İzolasyon ve Kemirgen Kemik İliği intravenöz enjeksiyon Türetilmiş Monositler

Merhaba, benim adım Helen Kuster ve Dr.Harold'ın kardiyovasküler araştırma grubunda çalışıyorum ve MacBook'taki Auto Vica Üniversitesi'nde profesörüm. Teminat gemisi büyümesinde araçlar için kullanılmak üzere deniz monositlerinin izolasyon karakterizasyonu ile ilgileniyoruz. Kemik iliğinden elde edilen monositlerin yetiştirilmesi, ilk fare anestezisi ve servikal çıkık, ikinci ekstraksiyon ve uyluk kemiğinin durulanması için aşağıdaki ana adımlar gereklidir.

Kemik iliğinin üçüncü filtrelenmesi. Dördüncüsü, orta beşincisi ile yıkama adımlarına, hücrelerin ultra düşük bağlantı plakaları üzerinde yetiştirilmesi. Altıncı akış sitometrisi.

Kemik iliğinden monositleri çıkarmak için, fare ISO flor kullanılarak uyuşturulacak ve servikal çıkık ile ötenazi yapılacaktır. Fare sabitlenecek ve her iki alt ekstremite bir steroid neşter ile ayrılacaktır. Hem femur hem de tibia hasat edildi ve en az 90 saniye boyunca% 96 Ethan etanol ile yıkandı.

Bundan sonra, kontaminasyonu önlemek için tüm adımlar kesinlikle steril olmalıdır. Kaslar veya sinüs kemikten çıkarılacaktır. Femur ve tibia birkaç kez ılık PBS ile durulanır.

Kemik iliğini toplamak için, her kemiğin proksimal ve distal uçları bir çift ince makasla kesilir. Kemiği durulamak için bir steroid 28 G iğneye, bir mililitre şırıngaya ve kemik başına 10 ila 15 mililitre ortama ihtiyacımız var. Daha sonra kemik iliği 70 mikrometrelik bir S'den süzülür ve ince bir forseps ile kemik tutulur.

Kemikleri yanılsayana kadar tek tek durulayın. Hücre stresini en aza indirmek için, şırınganın damgasına dikkatlice basınç uygulayın. Sieti PBS ile durulayın.

Daha sonra hücreler oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 250 G'de santrifüj edilir. Ve reus orta ile askıya alındı mı? Bu adımdan sonra, adımı bir kez daha tekrarlayın.

Doğal kemik iliğinden elde edilen kemik iliği türevli monositler için %1 penisilin ve streptomisin ile M 199 ve %10 fetal öksürük serumu kullanıyoruz. Ek olarak, ilk gün mililitre INE MCSF'ye 20 nanogram ekliyoruz. Kültürün son gününde ortama mililitre interfer gama başına sekiz nanogram eklenir.

MHC iki yukarı regülasyon istenirse, hücreler tabana kalıcı yapışmayı önlemek için kalın kuyucuklara sahip ultra düşük bağlantı plakalarına ekilir. Kuyu başına altı mililitreye kadar olmak üzere mililitre başına 10 ila altı hücre arasında bir konsantrasyon kullanıyoruz. Yetiştirme süresi 37 derece ve% 5 karbondioksit sıcaklığında beş gündür.

Hücreler beş gün sonra günlük olarak kontrol edilir, hücrelerin %60 ila %80'i monosittir. Benim adım Martin Bachner ve burada Auto Fungi Üniversitesi'nde Kardiyoloji, Anoloji ve Kronoloji Bölümü'nde tıp doktoru öğrencisiyim. Ve intravenöz enjeksiyonu yaptığınızda, bunu yapmadan önce çok pratik yapmak önemlidir, çünkü aksi takdirde monositleri yeterli bir şekilde uygulayamazsınız.

Deneyler, monositlerin sistemik olarak uygulandığında sanat ageneziyi iyileştirmede en etkili olduğunu göstermiştir. Sistemik ilaç uygulamasının yaygın bir yolu, kuyruk WA enjeksiyonudur. Bizim durumumuzda, yeniden süspanse edilmiş ve sodyum klorür olan 2,5 milyon monosit enjekte ediyoruz.

Fare arterlerinin kuyruğunda ventral ve dorsal tarafta dört damar ve lateral tarafta iki azalma vardır. Yani WA enjeksiyonu için kuyruğu yaklaşık 90 derece döndürmemiz gerekiyor. Daha kolay prosedür için, fare yaklaşık 10 dakika boyunca bir ısıtma yastığı kullanılarak ısıtılmalıdır.

Hayvanlar ısınarak gözlemlenmelidir. Bu, aşırı ısınma belirtilerini tanımak için önemlidir. Ayrıca, bu enfeksiyon ajanına ve bir mililitrelik insülin şırıngasına yerleştirilmiş 30 genlik bir iğneye ihtiyacımız var.

Hayvanı dikkatlice bir kısıtlayıcıya sabitleyin, bu da kuyruk yoluna enjekte etmeyi çok daha kolay hale getirir. Solüsyonu şırıngaya yüklemeden önce farenin nefes almak için yeterli alana sahip olduğundan emin olun. Vorteks, monosit çözeltisinin tüm monositlerin enjekte edilebildiğinden emin olur.

Enfeksiyonu önlemek için enjeksiyon bölgesini dezenfekte eder, kuyruğu yumruğunuz ve işaret parmağınız arasına alın. En uzak noktada, iğne düz bir açıyla yerleştirilir. Damar içine yerleştirilirse, monosit solüsyonunu enjekte etmek çok kolaydır.

Bir kabarcık varsa, yanlış bir enjeksiyonun işaretidir. Derhal durmalı ve daha fazlasını denemelisiniz. Proksimal, her zaman yavaş ve gram başına beş mikrolitreden fazla enjekte etmeye çalışın.

Enjeksiyon başarılı olduysa, yaklaşık bir dakika boyunca hafif bir baskı uygulayarak enjeksiyon bölgesindeki kanamayı durdurun. İşlemin sonunda, ekartörü açın ve monositleri karakterize etmek için fareyi kafesine yerleştirin. Etkileri, CD 11 B, F four 80, CD 115 ve GL one gibi antijenlerin bir kombinasyonu ile kullanıyoruz.

Bu antijenlerin ekspresyonu, monositleri analiz etmek için bir gelişim aşaması ile ilişkilidir. Gerçekleri 0, 3, 5 ve yedinci günlerde yaptık, monosit saflığı beşinci günde% 90'a kadar çıkıyor. Bu saflığı elde etmek için, güçlü bir şekilde terrin makrofajını tüketmek önemlidir.

Terrin olmayan hücreler, EDTA içermeyen yıkama tamponu kullanılarak tükenir. Terrine hücrelerini tüketmek için, yıkama, tampon ve nazik p sevişme içeren EDTA kullanıyoruz. Bu diyagram, tek uç kültürleri için ana hücre tiplerini gösterir.

Gösterilen farklı hücre tipleri bir lenfosit, iki monosit, üç granülosittir ve beşinci günden sonra monosit saflığını arttırır. Ve kültür. Yetiştirme hücresi popülasyonu sırasında değişen hücresel bileşimin bir monosit ve iki makrofaj içerdiğine dikkat edin.

Şekil iki, farklılaşma sırasında CD 115 ifadesinin zaman çizelgesi. Tüm hücrelerin %95'inden fazlasının beş günlük farklılaşmadan sonra CD 115 pozitif olduğunu unutmayın, bu da hücrelerin büyük çoğunluğunun ya monosit ya da makrofaj olduğunu gösterir. Sınıflandırma, hücre boyutuna ve ayrıntı düzeyine dayanabilir, ancak belirli hücresel belirteçler daha güvenilirdir.

Şekil üç, monosit makrofaj olgunluğunun artan ifadesi. Belirteç F dört 80, beşinci gün, monosit fenotipi ile tutarlı olan orta F dört 80 ekspresyonu olan bir popülasyonun görünümüne dikkat edin. Yedinci günde, makrofaj olgunlaşması ile tutarlı F dört 80 ifadesinin sağa kaymasına dikkat edin.

Monositlerin izolasyonu, birçok in vitro ve in vivo çalışma için önemlidir. Bu hücreler, örneğin iskemi ile ilişkili periferik arter hastalığı veya koroner kalp hastalığı gibi hastalıklarla bağlantılı olarak ilginç bir hedeftir. Biyopsi farelerinin FEMA ve tibiasından elde edilen kemik iliği, kemiklerin ılık orta hücre süspansiyonu ile yıkanmasıyla toplanır, MCSF ile desteklenir ve yapışmayı önlemek için ultra düşük bağlanma yüzeylerinde kültürlenir, monositlerin özelliklerini tetikler ve monositlerin farklılaşması farklı zamanlarda kontrol edilir ve hücreleri fenotiplemek için CD 11, b, CD 115 ve FO 80 gibi markörlerle gerçekler kullanılır.

Sistemik ilaç verilmesi isteniyorsa, intravenöz enjeksiyon bunu yapmanın kolay ve etkili bir yoludur. Kemik iliğinden büyük miktarlarda MI monositlerini basit ve uygun maliyetli bir şekilde izole etme yöntemini tanımladık. Bu yeni yöntemle, fare başına yaklaşık 11 milyon monosit üretebiliyoruz.