Yöntem Yanıcı Tütün Ürün Müstahzarların Sitotoksisite ve immünosupresyonun değerlendirin

Bu prosedürün genel amacı, tütün ürünü hazırlamanın sitokin salgılanması ve P BMC'ler tarafından hedef hücre öldürme üzerindeki etkilerini değerlendirmektir. Bu, önce kültürlenmiş P BMC'lerin tam duman durumu, ortam veya nikotin ile muamele edilmesiyle gerçekleştirilir ve daha sonra sitokin üretimini belirlemek için tedavi edilen p BMC'lerin hücre içi boyanması gerçekleştirilir. Alternatif olarak, CFSE etiketli K 5 62 hücreleri, tam duman şartlandırılmış orta muameleli PBMC efektör hücreleri ile ko-kültürdür ve K 5 62 hücrelerinin canlılığı yedi A d boyama ile nitelendirilir.

Sonuç olarak, yanıcı tütün ürünü preparatlarının her iki testten de P BMC'ler üzerindeki etkileri akış sitometrisi ile ölçülür. Tekniklerimizin veya krom salınım testi veya ALI lekesi gibi mevcut yöntemlerin temel avantajları, yöntemlerimizin yüksek verim olması, radyoaktif olmaması ve hücre işlevselliğini ölçebilmemizdir. Bu yöntem, tütün ürünü preparatlarının biyolojik etkileri hakkında fikir verebilir.

Boyama işlemine başlamadan önce PBMC efektör hücrelerinin tolike reseptör aracılı ve STIC fonksiyonlarını etkileyen diğer bileşiklerin değerlendirilmesine de uygulanabilir. Tüm duman koşulunu, ortamı ve nikotini listelenen konsantrasyonlarda seyreltin. RPMI'de, 96 oyuklu bir plakada kuyu başına toplam 100 mikrolitre hacme kadar tam orta.

Daha sonra, oyuk başına toplam 200 mikrolitre hacim için oyuk başına altı hücreye bir kez 10 ila 10 konsantrasyonda tam ortamda süspanse edilmiş 100 mikrolitre P BMC ekleyin. Ardından, plakayı örtün ve 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de inkübe edin. Üç saat sonra, hücreleri yıkayın ve süpernatanı aspire edin.

Ardından plakayı tekrar örtün ve peletleri ayırmak için girdaplayın. Hücreleri iki kez daha yıkayın, bir kez buz gibi soğuk çalışma tamponunda ve ikinci yıkamadan sonra bir kez tam ortamda. Bunları, 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de altı saat boyunca Golgi fişi ve LPS ile desteklenmiş tam ortam kuyusu başına 200 mikrolitre ile tedavi edin.

Daha sonra hücreleri buz gibi soğuk çalışan tamponla yıkayın ve 20 dakika sonra dört santigrat derecede kuyu başına 100 mikrolitre cyto fix ile muamele edin, hücreleri buz gibi soğuk perma yıkama ile üç kez yıkayın. Daha sonra her bir oyuğa 45 mikrolitre sito perma ekleyin, ardından listelenen antikorların her birinden beş mikrolitre ekleyin. Dört santigrat derecede 30 dakika sonra, hücreleri üç kez yıkayın ve 200 mikrolitre buz gibi,% 2 para formaldehit ile sabitleyin.

Daha sonra hücreleri 12 x 75 milimetrelik tüplere aktarın ve örnekleri bir akış sitometresinde analiz edin. Az önce gösterildiği gibi pbmc ile muamele edilmiş bir tütün ürünü tabağı hazırladıktan sonra, 10 mililitre DPBS'de% 80 co akıcılığında hasat edilen K 5 62 hücreli bir kültürü yıkayın. Resus. Peleti beş mililitre DPBS'de askıya alın ve hücreleri sayın.

Daha sonra, bir mililitre tam ortamda bir ila iki kez 10 ila yedinci K 5 62 hücresine bir mililitre taze hazırlanmış CFSE çalışma çözeltisi ekleyin ve hücre lekesini girdaplama ile dağıtın. Hücreleri tam olarak iki dakika sonra oda sıcaklığında inkübe edin, 200 mikrolitre FBS ekleyin ve hücreleri tekrar girdaplayarak iki dakika daha inkübe edin. İkinci inkübasyondan sonra, hücreleri 10 mililitre tam ortamda yıkayın, ardından peleti başka bir 10 mililitre tam ortamda yeniden süspanse edin ve hücreleri sayın.

Şimdi tütünle muamele edilmiş p BMC'leri santrifüjleyin ve süpernatanı boşaltın. Daha sonra kapağı değiştirin, hücreleri girdaplama ile yeniden süspanse edin ve kuyu başına 200 mikrolitre tam ortamda yıkayın. Öldürme testini başlatmak için, CFSE etiketli K 5 62 hücrelerini pbmc'ye bir ila 15 oranında ekleyin ve ko-kültürü 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de inkübe edin.

Beş saat sonra, hücreleri aşağı doğru döndürün ve süpernatanı atın. Peletleri girdaplama yoluyla askıya alın ve daha sonra hücreleri kuyu başına 200 mikrolitre çalışma tamponu ile yıkayın, ardından 95 mikrolitre çalışma tamponu ekleyin, ardından kuyu başına toplam 100 mikrolitre hacim için yedi A d beş mikrolitre ekleyin. Son olarak, hücreleri karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.

Daha sonra her bir kuyucuğa 100 mikrolitre çalışma tamponu ekleyin ve yedi, a, a, d ve CFSE pozitif hücrelerin yüzdesini belirlemek için tüm hacmi uygun karşılık gelen faks tüplerine aktarın. Akış sitometrik analizi ile, 24 saat sonra tam duman şartlandırılmış ortamda hücre ölümünde doza bağlı bir artış gözlenir ve hücrelerin yaklaşık% 80'i at nikotin birimlerinin mililitresi başına dört mikrogramda ölür. Bununla birlikte, p BMC'lerin sadece üç saat boyunca tedavisi, 24 saat sonra tam duman şartlandırılmış ortamın mililitre at nikotin birimi başına beş mikrogramda bile önemli bir toksisite ile sonuçlanmaz.

Üç saat sonra mililitre başına 3000 mikrogram nikotin ile tedaviden önce karşılaştırılabilir bir hücre ölümü derecesi not edilmez, nikotin tedavisi, tam duman durumu, ortam ve nikotin ile mililitre konsantrasyon başına 2000 mikrogram muameleden önce ölçülebilir hücre ölümüne neden olmaz, ardından TLR dört reseptörünün LPS tarafından uyarılması, salgılanan sitokinlerin doza bağlı bir azalmasına neden olur. Her ne kadar baskılanma derecesi bireysel sitokinler arasında değişse de. Ayrıca, hücreler sadece altı saat boyunca LPS ve Golgi tıkacı ile tedavi edildiğinde, nikotin maruziyetine kıyasla daha düşük at nikotin birim konsantrasyonlarında bile, tüm duman durumu ortamına maruz kaldıktan sonra hücre içi sitokin pozitif hücrelerin sayısında bir azalma gözlenir.

Gerçekten de, bu öldürme testinin sonuçları, tam duman durumu ortamının mililitresi başına 1.56 mikrograma maruz kalmanın, kontrol ve düşük doz konsantrasyonlarına kıyasla efektör PBMC popülasyonunun öldürme kabiliyetini önemli ölçüde azalttığını göstermektedir. Yüksek veya düşük konsantrasyonlarda nikotin tedavisi, bu prosedürleri denerken efektör PBMC popülasyonunun öldürme kabiliyetine müdahale etmez. CFSE etiketlemesinin yanı sıra antikor seyreltmeleri, etiketleme süresi ve inkübasyon sıcaklıkları konusunda hassas olmak önemlidir.

Bu videoyu izledikten sonra, tütün ürünü preparatlarının veya diğer tedavilerin periferik kan mononükleer hücreleri üzerindeki etkilerini belirlemek için akış sitometrisinde antikor etiketleme tekniklerinin nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.