Name: İzolasyon ve Kemirgen Kemik İliği intravenöz enjeksiyon Türetilmiş Monositler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Keşfedin kemik iliği kaynaklı monosit izolasyonunu farelerde kullanarak kardiyovasküler araştırmalar için. Bu yöntem, hayvan kullanımını azaltarak maliyetleri düşürür ve damar büyümesi çalışmalarına olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft, Alman Araştırma Vakfı) SFB 854 (Sonderforschungsbereich, işbirlikçi araştırma merkezi) tarafından desteklenmiştir. 
Teknik destek için Otto-von-Guericke Üniversitesi Magdeburg, Magdeburg, Almanya'dan Audiovisuelles Medienzentrum'dan Hans-Holger Gärtner'e teşekkürler.

Bu çalışmada hayvansal koruma (24D-9168,11-1 / 2008-24) Alman Yasanın 8. göre, Saksonya ve Saksonya Anhalt, Regierungspraesidium Dresden / Halle Devlet izni ile yapıldı. 1 Hücre İzolasyonu Femur ve Tibia 1.1 Hazırlık <ol><li> Kapalı bin izofluran vaporizing bir% 5 izofluran konsantrasyonu kullanılarak fare anestezisi. Fare 3 saniye hareket durduktan sonra, servikal dislokasyon gerçekleştirin. </li><li> Etanol (% 96) ile arka bacaklarda dezenfekte. Cilt ve kasları çıkarın ve steril bir bisturi ile kemikleri ayırın. <ol><li> Inguinal cilt kesi ile başlayın, ve medial malleol doğru kesi uzatmak ve alt baldır çevresindeki deri dairesel bir diseksiyon. Proksimale soyma tamamen bacaklar cilt çıkarın. </li><li> Keskin bir bisturi ile femur kuadriseps kas ayırın, ön Peroneus de kaldırabilirsinizve gastroknemius kas gruplarını bulma ve ligament diseksiyon ile kalça eklemi de bacak dezartikülasyon. </li><li> Öne başlayın ve dikkatle böylece eklem disarticulating, bacak dönen ve ligament transecting ile ortak etrafında devam. </li></ol></li><li> Aseptik hazırlanmasını sağlamak için 90 sn arasında, en az% 96 etanol ile femur ve tibia yıkayın. Etanol kalan durulayın steril PBS ile yıkama işlemini devam edin. Not: Tüm takip eden aşamalar kirlenmesini önlemek için steril olmak zorundadır. </li></ol> Kemik İliği 1.2 Hasat <ol><li> Femoral ve tibial milleri erişmek için ince bir makas her kemiğin proksimal ve distal ucu kesilir. Bu kemikler çok kolay kırılabilir, çünkü bu adımı dikkatli olun. </li><li> Sıcak ortam ile kemik yıkayın (M199 +% 10 fetal dana serumu (FCS), +% 1 Penisilin / Streptomisin). Bir steril 28 G iğne, bir 1 ml şırınga ve 10-15 mi medya başına arasında kullanındurulama için kemik. </li><li> Ince forseps ile kemik tutun ve yarı-saydam olana kadar teker teker yıkayın. Dikkatle hücre stresi en aza indirmek için, enjektör pistonunun ucuna baskı uygulanır. </li><li> 70 mikron naylon web üzerinden kemik iliği Filtre ve süzüntü toplamak. Kemik iliği, azami miktarda çıkarmak için, uzak ve yakın uçlarında tekrar tekrar yıkayın. </li><li> PBS ile elek durulayın ve süzüntü toplamak. Dikkatle enkaz ve nazik karıştırma ve pipetleme hücresel holdingleri yerinden. </li></ol> 1.3 Yetiştirme <ol><li> Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 250 x g&#39;de hücre süspansiyonu santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve orta yaklaşık 25 ml hücreleri tekrar süspansiyon. Kez tekrarlayın. </li><li> Ikinci yıkama aşamasından sonra, ortam, 6 ml içinde tekrar süspansiyon hücreleri. Tripan mavisi 50 ul hücre çözeltisinin 50 ul karıştırın. Bir ışık mikroskobu altında bir sayım odasında hücreleri sayın. C sayısını hesaplayınBu formül kullanılarak çözelti içinde arşın: <img alt="Denklem 1" fo:content-width="1.3in" src="/files/ftp_upload/52347/52347eq1.jpg" /></li><li> Plakasının tabanına kadar kalıcı yapışmasını önlemek için bir 6-çukurlu ultra-düşük-bağlantı yüzeyi tabakalarına hücreleri Tohum. Oyuk başına en fazla 6 ml, ml başına 10 6 hücre konsantrasyonuna kullanın. </li><li> Hücre farklılaşmasını teşvik etmek için 20 ng / ml M-CSF ile bir süspansiyon Supplement. </li><li> Kültür, 37 ° C de 5 gün süre ile hücre ve% 5 karbon dioksit ve hergün incelenmiştir. </li></ol> Hücreler 1.4 Hasat Not: Bu aşamaları, buz üzerinde gerçekleştirilmelidir. Buna göre 1.4.1 veya 1.4.2 ya devam edin. <ol><li> Bu noktada, ultra-düşük-bağlantı yüzeyi plakalardır bile, kültür plakalarına yapışacak farklı makrofajlar dahil olmak üzere, tüm kültür hasat edilir. <ol><li> Nazik pipetleme tüm kültür Hasat ve 4 ° C PB çözeltisi ile ayırmaS,% 0.5 büyükbaş hayvan serum albümini (BSA) ve 2 mM EDTA. Emin eğer mikroskop altında teyit - plakaları yapışık hücrelerin kalan net kadar tekrarlayın. </li></ol></li><li> Seçenek olarak ise, esas olarak monositler içeren süspansiyon hücreleri ile süpernatant hasat etmek suretiyle yapışkan makrofajlar atın. <ol><li> Bir EDTA içermeyen PBS çözeltisi ve% 0.5 BSA ile yıkanarak yapışmayan hücreler hasat edilir. Hafif yapışık makrofajlar yerinden oynatmamaya önlemek için çok fazla kuvvet uygulamayın. </li></ol></li></ol> 1.5 FACS-Analiz (İsteğe bağlı) Not: MACS kullanılarak CD117 + stem- ve projenitör hücrelerin hücre süspansiyonu tüketmek için mümkündür. Bu prosedür üretici protokollerini kullanın. <ol><li> Ya 1.4.1 veya 1.4.2 adımları göre hücreleri Hasat. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 250 x g&#39;de santrifüj hücreleri ve yine bu adımı tekrarlayın. </li><li> FACS b 300 ul süspanse en az 250.000 hücreprob başına uffer. </li><li> 96 oyuklu bir plaka (kuyu başına 30 ul) üzerine hücre çözeltisi aktarın. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 250 x g&#39;de hücre süspansiyonu santrifüjleyin. </li><li> Süpernatantı ve her bir kuyu (kullanım üreticisi seyreltme) antikor 25 ul ekleyin. </li><li> Adımdan sonra hücre feno üretici protokolleri takiben antikor ile (hücreler 1.5.1-1.5.6. Monosit / makrofaj tanımlanması için yaygın olarak kullanılan belirteçler CD11b, F4 / 80 (Şekil 3), CD115 içerir leke (Şekil 2), ve GR- 1. Not: Hücre çözümleri ilişkin ayrıntılı bilgi için, CD4, CD8a, CD11c, CD25, CD45, CD45R, CD62L, CD80, CD86, CD145, CD117, MHCⅡ, LY6C, Ly6G ve CD192 gibi belirteçlerin kullanılması tavsiye edilir. Hücresel özellikleri önceden 12 tarif edilmiştir. </li><li> 4 ° C&#39;de 20 dakika için sondalar inkübe edin. </li><li> Santrifüj 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 250 x g&#39;de problar ve FACS tamponu içinde 200 ul süspansiyon haline getirin. Tekrar inciiki adım olduğunu. </li><li> FACS tüpler içine sondaları aktarın ve FACS analizi 12 gerçekleştirin. </li><li> Hücre farklılaşmasını analiz için 0, 3 ve 5, FACS analizi 12 yapın. </li></ol> 2. Kuyruk Ven Enjeksiyon 2.1 Hazırlık <ol><li> Yaklaşık 10 dakika boyunca 37 ° C&#39;de bir ısıtma plakası üzerinde hayvanlar ısıtın. Aşırı ısınma işaretleri tanımak ısınırken hayvanları gözlemlemek. </li><li> NaCI 150 ul, adım 1.1- 1.4 izole monositler, süspanse edin ve bir 30G iğne ile 1 ml insülin şırınga içine hücreleri yükleyin. Hafif tüm monositler enjekte sağlamak için şırınga yüklemeden önce çözüm vorteks. Her zaman ısı aracılı eki ve monositlerin aktivasyonunu önlemek için buz üzerinde hücreleri ele. </li></ol> 2.2 frenleyici <ol><li> Damardan enjeksiyon için bir fare seçerken kafes Diğer fareler rahatsız kaçının. </li><li> Süzgeç içine fare yerleştirin. Çok pr kaçınınessure arka bacaklarda dikkatli olmak ve. (Şekil 4) Not: Alternatif olarak, hayvanların stres ücretsiz kullanımını garanti etmek için genel anestezi kullanın. </li><li> Fare koruyucularını kapatmadan önce nefes için yer olduğundan emin olun. </li></ol> 2.3 Enjeksiyon <ol><li> Dezenfeksiyon maddesi ile enjeksiyon yerinde dezenfekte edin. Fare kuyruğu Sprey ve en az 1 dakika bekletin. </li><li> Damarların daha iyi görüş için, enjeksiyon yerinde yukarıdaki yan kuyruk tarafına hafif basınç uygulayarak kuyruk venöz kan akışını durdurun. </li><li> Enjeksiyon öncesinde, kuyruk 90 derece çevirin. (Şekil 5) </li><li> 45 derecelik bir açıyla enjekte. Yavaş yavaş enjekte ve g başına en fazla 5 ul zarar hayvanlar önlemek için. </li><li> Başarısız bir enjeksiyon bir işaretidir bir kabarcık, varsa, derhal bırakın ve daha proksimal enjeksiyonunu tekrarlamak. </li><li> Nazik p uygulayarak enjeksiyon tarafında kanama durdurmayaklaşık 1 dakika boyunca basıncını kontrol edin. </li><li> Prosedürün sonunda, toplayıcı açmak ve kafeste fare koyun. </li><li> 20 dk hayvan enjeksiyonu zarar değildi ve sternum yatma muhafaza edilmesini sağlamak için fareyi gözlemleyin. Fare yeterli bilince kavuşur kadar gözlem süresini uzatın. Tam kurtarıldı sonra diğer hayvanların şirkete fare dönün. </li></ol>

<ol><li>Herold, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+monocytes%3A+a+novel+strategy+for+in+vivo+augmentation+of+collateral+vessel+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Transplantation of monocytes: a novel strategy for in vivo augmentation of collateral vessel growth.</a> Hum Gene Ther. 15 (1), 1-12 (2004).</li>
<li>Herold, J., Tillmanns, H., Xing, Z., Strasser, R. H., Braun-Dullaeus, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+transduction+of+monocytes%3A+promising+vehicles+for+therapeutic+arteriogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Langenbecks+Arch+Surg%22%5BJournal%5D)">Isolation and transduction of monocytes: promising vehicles for therapeutic arteriogenesis.</a> Langenbecks Arch Surg. 391 (2), 72-82 (2006).</li>
<li>Francke, A., Weinert, S., Strasser, R. H., Braun-Dullaeus, R. C., Herold, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+bone+marrow+derived+monocytes%3A+a+novel+approach+for+augmentation+of+arteriogenesis+in+a+murine+model+of+femoral+artery+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+Of+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Transplantation of bone marrow derived monocytes: a novel approach for augmentation of arteriogenesis in a murine model of femoral artery ligation.</a> American Journal Of Translational Research. 5 (2), 155-169 (2013).</li>
<li>Leon, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+differentiation+potential+of+mouse+monocytes%3A+monocytes+represent+immediate+precursors+of+CD8-+and+CD8%2B+splenic+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell differentiation potential of mouse monocytes: monocytes represent immediate precursors of CD8- and CD8+ splenic dendritic cells.</a> Blood. 103 (7), 2668-2676 (2004).</li>
<li>Timmerman, J. M., Levy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+vaccines+for+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Med%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell vaccines for cancer immunotherapy.</a> Annu Rev Med. 50, 507-529 (1999).</li>
<li>Salem, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+dendritic+cells+for+Peptide-based+vaccination+in+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The use of dendritic cells for Peptide-based vaccination in cancer immunotherapy.</a> Methods Mol Biol. 1139, 479-503 (2014).</li>
<li>Timmerman, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Idiotype-pulsed+dendritic+cell+vaccination+for+B-cell+lymphoma%3A+clinical+and+immune+responses+in+35+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Idiotype-pulsed dendritic cell vaccination for B-cell lymphoma: clinical and immune responses in 35 patients.</a> Blood. 99 (5), 1517-1526 (2002).</li>
<li>Berthold, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+monocytes+by+Ficoll+density+gradient+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Blut%22%5BJournal%5D)">Isolation of human monocytes by Ficoll density gradient centrifugation.</a> Blut. 43 (6), 367-371 (1981).</li>
<li>Houthuys, E., Movahedi, K., De Baetselier, P., Van Ginderachter, J. A., Brouckaert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+isolation+and+purification+of+mouse+peripheral+blood+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A method for the isolation and purification of mouse peripheral blood monocytes.</a> Journal Of Immunological Methods. 359 (1-2), 1-10 (2010).</li>
<li>Seeger, F. H., Tonn, T., Krzossok, N., Zeiher, A. M., Dimmeler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+isolation+procedures+matter%3A+a+comparison+of+different+isolation+protocols+of+bone+marrow+mononuclear+cells+used+for+cell+therapy+in+patients+with+acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Cell isolation procedures matter: a comparison of different isolation protocols of bone marrow mononuclear cells used for cell therapy in patients with acute myocardial infarction.</a> European Heart Journal. 28 (6), 766-772 (2007).</li>
<li>Auffray, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CX3CR1%2B+CD115%2B+CD135%2B+common+macrophage%2FDC+precursors+and+the+role+of+CX3CR1+in+their+response+to+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+Of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">CX3CR1+ CD115+ CD135+ common macrophage/DC precursors and the role of CX3CR1 in their response to inflammation.</a> The Journal Of Experimental Medicine. 206 (3), 595-606 (2009).</li>
<li>Francke, A., Herold, J., Weinert, S., Strasser, R. H., Braun-Dullaeus, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+mature+murine+monocytes+from+heterogeneous+bone+marrow+and+description+of+their+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Generation of mature murine monocytes from heterogeneous bone marrow and description of their properties.</a> J. Histochem. Cytochem. 59 (9), 813-825 (2011).</li>
<li>Sneider, E. B., Nowicki, P. T., Messina, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+medicine+in+the+treatment+of+peripheral+arterial+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Regenerative medicine in the treatment of peripheral arterial disease.</a> Journal Of Cellular Biochemistry. 108 (4), 753-761 (2009).</li>
<li>Van Royen, N., Piek, J. J., Schaper, W., Fulton, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+review+of+clinical+arteriogenesis+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Coll+Cardiol%22%5BJournal%5D)">A critical review of clinical arteriogenesis research.</a> J Am Coll Cardiol. 55 (1), 17-25 (2009).</li>
<li>Lawall, H., Bramlage, P., Amann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+peripheral+arterial+disease+using+stem+and+progenitor+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vasc+Surg%22%5BJournal%5D)">Treatment of peripheral arterial disease using stem and progenitor cell therapy.</a> J Vasc Surg. 53 (2), 445-453 (2011).</li>
<li>Herold, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetanus+toxoid-pulsed+monocyte+vaccination+for+augmentation+of+collateral+vessel+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Heart+Association%22%5BJournal%5D)">Tetanus toxoid-pulsed monocyte vaccination for augmentation of collateral vessel growth.</a> Journal of the American Heart Association. 3 (2), e000611(2014).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Kemik iliğinden sıçangil monosit büyük miktarda izole etmek için basit ve maliyet-etkin bir yöntem tarif eder. Monosit verimleri 5 x10 6 1.4 elde periferik kan kullanan diğer protokoller ile karşılaştırıldığında, biz tek bir donör fare 11 x 10 6 ± 3 x 10 6 monositlerin yüksek verim elde edebiliyoruz. Bu yöntemle zorlukları göz önüne alındığında, bu steril olmayan koşullarda çalışırken kontaminasyon potansiyeli söz önemlidir. Durulama ve sonraki yık...

Monositlerin izolasyonu, birçok in vitro ve in vivo çalışma için önemli ve kritiktir. Bu hücreler, periferik arter hastalığı, koroner kalp hastalığı veya diğer iskemik hastalıklar gibi hastalıklar için hedeflerdir, çünkü kollateral damar büyümesi güçlü bir şekilde lokal inflamasyon tarafından yönlendirilir. Enflamatuar yanıtlar, endotelyal aktivasyonu ve lökositlerin, esas olarak monositlerin lokal alımını içerir, bunlar daha sonra makrofajlara olgunlaşır ve bir arteriolün fonksiyonel bir kollateral arter1-3'e yeniden şekillenmesini indüklemek için çoklu büyüme faktörleri salgılayarak oldukça arteriyojenik bir ortam oluşturur. Monositler ayrıca immünolojik çalışmalar4,5 ve kanser araştırmaları6,7 için sıklıkla kullanılan dendritik hücrelere olgunlaşır.
Periferik kandan monosit izolasyonuyaklaşımında problemli olan 8, çoğu analiz için yeterli miktarda monosit üretmek için gereken yüksek sayıda donör hayvandır. Eski protokoller, monositleri izole ederken yoğunluk gradyan santrifüjleme ve MACS9 yoluyla hücre tükenmesi gibi yöntemleri tanımlar; Bununla birlikte, bu teknikler monositlerin özelliklerini ve işlevselliğini değiştirebilir ve bu da yorumlamada zorluklara yol açabilir10,11. Ayrıca, bu yöntemler zordur ve deneysel tekrarlanabilirliği azaltabilir.
Bu protokolle amacımız, büyük miktarlarda kemik iliği kaynaklı monositler oluşturmak için basit ve uygun maliyetli bir yöntem sağlamaktır. Bu protokolle elde edilen 11 x 106 ± 3 x 106 hücreli yüksek hücre verimi sayesinde, kemik iliği kaynaklı monositlerin izolasyonu sırasında gereken fare sayısını önemli ölçüde azaltabiliriz. Prosedür, minimum bir süre içinde ve yukarıda belirtildiği gibi pahalı ve karmaşık teknikler kullanılmadan tamamlanabilir. Burada, donör farelerin doğal kemik iliği süspansiyonundan monositleri ekstrakte ediyoruz, süspansiyonu ultra düşük bağlantı plakaları üzerinde geliştiriyoruz ve çözeltiyi 20 ng / ml M-CFS ile destekliyoruz. Kuluçka süresinin 5. gününde, hücreler toplanır ve fonksiyonel ve fenotipik özellikleri doğrulamak için karakterize edilir.
Arteriyogenez alanındaki deneyler için, bu kemik iliği kaynaklı monositlerin farelere intravenöz transplantasyonu, yaygın periferik arter hastalığı modellerinde femoral arter ligasyonu ile birleştirilebilen sistemik ilaç dağıtımının etkili bir yöntemidir.

<table><tbody><tr><td>6 kuyulu ultra düşük bağlantı plakası</td><td>Corning Incorporated, NY, ABD</td><td></td><td>6 kuyulu ultra düşük bağlantı plakası, kapaklı, steril</td></tr><tr><td>8-12 haftalık, erkek, balb/c fareler&nbsp;</td><td>Charles Nehri, Sulzfeld, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu plaka</td><td>Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mavi ölü hücre lekesi</td><td>Life technologies GmbH, Darmstadt, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini</td><td>GE Healthcare, Freiburg, Almanya</td><td></td><td>Fraksiyon V, pH 7.0</td></tr><tr><td>Kanüller</td><td>B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Almanya</td><td></td><td>28G, 30G</td></tr><tr><td>CD115</td><td>eBioscience, San Diego, ABD</td><td>12-1152</td><td></td></tr><tr><td>CD11b</td><td>eBioscience, San Diego, ABD</td><td>53-0112</td><td></td></tr><tr><td>Hücre kültürü kabı</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Almanya</td><td></td><td>Kapaklı, steril</td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Almanya</td><td></td><td>Allegra&reg; X-15R santrifüj</td></tr><tr><td>Tüy dökücü krem</td><td>Veet, Mannheim, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dezenfeksiyon maddesi</td><td>Sch&uuml; lke& Mayr GmbH, Norderstedt, Almanya</td><td></td><td>Kodan Tinktur forte</td></tr><tr><td>Tek kullanımlık neşter No.10&nbsp;</td><td>Tüy emniyetli tıraş bıçağı Co.Ltd, Osaka, Japonya&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich, Hamburg, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol %96&nbsp;</td><td>Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbr&uuml; cken, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ekstraksiyon ünitesi Pipetus</td><td>Hirschmann Laborger&auml; te GmbH & Co.KG, Eberstadt, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>F4/80</td><td>AbD Serotec, D&uuml; sseldorf, Almanya</td><td>MCA497APC</td><td></td></tr><tr><td>FACS tamponu&nbsp;</td><td>Tek bileşenli</td><td></td><td>grubumuz tarafından üretilmiştir PBS, %0.5 BSA, %0.1 NaN3</td></tr><tr><td>FACS cihazı</td><td>Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, ABD</td><td></td><td>BD FACS Canto II</td></tr><tr><td>FACS tüpleri&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, ABD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Falcon&reg; pipet</td><td>Becton Dickenson Labware, NY, ABD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetal buzağı serumu</td><td>Sigma Aldrich, Hamburg, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>İnce forseps</td><td>Rubis, Stabio, İsviçre</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eldiven</td><td>R&ouml; sner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gr1</td><td>eBioscience, San Diego, ABD</td><td>53-5931</td><td></td></tr><tr><td>Isıtma plakası&nbsp;</td><td>Labotect GmbH, G&ouml; ttingen, Almanya&nbsp;</td><td></td><td>Hot Plate 062</td></tr><tr><td>İnkübatör</td><td>Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Almanya</td><td></td><td>Incu safe</td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Baxter Deutschland GmbH, Unterschlei&szlig; heim, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Işık mikroskobu</td><td>Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Almanya</td><td></td><td>Axiovert 40 &deg; C</td></tr><tr><td>Makrofaj-Koloni Uyarıcı Faktör</td><td>Sigma Aldrich, Hamburg, Almanya</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/srp3110?lang=de&amp; bölge=DE">SRP3110&nbsp; </a></td><td></td></tr> <tr><td>Mekanik çalkalayıcı</td><td>IKA, Staufen, Almanya</td><td></td><td>ms2 minishaker</td></tr><tr><td>Orta 199</td><td>PAA Laboratories GmbH, Pasching, Avusturya</td><td></td><td>37 ° C'de sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu</td></tr><tr><td>Mikro test tüpleri</td><td>Eppendorf AG, Hamburg, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrobiyolojik çalışma tezgahı</td><td>Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Almanya</td><td></td><td>Hera güvenli</td></tr><tr><td>Monosit yıkama tamponu&nbsp;</td><td>Grubumuz tarafından tek bileşenli</td><td></td><td>PBS, %0,5 BSA, 2 mM EDTA</td></tr><tr><td>Fare tutucu</td><td>Çeşitli</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Berlin Chemie AG, Berlin, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaN3 (sodyum asit)</td><td>Sigma Aldrich, Hamburg, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neubauer sayma odası</td><td>Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-K&ouml; nigshofen, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Naylon hücreler</td><td>Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, ABD</td><td></td><td>Hücre süzgeci, 70 & m ağ boyutu</td></tr><tr><td>Penisilin/Streptomisin</td><td>Sigma Aldrich, Hamburg, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin</td><td>Life technologies GmbH, Darmstadt, Almanya</td><td></td><td>pH 7.4, steril</td></tr><tr><td>Pipetler</td><td>Eppendorf AG, Hamburg, Almanya</td><td></td><td>10&mikro; L / 100 ve mikro; L / 200 ve mikro; L / 1.000 ve mikro; l</td></tr><tr><td>Pipetleme kafaları</td><td>Eppendorf AG, Hamburg, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Serolojik pipet</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Almanya</td><td></td><td>Cellstar 5 ml, 10 ml</td></tr><tr><td>Aspirasyon ünitesi</td><td>Integra bioscience, Fernwald, Almanya</td><td></td><td>Vacusafe konfor</td></tr><tr><td>Cerrahi makas</td><td>Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, ABD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Şırınga</td><td>B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Almanya</td><td></td><td>1 ml Omnifix&reg; -F insülin şırınga</td></tr><tr><td>Kapaklı tüpler</td><td>Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Almanya</td><td></td><td>15 ml/50 ml Cellstar tüpleri</td></tr><tr><td>Sıcak su banyosu</td><td>Julabo Labortechnik GmbH, Seelbach, Almanya</td><td></td><td>Julabo SW22</td></tr></tbody></table>

İzolasyon ve kemirgen kemik İliği intravenöz enjeksiyon türetilmiş monositler

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

Lökositlerin bir alt tipi ve makrofajların öncüleri olan monositler, organizmaların birçok önemli sürecinde yer alır ve genellikle biyomedikal biliminde çeşitli alanların konusudur. Aşağıda açıklanan yöntem, murin monositlerini heterojen kemik iliğinden izole etmenin basit ve etkili bir yoludur.
Balb/c farelerinin femur ve tibiasından alınan kemik iliği, fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkanarak toplanır. Hücre süspansiyonu, makrofaj-koloni uyarıcı faktör (M-CSF) ile desteklenir ve monositlerin adezyon ile tetiklenen farklılaşmasını önlemek için ultra düşük bağlanma yüzeylerinde kültürlenir. Monositlerin özellikleri ve farklılaşması çeşitli aralıklarla karakterize edilir. Fenotipleme için CD11b, CD115 ve F4/80 gibi belirteçlere sahip floresan ile aktive edilmiş hücre sınıflandırması (FACS) kullanılır. Yetiştiriciliğin sonunda, süspansiyon% 45±% 12 monositlerden oluşur. Yapışkan makrofajları uzaklaştırarak saflık %86'ya± %6'ya kadar yükseltilebilir. İzolasyondan sonra monositler çeşitli şekillerde kullanılabilir ve in vivo doğum için en etkili ve yaygın yöntemlerden biri intravenöz kuyruk ven enjeksiyonudur. 
Bu izolasyon ve uygulama tekniği, özellikle inflamasyon veya immünoloji alanlarında fare modeli çalışmaları için önemlidir. Monositler ayrıca fare hastalığı modellerinde terapötik olarak da kullanılabilir.

fare kemik iliğinden elde edilen hücre çözeltisi çeşitli hücre tiplerinin oluşur. ana hücre tipi lenfositler, granülositler ve monositlerdir. Hücre tipi farklılaşma 5 gün sonra hasat hem doğal süspansiyonlar ve hücreler için Şekil 1 &#39;de gösterilen boyutta ve ayrıntı ile tahmin edilebilir. Yetiştirilmesi sırasında değişen hücresel bileşim edin. Ancak, nüfusun doğru sınıflandırma hücresel belirteçlerin ayırt edici ifadesi güvenmek gerekir. MPS-Sisteminin hücreleri tanımlam...

Burada, translasyonel uygulamalar için heterojen kemik iliğinden büyük miktarlarda murin monositleri üreten bir protokol sunuyoruz. Diğerleriyle karşılaştırıldığında, bu yeni yöntem, kurban edilen hayvan sayısını azaltmaya yardımcı olur ve yüksek gradyanlı manyetik hücre ayırma (MACS) gibi pahalı yöntemlerden kaçınarak maliyetleri düşürür.

İzolasyon ve Kemirgen Kemik İliği intravenöz enjeksiyon Türetilmiş Monositler

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Merhaba, benim adım Helen Kuster; Dr. Harold'un kardiyovasküler araştırma grubunda çalışıyorum ve MacBook'daki Auto Vica Üniversitesi'nde profesörüm. Kollateral damar büyümesi için taşıyıcılar olarak kullanmak amacıyla deniz monositlerinin izolasyonu ve karakterizasyonu ile ilgileniyoruz. Kemik iliği kaynaklı monositlerin kültüre edilmesi için şu temel adımlar gereklidir: birinci, fare anestezi ve servikal dislokasyon; ikinci, femur ekstraksiyonu ve durulama.Kemik iliğinin üçüncü filtrasyonu. Dördüncü olarak medyum ile yıkama basamakları, beşinci olarak hücrelerin ultra düşük tutunma plaklarında kültüre edilmesi. Altıncı olarak akış sitometrisi.Kemik iliğinden monositleri ekstrakte etmek için, fare izofluran kullanılarak anesteziye alınacak ve servikal dislokasyon ile ötanize edilecektir. Fare sabitlenecek ve her iki alt ekstremite steril bir bistüri ile ayrılacaktır. Her iki femur ve tibia hasat edilip minimum 90 saniye boyunca %96 etanol ile yıkanacaktır.Bundan sonra, kontaminasyonu önlemek için tüm adımlar kesinlikle steril koşullarda gerçekleştirilmelidir. Kaslar veya tendonlar kemikten uzaklaştırılır. Femur ve tibia, birkaç kez ılık PBS ile durulanır.Kemik iliğini toplamak için, her bir kemiğin proksimal ve distal uçları ince bir makasla kesilir. Kemiği durulamak için bir adet 28 G steril iğneye, bir adet bir mililitrelik şırıngaya ve kemik başına 10 ila 15 mililitre besiyerine ihtiyaç duyulur. Ardından, kemik ince bir pensle tutulurken kemik iliği 70 µm'lik bir süzgeçten filtrelenir.Kemikleri, şeffaf hale gelene kadar tek tek durulayın. Hücre stresini minimize etmek için şırınganın pistonuna dikkatli bir şekilde basınç uygulayın. Bölgeyi PBS ile durulayın.Ardından, hücreler oda sıcaklığında 250 G'de 10 dakika boyunca santrifüj edilir. Ve besiyeri ile tekrar süspande edilir. Bu adımdan sonra, işlemi bir kez daha tekrarlayın.Doğal kemik iliğinden türetilmiş monositler için, %1 penisilin ve streptomisin ile %10 fetal sığır serumu içeren M 199 kullanıyoruz. Ayrıca, ilk gün 20 nanograms per milliliter INE MCSF ekliyoruz. Kültürün son gününde ortama eight nanogram per milliliter interfer gamma eklenir.MHC II yukarı regülasyonu isteniyorsa, hücrelerin tabana kalıcı olarak yapışmasını önlemek için kalın kuyucuklu, ultra düşük yapışmalı plakalara ekim yapılır. Kuyucuk başına en fazla 6 mL olacak şekilde, 1 x 10⁶ hücre/mL konsantrasyonu kullanılır. Kültürleme süresi, 37 °C sıcaklıkta ve %5 CO₂ altında beş gündür.Beş gün sonra, hücrelerin %60 ile %80'i monosit olana kadar günlük kontroller yapılır. Benim adım Martin Bachner; Auto Fungi Üniversitesi Kardiyoloji, Onkoloji ve Kronoloji Bölümü'nde tıp fakültesi öğrencisiyim. İntravenöz enjeksiyon yaparken, monositleri uygun bir şekilde uygulayabilmek için işlemden önce bolca pratik yapmak önemlidir.Deneyler, monositlerin sistemik olarak uygulandığında art ajenezini iyileştirmede en etkili olduğunu göstermiştir. Sistemik ilaç uygulamasının yaygın bir yolu kuyruk içi enjeksiyondur. Bizim durumumuzda, sodyum klorür içinde yeniden süspande edilmiş 2,5 milyon monosit enjekte ediyoruz.Fare kuyruğundaki arterlerin ventral ve dorsal kısımlarında dört adet damar, lateral kısımlarda ise iki adet ven bulunur. Bu nedenle, WA enjeksiyonu için kuyruğu yaklaşık 90 derece döndürmemiz gerekir. İşlemi kolaylaştırmak için fare, bir ısıtma pedi kullanılarak yaklaşık 10 dakika boyunca ısıtılmalıdır.Hayvanlar ısıtma işlemi sırasında gözlemlenmelidir. Bu, aşırı ısınma belirtilerinin fark edilmesi açısından önemlidir. Ayrıca, bu enfeksiyon ajanına ve bir mililitrelik insülin şırıngası üzerinde 30 gauge iğne setine ihtiyacımız vardır.Hayvanı, kuyruk yoluyla enjeksiyon yapmayı çok daha kolaylaştıran bir tutucuya dikkatlice sabitleyin. Çözeltiyi şırıngaya çekmeden önce farenin nefes alması için yeterli alan kaldığından emin olun. Tüm monositlerin enjekte edilebilmesini sağlamak için monosit çözeltisini vorteksleyin.Enfeksiyonu önlemek için enjeksiyon bölgesini dezenfekte edin, kuyruğu başparmağınız ve işaret parmağınız arasında tutun. En distal noktadan, iğne düz bir açıyla yerleştirilir. Damara yerleştirildiğinde, monosit solüsyonunu enjekte etmek oldukça kolaydır.Eğer bir bülbül/kabarcık oluşursa, bu yanlış bir enjeksiyonun işaretidir. Hemen durmalı ve tekrar denemelisiniz. Proksimal bölgeye her zaman yavaşça enjekte etmeye çalışın ve gram başına beş mikrolitreden fazla enjekte etmeyin.Enjeksiyon başarılı olduysa, enjeksiyon bölgesine yaklaşık bir dakika boyunca hafifçe bastırarak kanamayı durdurun. Prosedürün sonunda,letraktörü açın ve monositleri karakterize etmek için fareyi kafesine yerleştirin. CD 11 B, F four 80, CD 115 ve GL one şeklindeki antijen kombinasyonlarının etkilerini kullanıyoruz.Bu antijenlerin ekspresyonu, monositlerin analizi için bir gelişim aşamasıyla ilişkilidir. İşlemleri 0, 3, 5 ve 7. günlerde gerçekleştirdik; monosit saflığı beşinci günde %90'a kadar yükselmektedir. Bu saflığa ulaşmak için, güçlü şekilde yapışan makrofajların uzaklaştırılması önemlidir.EDTA içermeyen yıkama tamponu kullanılarak terin olmayan hücreler uzaklaştırılır. Terin hücrelerini uzaklaştırmak için EDTA içeren yıkama tamponu ve nazik pipetleme işlemi uygulanır. Bu diyagram, terin kültürü için ana hücre tiplerini göstermektedir.Gösterilen farklı hücre tipleri; bir lenfositler, iki monositler ve üç granülositlerdir; beşinci günden sonra monosit saflığı artmaktadır. Kültüre dikkat edin; kültivasyon sırasındaki değişen hücresel kompozisyon, bir monositleri ve iki makrofajları içeren hücre popülasyonunu kapsamaktadır.Şekil iki, farklılaşma sırasında CD 115 ekspresyonunun zaman çizelgesi. Beş günlük farklılaşmanın ardından tüm hücrelerin %95'inden fazlasının CD 115 pozitif olduğuna dikkat edin; bu durum, hücrelerin büyük çoğunluğunun monosit veya makrofaj olduğunu göstermektedir. Sınıflandırma, hücre boyutu ve granülariteye dayandırılabilir, ancak spesifik hücresel markerlar daha güvenilirdir.Şekil üç, monosit makrofaj olgunluğunun artan ekspresyonu. Marker F4/80, beşinci gün, monosit fenotipiyle uyumlu olan orta düzeyde F4/80 ekspresyonuna sahip bir popülasyonun ortaya çıktığına dikkat edin. Yedinci gün, makrofaj olgunlaşmasıyla uyumlu F4/80 ekspresyonundaki sağa kaymaya dikkat edin.Monositlerin izolasyonu, birçok in vitro ve in vivo çalışma için temel önem taşımaktadır. Bu hücreler, örneğin iskemi ile ilişkili olan periferik arter hastalığı veya koroner kalp hastalığı gibi hastalıklarla bağlantılı olarak ilgi çekici bir hedeftir. Biyopsi farelerinin femur ve tibia kemik iliği, kemiklerin sıcak besiyeri ile yıkanmasıyla toplanır; hücre süspansiyonu MCSF ile takviye edilir ve monositlerin yapışmaya bağlı farklılaşmasını önlemek için ultra düşük yapışma özellikli yüzeylerde kültüre edilir. Monositlerin özellikleri ve farklılaşması; CD 11 b, CD 115 ve FO 80 gibi markerlar kullanılarak, farklı zamanlarda ve koşullarda hücre fenotiplemesi ile kontrol edilir.Sistemik ilaç iletimi isteniyorsa, intravenöz enjeksiyon bunu gerçekleştirmenin kolay ve etkili bir yoludur. Kemik iliğinden yüksek miktarda MI monositlerini basit ve maliyet açısından verimli bir şekilde izole etme yöntemini tanımladık. Bu yeni yöntemle, fare başına yaklaşık 11 milyon monosit üretebiliyoruz.

isolation-intravenous-injection-murine-bone-marrow-derived

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Kemik iliği nakli Kemik iliği kaynaklı hücrelerin genotipi değiştirmek için bir yol sağlar. Ilgilenilen genin kemik iliğinden elde edilen hücreler ve olmayan kemik iliğinden elde edilen hücreler, hem de ifade etmek gerekirse, kemik iliği transplantasyonu olmayan kemik iliği kaynaklı hücre genotip değiştirmeden, farklı bir genotip için kemik iliği kaynaklı hücre değiştirebilir.

Kemik İliği Transplantasyonu tarafından Fare Kolit immün ve non-immün Hücreler Gen Ekspresyonu İşlevsel Rolleri Farklılaşan

Bu videoda, bakteriyel lipopolisakkarit ve intravenöz immünoglobuline yanıt olarak kemik iliği kaynaklı makrofajların aktivasyonunu gösteriyoruz.

Antikorlara Yanıt Olarak Fare Kemik İliği Kaynaklı Makrofajların Aktivasyonu

Bir yoğunluk dereceli santrifüj yoluyla ve CellTracker boyalar kullanılarak nötrofil etiketlemesi için fare kemik iliğinden nötrofillerin izolasyonu ve saflaştırılması için bir protokol açıklamaktadır. Bu aşağı fonksiyonel çalışmalar ya da evlatlık transferi ve izleme deneyler için nötrofil çok sayıda elde etmek için basit, hızlı, tekrarlanabilir ve ekonomik yöntem temsil eder.

İzolasyon, Arıtma ve İşlevsel Araştırmalar ve Kabul edilmiş Transfer deneyler için Fare Kemik İliği Nötrofiller Etiketlenmesi

Monosit arteriogenesis periferik arter hastalığı bağlamında önemli arabulucu vardır. Bu iletişim kuralı bir membran benzeri matris ve intravital mikroskobu kullanarak, monosit enjeksiyon femoral arter ligasyonu fare modeli sonra monosit izleme ve tümör ile ilgili angiogenez inceler.

Monosit posta ve tümör ile ilgili angiogenez periferik arter hastalığı, bir fare modeli intravital mikroskobu

Monosit kaynaklı DC (MoDC) tehlike ilişkili molekülleri küçük miktarlarda hissi olabilir ve bu nedenle kolayca astarlanmalıdır. MoDC yalıtım kan ve tümörleri ve onların harekete geçirmek bağışıklık kompleksleri ile onların erken harekete geçirmek önlemek için düşünülmesi gereken önemli önlemler vurgulayarak süre için detaylı bir protokol sağlar.

Yalıtım Protokolü fare monosit kaynaklı dendritik hücreler ve onların sonraki Vitro harekete geçirmek ile tümör bağışıklık kompleksleri

Bu protokol, NO-redoks biyolojisini incelemek için tetrahidrobiyopterin (BH4) ve indüklenebilir nitrik oksit sentaz (iNOS) eksikliği olan primer murin makrofajlarını kültürlemek için kurulmuştur. Çalışma, BH4'ün ve geleneksel izolasyon ve kültür yöntemlerinde bulunan ve deneysel sonuçları ve sonuçların yorumlanmasını karıştırabilecek diğer eserlerin potansiyel kontaminasyonunu azaltmaya odaklanmaktadır.

NO-Redoks Biyolojisi Çalışması için Kemik İliği Kaynaklı Makrofajların İzolasyonu ve In vitro Kültürü

Burada, 10 ng / mL GM-CSF / IL-4 ile 7 günlük kültürden sonra farelerden yüksek saflıkta kemik iliği kaynaklı dendritik hücreleri izole etmek ve üretmek için ekonomik ve etkili bir yöntem sunuyoruz.

Kemik İliği Kaynaklı Dendritik Hücrelerin Farelerden İzole Edilmesi ve Kültürlenmesi için Ekonomik ve Verimli Protokol

Bu protokol, farelerden kemik iliği kaynaklı makrofajların izolasyonunu ve kültürünü açıklamaktadır.

Farelerden Kemik İliği Kaynaklı Makrofajların İzolasyonu ve Kültürü

Bu protokol, gen düzenlenmiş hücreler de dahil olmak üzere birkaç hematopoietik veya lösemik kök hücrenin murin ksenogreft modellerinde intrafemoral enjeksiyonunu tanımlar, bu da sadece hücrelerin hızlı ve güvenli bir şekilde nakledilmesini sağlamakla kalmaz, aynı zamanda kemik iliğinin seri analizlerini de sağlar.

Canlı fareler kullanılarak yapılan basitleştirilmiş intrafemoral enjeksiyonlar, sürekli kemik iliği analizine izin verir

Bu protokol, 7-9 günlük yenidoğan fare kemik iliği hücrelerini izole etmek ve granülosit koloni uyarıcı faktör (M-CSF) kaynağı olarak L929 hücrelerinin bir süpernatantını kullanarak farklılaşmış makrofajlar oluşturmak için enzimatik olmayan ve basit bir yöntemi tanımlar. Kemik iliği kaynaklı makrofajlar, yüzey antijenleri F4/80, CD206, CD11b ve fonksiyonel yeterlilik açısından daha fazla analiz edildi.

Yenidoğan Fare Kemik İliği İzolasyonu ve Kemik İliği Kaynaklı Makrofajların Hazırlanması

Keşfedin kemik iliği kaynaklı monosit izolasyonunu farelerde kullanarak kardiyovasküler araştırmalar için. Bu yöntem, hayvan kullanımını azaltarak maliyetleri düşürür ve damar büyümesi çalışmalarına olanak tanır.

İzolasyon ve Kemirgen Kemik İliği intravenöz enjeksiyon Türetilmiş Monositler

Daha fazla video keşfet