücre / ml) doygunluk ulaşacak. </li></ol></li><li> Katı ağar ortamının hazırlanması çeşitli kimyasal maddeyi ihtiva eden <ol><li> Birkaç stokları hazırlayınkimyasal, uygun bir çözücü içinde, 100x arzu edilen nihai konsantrasyonda test edilecek. Not: etkili konsantrasyonları kimyasal bağlıdır ve tecrübi olarak tespit edilmelidir. Yüksek mM düşük mcM gelen, yani; Başlangıçta geniş bir nihai konsantrasyon aralığını test etmek bu nedenle tavsiye edilir. </li><li> Kimyasal her bir konsantrasyonu için, bir kaç steril kültür tüpüne kısım erimiş YEPD agar 3 ml test edilecek. 55 ° C su banyosunda Yeri katılaşan tutmak için. </li><li> Test edilecek olan kimyasal her bir konsantrasyonu için, bir 12-çukurlu plaka içindeki çift havuzdan her bir çifti içine erimiş ortam, girdap karıştırmak için 2-3 saniye ve pipet 1 mi 100x bileşik 30 ul ekle. Yalnızca kontrol bir araç dahil emin olun. Plakalar oda sıcaklığında bir gece boyunca bekleyin. Herhangi bir ekstra medya atın. </li></ol></li><li> Forma kaplama hücreler <ol><li> Aşama 1 &#39;de olduğu gibi, gece boyunca büyütüldü doymuş bir maya kültürünün 2 ul ile YEPD sıvı ortam 10 ml inoküle.1.2. </li><li> Yuva başına seyreltilmiş maya kültürü 25 ul steril cam boncuklar veya çubuk ile düzgün biçimde yayılmış ve plaka, bir alev altında kurumasına izin plaka. 48 saat süre ile 30 ° C &#39;de plaka inkübe edin. </li><li> Plakalar üzerinde maya büyüme (koloniler hem toplam sayısını ve boyutunu) değerlendirir. Ekran gerçekleştirmek için daha fazla% 10 -15% gelişimini çoğunlukla inhibe etmemektedir bileşiğin bir alt öldürücü konsantrasyonunu belirleyin. </li></ol></li></ol> 2. Sistematik Kimyasal genetik Ekran <ol><li> Kaynak Plate silinmesi mutant-dizi Bakım (DMA) ve Hazırlık <ol><li> Gliserol stoklarından silme mutant diziler inşa ilgili ayrıntılı bilgi için Baryshnikova ark. 14 bakınız. Iptal mutantlarının plaka başına 384 koloni bir yoğunluğa dizilmiş edildikten sonra, DMA, 4 ° C&#39;de birkaç ay boyunca saklanabilir. Her birine büyüyen koloniler önlemek için G418 gerekli 200 ug / ml ihtiva eden YEPD agarı üzerinde çoğaltmaDiğer. NOT: Birden seri tekrarlamalı yavaş büyüyen suşlar kaybını önlemek ve baskılayıcı mutantlar görünümünü en aza indirmek için kaçınılmalıdır. Bu haploidlerin gibi koleksiyonları muhafaza eğer özellikle ilgilidir. </li><li> Robotik sistem arraying bir mikrobik kullanarak tüm çoğaltma kaplama adımları uygulayın. Alternatif olarak, manuel çivileme araçlarını kullanarak koloniler dizilmiş manipüle. NOT: maya silme toplama çeşitli ticari kaynaklardan haploidlerin ve diploid olarak kullanılabilir ve tipik olarak 96 oyuklu plakalar içinde gliserol stoklan halinde sevk edilir. </li></ol></li><li> Silme mutant dizi Yoğuşmalı <ol><li> G418, 200 ug / ml ihtiva eden YEPD agar ortamı 250 ml hazırlayın. G418 etkili konsantrasyon değişebilir ve her bir çok deneysel olarak test edilmelidir. </li><li> Plaka başına G418 200 ug / ml ihtiva eden YEPD agar 50 ml dökülerek beş YEPD agar hazırlayın. Dizi yoğuşmalı önce bu bir gün yapın ve plakalar oda sıcaklığında soğumaya bırakınerature gecede düz bir hatta yüzey üzerinde. NOT: Dört tabak 1.536-gerilme yoğunluğu toplanması için gerekli olacak, beşinci plaka ekstra olarak dökülür. </li><li> Plaka başına 384 koloni bir yoğunlukta mutant silme koleksiyonu içeren 16 Petri kapları çıkarın ve oda sıcaklığında (~ 1 saat) gelmek için izin verir. </li><li> Hassas bir görev silme kullanarak her plakanın kapak üzerinde oluşturulmuş olan herhangi bir yoğunlaşma silin. Su damlacıkları neden olabilir Aksi takdirde dizi ve dizilmiş mutantlar çapraz kontaminasyon biriken ediliyor. </li><li> Mikrobiyal dizi iğneleme robotu kullanarak, plaka başına 1.536 koloniler (4 Petri kapları) plaka başına 384 koloniler (16 Petri kapları) bir yoğunluktan DMA yoğunlaşmak. Plaka 1 pimleri 1. koloni yoğunlaştırılmış dizinin 1 sütun 1 satır böylece bu gerçekleştirin, plakanın 2 1. koloni 1 sütun 2, 2 ve sütun 1 satır plakanın 3 1. kolonisi satır, ve plakanın 4 1. koloni 2 satır içinSütun 2. </li><li> Gecede 30 ° C&#39;de konsolide dizi inkübe. </li><li> Kaynak plakalardan kolonilerin üniforma aktarımını sağlamak için dizi inceleyin. DMA doğru (Şekil 4A) yoğunlaşmış olan sağlamak için bir rehber olarak hizmet bilerek diziye dahil birçok boş pozisyonları, olacak. Not: Bu test bileşiği ihtiva eden ortam üzerinde çoğaltma kaplama için kaynak plakaları olacaktır. Tek bir kaynak plakası birden pinnings için kullanılabilir. Ayrıca birçok robotlar her zaman transfer ediliyor maya benzer numaraları sağlayacak bir mahsup özelliği, sahip olacaktır. </li></ol></li><li> Kopya plaka silme mutant dizisi <ol><li> Kontrol, 700 ml (yalnızca araç) ve deney ortam (kimyasal ihtiva eden) 700 ml hazırlayın. Bu üç nüsha olarak tahlil (koşul başına 12 plakaları, artı iki ekstra) gerçekleştirmek için yeterli. </li><li> Test kimyasal veya plaka başına denetimi içeren YEPD agar 50 ml dökün. Plakalar t izin vero düz bile yüzeyde gece boyunca oda sıcaklığında soğutun. </li><li> Çoğaltma plakasına robot kullanarak, deneysel belirlenen konsantrasyonda kimyasal içeren plakalar üç set yanı sıra araç denetimi içeren plakalar üç set üzerine DMA aşılamak. 24-48 saat süre ile, oda sıcaklığında inkübe edin. </li></ol></li></ol> 3. Görüntüleme Tabaklar ve Veri Analizi <ol><li> Inkübatör plakaları çıkarın ve oda sıcaklığında (~ 1 saat) önce görüntüleme gelmek için izin verir. Bu plakaları görüntüleme sırasında yoğunlaşmayı engeller. </li><li> Kapağı çıkarmadan ve bir düz yatak tarayıcı yüzü aşağı koyarak 24 ve 48 saat sonra görüntü plakaları. En az 300 dpi çözünürlükte görüntüler yakalayın. Alternatif olarak, görüntü yakalamak için bir dijital kamera kullanın. Bunu yaparken ise, yer plakaları karanlık bir arka plan üzerinde yukarı yüz ve görüntü kapakları kaldırın. NOT: Plakaların dosya formatı ve konumlandırma kullanılan miktar programına bağlıdır. </li&gt; <li> Ölçümlerini ve balony 15, SGAtools 16, ve ScreenMill 17 dahil olmak üzere birçok açık kaynak programları, birini kullanarak dizi koloni boyutları karşılaştırma yapın. </li></ol> Ekran 4. Doğrulama NOT: Bu aşamada çeşitli maya silmeleri mutantlar ilgi kimyasal olarak aşırı duyarlı atar. Bu kimyasal-genetik etkileşimler önümüzdeki iki şekilde valide edilmelidir. İlk duyarlı suşların kimliği PCR ile teyit edilmelidir. İkincisi, kimyasal duyarlılık bağımsız attı gerekir. Aşağıda belirtilen gerilme aşırı duyarlılık, maya biyoloji yaygın bir teknik doğrulamak için tespit tahliller yapmak için kısa bir protokoldür. <ol><li> Streak dışarı G418 200 ug / ml içeren YEPD agara maya silme koleksiyonundan (hipersensitif) mutantlar istenen. Koloniler oluşana kadar 30 ° C&#39;de inkübe edilir. Primerler göre diagnostik PCR ile soyun genotip doğrulamaÜreticinin protokolü. </li><li> Her bir suş için YEPD sıvının 5 ml inoküle ve dönme ya da çalkalama ile 30 ° C&#39;de gece boyunca inkübe edilir. </li><li> OD 600 ölçün ve steril dH 2 O. 600 = 1 OD her gerginlik sulandırmak Bunlar şimdi normalize maya kültürleri vardır. </li><li> 96 oyuklu bir plaka de A1 normalize yabani tip maya (BY4741), kültür, 100 ul koyun. Kuyular B1-H1 kadar yedi ek suşların 100 ul koyun. </li><li> A6-H6 ile kuyular A2-H2 steril dH 2 O 90 ul dağıtmak için bir çok kanallı pipet kullanın. Son olarak, normalleştirilmiş maya kültürlerinin 1:10 seyreltme serisi hazırlanır. Seri bir çok kanallı pipet ile sütun 2 sütun 1, 10 ul pipetleme başlayın ve altı seyreltme yapılana kadar 96 oyuklu plaka boyunca devam (yani, 10 0-10 -5). </li><li> Bir çok kanallı kullanarak bir tablo içinde seyreltilmiş maya kültürleri 2-5 ul aktarınKimyasal ve araç kontrolünü içeren YEPD katı ortama pipet. 24-48 saat için uygun sıcaklıkta inkübe edin. </li><li> Plakaları kontrol edin ve (BY4741 kontrole göre) kimyasal select mutantların duyarlılığını karşılaştırmak. Görüntü 24 de plakaları ve adım 3.2 olarak 48 saat. Not: ilgili gen ontolojilerinde veya fonksiyonlar ile bir kaç hiperduyarlı suşunun ekran geçerliliği güvenilir olmaktadır birlikte, genin vahşi tip bir kopyasını içeren bir plazmid ile aşırı duyarlı bir silme soyunun transformasyonu resmi bir gen kurmak için gerekli olan Çevrede silinmesi (ve gizli ikinci sitesi mutasyonlar) ilaç hassasiyeti neden olur. </li></ol>

<ol><li>Giaever, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+profiling+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome.</a> Nature. 418, 387-391 (2002).</li>
<li>Winzeler, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+the+S.+cerevisiae+genome+by+gene+deletion+and+parallel+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of the S. cerevisiae genome by gene deletion and parallel analysis.</a> Science. 285, 901-906 (1999).</li>
<li>Breslow, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+strategy+enabling+high-resolution+functional+analysis+of+the+yeast+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome.</a> Nat Methods. 5, 711-718 (2008).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+exploration+of+essential+yeast+gene+function+with+temperature-sensitive+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Systematic exploration of essential yeast gene function with temperature-sensitive mutants.</a> Nat Biotechnol. 29, 361-367 (2011).</li>
<li>Costanzo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+landscape+of+a+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The genetic landscape of a cell.</a> Science. 327, 425-431 (2010).</li>
<li>Parsons, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+chemical-genetic+and+genetic+interaction+data+links+bioactive+compounds+to+cellular+target+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Integration of chemical-genetic and genetic interaction data links bioactive compounds to cellular target pathways.</a> Nat Biotechnol. 22, 62-69 (2004).</li>
<li>Parsons, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+mode-of-action+of+bioactive+compounds+by+chemical-genetic+profiling+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Exploring the mode-of-action of bioactive compounds by chemical-genetic profiling in yeast.</a> Cell. 126, 611-625 (2006).</li>
<li>Hillenmeyer, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemical+genomic+portrait+of+yeast%3A+uncovering+a+phenotype+for+all+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes.</a> Science. 320, 362-365 (2008).</li>
<li>Hillenmeyer, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+genome-wide+fitness+data+in+yeast+reveals+novel+gene+function+and+drug+action%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of genome-wide fitness data in yeast reveals novel gene function and drug action.</a> Genome Biol. 11, R30(2010).</li>
<li>Smith, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Competitive+genomic+screens+of+barcoded+yeast+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Competitive genomic screens of barcoded yeast libraries.</a> J Vis Exp. (54), (2011).</li>
<li>Bowie, D., Parvizi, P., Duncan, D., Nelson, C. J., Fyles, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical-genetic+identification+of+the+biochemical+targets+of+polyalkyl+guanidinium+biocides%5BTitle%5D)+AND+%22Organic+%26+Biomolecular+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Chemical-genetic identification of the biochemical targets of polyalkyl guanidinium biocides.</a> Organic & Biomolecular Chemistry. 11, 4359-4366 (2013).</li>
<li>Alamgir, M., Erukova, V., Jessulat, M., Azizi, A., Golshani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical-genetic+profile+analysis+of+five+inhibitory+compounds+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemical-genetic profile analysis of five inhibitory compounds in yeast.</a> BMC Chem Biol. 10 (6), (2010).</li>
<li>Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAmberg%2C+DC+%22Cold+Spring+Harbor+Laboratory.+Methods+In+Yeast+Genetics%3A+A+Cold+Spring+Harbor+Laboratory+Course+Manual%22">Cold Spring Harbor Laboratory. Methods In Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring, NY. (2005).</li>
<li>Baryshnikova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+genetic+array+%28SGA%29+analysis+in+Saccharomyces+cerevisiae+and+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Synthetic genetic array (SGA) analysis in Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe.</a> Methods Enzymol. 470, 145-179 (2010).</li>
<li>Young, B. P., Loewen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balony%3A+a+software+package+for+analysis+of+data+generated+by+synthetic+genetic+array+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Balony: a software package for analysis of data generated by synthetic genetic array experiments.</a> BMC Bioinformatics. 14, 354(2013).</li>
<li>Wagih, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SGAtools%3A+one-stop+analysis+and+visualization+of+array-based+genetic+interaction+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">SGAtools: one-stop analysis and visualization of array-based genetic interaction screens.</a> Nucleic Acids Res. 41, W591-W596 (2013).</li>
<li>Dittmar, J. C., Reid, R. J., Rothstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScreenMill%3A+a+freely+available+software+suite+for+growth+measurement%2C+analysis+and+visualization+of+high-throughput+screen+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ScreenMill: a freely available software suite for growth measurement, analysis and visualization of high-throughput screen data.</a> BMC Bioinformatics. 11, 353(2010).</li>
<li>Longley, D. B., Harkin, D. P., Johnston, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-fluorouracil%3A+mechanisms+of+action+and+clinical+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">5-fluorouracil: mechanisms of action and clinical strategies.</a> Nat Rev Cancer. 3, 330-338 (2003).</li>
<li>Lum, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovering+modes+of+action+for+therapeutic+compounds+using+a+genome-wide+screen+of+yeast+heterozygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Discovering modes of action for therapeutic compounds using a genome-wide screen of yeast heterozygotes.</a> Cell. 116, 121-137 (2004).</li>
<li>Toussaint, M., Conconi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+and+sensitive+assay+to+measure+yeast+cell+growth%3A+a+bench+protocol+for+testing+genotoxic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">High-throughput and sensitive assay to measure yeast cell growth: a bench protocol for testing genotoxic agents.</a> Nat Protoc. 1, 1922-1928 (2006).</li>
<li>Robinson, M. D., Grigull, J., Mohammad, N., Hughes, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FunSpec%3A+a+web-based+cluster+interpreter+for+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">FunSpec: a web-based cluster interpreter for yeast.</a> BMC Bioinformatics. 3, 35(2002).</li>
<li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+integrative+analysis+of+large+gene+lists+using+DAVID+bioinformatics+resources%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources.</a> Nat Protoc. 4, 44-57 (2009).</li>
<li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinformatics+enrichment+tools%3A+paths+toward+the+comprehensive+functional+analysis+of+large+gene+lists%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists.</a> Nucleic Acids Res. 37, 1-13 (2009).</li>
<li>Hong, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Ontology+annotations+at+SGD%3A+new+data+sources+and+annotation+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Gene Ontology annotations at SGD: new data sources and annotation methods.</a> Nucleic Acids Res. 36, D577-D581 (2008).</li>
<li>Fang, F., Hoskins, J., Butler, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-fluorouracil+enhances+exosome-dependent+accumulation+of+polyadenylated+rRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">5-fluorouracil enhances exosome-dependent accumulation of polyadenylated rRNAs.</a> Mol Cell Biol. 24, 10766-10776 (2004).</li>
<li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame%2C+single-gene+knockout+mutants%3A+the+Keio+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Mol Syst Biol. 2, 0008(2006).</li>
<li>Nichols, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+landscape+of+a+bacterial+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Phenotypic landscape of a bacterial cell.</a> Cell. 144, 143-156 (2011).</li>
<li>Dai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+nucleosome+function%3A+a+highly+versatile+library+of+synthetic+histone+H3+and+H4+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Probing nucleosome function: a highly versatile library of synthetic histone H3 and H4 mutants.</a> Cell. 134, 1066-1078 (2008).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir mali çıkarları olmadığını beyan ederler.

Kimyasal genetik etkileşim profilleri oluşturmak için bir yaklaşım burada özetlenen. yöntem basittir: bir kimyasal maddenin varlığı ve yokluğunda geniş gen silinmesi koleksiyonlarında, her bir suş koloni boyutları karşılaştırarak, bir kimyasal hakaret tolere gerekli genler tespit edilir. Hassas soyların ortaya çıkan listesinin Açıklaması zenginleştirme analizi, daha sonra bir etki kimyasal moduna ilişkin bilgi temin etmek üzere kullanılabilir. Bu protokol, maya tomurcuklanma için optimize edilmiş olsa da, aynı zaman...

genetik araçlar ve model organizma Saccharomyces cerevisiae mevcut kaynakların topluca genler ağları biyolojik sistemlerin gerekliliklerini yerine getirmek olarak işlev nasıl yeni anlayış sağlamak büyük ölçekli fonksiyonel genomik çalışmalar sağlamıştır. Bu araçların taşı maya 1,2 bütün açık okuma çerçeveleri zorunlu olmayan gen silme komple bir set işbirlikçi kurulmasıdır. Çarpıcı bir gözlem, standart laboratuvar koşulları altında haploidlerin olarak yetiştirilen maya genlerinin ~% 20 canlılığı için gerekli oldu. Bu alternatif, biyolojik yolların kullanılması ile genomik düzensizliklerin karşı tampon bir hücrenin yeteneğini ortaya koymaktadır. Genetik ayrı ayrı yaşayabilir mutantlar, ancak birlikte öldürücü, bağlı veya yakınsak paralel biyolojik yollar sinyal ve biyolojik işlevi açıklayan genetik etkileşim ağları oluştururlar. Koşullu te gelişmesiyle birlikteEsas teşkil eden genlerin mperature duyarlıdır ve hypomorphic allelleri teknolojisi esansiyel olmayan genlerin 3,4 çalışması ile sınırlı değildir. Bu kavram, benzer hücresel proseslerle genlerin 5 bir araya gelip nasıl çalıştığını gösteren bir tarafsız genetik etkileşimin ilk üreten bir genomik ölçekte uygulanmıştır. Genetik ağların Kimyasal tedirginlikler mimik gen delesyonlar (Şekil 1) 6. Aşırı duyarlılık için, silme soylarının yüksek yoğunluklu dizisine doğru büyüme önleyici bileşikler sorgulama kimyasal stresi tolere için gerekli olan genlerin bir listesini, yani, kimyasal bir genetik etkileşim profili tanımlar. Genetik etkileşimleri gibi kimyasal kütüphanelerin büyük ölçekli ekranlar aksiyon küme bir araya 7 benzer bir modu ile bileşiklerin göstermiştir. Bu nedenle, bir bileşiğin kimyasal genetik etkileşim profili oluşturarak, etki mekanizmaları lar ile karşılaştırarak tahmin edilebilirge-ölçekli sentetik genetik ve kimyasal genetik etkileşim 8,9 veri setlerini. Bileşiklerin puanları, sorguya büyük ölçekli kimyasal-genetik ekranlar, barkod rekabet analizleri ile yapılmıştır. Bu yaklaşımda, silme soylarının havuzlanmış toplama kimyasal içeren, küçük bir ortam hacmi içinde birkaç nesil için topluca yetiştirilir. Her bir kromozom anormalliği mutantı, tek bir genetik barkod barındırır için, silme soylarının havuz içinde tek tek mutantlann canlılığı / büyüme mikrodizi veya yüksek sekanslama 10 tarafından izlenir. Bir biyolojik olarak aktif bileşiği içeren bir katı agar üzerinde büyütülmüş, fiziksel olarak dizilmiş mutantların kolonilerini izleyerek uygunluk çıkarım da kimyasal bir genetik etkileşimleri 11,12 tanımlamasında çok etkili bir yöntemdir. Bu yaklaşım, rekabete dayalı tarama için maliyet-etkin bir alternatif sunuyor ve kimyasallar küçük kütüphaneler tahlil için uygundur.Burada özetlenen S. kimyasal genetik etkileşimin bir listesini üretmek için bir basit bir yöntemdir biyoloji manipülasyonlar veya altyapı moleküler dayanmaz cerevisiae. Bu sadece bir maya silme koleksiyonu, bir robot veya manuel çivileme aparatı ve serbestçe kullanılabilir görüntü analizi yazılımı gerektirir.

<table><tbody><tr><td>Maya Özü</td><td>BioBasic</td><td>G0961</td><td>YEPD sıvı / katı ortam için% 1 nihai konsantrasyona ekleyin (w / v)</td></tr> <tr><td>Tyrptone Tozu</td><td>BD Biosciences</td><td>211820</td><td>YEPD sıvı / katı ortam için% 2 nihai konsantrasyona ekleyin (w / v)</td></tr> <tr><td>Dekstroz</td><td>Anachemia</td><td>31096-380</td><td>YEPD sıvı / katı ortam için% 2 nihai konsantrasyon (a / h) & # 8212'ye ekleyin; otoklav yapmayın. % 20 stok solüsyonu hazırlayın, filtreyle sterilize edin ve otoklavlamadan sonra ortama ekleyin.</td></tr><tr><td>Agar A</td><td>Bio Basic</td><td>FB0010</td><td>YEPD katı ortam için% 2 nihai konsantrasyona ekleyin (w / v)</td></tr> <tr><td>G418</td><td>AG Scientific Inc.</td><td>G-1033</td><td>200&nbsp'de 1.000x stok hazırlayın; dH2O cinsinden mg/ml ve süzgeç sterilize edilir.</td></tr><tr><td>12 oyuklu plaka</td><td>Greiner Bio One</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>5 ml kültür tüpleri</td><td>Evergreen Scientific</td><td>222-2376-080</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Petri Kabı</td><td>VWR</td><td>25384-302</td><td></td></tr><tr><td>ROTOR HDA</td><td>Singer Instruments&nbsp;</td><td>ROT-001</td><td>yüksek verimli mikrobiyal dizi sabitleme robotu</td></tr><tr><td>PLUSPLATE & copy; Petri Kabı</td><td>Şarkıcı Enstrümanları&nbsp;</td><td>PLU-001</td><td>200 tabak</td></tr><tr><td>kutusu 384 Kısa Pimli RePad</td><td>Singer Instruments&nbsp;</td><td>RP-MP-384</td><td>1.000 pedlik kutu</td></tr><tr><td>1536 Kısa Pimli RePad</td><td>Singer Instruments&nbsp;</td><td>RP-MP-1536</td><td>1.000 pedlik</td></tr><tr> kutu<td colspan="4">Alternatif Sabitleme Araçları:</td></tr> <tr><td>Tam Otomatik Robtic Systems</td><td>S & P robotik</td><td>http://www.sprobotics.com</td><td>Çeşitli otomatik koloni işleme, robitik ve hayal etme sistemleri mevcuttur.</td></tr><tr><td>Manuel Sabitleme Araçları</td><td>V& P Scientific</td><td>http://www.vp-scientific.com</td><td>El tipi çoğaltma araçları ve aksesuarları.</td></tr></tbody></table>

kimyasal genetik etkileşimleri hızlı kimlik<em&gt; saccharomyces cerevisiae</em

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Biyolojik olarak aktif kimyasal etki şeklinin belirlenmesi, akademik, ilaç geniş bir ilgi ve endüstriyel bilim göstermektedir. Saccharomyces cerevisiae ya da çiçek mayası bir model ökaryot olduğu ~ 6.000 gen silme mutantları ve hypomorphic elzem genin tam bir koleksiyon mutantlar ticari olarak temin edilebilir. Mutantlar bu koleksiyonları sistematik bir kimyasal tolere gerekli kimyasal gen etkileşimler, örneğin genleri tespit için de kullanılabilir. Bu bilgiler, sırayla, bileşiğin etkime olası moduna bildirir. Burada maya tomurcuklanma kimyasal genetik etkileşimin hızlı tespit edilmesi için bir protokol açıklar. Bu eylem, iyi tanımlanmış bir mekanizmaya sahiptir, kemoterapötik madde, 5-flüorourasil (5-FU), kullanılarak yöntemi göstermektedir. Sonuçlarımız, nükleer TRAMP eksozom ve DNA onarımı enzimler önceki m ile tutarlıdır 5-FU mevcudiyetinde çoğalma için gerekli olan RNA olduğunu göstermektedirtabanlı barkod kimyasal genetik yaklaşımlar ve 5-FU olumsuz hem RNA ve DNA metabolizmasını etkilediğini bilgiyi icroarray. Bu, yüksek verimli taramalara gerekli doğrulama protokolleri de tarif edilmektedir.

Bu yaklaşımın bir doğrulama olarak, yukarıda tarif edilen protokol izlenerek, kemoterapötik madde, 5-florourasil (5-FU) temsil eden bir kimyasal genetik etkileşimin ekran gerçekleştirilir. 5-FU, timidilat sintaz gibi DNA ve RNA metabolizmasını 18 bozmak için bilinmektedir. 5-FU kimyasal genetik etkileşimler de çalışılmış ve heterozigot ve homozigot silme koleksiyonları 8,19 ikisini de kullanarak maya barkod mikroarray teknikleri ile incelenmiştir. Burada içindeki mutant koloni boyutu karşılaştırmal...

Burada, tomurcuklanan mayadaki kimyasal-genetik etkileşimleri tanımlamak için uygun maliyetli bir yöntem sunuyoruz. Yaklaşım, maya moleküler biyolojisindeki temel teknikler üzerine inşa edilmiştir ve küçük ila orta ölçekli kimyasal koleksiyonlarının ve diğer ortam ortamlarının mekanik sorgulaması için çok uygundur.

Kimyasal Genetik Etkileşimleri Hızlı Kimlik<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Bu prosedürün genel amacı, ilgilenilen bir kimyasalın hedeflediği biyolojik süreçleri bulmak için maya hücrelerini kullanmaktır. Bu, önce maya için bir kimyasalın doz yanıt profilinin belirlenmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, öldürücü olmayan bir kimyasal doz ve bir kontrol plakası üzerinde maya geni nakavt suşlarının tam bir koleksiyonunu büyütmektir.Daha sonra, kimyasala aşırı duyarlı olan maya mutantları tanımlanır. Bu liste, kimyasalı tolere etmek için gereken tüm genleri ortaya çıkarmak için biyoinformatik olarak analiz edilir. Son adım, deneyin biyolojik bir kopyasını düşük verimde gerçekleştirmektir.Bu, bulunan herhangi bir kimyasal gen etkileşimini doğrular. Sonuç olarak, bu yüksek verimli kimyasal genetik tarama yöntemi, ilgilenilen kimyasalı tolere etmek için hangi gen ürünlerinin ve biyolojik yolların kullanıldığını göstermek için kullanılır. Bu tekniğin, sıvı kültürde barkodlu mutantların rekabetçi büyümesi gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, moleküler biyoloji tekniklerine gerek olmamasıdır.Bu yöntem, yeni bir küçük molekülün ökaryotik hücrelerin büyümesini nasıl engelleyebileceği gibi kimyasal biyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı

rapid-identification-chemical-genetic-interactions-saccharomyces

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz gen-ilaç ve gen-çevre etkileşimleri anlamak için kapsamlı, tarafsız genom ekranlar geliştirdik. Bu mutant koleksiyonlarını tarama yöntemleri sunulmaktadır.

Barkodlu Maya Kütüphaneler Rekabet Genomik Ekranlar

Sistematik, büyük ölçekli sentetik gen (bir gen ya da gen-epistasis) etkileşim ekranlar genetik ve fazlalık yolu çapraz konuşma keşfetmek için kullanılabilir. Burada, yüksek-throughput kantitatif sentetik genetik dizi tarama teknolojisi tarif eSGA biz epistatik ilişkileri durulaştırmada ve genetik etkileşim ağları keşfetmek için geliştirilen...

Bakteriyel Fonksiyonel Ağlar ve tanımında Haritalama<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Sentetik Genetik Diziler kullanarak

Bu videoda, hedef DNA ile etkileşime giren birden fazla proteini tespit eden modifiye maya tek hibrit testini gösteriyoruz. Dönüştürülmüş maya hücreleri, raportör genin yukarı akışındaki hedef DNA dizisini içerir. Ek olarak, transkripsiyon faktörü proteinlerini eksprese ederler. Proteinler kompleksler oluşturduğunda ve hedef DNA'ya bağlandığında, raportör gen eksprese edilir ve enzimatik olarak tespit edilebilir.

Heteromerik Protein Kompleksi-DNA Etkileşimlerini Tespit Etmek için Modifiye Maya-Bir Hibrit Testi

Mikrokokal nükleaz (MNase) füzyon proteinleri ile genom çapında protein bağlama bölgelerinin haritalanması için bir kromatin immünopresipitasyon (ChIP) -orthogonal yöntem olan yüksek verimli sekanslama (ChEC-seq) ile birleşince, kromatin endojen bölünmeyi tarif ederiz.

ChEC-seq ile Protein-DNA Etkileşimlerinin Genom Boyunca Haritalandırılması<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Biz Maya fizyon basit bastırıcı ekran protokolünde mevcut. Bu yöntem etkili, alkil-Alerjik ve kez tek bir genomik locus meydana gelen mutasyonlar için seçici değildir.  Protokol bir mutasyon veya bir uyuşturucu nedeniyle büyüme kusurları sıvı kültüründe hafifletmek bastırıcılarının yalıtmak için uygundur.

Fisyon mayası Schizosaccharomyces pombe derin sıralama yoluyla, kendiliğinden bastırıcı ekran

Sıralama (RH-seq) ile karşılıklı hemizygosity türler arasındaki bir özellik farkıgenetik temelharita için güçlü bir yeni yöntemdir. Hemizygot havuzları transposon mutagenezi tarafından oluşturulur ve fitness yüksek sıralama boyunca kullanarak rekabetçi büyüme ile izlenir. Elde edilen verilerin analizi, özelliğin altında yatan genleri saptar.

Genom-Geniş Karşılıklı Hemizygosity Analizi ile Saccharomyces Maya Türleri Arasındaki Termotolerans Farklarının Genetik Haritalama

Bakteriyel patojenler, önemli biyolojik süreçleri hedef alan konakiçine protein salgılarlar. Bakteriyel efektör proteinlertarafından hedeflenen konak yollarının belirlenmesi moleküler patogenezi ele almanın anahtarıdır. Burada, toksik bakteriyel efektör proteinlertarafından hedeflenen konak yollarını açıklamak için modifiye edilmiş maya bastırıcı ve toksisite ekranı kullanılarak kullanılan bir yöntem tanımlanmıştır.

Maya Toksisitesi ve Bastırıcı Ekranlar Kullanılarak Bakteriyel Efektör Proteinlertarafından Hedeflenen Konak Yollarının Belirlenmesi

Refakatçi-refakatçi ve refakatçi-substrat etkileşimlerini incelemek için, hafif mutasyonlar veya refakatçilerin aşırı ekspresyumu ile birlikte RNA paraziti kullanarak Caenorhabditis elegans'ta sentetik etkileşim ekranları gerçekleştiriyoruz ve dokuya özgü protein disfonksiyonunu organizma düzeyinde izliyoruz.

Dokuya Özgü Chaperone Etkileşimlerini Taramak için Caenorhabditis elegans'ı Kullanma

Burada, bir çapraz bağlayıcı varlığında gliserol gradyan santrifüjleme olan Grafix'in (Gradyan Fiksasyonu), spliceosome kompleksine geçici olarak bağlanan birleştirme faktörleri arasındaki etkileşimleri tanımlamak için kullanımını açıklıyoruz.

Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes Geçici Interactors Tespiti için Grafix kullanımı

Bu çalışma, Schizosaccharomyces pombe'de çok kopyalı baskılayıcı genetik ekran için bir protokolü açıklamaktadır. Bu ekran, bir sorgu mutant suşu ile ilişkili bir fonksiyon kaybı fenotipinin baskılayıcı klonlarını tanımlamak için genom çapında bir plazmid kütüphanesi kullanır. Bu ekran kullanılarak ell1 null mutantının yeni genetik baskılayıcıları tanımlandı.

Şizosakkaromices pombe'de Multicopy Suppressorların Tanımlanması için Genetik Ekran

D-döngü yakalama (DLC) ve D-döngü uzatma (DLE) testleri, Saccharomyces cerevisiae'de indüklenebilir çift sarmallı bir kırılma yerinde D-döngü oluşumunu, D-döngü uzantısını ve ürün oluşumunu ölçmek için kantitatif PCR ile birlikte yakınlık ligasyonu prensibini kullanır.

Saccharomyces cerevisiae'de Proximity Ligation ve Kantitatif PCR ile Homolog Rekombinasyon Ara Ürünlerinin Saptanması

Öğrenin, Saccharomyces cerevisiae kullanarak kimyasal-genetik etkileşimleri hızlıca belirleme yöntemini. Bu maliyet etkin yaklaşım, belirli kimyasallara karşı tolerans için gerekli genleri ve biyolojik süreçleri ortaya çıkarır.

Kimyasal Genetik Etkileşimleri Hızlı Kimlik

Daha fazla video keşfet