Name: Yöntem Yanıcı Tütün Ürün Müstahzarların Sitotoksisite ve immünosupresyonun değerlendirin (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-10T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Öğrenin, tütün ürünü müstahzarlarının insan periferik kan mononükleer hücreleri üzerindeki sitotoksisite ve immünosupresyon etkilerini değerlendirmek için akış sitometrisi kullanarak bu yüksek verimli yöntemi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser Tıp Wake Forest Üniversitesi ile ortak araştırma anlaşması kapsamında RJ Reynolds Tobacco Company (RJRT) tarafından finanse edilmektedir. GL Prasad RJRT tam zamanlı çalışanı.

NOT: Yazılı onam bu çalışmayı yapmak İyi Klinik Uygulamaları başına, IRB onayı altında yerel bir klinik araştırma birimi elde edilmiştir. Kan işleme, PBMC&#39;ler ve diğer hücre kültürü izolasyonu mikrobiyolojik steril malzemeleri ve reaktifler kullanılarak steril koşullar altında gerçekleştirilir. 1. WS-CM Hazırlık <ol><li> Daha önce açıklandığı gibi 12 WS-CM oluşturun. <ol><li> 35-60-2, ml puf hacmi, saniyede puf aralığı, ve puf süresi: Roswell Park Memorial Institute (RPMI) Aşağıdaki sigara rejimi kullanan kırmızı fenol olmadan 1640 aracılığıyla dört 3R4F referans sigara dumanı geçirerek WS-CM hazırlayın sırasıyla saniye içinde. Her preparasyon bir 20 ml lik bir numuneyi oluşturur. </li></ol></li><li> Tarih, tamamlanmış zaman ve sigara adı ve numarası ile Etiket tüp (ler). -80 ° 500 ul tümbölenleri hemen sigaradan sonra tamamlanır C saklayın. </li><li> Dondurulmuş WS hacimde analizDaha önce açıklandığı gibi 12 -CM nikotin, tütün özel nitrosamine ve polisiklik aromatik hidrokarbonlar düzeylerini belirlemek için. </li></ol> PBMC 2. izolasyonu <ol><li> (Tütün ürünlerinin olmayan tüketiciler) sağlıklı donörlerden taze kan toplayın Wake Forest Baptist Sağlık IRB 15 ayrı onayı altında aşağıda açıklandığı gibi taze kan PBMC&#39;leri izole. <ol><li> Kan torbasının varmadan önce, 500 ml şişe, makas, izolasyon tampon ve Dulbecco fosfat tamponlu tuzlu su (DPBS) (RT), bir biyogüvenlik düzeyi 2 (BSL-2) hücre kültürü kaputu hazır. İzolasyon tampon ışıktan korunmalıdır. </li><li> Baş aşağı kan torbasını tutun ve sadece borunun en az 3 cm bırakarak kenetlenmiş olan yerin altındaki tüp kesti. </li><li> 500 ml şişe kapağını çıkarın ve şişe açıklığının üzerindeki tüp tutun. Kan torbası Pick up ve kan t içine çantasından serbestçe akmasına izin için tersçanta boş dek şişe. Kan hava kabarcıkları oluşturarak önlemek için düz aşağı olarak karşı şişenin iç duvarına üzerine akmasına izin verin. </li><li> Kana izolasyon tamponunda 5: 1 oranında bir şişeye yalıtım tamponu dökün. Sonu aşırı uç, 10 kere, sıkıca şişe kapağı ve yavaşça çevirin. Oda sıcaklığında 1 saat süre ile, ışık ile kapalı inkübe hücre kültürü kaputu şişe bırakın. </li><li> Bir ışık, saman renkli tabaka kan üzerine kuracaksınız. 50 ml konik tüpler içine 25 ml serolojik pipet kullanarak bu katmanı kaldırın. Kan bağışında konuya bağlı olarak, 300 ml - toplanan miktar 50 arasında değişebilir. </li><li> Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 200 x g&#39;de tüpler santrifüjleyin. </li><li> Koyu kan renkli pelet bırakarak, saydam süpernatant aspire. Pelet gevşek ama viskoz olacaktır. </li><li> Pipet 15 ml konik tüpler içine izolasyon tampon 3 ml. </li><li> Tekrar süspansiyon pelet, S toplanan saman renkli bir sıvı, her 50 ml DPBS 20 ml ilave2.1.5 TEP. Vortex iyice karıştırın, ve birden tüpler yeniden süspanse sıvıyı pekiştirmek için. Bu sıvı, kan hücreleri askıya içerir. </li><li> Bir transfer pipeti, Aşama 2.1.8 yalıtım tamponu, 3 ml üzerine bir transfer süspansiyon kan hücreleri, 5 ml. İki ayrı katmanlar oluşturmak için yavaş ve nazikçe hücre süspansiyonu içeren 15 ml konik tüp eğin. Minimal ivme ile ve frensiz oda sıcaklığında 40 dakika için 400 xg&#39;de tüpler santrifüj. </li><li> 50 ml konik tüp içine PBMC&#39;leri içeren ortaya çıkan bulutlu orta tabaka (buffy coat) kaldırmak için bir transfer pipeti kullanın. Bunun altındaki diğer açık katmanları çizim kaçının. Her biri 50 ml konik bir tüp içine en fazla 25 mi aktarın. </li><li> Hücreleri yıkamak için (50 ml konik tüp, tüm kalan hacminin doldurulması için ya da daha fazla) akan soğuk tampon maddesi 25 ml ilave edilir. 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 400 x g&#39;de hücreleri santrifüjleyin. </li><li> Tampon çalışan 10 ml pelletini. Bu PBMC içerir. Hücreleri saymak ve im kullanındolaylı olarak ya da yer dondurma buz üzerinde. </li></ol></li></ol> 3. Dondurma ve PBMC&#39;leri Çözülme <ol><li> Santrifüj 400 x g&#39;de 10 dakika boyunca aşama 2.1.13 toplandı PBMC&#39;ler. </li><li> Üreticinin talimatlarına uygun olarak, izopropil alkol ile dondurma doldurun. DİKKAT: izopropil alkol yanıcı ve akut toksik. </li><li> % 20 fetal sığır serumu (FBS) ve% 10 dimetil sülfoksit (DMSO) ihtiva eden RPMI 1640 ortamı (4 ° C) pelet yeniden süspanse edin. Bu RPMI 1640 donma ortamıdır. 5 x 10 7 hücre / ml içeren bir süspansiyon ile sonuçlanacaktır orta dondurma bir miktar ile pelletini. Donma için kullanılabilir hücre sayısı değişecektir. </li><li> 2 mi cryotubes hücre süspansiyonu, 1 ml&#39;lik numuneler koyun ve dondurma kapta cryotubes yerleştirin. O / N depolamak ve daha sonra cryotubes çıkarın ve depolamak aktarmak için -80 ° C&#39;de bir dondurucuda cryotubes ile dondurma kap yerleştirin-190 ° C -150 ° C arasında, kriyojenik dondurucu. </li><li> Derin dondurucudaki depolamadan alınan cryotube çıkarın ve 37 ° C sıcaklıkta bir su banyosu içinde, hafifçe çalkalanarak bunun hızlı bir şekilde eritin. </li><li> Hemen,% 10 FBS,% 1 Pen / Strep ve% 1 L-glutamin içeren 10 ml RPMI 1640 ortamında (4 ° C) bir 15 mL konik tüp içine cryotube eritilir PBMC&#39;ler aktarın. çözülmüş cryotube içeriği maksimal hücre canlılığı 15 elde etmek mümkün olduğunca çabuk transfer edilmelidir. </li><li> 10 dakika boyunca 400 x g&#39;de PBMC&#39;leri santrifüj. </li><li> 5 ml RPMI 1640 tam orta ile pelletini tekrar ve hücreleri saymak. </li><li> Böyle tripan mavisi dışlama yöntemi olarak kurulan yöntemlerle hücre canlılığı ölçün. % 95 - Genel olarak, bu yöntemle hücre canlılığı ile ilgili 90&#39;dır. PBMC&#39;ler şimdi deneylerde kullanmak için hazır. </li></ol> 4. Hücre Ölümü Tespiti NOT: Burada listelenen Seyreltmeler bu stu amaçlıdırdy. seyreltikleri buna göre değiştirilebilir. <ol><li> 100 ul&#39;lik bir toplam hacme komple RPMI ortamı kullanılarak 96 oyuklu bir plaka içerisinde, WS-CM veya nikotin seyreltin / oyuk, aşağıda belirtildiği gibi. </li><li> Aşağıdaki konsantrasyonlara WS-CM seyreltilir: 0.1, 0.5, 1, 1.5, 2, (WS-CM nikotin içeriğine göre) eş-nikotin birimlerin 2,5, 3, 4, ve 5 mg / mL 12. </li><li> Aşağıdaki konsantrasyonlara RPMI ortamında nikotin seyreltilir: 100, 200, 500, 750, 1000, 2000 ve 3000 ug / ml. DİKKAT: Nikotin akut toksik ve çevreye zararlı olduğunu. </li><li> , 1 x 10 6 hücre / çukur konsantrasyonu ile her komple RPMI ortamı içinde süspansiyon haline PBMC 100 ul ekle. hücre ve WS-CM veya nikotin toplam hacmi 200 ul / oyuk olacak. </li><li> Bu çalışmanın amaçlan için, yukarıdaki gibi plakalar iki takım hazırlanır. Levhaları kapatılır ve 24 saat ve 37 ° C&#39;de 3 saat ve% 5 CO2 için, bir plaka, bir plaka inkübe edin. Gerektiği gibi zaman noktaları ayarlayın. </li&gt; <li> Buz gibi soğuk çalışan tampon 200 ul hücrelerin tekrar asılı tutulmasından son olarak, 3 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj süpernatan aspire, kapalı levha ile levhanın alt vorteks tarafından oda sıcaklığında hücreleri yıkanır ve yıkama adım bir kez daha tekrarlayın. </li><li> / Oyuk 100 ul bir toplam hacimde her bir oyuğa 7-aminoactinomycin D (7AAD) 5 ul ve ardından çalışan tampon 95 ul ekle. 15 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta plaka inkübe edin. </li><li> Küme tüplerine çalışan tampon 100 ul ekle. Küme tüplerine plakanın her kuyudan hücre süspansiyonu tüm hacmi aktarın ve akış sitometresi ile örnekleri kazanır. </li><li> Analiz yazılımı kullanılarak akış sitometrisi 7AAD-pozitif hücrelerin yüzdesi belirlenir. </li></ol> 5. EC50 belirlenmesi <ol><li> WS-CM ve nikotin EC50 değerleri PBMC&#39;lerin 7AAD pozitif boyama ile belirlenir. </li><li> EC50 değeri konsantre olarak tanımlanmaktadırentration olan hücrelerin% 50, 24 saat tahlilinde artık yaşayabilir halde olmuştur ve değerler eş-nikotin birim / ml ug olarak ifade edilir. </li><li> Bu çalışmanın amaçları için EC50 değerleri, sırasıyla, WS-CM ve nikotin 1.56 ug / ml ve 1650 ug / ml olarak tespit edildi. </li></ol> 6. Salgılanan sitokinler NOT: Burada listelenen Seyreltmeler Bu çalışmanın amacı içindir. seyreltme, uygun olarak ayarlanabilir. <ol><li> / Göz konsantrasyonunda 100 ul&#39;lik bir toplam hacme komple RPMI ortamı kullanılarak 96 oyuklu bir plaka içerisinde, WS-CM seyreltilir 0.3, 1.56, eş-nikotin birimleri 3 ve 5 ug / ml olmuştur. </li><li> Aşağıdaki konsantrasyonlara nikotin seyreltilir: 100, 200, 500, 750, 1000, 2000 ve 3000 ug / mL &#39;dir. DİKKAT: Nikotin akut toksik ve çevreye zararlı olduğunu. </li><li> , 1 x 10 6 hücre / çukur konsantrasyonu ile her komple RPMI ortamı içinde süspansiyon haline PBMC 100 ul ekle.hücre ve WS-CM veya nikotin toplam hacmi 200 ul / oyuk olacak. </li><li> Plakası kapatılır ve 37 ° C&#39;de 3 saat ve% 5 CO2 inkübe edilir. </li><li> , 3 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj süpernatan aspire, kapalı levha ile levhanın alt vorteks ve son olarak buz gibi soğuk 200 ul tampon çalışan ve yıkama adım bir kez daha tekrar eden süspansiyona, oda sıcaklığında hücreleri yıkayın. </li><li> RPMI tam orta 200 ul ekleyin ve yıkama adım bir kez daha tekrarlayın. </li><li> Her bir oyuğa 10 ug / ml LPS ortamı 200 ul ekle. </li><li> Plaka Kapak ve 4 saat, 24 saat, 48 saat ya da 37 ° C&#39;de 72 saat% 5 CO2 inkübe edilir. Gerektiğinde inkübasyon sürelerini ayarlar. </li><li> 3 dakika boyunca 300 × g plaka Santrifüj. </li><li> Adım 7 ve 8 &#39;de tahlilleri yapmak için -80 ° C&#39;de bir dondurucuda her bir ve deposundan süpernatan 175 ul al. </li></ol> 7. Sitometrik Boncuk Dizisi Testi &lt;ol&gt; <li> CBA tahlilde adım 6.10 ve kullanım hazırlanan hücre süpernatantlar çözülme. Üreticinin talimatlarına göre sitometrik boncuk dizisi (CBA) deneyi gerçekleştirmek. </li></ol> 8. IL-8 ELISA <ol><li> IL-8 ELISA adım 6.10 ve kullanım hücre süpernatantlar çözülme. Üreticinin talimatlarına göre ELISA testi yapın. </li></ol> 9. Hücre içi Boyama ve Sitometrisi NOT: Burada listelenen Seyreltmeler Bu çalışmanın amacı içindir. seyreltme, uygun olarak ayarlanabilir. <ol><li> / Göz konsantrasyonunda 100 ul&#39;lik bir toplam hacme komple RPMI ortamı kullanılarak 96 oyuklu bir plaka içerisinde, WS-CM seyreltilir 0.3, 1.56, eş-nikotin birimleri 3 ve 5 ug / ml olmuştur. </li><li> Aynı plaka aşağıdaki konsantrasyonlara nikotin seyreltik: 2, 10, 50, 100, 500, 2000 ve 4000 ug / ml. DİKKAT: Nikotin akut toksik ve çevre hazar olduğunudous. </li><li> / Oyuk 1 x 10 6 hücre yoğunluğunda RPMI tam ortam içinde süspansiyon haline PBMC 100 ul ekle. hücre ve WS-CM veya nikotin toplam hacmi 200 ul / oyuk olacak. </li><li> Plakası kapatılır ve 37 ° C&#39;de 3 saat ve% 5 CO2 inkübe edilir. </li><li> Buz gibi soğuk çalışan tampon 200 ul hücrelerin tekrar asılı tutulmasından son olarak, 3 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj süpernatan aspire, kapalı levha ile levhanın alt vorteks tarafından oda sıcaklığında hücreleri yıkanır ve yıkama adım bir kez daha tekrarlayın. </li><li> Plaka RPMI tam orta 200 ul ekleyin ve yıkama adım bir kez daha tekrarlayın. </li><li> Komple RPMI ortamı kullanılarak 2 ul / ml GolgiPlug çalışma konsantrasyonunu ve 10 ug / ml LPS hazırlamak ve her bir oyuğa 200 ul ekle. </li><li> 37 ° C&#39;de 6 saat ve% 5 CO2 plaka inkübe edin. </li><li> Aşama 9.8 sonunda tampon (4 ° C) çalıştıran ve 300 ile iplik hücreleri yıkayın4 ° C&#39;de 3 dakika boyunca x g. </li><li> Her bir oyuğa Cytofix 100 ul ilave edin ve 4 ° C&#39;de 20 dakika inkübe edilir. </li><li> 4 ° C&#39;de 3 dakika boyunca 300 x g&#39;de 1x Permwash (4 ° C) ile adım 9.9 de tarif edildiği gibi hücreler 3 kez yıkayın. </li><li> Aşağıdaki antikorların birisi her birinden 5 ul her bir göze, ardından 45 uL 1x Sitoperm ekleyin her bir göze: TNF-α-Alexa Fluor 488, IFN-γ V500 MIP-1α PE. 30 dakika boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edilir. </li><li> 1x Permwash (4 ° C) ve 4 ° C&#39;de 3 dakika boyunca 300 x g&#39;de tamponu (4 ° C) ile çalışan bir kez aşama 9.9 de tarif edildiği gibi hücreler iki kez yıkayın. </li><li> % 2 paraformaldehit (4 ° C) 200 ul tekrar süspansiyon hücreleri. 12 × 75 mm tüpler içine hücreleri aktarın ve akış sitometresinde örnekleri analiz. DİKKAT: Paraformaldehyde akut toksik ve bir sağlık tehlikesi, aşındırıcı olduğunu. </li></ol> 10. K562 Killing Testi Not: K562 hücrelerinin yetiştirilmesi gerekenRPMI tam ortam maddesi ile 37 ° C,% 5 CO2 de kültürde bu analizden önce% 80 kaynaşmaya kadar devam edilir. <ol><li> Flakon DMSO 18 ul ekleyerek suksinimidil esteri (KAKE) stok solüsyonu carboxyfluorescein 5 mM hazırlayın. </li><li> / Oyuk her bir için arzu edilen eş-nikotin birimleri veya nikotin konsantrasyonları elde etmek için 100 ul&#39;lik bir toplam hacme komple RPMI ortamı kullanılarak 96 oyuklu bir plaka içerisinde, WS-CM veya nikotin seyreltin. DİKKAT: Nikotin akut toksik ve çevreye zararlı olduğunu. </li><li> / Oyuk 1.5 x 10 6 hücre yoğunluğunda RPMI tam ortam içine PBMC 100 ul ekle. WS-CM veya nikotin ile hücrelerin toplam hacim 200 ul / kuyucuk olacak. </li><li> Plakası kapatılır ve 37 ° C&#39;de 3 saat ve% 5 CO2 inkübe edilir. </li><li> Oda sıcaklığında 8 dakika boyunca 400 xg&#39;de 10 DPBS ml ve santrifüj ekleyerek K562 hücreleri yıkayın. </li><li> DPBS 10 ml hücrelerin yeniden süspanse edin ve K562 hücreleri sayın. </li><li> KAKE worki hazırlayın1 ml DPBS için KAKE stok solüsyonu 1 ul ekleyerek ng çözümü. </li><li> 2 x 10 7 hücreleri 1 - ihtiva eden K562 hücre süspansiyonu 1 ml&#39;ye CFSE çalışma çözeltisi 1 ml ilave edilir. Vorteks ve oda sıcaklığında 2 dakika boyunca tam inkübe edin. </li><li> Hemen FBS 200 ul ekleyin. Vorteks ve oda sıcaklığında 2 dakika boyunca tam inkübe edin. </li><li> RPMI tam ortam, 10 ml ilave edilir ve oda sıcaklığında 8 dakika boyunca 400 x g&#39;de santrifüj tüpü. </li><li> RPMI Süpernatantı ve pelet kırmak ve RPMI tam orta 10 ml hücreleri tekrar süspansiyon ve KAKE-etiketli K562 hücreleri saymak. </li><li> Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile plaka PBMC&#39;ler yıkayın. Sıvı boşaltılarak süpernatant aspire. Kapağı yerine takın ve plaka alt vorteks. RPMI tam orta 200 ul ekleyin ve yıkama adım bir kez daha tekrarlayın. </li><li> (: 1.5 x 10 6 PBMC&#39;ler 100,000 K562s) PBMC levha ve ayrıca her i örnek oyuğuna 1:15 oranında CFSE etiketli K562 hücreleri ekleyin37 ° C&#39;de 5 saat ve% 5 CO2 için ncubate. </li><li> Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile hücre karışımı yıkayın. Sıvı atarak süpernatant aspire. Kapağı yerleştirin ve plaka alt vorteks. </li><li> Tampon çalışan 200 ul ekleyin ve adım 10.14 bir kez daha tarif yıkama adımı tekrarlayın. </li><li> / Oyuk 100 ul bir toplam hacimde her bir oyuğa 7AAD 5 ul ve ardından çalışan tamponu 95 ul ekle. 15 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta plaka inkübe edin. </li><li> Her bir oyuğa çalışan tampon 100 ul ilave edin ve küme tüplerine plakanın her kuyudan hücre süspansiyonu tüm hacmi transferi ve akış sitometresi ile örnekleri kazanır. </li><li> Analiz yazılımı kullanılarak akış sitometrisi 7AAD-pozitif ve CFSE-pozitif hücrelerin yüzdesi belirlenir. </li></ol>

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22How+Tobacco+Smoke+Causes+Disease%3A+The+Biology+and+Behavioral+Basis+for+Smoking-Attributable+Disease%2C+A+Report+of+the+Surgeon+General%22">How Tobacco Smoke Causes Disease: The Biology and Behavioral Basis for Smoking-Attributable Disease, A Report of the Surgeon General</a>. , U.S. Department of Health and Human Services. (2010).</li>
<li>Zeller, M., Hatsukami, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Strategic+Dialogue+on+Tobacco+Harm+Reduction%3A+a+vision+and+blueprint+for+action+in+the+US%5BTitle%5D)+AND+%22Tob.+Control%22%5BJournal%5D)">The Strategic Dialogue on Tobacco Harm Reduction: a vision and blueprint for action in the US.</a> Tob. Control. 18, 324-332 (2009).</li>
<li>Sopori, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+cigarette+smoke+on+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Effects of cigarette smoke on the immune system.</a> Nature Reviews Immunology. 2, 372-377 (2002).</li>
<li>Birrell, M. A., Wong, S., Catley, M. C., Belvisi, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+tobacco-smoke+on+key+signaling+pathways+in+the+innate+immune+response+in+lung+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Impact of tobacco-smoke on key signaling pathways in the innate immune response in lung macrophages.</a> J. Cell Physiol. 214, 27-37 (2008).</li>
<li>Laan, M., Bozinovski, S., Anderson, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cigarette+smoke+inhibits+lipopolysaccharide-induced+production+of+inflammatory+cytokines+by+suppressing+the+activation+of+activator+protein-1+in+bronchial+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cigarette smoke inhibits lipopolysaccharide-induced production of inflammatory cytokines by suppressing the activation of activator protein-1 in bronchial epithelial cells.</a> J. Immunol. 173, 4164-4170 (2004).</li>
<li>Moodie, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+and+cigarette+smoke+alter+chromatin+remodeling+but+differentially+regulate+NF-kappaB+activation+and+proinflammatory+cytokine+release+in+alveolar+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+J%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress and cigarette smoke alter chromatin remodeling but differentially regulate NF-kappaB activation and proinflammatory cytokine release in alveolar epithelial cells.</a> Faseb J. 18, 1897-1899 (2004).</li>
<li>Oltmanns, U., Chung, K. F., Walters, M., John, M., Mitchell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cigarette+smoke+induces+IL-8%2C+but+inhibits+eotaxin+and+RANTES+release+from+airway+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Respir.+Res%22%5BJournal%5D)">Cigarette smoke induces IL-8, but inhibits eotaxin and RANTES release from airway smooth muscle.</a> Respir. Res. 6, 74(2005).</li>
<li>Vayssier, M., Favatier, F., Pinot, F., Bachelet, M., Polla, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco+smoke+induces+coordinate+activation+of+HSF+and+inhibition+of+NFkappaB+in+human+monocytes%3A+effects+on+TNFalpha+release%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Tobacco smoke induces coordinate activation of HSF and inhibition of NFkappaB in human monocytes: effects on TNFalpha release.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 252, 249-256 (1998).</li>
<li>Witherden, I. R., Vanden Bon, E. J., Goldstraw, P., Ratcliffe, C., Pastorino, U., Tetley, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+human+alveolar+type+II+epithelial+cell+chemokine+release%3A+effects+of+cigarette+smoke+and+neutrophil+elastase%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Cell+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Primary human alveolar type II epithelial cell chemokine release: effects of cigarette smoke and neutrophil elastase.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 30, 500-509 (2004).</li>
<li>Hatsukami, D. K., Biener, L., Leischow, S. J., Zeller, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco+and+nicotine+product+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Nicotine+Tob.+Res%22%5BJournal%5D)">Tobacco and nicotine product testing.</a> Nicotine Tob. Res. 14, 7-17 (2012).</li>
<li>Ashley, D. L., Backinger, C. L., van Bemmel, D. M., Neveleff, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco+Regulatory+Science%3A+Research+to+Inform+Regulatory+Action+at+the+Food+and+Drug+Administration%27s+Center+for+Tobacco+Products%5BTitle%5D)+AND+%22Nicotine+Tob.+Res%22%5BJournal%5D)">Tobacco Regulatory Science: Research to Inform Regulatory Action at the Food and Drug Administration's Center for Tobacco Products.</a> Nicotine Tob. Res. , (2014).</li>
<li>Arimilli, S., Damratoski, B. E., Bombick, B., Borgerding, M. F., Prasad, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+cytotoxicity+of+different+tobacco+product+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Regul.+Toxicol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of cytotoxicity of different tobacco product preparations.</a> Regul. Toxicol. Pharmacol. 64, 350-360 (2012).</li>
<li>Gao, H., Prasad, G. L., Zacharias, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+cell-specific+cytotoxic+responses+of+oral+cavity+cells+to+tobacco+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Differential cell-specific cytotoxic responses of oral cavity cells to tobacco preparations.</a> Toxicol In Vitro. , (2012).</li>
<li>Arimilli, S., Damratoski, B. E., Prasad, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combustible+and+non-combustible+tobacco+product+preparations+differentially+regulate+human+peripheral+blood+mononuclear+cell+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Combustible and non-combustible tobacco product preparations differentially regulate human peripheral blood mononuclear cell functions.</a> Toxicol. In Vitro. 27, 1992-2004 (2013).</li>
<li>Arimilli, S., Damratoski, B. E., Chen, P., Jones, B. A., Prasad, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+of+leukocyte+subsets+from+fresh+and+cryopreserved+peripheral+blood+mononuclear+cells+in+clinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cryo+Letters%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation of leukocyte subsets from fresh and cryopreserved peripheral blood mononuclear cells in clinical research.</a> Cryo Letters. 33, 376-384 (2012).</li>
<li>Schmid, I., Krall, W. J., Uittenbogaart, C. H., Braun, J., Giorgi, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dead+cell+discrimination+with+7-amino-actinomycin+D+in+combination+with+dual+color+immunofluorescence+in+single+laser+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Dead cell discrimination with 7-amino-actinomycin D in combination with dual color immunofluorescence in single laser flow cytometry.</a> Cytometry. 13, 204-208 (1992).</li>
<li>Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+multiparametric+flow+cytometry-based+cytotoxicity+assay+simultaneously+immunophenotypes+effector+cells%3A+comparisons+to+a+4+h+51Cr-release+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay.</a> J. Immunol. Methods. 325, 51-66 (2007).</li>
<li>Taga, K., Yamauchi, A., Kabashima, K., Bloom, E. T., Muller, J., Tosato, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target-induced+death+by+apoptosis+in+human+lymphokine-activated+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Target-induced death by apoptosis in human lymphokine-activated natural killer cells.</a> Blood. 87, 2411-2418 (1996).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan eder.

Ve biz daha önce TPPs PBMC&#39;lerin tedavi ifadesi ve sitokinler ve hedef hücre 14 öldürme fonksiyonel önlemlerin salgısı dahil olmak üzere çeşitli yanıtları bastırdığını göstermiştir. Bir önceki çalışmada tarif deneysel yöntemler daha uzun kuluçka dönemleri gerektiren ve büyüklüğü 14 mütevazı idi. Temel için bu cazip ex vivo model potansiyel uygulamalarını göz önüne alındığında ve uygulamalı araştırma, bu çok aşamalı biyolojik deneylerde deney parametrelerinin herhangi optimize olabilir ...

Kardiyovasküler hastalık (CVD), kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH) ve kanser gibi kronik 1,2 sigara içiminin olumsuz sağlık etkileri için bilgi noktalarının önemli bir vücut. Kronik sigara içiminin inflamasyon ve immün baskılanması neden olduğu bilinmektedir ve bu değişiklikler sigara içenlerde 3 mikrobiyal enfeksiyon ve kanser riskine katkıda bildirilmektedir. In vitro ve ex vivo teknikleri yararlıdır patofizyolojik etkileri moleküler temelini aydınlatılmasında sigara dumanı 4-9 (Tablo 1) ve çeşitli tütün ürünleri 10,11 ortaya çıkan yönetmelik yönlendirmek için önemli araçlar olarak kabul edilmektedir. Örneğin, biz böyle bütün duman klimalı ortamda (WS-CM) ve toplam partikül madde (TPM) gibi yanıcı tütün ürünü preparatları (TPPs) çok daha sitotoksik ve zarar için olduğunu göstermiştirYanıcı olmayan TPPs veya nikotin 12,13 den DNA. Yayınlanan çalışma ile tutarlı olarak, son zamanlarda yanıcı TPPs veya nikotin 12,13 olduğu bildirildi. Yayınlanan çalışma ile uyumlu olarak, son zamanlarda yanıcı TPPs belirgin immunosupresyonun neden olduğunu bildirdi. Bu reseptör (TLR) -ligands gibi Toll- bastırılması ile kanıtlanmıştır, ex vivo modelde 14 PBMC&#39;ler tarafından öldürülmesi (K562) sitokin salınımını stimüle, ve hücre hedefli. Sigara dumanı kaynaklı hastalık süreçlerindeki enflamasyon önemi göz önüne alındığında, sigara dumanı, bağışıklık düzenleyici etkilerini değerlendirmek için test koşulları daha fazla optimizasyon Bu raporda sunulan edilir. Ex vivo tahliller tipik olarak hücre içi ölçülmüş ve sitokinler gibi tahliller 14 öldürme k562 hücresinin sitotoksik T ve NK hücrelerinin sitolitik fonksiyon salgılanan. deneyler, WS-CM ve nikotin ile PBMC&#39;nin sonraki stimülasyonu ile ön inkübasyon söz konusuTLR ile s, 3 günlük bir süre boyunca agonistleri; son okumalar enzim bağlı immünosorbent deneyleri (ELISA) kullanılarak ve / ya da akış sitometrisi uygulanır. Bu TLR-4 reseptörlerine bağlanmakta ve PBMC&#39;ler, hücre içi sitokin ve sitokinlerin sekresyonu üretimi ile sonuçlanan uyaran bakteriyel lipopolisakkarid (LPS) kullandı. Izole PBMC&#39;ler, hücre ölümü deneyleri ve IL-8 miktar tayini için TPPs, aynı zamanda, bu yöntem immünomodülatör etkisini değerlendirmek için çeşitli deney adımları optimizasyonuna ek olarak. Bu yöntemler, diğer araştırma soruları için uygulanan ve düzenleyici bağlamda, tütün ürünler için özel olarak rafine edilebilir. Tablo 1. in vitro raporları Yayınlandı ve ex vivo yöntemler tütün ürünü hazırlıkları varilus patofizyolojik etkilerini incelemek için kullanılan CS, sigara dumanı ortamı.; CSC, sigara duman yoğunluk; CSE, sigara dumanı özü; ELISA immünosorbent deneyi enzim-bağlı; GADPH, gliseraldehid 3-fosfat dehidrojenaz; QPCR, kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu; RT, gerçek zamanlı kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu; TS, tütün dumanı. <table><tbody><tr><td> Yazar (Ders yılı) </td><td> Schouwburgplein ve ark. (2004) </td><td> Moodie ve ark. (2004) </td><td> Oltmanns ve ark. (2005) </td><td> Vayssier (1998) </td><td> Witherden ve ark. (2004) </td><td> Birrell ve ark. (2008) </td></tr><tr><td> Hücreler kullanılan </td><td> İnsan bronş endotel hücreleri (BEAS-2B), insan nötrofil </td><td> İnsan alveolar epitel hücreleri (A549) </td><td> İnsan solunum yolu düz kas hücreleri (HASMC) </td><td> İnsan premonocytic U937 hücreleri, insan monositleri </td><td> Alveoler tip II epitel hücreleri (ATII) </td><td> İnsan monositikhücre hattı (THP-1), insan akciğer makrofajlar </td></tr><tr><td> DYP kullanılan </td><td> CSE </td><td> CSC </td><td> CSE </td><td> TS </td><td> CSE </td><td> CS </td></tr><tr><td> Yöntem kullanılan </td><td> ELISA, QPCR, göç, Elektrodevingenlik kayması </td><td> Immunhisto kimya, elektroforez, Arrayscan seti, RT-PCR, ELISA </td><td> ELISA, RT-PCR, qPCR, elektroforez </td><td> Jel-mobilite kayma </td><td> Işık mikroskobu, elektron mikroskobu, elektroforez, ELISA </td><td> QPCR ELISA, E-toxate kiti (Sigma), p65, plaka deneyi (TransAM), elektroforez, çeşitli bağışıklık kitleri </td></tr><tr><td> Tedbir </td><td> IL-8, GM-CF, AP-1, NF-KB, göç </td><td> Histon asetiltransferazlar histon deasetilazlar, NF-KB, IL-8, ul kB-α, GADPH </td><td> HO-1, GADPH, RANTES, IL-8, eotaksin </td><td> Isı şok / stres proteinleri (HSP / Hsp70), HF transkripsiyon faktörü NF-KB,TNF-α </td><td> Yüzey Aktif protein (SP-A, SP-C), IL-8, MCP-1, GRO-α, TNF-α, IL-1β, IFN-γ </td><td> IL-8, IL-1β, IL-6, TNF-α, MIP1-α, GRO-α MAPK / JNK / ERK fosforilasyonu, cJun: DNA bağlama, glutatyon, p65: DNA bağlama </td></tr><tr><td> Sonuç </td><td> CSE AP-1 aktivasyonu bastırılması yoluyla sitokin üretimini aşağı-düzenler. </td><td> H 2 O 2 ve CSC farklı olarak, histon deasetilaz etkinliğini azaltmak, histon proteinlerin asetilasyonunu geliştirmek proinflamatuvar sitokin salınımını düzenler. </td><td> Sigara dumanı, sigara dumanı TNF-α,% 20 CSE daha az, IL-8 salıverilmeleri, eotaksin inhibisyonu ve RANTES tarafından geliştirilmiş HASMC IL-8 salıverilmesini neden olabilir. </td><td> TH Hsp70 ekspresyonu ve aktivitesi ve TNF-α serbest bağlanma NFkB&#39;nin inhibe edilmesi ile ilişkili HF transkripsiyon faktörü, aktif. </td><td> Azaltılmış ATII hücresinden türetilmiş kemokin düzeyleri ile uygun düşmek Alveolar onarım, sigara dumanı kaynaklı alveol hasarı ve amfizem katkıda bulunmaktadır. </td><td> Veriler neden sigara arttı solunum yolu enfeksiyonları için mekanistik açıklama. Doğal tepkinin bastırılması, IL-8 bir artış eşlik etmektedir. </td></tr></tbody></table>

<table><tbody><tr><td>12 x 75 mm tüpler</td><td>BD Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>15 ml konik tüpler</td><td>Corning</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>2 ml mikrotüpler</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C-S</td><td></td></tr><tr><td>3R4F referans sigaralar</td><td>Kentucky Üniversitesi, Ziraat Fakültesi</td><td>3R4F</td><td></td></tr><tr><td>50 ml konik tüpler</td><td>Corning</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>500 ml şişe</td><td>Corning</td><td>430282</td><td></td></tr><tr><td>7AAD</td><td>BD Pharmingen</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>96 oyuklu düz tabanlı plaka</td><td>Termo Nunc</td><td>439454</td><td></td></tr><tr><td>96 oyuklu yuvarlak alt plakalar</td><td>BD Falcon</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>Hücre kültürü davlumbazı</td><td>Thermo Scientific</td><td>1300 Serisi A2</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>58110R</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Moleküler Problar Yaşam Teknolojileri</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>Küme tüpleri</td><td>Corning</td><td>4401</td><td>Yutulması halinde zararlı, kanserojen</td></tr><tr><td>Cytofix/Cytoperm (Permwash)</td><td>BD Biosciences</td><td>555028</td><td>Yanıcı</td></tr><tr><td>DMSO (dimetil sülfoksit)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Lonza</td><td>17-512F</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>FCAP Dizisi</td><td>BD Biosciences</td><td>652099</td><td>Yazılımı, CBA verilerini analiz eder</td></tr><tr><td>Filtre ünitesi</td><td>Nalgene</td><td>156-4020</td><td></td></tr><tr><td>Akış sitometresi</td><td>BD Biosciences</td><td>FACS Canto II</td><td>8 renk, Ex 405 ve Em 785'te.</td></tr><tr><td>Akış sitometresi,</td><td>BD Biosciences,</td><td>FACS, Calibur</td>, <td>Ex 495 ve Em 785'te 4 renk.</td></tr><tr><td>Akış sitometrisi analiz yazılımı</td><td>Tree Star</td><td>FlowJo</td><td></td></tr><tr><td>Dondurma kabı</td><td>Nalgene</td><td>5100-0001</td><td>DMSO, tahriş edici</td></tr><tr><td>GogliPlug</td><td>BD Biosciences</td><td>555029</td><td>Kanserojen, tahriş edici, aşındırıcı</td></tr><tr><td>içerir H2SO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>339741</td><td></td></tr><tr><td>İnsan İnflamatuar Sitokin Kiti</td><td>BD Biosciences</td><td>551811</td><td></td></tr><tr><td>IFN-&gama; V-500 Antikor</td><td>BD Horizon</td><td>561980</td><td>cilt hassaslaştırıcı</td></tr><tr><td>IL-8 ELISA Kiti</td><td>R ve D Sistemleri</td><td>DY208</td><td></td></tr><tr><td>İzolasyon tamponu</td><td>İzolenf, CTL Scientific Corp.</td><td>1114868</td><td>Yanıcı sıvı, tahriş edici</td></tr><tr><td>İzopropil alkol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W292907</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>LPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2630</td><td></td></tr><tr><td>MIP1-&alfa; PE Antikoru</td><td>BD Pharmingen</td><td>554730</td><td>Akut toksisite, oral</td></tr><tr><td>Monensin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5273</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Nikotin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3876</td><td>Akut toksisite, çevresel tehlike</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>" M"</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Yanıcı, cilt tahrişi</td></tr><tr><td>Kalem/strep</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Çalışma tamponu</td><td>MACS Koşu Tamponu, Miltenyi Biotech</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>Th1/Th2 CBA Kiti</td><td>BD Biosciences</td><td>551809</td><td></td></tr><tr><td>TNF-&alfa; Alexa Fluor 488 Antikor</td><td>BioLegend</td><td>502915</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipeti</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-20</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr></tbody></table>

yöntem yanıcı tütün Ürün müstahzarların sitotoksisite ve immünosupresyonun değerlendirin

Methods to Evaluate Cytotoxicity and Immunosuppression of Combustible Tobacco Product Preparations

Diğer patofizyolojik değişiklikler arasında, sigara dumanı kronik bir maruziyetin, mikrobik enfeksiyonlar ve tümör insidansı içenlerin artan hassasiyet ile bağlantılı olan enflamasyon ve bağışıklık bastırılması neden olur. Ex vivo insan periferal kan tek-çekirdekli hücrelerinde reseptör aracılı bağışıklık tepkilerinin bastırılması (PBMC) duman bileşenleri ile tedavi mekanizmaları incelemek ve tütün ürünlerine maruz muhtemel uzun vadeli etkilerini değerlendirmek için cazip bir yaklaşımdır. Burada, bakteriyel lipopolisakarit, bir Toll benzeri reseptör 4 ligand ile uyarılmış PBMC ile eks vivo tahliller yapmak için yöntemler iyi duruma getirilmiştir. Bütün duman koşullu ortam (WS-CM) etkileri, yanıcı bir tütün ürünü preparatı (TPP) ve nikotin ex vivo deneylerde PBMC&#39;ler tarafından sitokin salgılanması ve hedef hücre öldürme etkisi incelenmiştir. Bu göstermektedir ki, salgılanan sitokinler, IFN-γ, TNF, IL-10, IL-6 ve IL-8 ve hücre içi sitokin IFN-47 ;, TNF-α ve MIP-1α WS-CM-maruz kalan PBMC&#39;de bastırıldı. bir K562 hedef hücre öldürme deneyi ile belirlendiği gibi efektör PBMC sitolitik fonksiyon aynı zamanda, WS-CM maruz bırakılarak indirgenmiştir; Nikotin, bu deneylerde minimal bir etkiye sahip olmuştur. Özet olarak, eks vivo deneylerde TPPs etkilerini değerlendirmek için geliştirilmiş deneylerde, bir dizi mevcut ve bu yöntemler, hali hazırda ilgi konusu olan diğer ürünlerin test edilmesi için adapte edilebilir.

Sonuçlar ortalama (dört verici numuneleri), ortalama ± standart hatası olarak sunuldu. işlem görmüş ve görmemiş kontrol numuneleri arasındaki Student t-testi, karşılık gelen kontrol Tüm tedaviler için Excel yazılımı hem de t-testi karşılaştırmaları kullanılarak gerçekleştirilmiştir. İstatistiksel anlamlılık ile tespit edildi: * P &lt;0.05; ** P &lt;0.005; *** P &lt;0.0005. WS-CM ve nikotin maruz kalma etkisini ölçmek için PBMC, 3 saat ya da 24 saat boyunca farklı WS-CM konsantrasyonlarda ve ...

Optimize edilmiş insan periferik kan mononükleer hücresi (PBMC) ex vivo tahlilleri kullanarak, yanıcı bir tütün ürünü preparatının, efektör PBMC'lerin reseptör aracılı hücre içi salgılanan sitokinleri ve sitolitik yeteneğini belirgin şekilde baskıladığını gösterdik. Bu hızlı tahliller, ürün değerlendirmesinde ve tütün maruziyetinin potansiyel uzun vadeli etkilerinin anlaşılmasında faydalı olabilir.

Yöntem Yanıcı Tütün Ürün Müstahzarların Sitotoksisite ve immünosupresyonun değerlendirin

Among other pathophysiological changes, chronic exposure to cigarette smoke causes inflammation and immune suppression, which have been linked to ...

Bu prosedürün genel amacı, tütün ürünü hazırlığının P BMC'ler tarafından sitokin salgılanması ve hedef hücre öldürülmesine etkilerini değerlendirmektir. Bu işlem, öncelikle kültürlenmiş P BMC'lerin tam duman koşulu, besiyeri veya nikotin ile tedavi edilmesiyle gerçekleştirilir ve ardından tedavi edilen p BMC'lerin sitokin üretimlerini belirlemek için hücre içi boyama yapılır. Alternatif olarak, CFSE işaretli K 5 62 hücreleri, tam duman koşullu besiyeri ile tedavi edilmiş PBMC efektör hücreleri ile birlikte kültüre edilir ve K 5 62 hücrelerinin canlılığı seven A a d boyaması ile nitelendirilir.Nihayetinde, yanıcı tütün ürünü preparatlarının P BMC'ler üzerindeki etkileri, her iki analizden elde edilen verilerle akış sitometrisi kullanılarak ölçülür. Tekniklerimizin veya kromyum salınım analizi ya da ALI spot gibi mevcut yöntemlerin temel avantajları, yöntemlerimizin yüksek kapasiteli olması, radyoaktif madde içermemesi ve hücre fonksiyonelliğini ölçebilmemizdir. Bu yöntem, tütün ürünü preparatlarının biyolojik etkileri hakkında bilgi sağlayabilir.Bu yöntem, PBMC efektör hücrelerinin tollike reseptör aracılı ve STIC fonksiyonlarını etkileyen diğer bileşiklerin değerlendirilmesi için de uygulanabilir. Boyama işlemine başlamadan önce; tüm duman koşulunu, ortamı ve nikotini, 96 kuyucuklu bir plakadaki kuyucuk başına toplam 100 µL hacme ulaşacak şekilde RPMI komple ortamı içerisinde belirtilen konsantrasyonlarda seyreltin.Ardından, her kuyucuk için toplam 200 µL hacme ulaşacak şekilde, tam besiyerinde 1 × 10⁶ hücre/kuyucuk konsantrasyonunda süspanse edilmiş 100 µL P BMC ekleyin. Daha sonra, plakayı kapatın ve 37 °C'de %5 CO2 ortamında inkübe edin. Üç saat sonra, hücreleri yıkayın ve süpernatantı aspire edin.Ardından plakayı tekrar kapatın ve peletleri dağıtmak için vorteksleyin. Hücreleri iki kez daha yıkayın; bir kez buz gibi soğuk çalışma tamponu ile ve ikinci yıkamadan sonra bir kez tam besiyeri ile yıkayın. Hücreleri, kuyuk başına 200 µL Golgi plug ve LPS takviyeli tam besiyeri ile 37 °C ve %5 CO2'de altı saat boyunca inkübe edin.Ardından hücreleri buz gibi soğuk akış tamponu ile yıkayın ve 4 °C'de 20 dakika boyunca her kuyucuğa 100 µL cyto fix uygulayın, hücreleri buz gibi soğuk perm wash ile üç kez yıkayın. Sonra her kuyucuğa 45 µL cyto perm ve ardından listelenen antikorların her birinden 5 µL ekleyin. 4 °C'de 30 dakika bekledikten sonra hücreleri üç kez yıkayın ve 200 µL buz gibi soğuk, %2 paraformaldehit ile sabitleyin.Ardından hücreleri 12 x 75 mm'lik tüplere aktarın ve örnekleri bir akış sitometresinde analiz edin. Az önce gösterildiği gibi tütün ürünü ile işlem görmüş PBMC'lerden oluşan bir plaka hazırladıktan sonra, %80 konfluens düzeyinde hasat edilmiş bir K 5 62 hücresi kültürünü 10 mL DPBS ile yıkayın. Pelleti 5 mL DPBS içinde süspande edin ve hücreleri sayın.Ardından, bir mililitre komple medyuma alınmış 1 ila 2 x 10⁷ K 5 62 hücresine, taze hazırlanmış bir mililitre CFSE çalışma çözeltisi ekleyin ve hücre boyasını vorteksleyerek dağıtın. Hücreleri oda sıcaklığında inkübe edin; tam iki dakika sonra 200 mikrolitre FBS ekleyin ve hücreleri tekrar vorteksleyip iki dakika daha inkübe edin. İkinci inkübasyondan sonra hücreleri 10 mililitre komple medyum ile yıkayın, ardından pelletini başka bir 10 mililitre komple medyum içinde yeniden süspande edin ve hücreleri sayın.Şimdi tütün ile işlem görmüş p BMC'leri santrifüjleyin ve süpernatantı dökün. Ardından kapağı kapatın, hücreleri vorteksleyerek yeniden süspansiyona alın ve her kuyucukta 200 µL komple medyum ile yıkayın. Öldürme testi ile başlatmak için, CFSE etiketli K 5 62 hücrelerini 1:15 oranında pbmc'lere ekleyin ve ko-kültürü 37 °C ve %5 CO2'de inkübe edin.Beş saat sonra, hücreleri çöktürmek için santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Pelletleri vorteksleyerek süspansiyon haline getirin ve ardından hücreleri kuyuk başına 200 µL yürütme tamponu ile yıkayın; daha sonra 95 µL yürütme tamponu ve ardından kuyuk başına toplam 100 µL hacme ulaşacak şekilde beş mikrolitre seven A a d ekleyin. Son olarak, hücreleri oda sıcaklığında, karanlıkta 15 dakika boyunca inkübe edin.Ardından her kuyucuğa 100 µL çalıştırma tamponu ekleyin ve yedi a a D ile CFSE pozitif hücrelerin yüzdesini belirlemek için tüm hacmi uygun karşılık gelen faks tüplerine aktarın. Akış sitometrik analizle, tüm duman kondisyonlu ortam ile 24 saatte hücre ölümünde doz bağımlı bir artış gözlemlenmiş olup, mililitre başına dört mikrogram eşdeğer nikotin biriminde hücrelerin yaklaşık %80'inin ölü olduğu görülmüştür. Bununla birlikte, pBMC'lerin sadece üç saat boyunca tedavi edilmesi, tüm duman kondisyonlu ortamın 24 saatteki mililitre başına beş mikrogram eşdeğer nikotin birimlerinde bile anlamlı bir toksisite ile sonuçlanmamaktadır.Üç saat sonra 3000 µg/mL nikotin tedavisine kadar benzer derecede hücre ölümü gözlemlenmemiştir; nikotin tedavisi, tüm duman koşulu ortamı ve nikotinin 2000 µg/mL konsantrasyondaki tedavisine kadar ölçülebilir hücre ölümüne neden olmaz. Bunu takiben LPS ile TLR4 reseptörünün stimülasyonu, salgılanan sitokinlerde doza bağımlı bir azalma ile sonuçlanır; ancak baskılanma derecesi bireysel sitokinler arasında farklılık göstermektedir. Ayrıca, hücreler LPS ve Golgi plug ile sadece altı saat boyunca birlikte tedavi edildiğinde, tüm duman koşulu ortamına maruz kalma sonrası, nikotin maruziyetine kıyasla daha düşük eşdeğer nikotin birimi konsantrasyonlarında bile hücre içi sitokin pozitif hücre sayısında bir azalma gözlemlenir.Nitekim, bu öldürme deneyinin sonuçları, 1.56 µg/mL bütün sigara dumanı koşullu ortamına maruz kalmanın, kontrol grubu ve daha düşük doz konsantrasyonlarına kıyasla efektör PBMC popülasyonunun öldürme yeteneğini önemli ölçüde azalttığını göstermektedir. Öte yandan, yüksek veya düşük konsantrasyonlardaki nikotin tedavisi, efektör PBMC popülasyonunun öldürme yeteneğine müdahale etmemektedir. Bu prosedürler uygulanırken CFSE etiketlemesinin yanı sıra antikor dilüsyonları, etiketleme süresi ve inkübasyon sıcaklıklarında hassas davranmak önemlidir.Bu videoyu izledikten sonra, tütün ürünü preparatlarının veya diğer tedavilerin periferik kan mononükleer hücreleri üzerindeki etkilerini belirlemek için akış sitometrisinde antikor işaretleme tekniklerinin nasıl kullanılacağına dair iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.

methods-to-evaluate-cytotoxicity-immunosuppression-combustible

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Pulmoner farelerin solunum yolu epitel hücreleri izole ve farklılaşmış bir solunum yolu epitel bir model olarak hava-sıvı arayüzü kültüre olabilir. Bu çevresel toksin moleküler yanıtların incelemek üzere bir protokol, tecrit, kültür ve bu hücreler ana sigara dumanına maruz için tarif edilir.

Hava Sıvı Arabirimi Fare Solunum Epitel Hücreleri ve Deneysel sigara dumanına maruz kalma izolasyonu

Bu video, tütün ürünü preparatlarının, TPP'lerin, akış sitometrisi kullanılarak insan periferik kan mononükleer hücrelerinden sitokin üretimi üzerindeki etkisini göstermektedir. Hücrelerin TPP ile tedavisi, lipopolisakkarit stimülasyonundan sonra tahmin edilen proinflamatuar sitokinlerin üretimini aşağı regüle eder, ardından immün boyama ve akış sitometrisi analizi yapılır.

Tütün Ürünü Preparatlarının Sitokin Üretimi Üzerine Etkisinin Hücre İçi Boyama ve Akış Sitometrisi ile İncelenmesi

Bu videoda, yanıcı bir tütün ürünü hazırlığı olan tamamen dumanla şartlandırılmış bir ortamın, efektör periferik kan mononükleer hücreleri tarafından K562 hücresinin öldürülmesi üzerindeki etkisini inceliyoruz.

Tütün Ürünü Preparatlarına Maruz Kalan Periferik Kan Mononükleer Hücreleri Tarafından K562 Hücrelerinin Öldürülmesi

Bu video, WST-1 testi yoluyla insan hassas kesimli akciğer dilimlerinde sitotoksisiteyi değerlendirmek için bir tekniği göstermektedir. İnsan hassas kesilmiş akciğer dilimleri, sitotoksisitelerini ölçmek için artan sitotoksik konsantrasyonlara tabi tutulur. Renk yoğunluğundaki bir azalma, kimyasalın akciğer hücreleri üzerindeki zararlı etkisinin doğrulanması olarak işlev görür.

İnsan Hassas Kesilmiş Akciğer Dilimlerinde Kimyasal Olarak İndüklenen Sitotoksisiteyi Ölçmek İçin Bir Test

Bu protokolün amacı, insan organotipik 3D bronşiyal ve burun dokusu modellerini hava-sıvı arayüzünde ana akım sigara dumanına (CS) maruz bırakmaktır. CS'nin dokular üzerindeki etkisi daha sonra bir sitokrom P450 aktivite testi, bir kirpik atma ölçümü ve bir sistem biyolojisi yaklaşımı kullanılarak araştırılmaktadır.

Tüm Sigara Dumanına Organotipik 3D Bronşiyal ve Burun Doku Kültürü Modelleri Tekrarlanan Pozlama Etki Değerlendirmesi

Çalışmanın amacı, empedans tabanlı gerçek zamanlı hücre analizörü ve in vitro toksikolojik değerlendirme için yüksek içerikli tarama (HCS) tabanlı bir platformun bir kombinasyonunu kullanarak 15 sigara dumanı bileşeninin biyolojik etkisini değerlendirmekti. Bu çalışma, test edilen bileşiklerin etkili dozları, toksisitesi ve etki şekilleri hakkında bilgi sağlar.

Zararlı ve Potansiyel Zararlı Bileşenlerinin Toksikolojik etkilerinin değerlendirilmesi için yüksek İçerik Tarama Analizi (HPHC)

Bu protokol, kemirgenleri elektronik sigara buharı (E-buhar) ve sigara dumanına maruz bırakmaya yönelik bir yöntemi açıklamaktadır. Maruz kalma odaları, anestezi odalarını, kemirgenlere E-buhar veya sigara dumanı veren otomatik bir pompalama sistemi ile modifiye ederek yapılır. Bu sistem birçok deneysel son noktayı barındıracak şekilde kolaylıkla değiştirilebilir.

Bir Elektronik Romanda Elektronik Sigara Buharı ve Sigara Dumanının Etkilerinin Karşılaştırılması<emIn vivo</em&gt; Pozlama Sistemi

Burada, geleneksel sigara duman ve elektronik sigara aerosol özleri oluşturmak için kullanılan bir programlanabilir laboratuvar cihaz açıklayın. Bu yöntem geleneksel sigara ve elektronik sigara arasında doğrudan karşılaştırmalar yapmak için yararlı bir araç sağlar ve elektronik sigara araştırma içine erişilebilir giriş noktasıdır.

Sıvı özleri geleneksel sigara duman ve elektronik sigara Aerosol gelen nesil için aygıt mikroişlemci işletilen

3Rs prensibi içinde görüş-in seçimli-e doğru hayvan çalışmaları olarak solunum modelleri gelişmektedir. Özellikle solunum maddelerin risk değerlendirmesi için uygun deneyleri eksikliği vardır. Burada, biz insan hassas kesim akciğer dilimleri hava maddelerin değerlendirilmesi için nasıl kullanılacağını açıklar.

Sitotoksik değerlendirilmesi ve insan hassas kesim akciğer dilimleri maddelerin etkileri Immunomodulatory

Elektronik Sigara (e-cig) kullanıcılar dünya çapında artıyor. Az, ancak, inhale e-cig aerosoller tarafından indüklenen sağlık etkileri hakkında bilinir. Bu makalede, bir e-cig aerosol üretimi tekniği hayvan Etkilenmeler ve sonraki toksikolojik çalışmalar için uygun. Böyle protokolleri deneysel olarak tekrarlanabilir ve standart e-cig pozlama sistemleri kurmak için gereklidir.

Elektronik Sigara Aerosol üçüncü nesil makine-Vaping aygıt tarafından nesil: toksikolojik çalışmalar uygulamaya

Hava-sıvı arayüzünde esrar buharı maruziyetini incelemek için standartlaştırılmış bir in vitro model oluşturuyoruz. Bu model, buharlaştırılmış esrarın etkilerini incelemek için sistematik bir yaklaşım sunmakta ve sigaraya alternatif olarak kenevir buharlaştırıcılarına artan ilgiyi ele almaktadır.

Laboratuvar ortamında Hava-sıvı arayüzünde akciğer epitel hücrelerinin esrar maruziyetleri

Öğrenin, tütün ürünü müstahzarlarının insan periferik kan mononükleer hücreleri üzerindeki sitotoksisite ve immünosupresyon etkilerini değerlendirmek için akış sitometrisi kullanarak bu yüksek verimli yöntemi.

Yöntem Yanıcı Tütün Ürün Müstahzarların Sitotoksisite ve immünosupresyonun değerlendirin

Daha fazla video keşfet