POSTNATAL nöron Çalışmaları için organotipik Dilim Kültürler

Bu prosedürün genel amacı, açık hipokampal topografyaya sahip dilim kültürleri üretmek ve hipokampusun dentat girusundaki nörojenezi değerlendirmektir. Bu, ilk olarak hipokampal dilimlerin özel bir zar ile donatılmış bir kültür kabında kültürlenmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra, bölünen hücreler bir mitotik işaretleyici ile etiketlenir.

Etiketli doku daha sonra bölümlere ayrılır. Son olarak, kesitler yenidoğan nöronlarını tanımlamak için standart immünohistokimyasal prosedürler kullanılarak boyanır. Sonuç olarak, hücre yoğunluğunu ve hücre özelliklerini ölçmek için immünohistokimya ve hücre sayımı kullanılır.

Genel olarak, bu tekniğe yeni olan kişiler, çok fazla pratik gerektirdiği için bunu zor bulabilir. Görsel gösterim kritiktir, çünkü diseksiyon adımları ve doku kültür plağından vibram aşamasına aktarılma sürecinin öğrenilmesi zor olabilir. Prosedürü göstermek, laboratuvarımızda yüksek lisans öğrencisi olan Adam Moza'nın temiz bir neşter bıçağı kullanarak, izole edilmiş bir sargı beyninin iki yarım küresini kesmesi olacak.

Sol yarım küreyi tekrar büyük Petri kabına aktarın ve diğer PS tarafını buza yerleştirin. Soğuk diseksiyon çözeltisi. Sağ hemisferin medial yüzünü görüntüleyin ve kenar forniksini tanımlayın.

Hipokampusun medial kenarı boyunca belirgin bir beyaz madde bandı tanımlandıktan sonra, neşter bıçağının sadece yaklaşık 0,5 santimetresini kullanarak forniksi keser. İki mikro spatula kullanarak. Sağ el spatulasını beyin sapına yerleştirerek ve üstteki korteksi kaldırarak hipokampusu çıkarın.

Sol el spatula ile. Hipokampusun lateral ventrikülünü ve medial yüzeyini ortaya çıkarmak için korteksi yavaşça kaldırın. Beyaz eğri bir çizgi.

FIA artık görünür olmalı. Spatulanın eğriliğini fia'nın eğriliği ile hizalayın ve spatulayı FIA'nın altına hafifçe bastırın, spatulayı sola kaydırın ve sırt yönünde kaldırmadan önce rostral coddle ekseni boyunca sürün. Hipokampusu çıkarmak için, hipokampusu buz gibi soğuk diseksiyon solüsyonu ile ayrı bir küçük Petri kabına aktarın.

Sol hipokampusu çıkarmak için bu işlemi sol yarımkürede tekrarlayın. İzole edildikten sonra, su aygırı kampını dikkatlice doku doğrayıcı aşamasına aktarın. Bunları birbirine bitişik ve paralel ve doğrayıcı bıçağın eksenine dik olarak düzenleyin.

Dokuyu konumlandırmak için bir boya fırçası kullanın ve su aygırının üzerine birkaç damla diseksiyon solüsyonu ekleyin. Campi. Tek tek dilimleri çıkarmak için dokuyu duraklamadan 400 mikrometrelik dilimler halinde kesin Tüm hipokampus kesildikten sonra, bölümleri diseksiyon solüsyonu ile küçük bir Petri kabına nazikçe aktarmak için bir boya fırçası kullanın. Diseksiyon mikroskobu altında, yüzen dilimleri bir mikro, spatula ve boya fırçası kullanarak dikkatlice ayırın.

Daha sonra, daha önce bir kültür eki ile hazırlanmış bir kültür plakasını inkübatörden çıkarın ve laminer akış başlığına yerleştirin. Ateşle parlatılmış bir PE veya pipet kullanarak, dört ila beş dilim çizin ve bunları kültürün apikal yüzeyine yerleştirin. Membranı yerleştirin.

Aralıklarını ayarlamak için bir boya fırçası kullanın, tek tek bölümler ile kültürün sınırı arasında boşluk bırakın. Yerine bir kez yerleştirin, fazla diseksiyon solüsyonunu zarın apikal yüzeyinden çıkarın. Serum içeren kültür ortamını içeren kültür plakasını ve hipokampal dilimleri 35 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübatöre geri yerleştirin.

Kültürleri diseksiyondan iki gün sonra steril bir laminer akış başlığında besleyin. Önce eski kültür ortamını aspire edin ve ardından kuyucuklara bir mililitre taze serum içeren ortam ekleyin. Sterilize edilmiş bir cam pipet kullanarak, kültür ekini nazikçe yerine yerleştirin ve zar yüzeyinin altında oluşmuş olabilecek hava kabarcıklarını gidermeye dikkat edin.

İlk beslemeden sonra, ortamı her gün değiştirin. Dentat granül hücrelerinin olgunlaşmasını ve entegrasyonunu incelemek için, besleme ortamını bir timidin analoğu ile değiştirin ve 35 santigrat derecede iki saat inkübe edin. İnkübasyonun ardından, analog içeren ortamı çıkarın ve normal besleme ortamı ile değiştirin.

İstenilen zaman noktasında normal besleme programına devam etmek için. Kültür plakasını alın ve kültür ortamını çıkarın. Daha sonra, her kültüre bir mililitre% 4 PFA ekleyin.

Paraform ile iyice kapatın ve ertesi gün 24 saat boyunca dört santigrat derecede saklayın. Sabitleyiciyi çıkarın ve sodyum azid contalı bir mililitre PBS ekleyin ve plakaları daha önce gösterildiği gibi saklayın. Kesit almaya hazır olduğunuzda, dairesel ekin çevresini dikkatlice kesmek için bir neşter kullanın ve ayrılan zarı PBS içeren bir Petri kabına aktarın.

Durulamadan sonra, membranı vibram montaj aşamasına aktarmak için forseps kullanın. Ardından, temiz kenarları bölmek için seçilen iki ila üç dilimi çevreleyen fazla zarı ortadan kaldırmak için bir neşter kullanın. Kesit alma konusunda yardım, membranın düz olmasını ve kesme yüzeyine kolayca yapışabilmesini sağlar.

Vibram kesme aşamasına bir ila iki damla yapıştırıcı yerleştirin ve eşit bir tabaka halinde yayın. 22 gauge iğne kullanarak, yapıştırıcıyı kesme bıçağına paralel uzun bir kenarı olan dikdörtgen bir şekle hızla yayın. Kesilen zarı kesme aşamasındaki yapıştırıcıya aktarmak için forseps kullanın ve süper yapıştırıcı kururken hava kabarcığı olmadığından emin olun.

Vibram aşamasını Petri içeren PBS'ye geri aktarın. Doku bölümlerini saklamak için Vibram bıçağını ve sodyum azid içeren 48 oyuklu bir plakayı hazırlayın. Organa özgü dilimlenmiş dokunun 30 mikrometrelik kesitlerini oluşturmak için vibratoyu kullanın.

Bölümleri, depolama ve ardından immünohistokimyasal boyama için sodyum azidli PBS içeren 48 oyuklu bir plakaya aktarın. PBS'yi sırayla primer ve sekonder antikorlar içeren solüsyonlarla değiştirerek ve bu solüsyonlardaki kesitleri istenen süreler boyunca inkübe ederek standart immünohistokimyasal boyama prosedürlerini gerçekleştirin. Bu floresan mikroskop fotoğrafları, kültürde korunmuş hipokampal morfolojiyi vurgulamaktadır.

Burada, organotipik dilimler kloro, deoksi, üridin ve calbindin için immüno-etiketlendi. CLDU ve çift cottin için etiketlenmiş bir dilim immünosunun örnek bir mikrografı burada gösterilmektedir. Sol taraftaki resim, çift kotin ile etiketlenmiş bir nöronu göstermektedir.

Ortadaki resim, kloro deoksi üridin etiketli bir çekirdeği göstermektedir. Sağ taraftaki resim, olgun bir nöronu göstermek için üst üste bindirilmiş her iki işaretçiyi de göstermektedir. Sol taraftaki resim, kloro deoksi üridin etiketli bir çekirdeği göstermektedir.

Ortadaki görüntü, bağlanması ile etiketlenmiş bir nöronu göstermektedir. Sağ taraftaki resim, bu prosedürü takiben olgun bir nöronu göstermek için üst üste bindirilmiş her iki işaretçiyi de göstermektedir. İn vivo immünohistokimya gibi diğer teknikler, kültürdeki nöronal gelişimin, özellikle yetişkin beynindeki in vivo nöronal gelişimle nasıl karşılaştırıldığı gibi ek sorular sormak için kullanılabilir.